Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố

hiên nhiên để chống nấm mốc trong thực phẩm. VD: dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit formic. Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn. Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13%, có thể kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày. Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì aflatoxin có thể chịu được nhiệt độ >100-105 0C. Nếu chiếu xạ 10KGy thì sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Dùng hấp ướt (autoclave) 1,5at trong 60 phút nhưng lại có ít giá trị ứng dụng trong thực tế. Phương pháp hấp thụ: các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic, than hoạt tính … có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hoá, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngoài qua phân. Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxy hoá khử Na2SO4, NaHSO3 1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin. Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo) hoặc trong các túi P.E có thể chứa tới 20-30 tấn ngô. Ngô có hàm lượng aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1,5 % NH3 ở nhiệt độ 320C dã làm giảm xuống còn 7ppb. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu: 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Trong quá trình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 30 mẫu ngô, bao gồm: 21 mẫu ngô được lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ An. 7 mẫu ngô được lấy tại một số cửa hàng ở thị trường Nghệ An và Hà Nội, 4 mẫu được lấy tại thị trường Đồng Nai 4 mẫu lạc lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ An và 15 mẫu lấy tại thị trường Đồng Nai 3.1.2. Các môi trường PDA: * Môi trường thạch khoai tây (PDA): 200 g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4.500 ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây. 1000 ml dịch chiết khoai tây 20 g glucoza 20 g thạch Đun cho tan chạy thạch và glucoza, thử pH, rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1 at trong 30 phút, pH = 6. 3.1.3. Môi trường Czapex – Dox (g/l): Sacaroza 30 NaNO3 3 K2HPO4 1 MgSO4.7H2O 0,5 KCL 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 Thạch 20 Nước 1lít pH = 5 – 6. Khử trùng 0,8 at/30 phút 3.1.4. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B1 NaCL tinh khiết (Trung Quốc) Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc kí lớp mỏng. NaSO3 khan (Trung Quốc). NaHCLO, Nhà máy hóa chất Việt Trì. H2O2 Công ty dược phẩm Hà Nội. Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc). Nước cất (Viện công nghệ sau thu hoạch). Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma). 3.1.5. Dụng cụ thí nghiệm: Buồng sắc kí lớp mỏng (chromatography tank), Thụy Sĩ. Đèn cực tím sóng dài 254 nm, 366 nm, Camag, Thụy Sĩ. Bản mỏng cho sắc ký 20x20 cm, Đức. Phễu chiết phân tách pha dung môi, Trung Quốc. Máy nghiền đồng thể polytron. ống hút 0,2 ml và 0,1 ml, Trung Quốc. Máy lắc, máy xay. Bình phun dung dịch lỏng có quả roa. Giấy lọc Whatman N01, chemapoli, Tiệp Khắc. Kính hiển vi olympus có gắn máy chụp ảnh, Nhật. Tủ cấy vô trùng tự động, Tủ cấy vô trùng tự động, Sanyo, Nhật Bản Máy có chân không quay, Đức Hộp petri, bình tam giác, ống đong 50ml, 100ml….. 