Sử dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối xiêm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TRẦN THỊ HỒNG HẠNH SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI TIẾN CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG CHUỐI XIÊM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn Ts. LÝ NGUYỄN BÌNH NĂM 2007 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng i LỜI CẢM TẠ Qua năm năm học tập ở Trường Đại học Cần Thơ, được sự chỉ dạy tận tình của thầy cô, em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn quí thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quí báo cho em trong suốt năm năm học vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy Lý Nguyễn Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quí báo để giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Cảm ơn các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm Khoá 28 đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................. i Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii MỤC LỤC....................................................................................................................... i TÓM LƯỢC...................................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH.....................................................................................................iii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... iv CHƯƠNG I ....................................................................................................................1 ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................1 1.1 GIỚI THIỆU ............................................................................................................1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.....................................................................................1 CHƯƠNG II ...................................................................................................................2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..............................................................................................2 2.1 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHUỐI XIÊM ....2 2.1.1 Chuối xiêm .........................................................................................................2 2.1.2 Nấm men ............................................................................................................7 2.1.3 Enzyme ...............................................................................................................9 2.1.4 Nước ................................................................................................................22 2.1.5 Acid citric .........................................................................................................23 2.2. Động lực của quá trình lên men ............................................................................23 2.2.1 Cơ chế của quá trình lên men ...........................................................................23 2.2.2 Động học của quá trình lên men.......................................................................24 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men.........................................................24 2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................................24 2.3.2 Ảnh hưởng của pH ...........................................................................................25 2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ rượu...........................................................................25 2.3.4 Ảnh hưởng của chất lượng và số lượng nấm men sử dụng..............................25 2.4 Qui trình sản xuất rượu vang chuối........................................................................26 2.5 Các dạng hư hỏng trong sản xuất rượu vang chuối...............................................27 2.5.1 Lên men lactic ..................................................................................................27 2.5.2 Lên men butyric................................................................................................27 2.5.3 Lên men dại ......................................................................................................27 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM......................28 3.1 Phương tiện ............................................................................................................28 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................28 3.1.2 Thời gian thực hiện...........................................................................................28 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ ...........................................................................................28 3.2 Phương pháp thí nghiệm ........................................................................................29 3.2.1 Phân tích thành phần nguyên liệu.....................................................................29 3.2.