Sử dụng chỉ thị phân tử Microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dòng keo lá tràm (Acacia auriculiformis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khóa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 1 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ.  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS. Nguyễn Quốc Bình Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài.  Chân thành cảm ơn! Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Công nghệ sinh học 29, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG 2 TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”. Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ . Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao.  Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.  Kết quả - Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.  Kết luận 3 - Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770) có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt. 4 MỤC LỤC ĐỀ MỤC ...................................................................................................... TRANG TRANG TỰA ........................................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................... iv MỤC LỤC ................................................................................................................ v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................. x Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài ....................................................... 2 1.4 Giới hạn của đề tài ............................................................................................. 2 Phần 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học ........................................................................... 4 2.1.1 Định nghĩa ....................................................................................................... 4 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học ......................................................................... 4 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................. 4 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái ............................................................................ 4 2.1.3.2 Đa dạng loài ................................................................................................. 5 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền .................................................................................... 6 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................ 7 2.2.1 Phân loại .......................................................................................................... 7 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ..................................... 8 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ..................................... 9 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) ........................ 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) ...................................................................................... 10 5 2.3 Kỹ thuật Microsatellite ..................................................................................... 11 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite .......................................................................... 11 2.3.2 Tính chất ........................................................................................................ 12 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite ......................................................... 13 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite ........................................................................... 14 2.3.5 Các loại Microsatellite .................................................................................. 15 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite ........................................... 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite .............................................................. 15 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite ........................................................................... 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite ................................................. 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai ......................................................................................... 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 19 2.4.1 Khái niệm ...................................................................................................... 19 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR ............................. 20 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR.......................................................................... 23 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................ 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật ...................................................................... 23 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......................................... 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di ...................................... 26 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) .................................. 28 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) .......................................................................... 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo .......................................................... 28 2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) ........................................................ 30 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) ........ 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái ............................................................ 33 2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng ............................................................ 35 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 36 6 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 36 3.1.1 Thời gian thực hiện ....................................................................................... 36 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 36 3.4 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37 3.5 Ly trích DNA ................................................................................................... 37 3.5.1 Hóa chất ....................................................................................................... 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA ................................................................................. 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích ................................................................. 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................ 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR .................................................................................. 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 44 4.1 Quá trình ly trích ............................................................................................. 44 4.2 Phản ứng PCR .................................................................................................. 44 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50 PHỤ LỤC 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite).  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của Taq  UV: Ultra Violet 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ..................................................... 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ................................................. 16 Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ................................................... 20 Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) .......................................................... 29 Hình2.5:Hình thái một số loài Keo ........................................................................ 30 Hình 2.6. Keo lá tràm ............................................................................................. 33 9 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) ......... 8 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose ..................................... 27 Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide ........................ 27 Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) ............ 32 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA .............................. 38 Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 41 Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng .......................................................... 