3.2. Phương pháp: 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố aflatoxin: Tiến hành lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu của FAO [32] Cách lấy mẫu ngô bắp: lấy khoảng 50 hạt mỗi giống, ở 3 vị trí của bắp đầu, giữa, cuối, sau đó trộn đều, dàn mỏng thành hình vuông hay chữ nhật. Lấy theo kiểu đường chéo đến khi nào được 50 hạt thì dừng. Cách lấy mẫu lạc: Lạc được lấy từ các hộ nông dân trong tình trạng đã phơi khô và bảo quản trong các bao, lấy 1kg làm đại diện cho mỗi mẫu. Mỗi đại diện của từng mẫu trôn đều rồi chia tư. Từ một phần tư mẫu lại tiêp tục chia tư cho tới khi được 100 làm mẫu phân tích. Đối với các mẫu ngô thu thập từ các chợ, khối hạt ngô được trộn đều lấy 1kg làm đại diện. Một đại diện được xay nhỏ, trộn đều rồi chia tư, một phần từ đó lại được trộn đều và chia tư lấy 100g làm mẫu phân tích. 3.2.2. Phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm mốc bên trong hạt ngô; lạc. Mức độ nhiễm này được tính bằng phần trăm hạt bị nhiễm từ bên trong hạt lương thục, được tiến hành theo phương pháp phát hiện hệ nấm mốc bên trong hạt lương thực của Christensen [22]. Khử trùng hệ nấm mốc bên ngoài hạt bằng dung dịch H2O2 5% trong 6 - 7 phút (Có thể rửa bằng dung dịch NaClO 3% hoặc AgCl 1% trong 4 phút), lắc mạnh và đều sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. Để ráo hạt và đặt hạt vào hộp petri có môi trường PDA đặc để phân lập các loại nấm mốc. Mỗi đĩa đặt 10 hạt, thí nghiệm nhắc lại 3 lần. Đặt đĩa đã cấy vào tủ ấm 300 C, sau 72 giờ lấy ra quan sát. Cho tiếp vào tủ ấm theo dõi 7 - 8 ngày. Đem ra đọc kết quả. 3.2.3. Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc: Dựa trên những đặc điểm hình dạng, kích thước của nấm mốc để phân loại sơ bộ các loài nấm mốc khác nhau. Nhỏ một giọt cồn: nước theo tỷ lệ 2:1 lên lam kính, dùng que cấy mốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên, nhỏ một giọt xanh metylen, đậy lá kính lên, để khô, tiến hành soi kính. 3.2.4. Phân loại các loài nấm mốc: Các bào tử được tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này được pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc: 1:10. Một ml từ hai hay ba độ pha loãng được chọn, tùy theo mật độ của hỗn dịch ban đầu, được cho vào các hộp petri. Sau đó đun tan chảy thạch, đợi nguội đến gần 450 C rồi phân vào các hộp này, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào tử được pha loãng. Để vào tủ ấm 300 C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số lượng khuẩn lạc giới hạn riêng biệt đồng đều. Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi sử dụng tài liệu của Raper và Fennell [44]. 3.2.5. Phương pháp phân tích aflatoxin: Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko[29] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC)[20] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dung dịch NaCL 10% (50ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman N0 1. Lấy 50ml dịch lọc và tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman N0 1. 80ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết xuất bằng hai pha lỏng – lỏng với 40ml hexan (2lần). Lớp nước axeton được chiết xuất với 40ml cloroform (3lần), loại bỏ lớp nước axeton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100 ỡl cloroform, giữ ở 40C cho đến lúc tiến hành định tính và định lượng aflatoxin. 25 g Mẫu ngô( lạc) Nghiền nhỏ Ngâm 24 h(trong tủ tối) 25 ml NaCl 10% 100ml acetol Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể Lọc lấy 50 ml dịch 50ml chì axetat 10% Lọc 80ml dịch Phễu chiết 40 ml n-hexan Lấy phần dich trong Bỏ phần dịch nổi trên chlorofoom Lấy pha trên cho vào bình cầu Cất quay( cô chân không) lấy 3ml cặn ống nhót, để bay hơi lấy cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 40C Na2SO4 khan Nhắc lại 2 lần Nhắc lại 3 lần Quy trình chiết tách aflatoxin được biểu thị qua sơ đồ sau 100 ml chlorofoom Định tính aflatoxin: Dùng bơm tiêm vi lượng (microsyring) nhỏ trên sắc ký lớp mỏng 2ỡl, 6ỡl và 2 lần 10ỡl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép 2cm (từ mép dưới của phiến mỏng) và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho các vết nhỏ không có đường kính quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2, 6, 10ỡl chuẩn aflatoxin B1 với nồng độ 0,71 ng/ỡl trên cùng một phiến bản mỏng. Nhỏ 5ỡl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10ỡl) như chuẩn trong. Hệ dung môi dùng cho sắc ký bản mỏng một chiều là: cloroform : aceton 9:1. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 ỡg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3 – 5,0. Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (độ phát xạ cực đại 365nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng của aflatoxin. Thử xác minh aflatoxin: Thử với axit vô cơ : Phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trong nước, tỷ lệ 1: 2. Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có aflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều đó có thể xem như là có aflatoxin trong mẫu thử. Định lượng aflatoxin: Nếu aflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau: Nhỏ 10ỡl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới, bên phải của bản mỏng, 1,5 cm cách mép. Ở góc dưới bên trái, 1,2 và 3 cm cách mép và 1,5cm từ mép dưới của bản mỏng, nhỏ 2, 4, 6 ỡl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin. Nhỏ 6ỡl dung dịch chuẩn lên phía bên phải góc trên, 1,5cm cách mép phiến mỏng. Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1). So sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử. Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau: (ng/g hay ppb) C là nồng độ aflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phõn tớch ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – axeton (ml) V2 là thể tích hỗn hợp nước – axeton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – axeton và acetate – chỡ (ml) V4 là thể tớch dịch lọc sau khi làm sạch bằng acetate – chỡ (ml) V5 là thể tích dung dịch chiết đó bay hơi làm sạch ở chloroform trước khi làm sắc ký bản mỏng (àl) V6 là thể tớch dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (àl) m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g). 