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase ...................30 3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme amylase và pectinase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm..........................................................................................31 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................34 4.1 Phân tích thành phần nguyên liệu ..........................................................................34 4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase.........................34 4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme glucoamylase và polygalacturonase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm.............................................................................36 CHƯƠNG V KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ .......................................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................48 PHỤ LỤC DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase lên tinh bột ......................................10 Hình 2: Cơ chế tác dụng của enzyme amylase.............................................................12 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng....................................13 Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng.....................................14 Hình 5: Hình vẽ minh hoạ động học phản ứng vô hoạt enzyme bậc 1 ở các nhiệt độ khác nhau......................................................................................................................17 Hình 6: Hình vẽ minh hoạ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ ......................17 Hình 7: Cơ chế tác dụng của các enyme pectinase lên pectin .....................................18 Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng.....................................20 Hình 9: Máy đo pH ......................................................................................................28 Hình 10: Máy đo màu quang phổ hấp thụ....................................................................26 Hình 11: Bếp điện và thiết bi chưng cất ..................... Error! Bookmark not defined. Hình 12: Cồn kế, nhiệt kế.............................................................................................26 Hình 13: Bể điều nhiệt .................................................................................................28 Hình 14: Cân điện tử .................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 15: Nấm men .......................................................................................................29 Hình 16: Bố trí thí nghiệm động học vô hoạt enzyme glucoamylase ..........................31 Hình 17: Động học vô hoạt nhiệt của chế phẩm glucoamylase thương mại................35 Hình 19: Sản phẩm rượu vang chuối xiêm. Mẫu (ĐC, A, AP1,AP2, AP3) theo thứ tự từ trái sang phải ............................................................................................................37 Hình 20: Hàm lượng rượu sinh ra theo thời gian........................................................38 Hình 21: Kết quả khảo sát độ hấp thụ của rượu thành phẩm.......................................40 Hình 22: Mẫu phân tích hàm lượng methanol .............................................................40 Hình 23: Kết quả phân tích hàm lượng methanol trong sản phẩm (bước sóng 575nm)41 Hình 24: Kết quả phân tích hàm lượng andehyde trong sản phẩm..............................42 Hình 25: Kết quả phân tích hàm lượng đường tổng trong sản phẩm...........................43 Hình 26: Kết quả phân tích hàm lượng acid toàn phần trong sản phẩm......................43 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của chuối (giá trị trung bình trong 100g ăn được) ....3 Bảng 2: Sự chuyển hoá tinh bột thành đường trong quá trình chín ...............................5 Bảng 3: Hàm lượng glucid của chuối xanh và chuối chín .............................................5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v Bảng 4: Sự biến đổi của chất pectin trong quá trình chín ..............................................6 Bảng 5: Sự biến đổi của acid trong quá trình chín.........................................................6 Bảng 6: Sự thay đổi của hàm ẩm chuối trong quá trình chín.........................................7 Bảng 7: Hàm lượng muối cho phép trong sản xuất rượu.............................................22 Bảng 8: Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu .....................................................34 Bảng 9: Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme glucoamylase thương mại sau quá trình xử lý ở các nhiệt độ 68oC; nhiệt độ 71oC; nhiệt độ 74oC và nhiệt độ 77oC ........35 Bảng 10: Thông số động học vô hoạt enzyme glucoamylase ......................................36 Bảng 11: Hàm lượng rượu sinh ra theo thời gian trong quá trình lên men chính........38 Bảng 12: Kết quả phân tích độ hấp thụ ánh sáng của mẫu rượu thành phẩm đo ở bước sóng λ = 294 nm..................................................................................................39 Bảng 13: Kết quả phân tích hàm lượng methanol........................................................40 Bảng 14: Kết quả phân tích hàm lượng andehyde ......................................................41 Bảng 15: Kết quả phân tích hàm lượng đường ...........................................................42 Bảng 16: Kết quả phân tích hàm lượng acid toàn phần của sản phẩm .......................43 Bảng 17: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc và độ trong của sản phẩm ..................44 TÓM LƯỢC Tên đề tài thực hiện nghiên cứu “Sử dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối xiêm” . Tiến hành nghiên cứu thu được với hai thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase Khảo sát nhiệt độ làm bất hoạt enzyme glucoamylase: 68oC, 71oC,74oC, 77oC, ứng với điều kiện pH 4,5. Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi - Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme glucoamylase và polygalacturonase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm. Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại Thí nghiệm được tiến hành với 5 mẫu DC là mẫu không có bổ sung enzyme A là mẫu chỉ có bổ sung enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% AP1 là mẫu bổ sung enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% và enzyme polygalacturonase với tỉ lệ 0,01% AP2 là mẫu bổ sung enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% và enzyme polygalacturonase với tỉ lệ 0,02% AP3 là mẫu bổ sung enzyme enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% và enzyme polygalacturonase với tỉ lệ 0,03% Kết quả: - Thí nghiệm 1: Sự vô hoạt đẳng nhiệt enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ Aspergilus niger được mô tả bằng phương trình động học phản ứng bậc 1.Kết quả cho thấy khi nhiệt độ vô hoạt enzyme tăng thì hằng số tốc độ bị vô hoạt enzyme càng tăng. - Thí nghiệm 2: Mẫu thí nghiệm đạt tốt nhất là AP2 với điều kiện (đường hoá 60oC, pH 4,5, 1giờ; phối chế Brix 22%, pH 4,0; thanh trùng NaHSO3 140mg/1lít, 30 phút; cấy chủng nấm men 0,04%; lên men chính 10 ngày). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1 CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 GIỚI THIỆU Nước ta có khí hậu nhiệt đới nên nguồn trái cây phong phú quanh năm với nhiều loại trái cây đặc sản như: cam, bưới, chuối, xoài,…Đó là điều kiện thuận lợi để sản xuất nhiều loại sản phẩm như: mứt đông, nước ép, rượu vang, sữa, bánh kẹo, các sản phẩm sấy khô,… Ngày nay, các sản phẩm rượu vang từ trái cây cũng ngày càng phong phú về số lượng lẫn chất lượng: rượu vang dâu, rượu vang nho, rượu vang dứa, rượu vang sơri,… Rượu vang được chế biến từ các loại trái cây do lên men tự nhiên không qua chưng cất. Trong sản xuất rượu vang có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng rượu nhưng hiệu suất thu hồi và độ trong là 2 yếu tố quang trọng, vấn đề được đặt ra là phải có biện pháp làm tăng hiệu suất thu hồi và cải thiện độ trong của rượu vang. Do đó nhu cầu củ việc sử dụng chế phẩm sinh học để cải tiến chất lượng rượu vang chuói xiêm là cần thiết. Nhằm đa dạng hoá sản phẩm cũng như nâng cao giá trị kinh tế của nguyên liệu chuối, là nguồn nguyên liệu của đồng bằng sông Cửu Long với sản lượng lớn và dồi dào quanh năm, đây là điều kiện thuận lợi để sản xuất rượu chuối trên qui mô lớn. Bên cạnh đó, do nhu cầu thưởng thức của con người ngày càng tăng nên việc chế biến các sản phẩm rượu trái cây ngày càng đa dạng về số lượng lẫn chất lượng. Nguồn nguyên liệu chuối chứa nhiều chất dinh dưỡng và nhất là đường glucid (20,5%), protid (1,2%), lipid (0,3%), nước (75%),…rất thuận lợi cho việc sản xuất rượu vang, góp phần nâng cao giá trị kinh tế của chuối, cải thiện thu nhập cho nông dân và góp phần đa dạng hoá sản phẩm. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sử dụng chế phẩm enzyme sinh học là enzyme amylase và enzyme pectinase để cải tiến chất lượng rượu vang chuối xiêm. Nội dung nghiên cứu bao gồm - Phân tích thành phần nguyên liệu - Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase - Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme glucoamylase và polygalacturonase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHUỐI XIÊM 2.1.1 Chuối xiêm Đại cương về nguyên liệu chuối Nguồn gốc Chuối bắt nguồn từ Đông Nam Á. Các giống chuối khác được bắt nguồn từ những vùng khác nhau nằm giữa Ấn Độ và Malaysia. Di tích lịch sử của cây chuối sớm nhất từ Ấn Độ (600÷500 năm trước công nguyên) nhưng vụ mùa xuất hiện ở đất nước này hàng ngàn năm trước đó. Cây chuối được đưa vào Nam Phi theo đường Madagascar khoảng 500 năm sau công nguyên, và lan tràn qua trung tâm nhiệt đới của lục địa Châu Âu về phía tây bờ biển, chúng đến Địa Trung Hải khoảng năm 650 sau công nguyên và đưa vào Thái Bình Dương bởi những du khách Polynesia, khoảng năm 1000 năm sau công nguyên sự du nhập đầu tiên đến New York được bắt đầu ở đảo Canary, nơi mà trái cây được đưa vào bởi du khách Bồ Đào Nha từ Tây Châu Phi. Ngày nay chuối được trồng khắp vùng nhiệt đới của hai bán cầu. Vùng chuối tập trung nhiều nhất thế giới là Trung và Nam Bắc Mỹ (65%) và sau đó là Đông Nam Á (24%). Các giống chuối Cây chuối thuộc họ Musa, thuộc bộ Scitamilases, họ Muoidae trong lớp đơn tử diệp loài Musa sống hoang dại trong một vùng liên nhiệt đới rộng lớn như Ấn Độ, Nêpan, Miến Điện, bán đảo Đông Dương, Malacca, Indonesia, Niu_Ghine và vài quần đảo phía đông Thái Bình Dương. Ở Việt Nam có nhiều loại chuối, trong đó có ba loại chính là: chuối tiêu (chuối già), chuối giống (chuối tây, chuối sứ, chuối xiêm) và chuối bom. Ngoài ra còn có chuối ngự, chuối cao, chuối lá, chuối hạt… Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng Thành phần hoá học của chuối chứa 70 ÷ 80% nước, 20 ÷ 30% chất khô, chủ yếu là glucide. Hàm lượng protein của chuối thấp (1 ÷ 1,8%), gồm 17 acid amin mà chủ yếu là histidin. Hàm lượng chất béo không đáng kể. Acid trong chuối (trung bình 0.2%) chủ yếu là acid malic và acid oxalic. Ngoài ra, chuối còn chứa các vitamin, carotene, B1, B2, B6, C, acid pantotenic, inositol, acid folic, muối khoáng, pectin, hợp chất polyphenol. Nước: hiện diện trong nguyên liệu dưới dạng nước tự do và nước liên kết. Glucid: tồn tại chủ yếu ở dạng tinh bột khi chuối còn xanh. Chuối càng chín tinh bột chuyển dần sang đường. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 Acid hữu cơ: acid hữu cơ có chủ yếu trong chuối là acid malic và acid oxalic (chỉ xuất hiện trong chuối chín). Tanin: là thành phần chưa rõ nhưng thường chứa nhóm phenol (diphenol, pyrocatechol, resorcinol, hydroquinone, triphenol, pyrogollol, phyloroglucinol) thường ở dạng phức hợp với các chất nhầy. Phytin: ở dạng muối của Ca, Mg với acid phylic (inositol, acid hexaphotphoric). Protein: ngoài albumin, globulin còn có glutein, protease, prolamin. Lipid: không đáng kể thành phần chưa biết rõ có thể chứa sirotirol. Tro: gồm Si, S, Ca, Mg, Fe, P, Cl, K, Na, Al, Zn, Cu ở dạng hợp chất oxyt. Cấu tử bay hơi: mùi hương chuối tạo nên cho quá trình chín có thể do một vài loại rượu và ester tạo nên như: ester của acid acetic, acid butyric. Ngoài ra còn có một lượng đáng kể aldehyde, rượu ethyl và methyl. Sắc tố: gồm chlorophyl và carotene, ngoài ra còn có flavone, anthocianine trong lớp nhựa vỏ. Enzyme: trong chuối có nhiều enzyme polyphenoloxydase, perosidase là yếu tố gây sẫm màu sản phẩm chuối. Chuối cung cấp nhiều năng lượng, chất bột đường, nhiều vitamin… dễ tiêu hoá. Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của chuối (giá trị trung bình trong 100g ăn được) Thành phần gam (g) Glucid 20,5 Protid 1,2 Lipid 0,3 Nước 75 Thành phần khác 2,0 Tro mg K 385,000 P 22,000 Ca 8,000 Mg 30,000 Na 1,000 Fe 0,400 Cu 0,110 Zn 0,190 Mn 0,300 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 Vitamin mg Vitamin C (Acid ascorbic) 12,00 Pro vitamin A (caroten) 0,150 Vitamin B1 (thiamin) 0,040 Vitamin B2 (riboflavin) 0,040 Vitamin B3 hoặc PP (niconamid) 0,610 Vitamin B5 (acid phantothenic) 0,280 Vitamin B6 (pyridoxin) 0,500 Vitamin H (biotin) 0,003 Vitamin B9 (acidfolic) 0,023 Vitamine E (tocopherol) 0,290 (Nguyễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978) Hoá sinh sự chín của chuối Đại cương về sự chín Quả là những sản phẩm thiết yếu đối với dinh dưỡng của con người, bởi lẽ chúng là nguồn cung cấp chính các vitamin, muối khoáng, acid hữu cơ, polyphenol, các chất thơm và glucid dễ tiêu hoá. Một trong những yêu cầu quan trọng bậc nhất đối với các phương pháp chế biến và cất giữ quả là làm thế nào để bảo tồn được một cách tối đa các chất dinh dưỡng, vitamin, hương vị và màu sắc tự nhiên của quả. Muốn làm được điều đó phải biết rõ thành phần hoá học của quả và hiểu sâu sắc các quá trình sinh hoá xảy ra trong mô của chuối khi chín, cũng như khi chế biến và bảo quản. Trong quá trình phát triển của mình, tế bào trãi qua một loạt các giai đoạn nối tiếp nhau: phân chia, sinh trưởng, chín già và phân huỷ rồi chết. Khi còn ở trên cây, các chất dinh dưỡng được tích tụ dần dần làm cho quả trở nên “già dần”. Quả đã “già” hàm lượng các chất dinh dưỡng trong chúng được tích tụ khá cao. Tiếp sau đó nhiều biến đổi hoá học khác nhau tiếp tục xảy ra dưới sự điều hoà của các chất kích thích tố và hệ enzyme làm cho quả có thành phần hoá học, hình dạng, kích thước, màu sắc đặc trưng, hương vị thơm ngon điển hình cho từng Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 loại quả. Đó là hiện tượng chín. Đối với chuối, quả chín sau khi ngắt lìa khỏi cây mẹ gọi là quả rấm chín. Trong thời gian chín, thịt quả (như mô) tích luỹ một lượng lớn các chất dinh dưỡng hoà tan (chủ yếu là đường hoặc acid hữu cơ) từ lá chuyển đến hoặc do các chất hữu cơ phức tạp phân giả tạo thành làm độ chắc của quả giảm, quả trở nên mềm. Màu sắc của vỏ quả và thịt quả thay đổi. Khi trong quả kết tụ các chất dinh dưỡng cao nhất, màu sắc của quả đẹp nhất, hương vị của quả thơm ngon nhất được gọi là quả chín tới. Tiếp sau đó là thời kỳ già cõi và phân huỷ tế bào của mô. Lúc này quá trình phân huỷ nội tế bào tăng lên rất mạnh vì hạt bắt đầu phát triển nhờ làm cho màu sắc của quả trở nên xấu đi, quả không còn độ chắc nhất định còn gọi là sự chín quá hay chín nẫu. Biến đổi thành phần hoá học cơ bản của quả khi chín Biến đổi Glucid Đường và tinh bột Sự thay đổi chủ yếu trong thịt quả trong quá trình chín là sự biến đổi tinh bột thành đường. Hàm lượng tinh bột giảm còn hàm lượng chung của đường tăng lên do sự thuỷ phân tinh bột thành đường dưới tác dụng của enzyme. Bảng 2: Sự chuyển hoá tinh bột thành đường trong quá trình chín Số ngày trong nhà rấm chín 0 3 5 7 9 11 Glucid tổng số (%) 21,51 20,49 10,87 19,78 18,60 19,12 Tinh bột (%) 20,65 12,85 6,00 2,93 1,73 7,21 Đường khử (%) 0,24 2,81 7,24 10,73 12,98 15,31 Đường không khử oxy (%) 0,62 4,85 6,25 6,12 3,89 2,60 (Nguyễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978) Trong chuối chín tới, saccharose, fructose, glucose chiếm tỉ lệ gần như nhau, cả ba loại đường này đều tăng khi chuối chín quá, nghĩa là sau một thời gian hô hấp đột phát, hàm lượng đường chung đặt biệt là saccharose giảm nhanh vì tiêu thụ nhanh trong quá trình hô hấp. Bảng 3: Hàm lượng glucid của chuối xanh và chuối chín Đường(%) Độ già Tinh bột Saccarose Glucose Fructose Tổng Chuối xanh 20,6 0,32 0,12 1,0 1,44 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 Chuối chín 1,21 2,6 2,4 12,9 17,9 (Nguyễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978) Biến đổi của chất pectin và các enzyme chuyển hoá pectin Ở quả xanh, protopectin (pectin không hoà tan) phân tán trong thành tế bào làm cho quả có độ rắn chắc nhất định. Trong quá trình chín, dưới tác dụng của enzyme protopectinase và acid hưu cơ, 