41 Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA ................................................................. 39 10 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn, phòng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn có thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt, giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trƣờng... Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,... ( Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nông dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất lƣợng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết đặt ra cho ngành lâm nghiệp. Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã đƣợc triển khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhƣng biện pháp chủ yếu là nhập hạt giống chất lƣợng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phƣơng pháp cổ điển của các dòng cây trội. Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử 11 hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu nhƣ chƣa có nhiều. Các phƣơng pháp chọn giống cổ điển tuy đã góp phần hình thành nên những giống vật nuôi đa dạng, nhƣng do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa thƣờng không ổn định và chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi môi trƣờng. Sử dụng chỉ thị phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi đƣợc các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình. Hiểu biết về cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta có cơ sở vững chắc trong việc sử dụng nguồn tài nguyên thực vật một cách có hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng, phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng. Nhằm góp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis)” đƣợc thực hiện do sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học và sự hƣớng dẫn chính của TS. Vƣơng Đình Tuấn. 1.2 Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Tƣd đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao. 1.3 Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam. 1.4 Giới hạn của đề tài Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc hoàn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm. Và đề tài chỉ thực hiện trên một số mẫu nghiên cứu thu thập đƣợc ở Trạm thực 12 nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Bình Dƣơng) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. 13 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học 2.1.1 Định nghĩa Thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980) định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài trong một quần xã sinh vật). Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002). Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vô tận, đó chính là nguồn cảm hứng sáng tạo và cũng là nguồn kiến thức phong phú của nhân loại. Sự đa dạng sinh học cung cấp cho con ngƣời nguồn thức ăn phong phú và đa dạng chủng loại; cung cấp nguồn hàng hoá và nguyên vật liệu phong phú và cần thiết cho nông nghiệp, cho dƣợc học, cho khoa học công nghệ. Đa dạng sinh học là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp. Ngoài ra đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đó tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh học. 14 Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau giữa các quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình) (OTA, 1987; FAO, 1990). Vậy hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng. 2.1.3.2 Đa dạng loài Sự đa dạng loài đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định theo cấu tạo hình thái của loài hoặc theo phân loại sinh học( Theo cấu tạo hình thái của loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác. Thƣờng đƣợc vận dụng để định danh loài, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới. Phân loại sinh học loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác. Cách này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá khảo sát mối quan hệ về gene. Theo Rojas và Stanley (1992), những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn nhiều so với lý thuyết. Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Nhƣng, đôi khi các phân loài giống nhau đến mức tƣởng nhƣ là chúng cùng một loài. 15 Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới chƣa đƣợc biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết. 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học. Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau ( Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Nghiên cứu về đa dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hƣởng bởi tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gene khác nhau. Sự đa dạng về bộ gene này là do các cá thể có các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (Lâm Vỹ Nguyên, 2006). Những hình thái khác nhau của gene đƣợc thể hiện bằng những alleles và những khác biệt do sự đột biến. Những alleles khác nhau của một gene có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gene trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các gene trong quá trình sinh sản. Các gene trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gene và alleles trong một quần thể là vốn gene của quần thể và những tổ hợp của các alleles mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu gen – kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện bởi các đặc điểm 16 về hình thái, sinh lý, hoá sinh và đƣợc đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trƣờng nhất định. Số lƣợng khác biệt nhau về gene trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gene trong vốn gene đó, thƣờng mỗi gene có nhiều hơn một allele (các gene đa hình) và số các alleles cho mỗi một gene đa hình. Sự tồn tại của các gene đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gene dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alleles khác nhau từ các gene của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gene cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng. 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền 2.2.1 Phân loại Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào đƣợc dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem nhƣ một DNA marker. Những marker có tính chất nhƣ vậy rất cần thiết vì số lƣợng của chúng lớn hơn rất nhiều so với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Bài giảng CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ): - Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP. - Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD. Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ): - Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP. - Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP. 17 Bảng 2.1 : Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary Primer-PCR DAF DNA Amplification Fingerprinting AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence-Tagged Sites 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell và ctv,1996). Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ) liên kết với một 18 locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996). RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các restriction enzyme, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bƣớc lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP. 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt ( Powell et al, 1996; Winfield et al, 1998) Thông thƣờng, trong AFLP sử dụng một cặp restriction enzyme gồm một enzyme cắt thƣờng xuyên và một enzyme cắt không thƣờng xuyên. Enzyme cắt thƣờng xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thƣờng xuyên sẽ nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt. Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản 19 ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.( Matthes et al., 1998; Karp et al., 1997) AFLP nhanh, không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thông tin di truyền phải đƣợc biết rõ để chuẩn bị primer tƣơng ứng, và AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao (Harris,1999) 2.2.5 SSR (Microsatellite) Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số 20 lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA nhƣ: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n … Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA, microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng từ 100 - 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội. 2.3 Kỹ thuật Microsatellite 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thƣờng xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,2005), là một đoạn DNA đƣợc mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lƣợng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí nào (locus), thƣờng xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện bởi PCR , sử dụng primers đƣợc thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR đƣợc chạy trên gel điện di, alleles đƣợc ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại,... 