3.2.6. Quy trỡnh nuụi cấy nấm mốc Aspergillus flavus cho việc nghiờn cứu khả năng tạo aflatoxin: Các mẫu ngô đó được xác định là không có aflatoxin (theo phương pháp 3.2.5). Cân 25g ngô cho vào bỡnh tam giỏc, chộn với 3ml nước cất, lắc thật đều, khử trùng 1 atm trong 30 phỳt. Điều chế hỗn dịch của chúng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sao cho nồng độ 109 bào tử là tốt nhất.Theo phương pháp pha loóng hàng loạt ở mục (3.2.4). Số khuẩn lạc trên ml được tính theo công thức: Trong đó: C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên mỗi hộp Petri giữ lại ở nồng độ có khuẩn lạc từ 30 – 100. n1 là số đĩa giữ lại ứng với độ pha loóng đầu. n2 là số đĩa giữ lại ứng với độ pha loóng thứ 2. d là hệ số pha loóng ứng với độ pha loóng đầu. Lấy 1ml hỗn dịch trên cấy vào môi trường đó khử trựng, nuụi cấy cỏc chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus ở 28 – 300C trong 9 ngày, mỗi ngày đều lấy ra lắc. Chiết xuất aflatoxin B1 từ cỏc chủng Aspegillus flavus và Aspegillus parasiticus đó nuụi cấy (theo phương pháp 3.2.5). Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. 3.2.7. Thăm dũ khả năng giảm aflatoxin bằng các chủng aflavus không tạo độc tố: Thớ nghiệm 1: Aspergillus flavus sinh độc tố với sản lượng 331ppb được nuôi hỗn hợp với từng chủng của 8 chủng Aspegillus flavus không tạo độc tố (số khuẩn lạc của 2 chủng là 7,1.106 khuẩn lạc), nuụi cấy trên cơ chất ngô đó xỏc định là khụng cú nấm mốc và khụng cú aflatoxin B1, nuôi 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ 28 – 300C, ẩm độ 19 – 20 %, cho aflavus sinh trưởng và phát triển. Sau đó đem chiết để kiểm tra khả năng ức chế của từng chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố đối với chủng sinh độc tố. Thớ nghiệm 2: Aspergillus flavus không sinh độc tố aflatoxin B1(chủng có hiệu quả giảm độc tố cao nhất trong các chủng được thực hiện ở thí nghiệm 1), trộn vào cơ chất ngô đó xỏc định hàm lượng aflatoxin B1 là 3000ppb (theo phương pháp 3.2.5), nuôi 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ 28 – 300C, ẩm độ 19 – 20%, cho Aspergillus flavus sinh trưởng và phát triển. sau đó đem chiết để kiểm tra khả năng giảm hàm lượng aflatoxin B1 trên cơ chất ngô đó xỏc hàm lượng aflatoxin B1 là 3000ppb. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên một số mẫu ngụ: kết quả về mức độ nhiễm mốc trên một số mẫu ngô được trỡnh bày ở bảng 1 và bảng 2. Kết quả bảng 1 cho thấy ngô sau thời gian thu hoạch đó bị nhiễm mốc bờn trong hạt ngụ ở mức độ cao. 20/21 mẫu (chiếm 95% số mẫu phõn tớch) đó cú tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% - 100%, mức nhiễm trung bỡnh là 69%. 15/21 mẫu (chiếm 64% số mẫu phân tích) đó cú tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 67% - 100%, mức nhiễm trung bỡnh 85%. Cỏc loài nấm mốc nhiễm trờn cỏc mẫu ngụ thuộc cỏc chi mucor, và Aspergillus, Fusarium, penicillium. A.flavus là loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đó nhiễm trong 16/21 mẫu (76% số mẫu phõn tớch) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 2% đến 90% mức độ nhiễm trung bình là 17%. Chi Fusarium là chi nấm có rất nhiều loài có khả năng tạo các độc tố như fumonisin, Zearalenone, các trichothecen như deoxynialenol, nivalenol, T2- toxin, zearanone đã nhiễm trên các mẫu ngô khoả sát là 9/21 mẫu (42% số