1 phần lớn protopectin chuyển thành pectin hoà tan phân tán vào dịch bào do đó quả mềm. Bảng 4: Sự biến đổi của chất pectin trong quá trình chín Số ngày trong ngày rấm chín 0 3 5 7 9 11 Pectin (%) Protopectin (%) - 0,53 0,27 0,56 0,36 0,31 0,34 0,34 0,37 0,21 0,4 0,22 (Nguyễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978) Các chất xơ Chất xơ trong chuối có xenlulose, hemixenlulose, lignin, chỉ có 0,84% chất xơ trong thịt quả. Trong chuối chín, các chất trên giảm, đặc biệt là hàm lượng hemixenlulose giảm rõ rệt (8% xuống 1%). Biến đổi acid hữu cơ Khi quả chín, acid hữu cơ biến đổi cả về chất lẫn lượng. Ở chuối, thì hàm lượng acid giảm xuống, sự giảm acid này làm cho hệ số đường, acid của quả tăng lên. Đó chính là nguyên nhân làm tăng độ ngọt của quả. pH của chuối thay đổi từ: 5,02 ÷ 5 trong chuối xanh. 4,2 ÷ 4,75 trong chuối chín. Bảng 5: Sự biến đổi của acid trong quá trình chín Số ngày trong nhà rấm chín Độ chua (số ml NaOH để trung hoà 100g thịt quả) 0 3 5 7 9 2,96 3,56 4,95 4,46 4,08 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 11 3,66 (Nguyễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978) Biến đổi Vitamin Acid ascorbic (vitamin C) được đặc biệt chú ý, là vitamin chủ yếu trong chuối. Acid ascorbic trong chuối tăng lên trong quá trình chín nhưng giảm khi chuối quá chín. Ở chuối xanh, acid ascorbic chiếm khoảng 5 mg/100g. Biến đổi các sắc tố Ở đa số quả, dấu hiệu chín đầu tiên là sự biến đổi về màu sắc do lượng chlorophyll giảm xuống và lượng carotenoid cũng như antoxyan và các flavonoide tăng lên. Biến đổi hợp chất phenol Polyphenol chủ yếu là chất tanin thường tạo vị chát, sự biến đổi của tanin tự do có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo thành vị ngon của quả. Trong thịt quả, lượng tanin giảm từ 7,36% xuống 1,7% ở quá trình chín. Biến đổi hàm ẩm Hàm ẩm của thịt quả tăng khi trái chín. Lượng nước thu được là sản phẩm của quá trình carbohydrate tiêu huỷ cho hô hấp. Bảng 6: Sự thay đổi của hàm ẩm chuối trong quá trình chín Số ngày trong nhà rấm chín 0 3 5 7 9 11 Hàm ẩm (%) 74,4 75,6 75,4 75,9 76,4 77,4 (Nguyễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978) Tỉ lệ thịt quả / vỏ Trong suốt quá trình chín của trái, thịt quả gia tăng do có sự gia tăng nước. Lượng nước này có được từ vỏ và từ thân cây. Do đó, vỏ mất trọng lượng và điều này chính là nguyên nhân của sự thay đổi tỷ lệ thịt/vỏ. Biến đổi một số chất khác Trên đây là một loạt các biến đổi quan trọng của một số hợp chất thành phần của quả. Trong quả còn có một số hợp chất thành phần khác như: lipid, protein, khoáng… 2.1.2 Nấm men Giới thiệu chung về nấm men Cấu tạo nấm men Tế bào nấm men có cấu tạo hình thái và kích thước rất khác nhau. Tuỳ loại tuỳ giống chúng có thể hình cầu hình bầu dục, hình trứng hình, quả chanh, hình ống. Tuỳ theo loại giống, điều kiện sinh trưởng kích thước tế bào nấm men rất nhiều. Chúng có thể thay đổi trong khoảng 1,5 ÷ 5,3 µm hay có khi dài hơn, các loại nấm men dùng trong sản xuất rượu bia có kích thước khoảng 4 ÷ 7 µm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Sinh dưỡng của tế bào nấm men Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khếch tán vào bên trong. Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào trong trường hợp này đóng vai trò là màng bán thấm ngăn cách, điều khiển các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải ra môi trường xung quanh những sản phẩm của hoạt động sống. Để cho tế bào dễ hấp thụ, các chất dinh dưỡng phải là những chất có nguyên tử lượng thấp và hoà tan trong nước, một phần các chất dinh dưỡng chuyển hoá các hợp chất cao phân tử (protid, glucid, lipid…) trong tế bào và xây dựng thành tế bào mới. Chúng ta muốn biết nấm men cần những chất dinh dưỡng (thức ăn gì) phải xem xét thành phần hoá học của tế bào nấm men. Nấm men sinh sản trong môi trường nước đường, lóc tách men, rửa, ép bỏ nước sẽ được men bánh hay gọi là men ép. Nước trong nấm men gồm hai dạng: dạng tự do bám ở ngoài màng tế bào khoảng 28% và nước dạng kết hợp khoảng 47%. Thành phần các chất không phụ thuộc vào giống nấm men. Nấm men cũng giống như các cơ thể thực vật khác cần oxy, cacbon, nitơ, phosphat, kali, magiê,… Nấm men trong sản xuất rượu vang Saccharomyces vini Nấm này phổ biến trong lên men nước quả, chiếm 80% trong tổng số có trong nước quả lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng chủng: các tế bài dạng bụi hoặc dạng bông. Đa số các tế bào loài này hình ovan, có kích thước từ (3 ÷ 8) x (5 ÷ 12) µm. Sinh sản theo lối nảy chồi và tạo bào tử. Saccharomyces vini sinh ra enzyme invectaza có khả năng khử đường saccarose thành fructose và glucose. Vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu đựoc bình thường. Chủng này lên men chỉ đạt được 8 ÷ 10% hàm lượng rượu theo thể tích. Saccharomyces uvacum Men này được tách ra từ nước quả nho, rượu và nước quả phúc bồn tử lên men tự nhiên, về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch-malt. Các chủng của loài này có thể lên men 12 ÷ 13˚ cồn trong dịch nước nho. Saccharomyces chevalieri Men này được tách ra từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được gây men từ nước dừa. Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 16˚ cồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces vini. Saccharomyces ovifromis Được tách ra từ nước nho tự lên men, những loài nấm men này ít hơn so với Saccharomyces vini. Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước quả khác, có khả năng chịu được đường cồn cao; lên men kiệt đường và có Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 thể tạo thành tới 18˚ cồn. Các yếu tố sinh trưởng của loài này giống như Saccharomyces vini và có khả năng chịu được cồn cao 2.1.3 Enzyme Khái niệm về enzyme Sự sống đó là quá trình trao đổi chất liên tục. Để thực hiện sự trao đổi chất trong cơ thể diễn ra một cách liên tục, nhịp nhàng, hàng ngàn hàng vạn những quá trình hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Những quá trình đó hầu như tất cả đều có sự tham gia của chất xúc tác sinh học có đặc tính cao và có hiệu lực xúc tác lớn. Chất xúc tác sinh học có hầu hết trong các loại tế bào của cơ thể sống. Nhờ chất xúc tác sinh học mà các quá trình hóa học trong cơ thể xảy ra rất nhạy với vận tốc rất nhanh trong những điều kiện sinh lý bình thường của môi trường cơ thể sống. Sự xuất hiện thuật ngữ “Enzyme” có liên hệ từ bước đầu của quá trình lên men. Sự nghiên cứu mở ra sản xuất lên men đặc biệt là sự lên men trong công nghệ thực phẩm và nông nghiệp Enzyme amylase Giới thiệu Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn. Enzyme amylase cũng như các enzyme khác đều có bản chất là protein được vi sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng sinh học. Phân loại và cơ chế tác dụng Các enzyme amylase từ các nguồn sẽ khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân α-amylase Đặc tính Là một metaloenzyme, trong phân tử có ít nhất một phân tử Ca2+ có tác dụng làm bền cấu trúc bậc hai và bậc ba của phân tử enzyme. Enzyme α-amylase là những protid đơn giản, có chứa nhóm amin tự do. Enzyme α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionin. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn hóa trị nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật. Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II. Hoạt hóa bởi Enzyme hóa trị I như sau:Cl- > Br- > I-. Chúng bị kiềm hảm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+,… Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. (bền nhất trong hệ α-amylase) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau: pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5 ÷ 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,7 ÷ 5,4) và của vi khuẩn là 5,8 ÷ 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 ÷ 7,0). Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α- amylase ở nấm sợi là 500C. Amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 ÷ 600C. Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin α-amylase chỉ có khả năng phân cắt liên kết α-1,4-glucoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme). Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6 ÷ 7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt dần và bị phân giải chậm đến maltose tetrose, maltose triose, maltose. Sau thời gian thủy phân amylase sản phẩm bao gồm: 87% maltose, 13% glucose. Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylosepectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì α-amylase không cắt được liên kết α-1,6-glucoside nên dù có kéo dài thời gian thủy phân nhưng sau cùng sản phẩm có khoảng: 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và izomaltose là 8%. Hình 1: Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase lên tinh bột β-amylase Đặc tính β-amylase là một loại albumin. Tâm xúc tác của nó chứa gốc –SH, -COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nẩy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase. Sự tồn tại của β-amylase trong mold cho đến nay vẫn chưa được xác định. β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, ure, iodo, acetanid, iod, ozon. pH tối thích trong dung dịch bột thuần khiết là 4 ÷ 6, trong dung dịch nấu là 5 ÷ 5,6; nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40 ÷ 50˚C, trong dung dịch nấu là 60 ÷ 65˚C; β-amylase bị vô hoạt ở 70˚C Cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11 β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử. Maltose có cấu hình β được tạo thành. β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo-enzyme). β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54 ÷ 58% amylosepectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylosepectin có từ 20 ÷ 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α- 1,4-glucoside gắn với liên kết α-1,6-glucoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Có chứa rất nhiều liên kết α-1,6- glucoside gọi là dextrin có màu tím đỏ với Iod. γ-amylase Đặc tính So với α-amylase và β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone không được bảo vệ bằng Ca2+. γ-amylase không bền với ion kim loại nặng: Cu2+, Hg2+… có trong nấm mốc và một loài vi khuẩn. Vận tốc thủy phân các cơ chất khác nhau bằng γ-amylase tinh thể cho thấy rằng các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các chất phân tử thấp. Đa số γ-amylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”. Hoạt động tốt ở 50˚C, hoạt lực tối đa trong vùng pH = 3,5 ÷ 5,5. So với α-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và liên kết α- 1,6-glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide, cả maltose và các oligosaccharide kiểu maltose. Là enzyme ngoại phân exo-enzyme, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một. Không thủy phân được các dextrin vòng. Khi thủy phân tinh bột, ngoài glucose còn có thể tạo thành oligosaccharide. Ngoài ra γ-amylase còn có khả năng cắt cả liên kết α-1,2 và liên kết α-1,3-glucoside nữa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12 K3 K1 Hình 2: Cơ chế tác dụng của enzyme amylase Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Khi cơ chất đầy đủ thì vận tốc của phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme         = EkV * (1) Trong đó: v: vận tốc của phản ứng k: hằng số vận tốc [E]: nồng độ của enzyme Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Nồng độ của enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Tuy nhiên có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn thì vận tốc phản ứng chậm. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Enzyme tham gia quá trình xúc tác tạo phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất tạo thành một sản phẩm (P), phản ứng xảy ra như sau: Trong đó: K1: hằng số vận tốc phản ứng tạo ES K2: hằng số vận tốc phân ly ES và cơ chất ban đầu K3: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P Mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác và nồng độ cơ chất được biểu diễn theo phương trình Michaelis – Menten như sau: [ ] [ ]SK SV v m + = max (2) Trong đó: v : vận tốc phản ứng Km : hằng số Michaelis – Menten E + S ES E + P K2 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13 Vmax: vận tốc phản ứng cực đại [S] : nồng độ cơ chất Trong đó v là hàm số của [S], đồ thị có dạng nhánh hyperbol vuông góc: Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng Km gọi là hằng số Michaelis – Menten và đặc trưng cho mỗi enzyme – Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất. Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc enzyme càng lớn.Qua đồ thị chung của đường biểu diễn cho thấy khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng tăng. Khi tăng nồng độ cơ chất đến một giá trị nào đó, vận tốc phản ứng đạt giá trị cực đại Vmax , sau đó vận tốc phản ứng sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng nồng độ cơ chất. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó tốc độ phản ứng enzyme giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là tốc độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40÷500C. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì khác nhau. Bảng tóm tắt nhiệt độ / pH Tố c độ ph ản ứn g (% ) Nhiệt độ (oC) T ốc độ ph ản ứn g (% ) pH Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14 Bảng tóm tắt nhiệt độ (
=alpha- amylase,
=beta-glucanase) Bảng tóm tắt pH (
=alpha- amylase,
=beta-glucanase) Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ, khi tăng nhiệt độ phản ứng thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch về phía pH lớn hơn. Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến thực phẩm, tuyển chọn giống vi sinh vật. Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt động của enzyme Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme amylase từ trạng thái không hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên mạnh hơn, chất hoạt hóa có bản chất giống nhau có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro. Ví dụ: NAP+, NADP+, acid ascorbic (chuyển hydro), ADP (chuyển photphat)… - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme kết quả là bỏ một vài đoạn peptide, phá thế bị bao vây của các nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme trở nên hoạt động. - Các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme. Ví dụ: Trung tâm hoạt động của papain có chứa nhóm –SH sẽ chuyển thành –S-S- làm enzyme mất khả năng hoạt động. Nếu thêm vào môi trường các chất hoạt hóa có tính khử như cystein, glutation, nhóm –SH sẽ được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở lại. - Các anion, các ion kim loại cũng có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của enzyme. Tuy nhiên, khi sử dụng các hóa chất này phải tùy từng loại mà sử dụng nồng độ khác nhau vì các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme. Ảnh hưởng của chất kìm hãm Các chất kìm hãm là chất có mặt trong phản ứng enzyme làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15 Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là ion kim loại, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và protein. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Kìm hãm thuận nghịch: phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng: Trong đó: E: enzyme I: chất kìm hãm K1, K2: hệ số vận tốc của phản ứng thuận nghịch Kìm hãm không thuận nghịch: K2 sẽ rất nhỏ và không đáng kể. Thường phân biệt hai loại kìm hãm thuận nghịch là: kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh. Kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Cơ chất loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả làm hoạt động của enzyme sẽ giảm. Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả chất kìm hãm này làm thay dổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác, làm giảm hoạt động của enzyme. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi những ion kim loại nặng như: Cu2+, Ag+, Hg+... Ngoài ra acid sunfosalisilic 20%, acid chlohydric làm ngưng hoạt động của enzyme. Động học phản ứng vô hoạt enzyme amylase - Phản ứng bậc 1 Sự vô hoạt enzyme bởi nhiệt độ độ thường tuân theo phương trình động học phản ứng bậc 1. kA dt dA −= (3) Hay: kdt A dA −= (4) E + I EI I K2 K1 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16 Phương trình vi phân (2) được lấy tích phân theo điều kiện đầu và cuối. Khi t = 0 → A = Ao t = t → A = A ∫∫ −= tA o kdtdA 0A A (5) Khi quá trình thực hiện ở nhiệt độ vô hoạt không đổI (k= hằng số, quá trình xử lý là đẳng nhiệt) thì phương trình (5) được viết: ∫∫ −= tA o dtkdA 0A A (6) → kt Ao A −=     ln (7) Hay: A=Ao exp(-kt) (8) Phương trình (8) là phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt tính còn lại của enzyme và thời gian xử lý nhiệt. Hay: t DAo A 1log −=      (9) k 303,2D = Trong đó: A: Hoạt tính của enzyme ở thời điểm t (đơn vị hoạt tính). Ao: Hoạt tính của enzyme ban đầu (đơn vị hoạt tính). t: là thời gian xử lý nhiệt (phút) k: là hằng số tốc độ phản ứng vô hoạt enzyme bậc 1 (1/phút) D: thời gian làm giảm hoạt tính của enzyme xuống 10 lần (phút) ln (A /A o ) Thời gian (phút) t1 t2 t3 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17 Hình 5: Hình vẽ minh hoạ động học phản ứng vô hoạt enzyme bậc 1 ở các nhiệt độ khác nhau - Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của hằng số tốc độ Theo quan điểm động học về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hằng số tốc độ vô hoạt được biễu diễn theo phương trình Arrhenius: 2RT ln Ea dT kd = (10) Hay: dTEakd 2RT ln = (11) Lấy tích phân 2 vế phương trình ta được: 2 * R ln 0k T dTEakd T T k o ∫∫ −= (12) →       −=− TTo Eakok 11 R lnln (13)       −+= TTo Eakok 11 R lnln (14) Trong đó: k: Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme ở nhiệt độ T (1/phút) k: Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme ở nhiệt độ To (1/phút) R: Hằng số khí lý tưởng (R= 8,314 J/mol.K) T: Nhiệt độ xử lý (K) To: Nhiệt độ tham chiếu (K) Hình 6: Hình vẽ minh hoạ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ ln(k) 1/T (1/K) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18 Enzyme pectinase Giới thiệu Enzyme pectinase là nhóm enzyme thuỷ phân pectin, sản phẩm tạo thành các acid galacturonic, galactose, methanol… Phân loại và cơ chế tác dụng của enzyme Trong hệ enzyme phân giải pectin gồm nhiều enzyme khác nhau được phân loại phổ biến như sau: Enzyme pectinesterase (PE) Enzyme pectinesterase chỉ phân cắt nhóm methoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự do, enzyme pectinesterase có ái lực với nhóm methoxyl ở vị trí 3 và 7. Sự phân cắt các nhóm methoxyl sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm –COOH tự do. Kết quả là tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Hình 7: Cơ chế tác dụng của các enyme pectinase lên pectin Enzyme polygalacturonase (PG) Enzyme polygalacturonase xúc tác sự phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside ở trong các mạch của chất pectin. Enzyme polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng trên cơ chất, các enzyme này ra hai loại: Enzyme polymethylgalacturonase (PMG) Enzyme này tác dụng trên acid polygalacturonic đã được methoxyl hoá. Tuy nhiên phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch của chất pectin mà được chia thành 2 nhóm: Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19 - Enzyme endo-glucosidasse polymethylgalacturonase Kiểu I (endo- PMG-I) là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá. Pectin có mức độ methoxyl hoá càng cao thì bị thuỷ phân càng nhanh. - Enzyme exo-glucosidasse polymethylgalacturonase Kiểu III (exo- PMG-III) là enzyme polymethylgalacturonase đường hoá, enzyme này có thể cắt từng gốc acid galacturonic ra khỏi acid ectinic hay pectin phân cắt các liên kết α-1,4 ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc acid galacturonic có nhóm – COOCH3 Enzyme polygalacturonase (PG) Enzyme này tác dụng lên acid pectic hoặc acid pectinic và cũng được chia thành 2 nhóm: - Enzyme endo-glucosidasse polygalacturonase Kiểu II (endo- PG-II) là enzyme polygalacturonase dịch hoá. Enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic khi có mặt nhóm –COOH tự do. - Enzyme exo-glucosidasse polygalacturonase Kiểu IV (exo- PG-IV) thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside ở cuối mạch của phân tử acid pectic hoặc acid pectinic nhưng bên cạnh không được có nhóm methyl. Pectate lyase(PEL) Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hóa. Cả 2 enzyme exo- PEL (exo-poly(1,4-α-D-galacturonide) lyase và endo-PEL (endo- poly(1,4-α-D- galacturonide) lyase đề tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Pectine lyase(PL) Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hóa. Tất cả các PL đều là endo-enzyme. Ngoài ra còn có: - Pectin- transeliminase (PTE) hay còn gọi là poly α-1,4-D-galacturonite- methylesterglucanoliase. Là enzyme tác động trên pectin và pectin acid. - Polygalacturonate- transeliminase còn gọi là poly α-1,4-D-galacturonite- glucanoliase, là enzyme tác động trên pectic acid và pectinic acid. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme Ảnh hưởng của thành phần hoá học của nguyên liệu Tình trạng chất lượng pectin ảnh hưởng nhiều tới sự tạo độ nhớt của dịch quả và khả năng thuỷ phân của enzyme pectinase. Pectin có độ ester hoá càng cao thì độ nhớt càng cao và hiệu quả tác dụng của polygalacturonase càng thấp. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20 Các acid hữu cơ có trong quả ức chế enzyme pectinase với mức độ khác nhau. Acid citric và acid tartric ở nồng độ 0,4% có tính chất ức chế hầu như giống nhau. Ở nồng độ 0,8%, acid citric ức chế enzyme pectinase mạnh hơn so với acid tartric. Hiệu quả tác dụng của enzyme pectinase cũng bị ảnh hưởng bởi các ion có trong dịch quả. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectinase Khi lựa chọn nồng độ chế phẩm enzyme nên chọn lựa tối thiểu mà bảo đảm được các biến đổi cần thiết với thời gian mà công nghệ của dạng nước quả cho phép. Không tuỳ thuộc vào hoạt độ của một chế phẩm hoặc của m