21 Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng đƣợc phát hiện bằng PCR và chúng có khuynh hƣớng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome. Hàng ngàn SSR đã đƣợc lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau. Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward; 1991). Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thƣớc tại mỗi locus là 20 - 100 bp. Microsatellite đƣợc tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome. Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 - 5.10-6, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể đƣợc xác định bằng PCR từ một lƣợng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng. 2.3.2 Tính chất Những markers này thƣờng hiện diện với mức độ cao của hiện tƣợng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự đƣợc lặp lại thƣờng đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tƣơng ứng với việc lặp lại di-, tri-, và tetranucleotide), và có thể đƣợc lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thƣờng xuyên trong bộ gene ngƣời và các loài khác, và đƣợc hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Nhƣ vậy có sự xuất hiện thƣờng xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thƣờng cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể đƣợc nhận biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tƣởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn. 22 Microsatellite thƣờng thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể đƣợc giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trƣợt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu đƣợc sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhƣng một vài đột biến có thể không đƣợc sửa chữa. Kích thƣớc của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng nhƣ là tính thƣờng xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tƣơng tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể đƣợc khuếch đại. 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dòng dƣơng tính có thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đoán trƣớc và primers đƣợc thu nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite đƣợc trải xuyên suốt genome và có thể đƣợc thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR. Primer microsatellite đặc trƣng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài. Điều 23 này có thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng có thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền đƣợc khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẩn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu; sự khuếch đại ƣu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử đƣợc ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị) ( M. J. Hayden and P. J. Sharp, 2001) Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù đƣợc khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hƣởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần đƣợc xem xét để không đƣa ra giá trị sai của alleles không giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thƣớc allele cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lƣợng hoặc sự cố trong vùng exon của genes dƣới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhƣng số vị trí khuếch đại thành công 24 trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hƣởng xấu trong trƣờng hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể đƣợc dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thƣớc, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thƣớc, khi mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thƣớc; sự ép buộc này đã đƣợc xác định nhƣng giá trị khẳng định là chƣa chuyên biệt. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thƣờng xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó. 2.3.5 Các loại Microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm 25 phân (unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage). Và quá trình trƣợt lỗi trong sao mã đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 26 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite Rất nhiều microsatellite đã đƣợc tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng, mặc dù ngƣời ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite đƣợc dùng nhƣ một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite đƣợc tìm thấy khắp nơi ở phần trƣớc vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã đƣợc tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lƣợng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trƣờng hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này đƣợc giải phóng thì gen đƣợc khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động nhƣ một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hƣởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hƣởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hƣởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Nhƣ một trình tự mang mã, microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác 27 nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hƣởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv., 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv., 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite Có 2 phƣơng pháp để phát hiện microsatellite: phƣơng pháp lai và phƣơng pháp PCR. 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai Phƣơng pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế. Trong phƣơng pháp lai có hai cách: phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phƣơng pháp nhuộm bạc.  Phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ Phƣơng pháp hiệu quả và đƣợc dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Ngƣời ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhƣng 28 ngày nay phƣơng pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít đƣợc sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém.  Phƣơng pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ) Phƣơng pháp này rẻ, không hại, nhƣng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Phƣơng pháp này đƣợc phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện đƣợc bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thƣớc chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này đƣợc gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Phƣơng pháp này có hiệu quả rất cao và đang đƣợc sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Ngƣời ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thƣớc các đoạn bằng nhau nhƣng chúng ta vẫn có thể xác định đƣợc nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả đƣợc thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định đƣợc chính xác kích thƣớc của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A… 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.4.1 Khái niệm 29 Kỹ thuật PCR đƣợc phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự. Phát minh này đã đem đến cho Mullis giải Nobel Hóa học năm 1993. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu. Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR  Mẫu DNA: Mẫu DNA đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô … 30 Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5-10 ng DNA thuần khiết. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức : - 1 OD260nm = 50 ng/ l (đối với DNA sợi kép). - 1 OD260nm = 40 ng/ l (đối với DNA sợi đơn).  Primer (mồi): Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngƣợc). Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác.  dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): Nồng độ dNTPs thƣờng đƣợc sử dụng là 20 - 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTPs thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lƣợng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm đƣợc khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ƣu cho từng phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm  Dung dịch buffer: Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động.  Taq polymerase: 31 Ban đầu, khi chƣa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase ngƣời ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhƣng không chịu đƣợc nhiệt độ lớn hơn 900 C ở giai đoạn tách hai sợi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase đƣợc phát hiện. Đây là một DNA polymerase bền với nhiệt, đƣợc cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, với enzyme này chỉ cần cho một lần Taq polymerase là đủ. Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0.5 - 5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có kh