mẫu) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 40%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 12%. Điều này cho thấy các Fusarium có thể có khả năng nhiễm trên các mẫu ngô ngay ở giai đoạn sau thu hoạch và bảo quản không lâu. Chi Penicillium cũng có khả năng tạo độc tố như ochratoxin A, patulin, citrinin, penitrem A… đã nhiễm trong 12/21 mẫu (57% số mẫu phân tích), v ới tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 97%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 16%. So sánh mức độ nhiễm mốc giữa các mẫu ngô khảo sát ta thấy: các giống YT1, YT6, YT7, VT3, ĐL1, ĐL2, CS1 có tỷ lệ hạt nhiễm ốc cao, từ 70% đến 100%. Giống YT8 hoàn toàn không bị nhiễm mốc, các giống ĐL4, ĐL5 có tỷ lệ hạt nhiễm mốc thấp, từ 10% đến 27%. Kết quả trên cho thấy rằng những giống này có khả năng đề kháng nấm mốc. Sự nhiễm nấm mốc khác nhau giữa NN1 (tỷ lệ nhiễm 67%) và YT8 (không bị nhiễm) được thấy rõ qua ảnh 1 và 2. Ảnh 1:Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô NN1 Ảnh 2: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô YT8 B ảng 1: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô ở một số tỉnh Việt Nam STTNgô nghiên cứuĐịa điểm thu thậpTỷ lệ hạt nhiễm mốc (%)Mức độ nhiễm nấm mốc (%)MucorAspergillusFusa riumPenici lliumA. flavusA. Niger01YT1Nghệ An100100000002YT2Nghệ An10033130379703YT3Nghệ An10065000604YT4Nghệ An70302190005YT5Nghệ An520223630006YT6Nghệ An90675040307YT7Nghệ An811091940408YT8Nghệ An00000009YT9Nghệ An920273702610YT10Nghệ An43017*270011VT1Nghệ An671025259012VT2Nghệ An5304730713VT3Nghệ An87020*0333314ĐL1Nghệ An100100000015ĐL2Nghệ An1004300375716ĐL3Nghệ An703020250017ĐL4Nghệ An1001033018ĐL5Nghệ An27013130619CS1Nghệ An90090900020CS2Nghệ An82192020103021CS3Nghệ An7122917060Ghi chú:* Asspergilus parasiticus YT: Yên Thành VT: Vĩnh Thành ĐL: Đô Lương CS: Cao Sơn Mức độ nhiễm mốc trên ngô tiêu thụ ở một số tỉnh được trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy 11 mẫu ngô đã bị nhiễm mốc bên trong hạt ngô ở mức độ cao. 10/11 mẫu (95% số mẫu) đã có tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% đến 100% mức nhiễm trung bình 50%. Các loài nấm mốc nhiễm trên các mẫu ngô thuộc các chi Mucor, Aspergillus, Fusarium, Penicilium, Aspergillus flavus là loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đã nhiễm trong 9/11 mẫu (81% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% đến 97%, mức nhiễm trung bình là 31%. A.niger đã nhiễm trên các mẫu ngô khảo sát trong 8/11 (71% số mẫu phân tích) với tỷ lệ nhiễm mốc từ 3% đến 70%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 17%. Chi Fusarium đã nhiễm trên các mẫu ngô khảo sát là 7/11 mẫu (61% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 70%, mức độ nhiễm trung bình 14%. Chi Penicillium đã nhiễm trên các mẫu ngô là 5/11 mẫu (41% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 7% đến 47%, mức độ nhiễm trung bình là 13%. Điều này cho thấy việc điều tra mức nhiễm các độc tố aflatoxin và fumonisin, các trichthecen và zearanone trên các mẫu ngô khảo sát là một việc là cần thiết. Bảng 2: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô tiêu thụ ở một số tỉnh STTMẫu ngô nghiên cứuĐịa điểm thu thậpTỷ lệ hạt nhiễm mốc (%)Mức độ nhiễm nấm mốc (%)MucorAspergillusFusar iumPenici lliumA. flavusA. Niger01CBH1Đồng Nai3700037002CBH2Đồng Nai87333013202703CBH3Đồng Nai1007203704704CBH4Đồng Nai00000005CDC1Nghệ An100040630006CDC2Nghệ An430371034307CDC3Nghệ An10033205067008GLHà Nội47320023709NN1ĐH NNI670272701710NN2ĐH NNI1001030011Ngô hỗn hợp*1000971730Ghi chú:CBH: chợ Biên Hoà CDC: chợ Diễn Châu GL : Gia Lâm * :Nguồn Mộc Châu đang bán tại các cửa hàng Hà Nội Kết quả thu được từ bảng 1 và bảng 2 cho thấy: khảo sát về mức độ nhiễm nấm mốc bên trong một số mẫu ngô thu thập từ một số tỉnh phù hợp với kết quả của PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự, 2005, báo cáo kết quả định kì, dự án`DADIDA [21] 100% ngô bị nhiễm mốc với tỷ lệ 59%- 72%, tần suất nhiễm A.flavus 24%-35%. Kết quả Nguyễn Thuỳ Châu [1] công bố là 100% mẫu ngô ở dạng hạt đều bị nhiễm nấm mốc, mức độ nhiễm trung bình dao động trong khoảng 80% đến 100%, cũng như kết quả của Nguyễn Thị Thanh Trà 1998[17] công bố về ngô: 100% mẫu ngô bị nhiễm mốc, mức độ nhiễm mốc trung bình dao động 80% đến 87%. Theo Kawashima và cộng sự [39] A.flavus là loài nấm phổ biến trên ngô ở Thái Lan và không chỉ phát hiện được ở giai đoạn bảo quản mà ngay cả giai đoạn ngoài đồng. Donald và cộng sự [27] cũng đã phát hiện 211 chủng A.flavus phân lập từ các mẫu ngô ở giai đoạn thu hoạch, trong đó có 50% các loài tạo afflatoxin, Aspergillus parasiticus được phát hiện với tần suất ít hơn so với A. flavus. Một điều đáng chú ý về mức độ nhiễm nấm mốc trên mẫu ngô được khảo sát là A.niger cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Những thông báo gần đây cho thấy loài này cũng có khả năng sinh ochrratoxin A. Vì vậy cần xác định ochratoxin A trên các mẫu ngô này. Mặc dù số mẫu phân lập còn ít nhưng có thể nói rằng A.flavus là loài chính nhiễm trên ngô ở các mẫu ngô thu thập được Hà Nội, Nghệ An và Mộc Châu. Ngoài ra các chi nấm bảo quản khác Mucor, Fusarium, Penicillium… cũng nhiễm trên ngô nhưng với tỷ lệ thấp hơn. Bảng 3: Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc STTMẫu lạcĐịa điểm thu thậpTỷ lệ hạt nhiễm mốc (%)Mức độ nhiễm nấm mốc (%)MucorAspergillusNấm mốc khácA. flavusA. Niger01TB1Đồng Nai5230061602TB2Đồng Nai100261395403TB3Đồng Nai3414215004TB4Đồng Nai268601205TB5Đồng Nai8008006CSNghệ An3619010807CDC1Nghệ An480004808CDC2Nghệ An7042252809CDC3Nghệ An4801173510CBH1Đồng Nai3601330011CBH2Đồng Nai1823023012CBH3Đồng Nai2001113CBH4Đồng Nai16458114CBH5Đồng Nai161503715CBH6Đồng Nai4630002616CBH7Đồng Nai10005517CBH8Đồng Nai20211018CBH9Đồng Nai160810019CBH10Đồng Nai501510620Ghi chú: TB :Trảng Bom CS : Cao sơn CDC: chợ Diễn Châu CBH: chợ Biên Hoà Kết quả bảng 3 cho thấy mức độ nhiễm mốc bên trong hạt lạc là khá cao. 100% số mẫu phân tích bị nhiễm mốc với tỷ lệ từ 2% - 100%. Trung bình là 34% các loài nấm nhiễm trên lạc thuộc các chi Mucor, Aspergillus, và 1 số mốc khác. A.flavus sinh độc tố aflatoxin nhiễm 10/19 mẫu với tỷ lệ nhiễm mốc từ 1 – 21% trung bình là 5%. Ngoài ra trên lạc còn xuất hiện loại nấm mốc khác với 13/19 mẫu bị nhiễm (chiếm 68%) tỷ lệ nhiễm mốc từ 1 – 54%, trung bình là 14%. Kết quả trên phù hợp với kết quả dự án DADIDA của Nguyễnc Thuỳ Châu công bố 100% lạc nhiễm mốc với tỷ lệ nhiễm trung bình 45%. Ảnh 3: Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc So sánh mức độ nhiễm mốc trên ngô và lạc qua bảng 1, bảng 2 và 3 ta thấy tỷ lệ % nhiễm mốc trong tổng số mẫu lạc khoả sát cao hơn mẫu ngô, nhưng mức độ nhiễm trong hạt ngô cao hơn rất nhiều mức độ nhiễm trong hạt lạc. 4.2. Hàm lượng aflatoxin B1 của ngô ở một số tỉnh Bảng4: Hàm lượng aflatoxin B1 trên ngô ở một tỉnh STTMẫu ngô nghiên cứuĐịa điểm thu hoạchHàm lượng Aflatoxin (ppb)01YT2Nghệ AnKPHĐ02YT8Nghệ AnKPHĐ03VT1Nghệ AnKPHĐ04ĐL4Nghệ AnKPHĐ05CS2Nghệ AnKPHĐ06CBH2Đồng Nai2507CDC1Nghệ An2708GLHà NộiKPHĐ09NN1ĐHNN IKPHĐ10NN2ĐHNN I2411Ngô hỗn hợp*36Ghi chú: * Nguồn Mộc Châu đang bán tại cửa hàng tai Hà Nội. KPHĐ: Không phát hiện được. Kết quả ở bảng 4 cho thấy, trên 11 mẫu ngô mức độ nhiễm aflatoxin là 4/11 mẫu (chiếm 36% số mẫu phân tích), có hàm lượng aflatoxin từ 25ppb đến 36ppb với hàm lượng trung bình 18ppb (nằm trong giới hạn cho phép sử dụng thức ăn cho gia súc < 50ppb và FAO<100ppb . 7/11 mẫu (57% số mẫu phân tích) không bị nhiễm afflatoxin B1. 4.3. Đặc điểm phân loại chủng A.flavus và A.parasiticus đã tuyển chọn: Trong 30 mẫu ngô khảo sát, chúng tôi phân lập được 22 mẫu chủng A.flavus và A.parasiticus có đặc điểm khuẩn lạc cấu trúc vi học của nấm A.flavus và A.parasiticus, theo khoá phân loại của Raper và Fennell [44], chúng tôi đã tuyển chọn được 11/22 chủng A. flalvus và A.parasiticus (bảng 6), đại diện cho 22 A.flavus và A.parasiticus đã phân loại ở (bảng 5). Sự khác nhau về cấu trúc vi học của nấm A.flavus CBH2 thấy rõ qua ảnh 4 và ảnh 6 và A.parasiticus VT10 qua ảnh 5 và 7. Bảng 5: Đặc điểm phân loại học của các loại A.flavus và A.parasiticus phân lập trên ngô STTChủng A.flavus và A.parasiticusThể bìnhBào tử trầnBọng đỉnh giảCuống sinh bào tửHình dạngĐK (mirrco met)Hình dạngĐK (mirrco met)Hình dạngĐK (mirrco met)134567891001 02Chủng A.flavus CBH2 1-2 hàngHình cầu có gai nhẹ4-6Hình cầu hay gầu cầu25,5-36,5Sần xùi200-400Chủng A.flavus BH3 1-2 hàngHình cầu có gai nhẹ4,5-5,5Hình cầu hay gầu cầu25-30Sần xùi200-40003 04 05Chủng A.flavus NNI 1-2 hàngHình cầu có gai2.5-4,5Hình cầu30-40Sần xùi380-720Chủng A.flavus VT1 1-2 hàngHình cầu có gai3-4,5Hình cầu30-38Sần xùi400-700Chủng A.flavus VT2 1-2 hàngHình cầu có gai2,5-3,8Hình cầu35-40Sần xùi400-68006Chủng A.flavus NN2 1-2 hàngHình cầu có gai3-4,8Hình cầu25-35Sần xùi400-60007 08 09Chủng A.flavus YT6 1-2 hàngHình cầu hay gần cầu3-4Hình cầu hay chuỳ356,5-40Sần xùi300-550Chủng A. flavus YT7 1-2 hàngHình cầu hay gần cầu3-3,5Hình cầu hay chuỳ35-40Sần xùi300-500Chủng A.flavus YT9 1-2 hàngHình cầu hay gần cầu3-3,5Hình cầu hay chuỳ35-45Sần xùi300-50010 11 12Chủng A.parasiticus VT3 1 hàngHình cầu hay gần cầu2,5-3Hình câu, gần cầu hay chuy36,5-50Sần xùi250-550Chủng A. parasiticus YT10 1 hàngHình cầu hay gần cầu2,5-3,5Hình câu, gần cầu hay chuy35-50Sần xùi270-55016Chủng A.flavus GL 1-2 hàngHình cầu 3,5-6Hình cầu40-50Sần xùi600-100017 18Chủng A.flavus ĐL3 1-2 hàngHình cầu hay gần cầu3,75-7Hình cầu hay gần cầu36-60Sần xùi400-750Chủng A. flavus ĐL5 1-2 hàngHình cầu hay gần cầu3-5,5Hình cầu hay gần cầu37-52Sần xùi450-70019 20 21Chủng A.flavus DC1 1-2 hàngHình cầu 3-5Hình cầu hay gần cầu19-45Sần xùi300-450Chủng A.flavus DC2 1-2 hàngHình cầu 3-4,5Hình cầu hay gần cầu25-40Sần xùi300-400Chủng A.flavus DC3 1-2 hàngHình cầu 3,5-4,5Hình cầu hay gần cầu30-40Sần xùi320-40022 23 24Chủng A.flavus CS1 1-2 hàngHình cầu 3-5,5Hình cầu hay chuỳ25-60Sần xùi300-450Chủng A.flavus CS21-2 hàngHình cầu 2,5-5Hình cầu hay chuỳ21-50Sần xùi250-450Chủng A.flavus CS3 1-2 hàngHình cầu 2,7-4,5Hình cầu hay chuỳ30-65Sần xùi300-42025 26Chủng A.flavus hỗn hợp (Mộc Châu)1-2 hàngHình cầu 2,5-4Hình cầu, gần cầu hay chuỳ30-65Sần xùi400-650Chủng A.flavus CS3 1-2 hàngHình cầu 2,5-4Hình cầu, gần cầu hay chuỳ30-60Sần xùi400-600Từ 30 mẫu Ngô, chúng tôi đã phân lập được 22 mẫu phân lập có đặc điểm khuẩn lạc, cấu trúc vi học của loài A.flavus và loài A.parasiticus theo khoá phân loại của Raper và Fennell. Ảnh 4: Hình thái bào tử Aspergillus flavus CBH2 Ảnh 5: Hình thái bào tử Aspergillus parasiticus YT10 ảnh 6: Hình thái nấm mốc Aspergillus flavus CBH2 Ảnh 7: Hình thái nấm mốc Aspergillus parasiticus YT10 4.3.1. Chủng A.flavus CBH2 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8 đến 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 7 cm, hạch nấm màu đen, khuẩn lạc màu xanh vàng không chuyển màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc nhăn nheo, có màu hồng nhạt. Cuống sinh bào tử dài 200-400 àm, 1 hoặc 2 hàng thể bình. Bọng đỉnh giá hình cầu, gần cầu đường kính 25,5-36,5àm. 4,3,2, Chủng A.flavus NN1 (Đại học Nông nghiệp I) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 7,1cm. Hạch nấm màu đen, khuẩn lạc màu xanh vàng khong chuyển sàng màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc có màu hơi hồng, nhăn nheo. Cuống sinh bào tử sần xùi, dài 380-720àm, bọng đỉnh giá hình cầu có đường kính 40àm , Một hoặc hai thể bình, bào tử hình cầu, có gai, đường kính 2,5-4,5àm. 4.3.3. Chủng A.flavus NN2(Đại học Nông nghiệp 1) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,5 cm hạch nấm nhiều mầu đen, khuẩn lạc màu xanh nâu, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc màu hơi hồng, nếp nhăn ít. Cuống sinh bào tử 400-600àm, sần xùi, 1 hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu đường kính 25-35 àm, bào tử hình cầu có gai, đường kính 3-3,8àm . 4.3.4 Chủng A.flavus YT6 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,5 cm, hạch nấm nhiều, mầu đen, khuẩn lạc có màu xanh lá cây. Mặt trái khuẩn lạc không đổi màu. Cuống sinh bào tử sần xùi, dài 300-500àm, 1 hàng thể bình, bào tử không gai, đường kính 3-4àm, có bọng đỉnh giá hình cầu, gần cầu hoặc chuỳ, đường kính 36,5-50àm. 4.3.5 Chủng A.parasiticus VT3 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc5,6 cm, hạch nấm nhiều, màu đen, khuẩn lạc màu xanh lá cây hoặc vàng. Mặt trái khuẩn lạc không đổi màu. Cuống sinh bào từ nhẵn, dài 250-500àm, Một hàng thể bình duy nhất, bào tử không có gai, đường kính 2,5-3àm, bọng đỉnh giá hình cầu, hình chuỳ hoặc gần cầu, đường kính 36,5-50àm. 4.3.6. Chủng A .flavus YT5 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,9 cm, hạch nấm nhiều, khuẩn lạc màu vàng hơi nâu, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc có màu hồng chạy theo hình phóng xạ, nhăn nheo, cuống sinh bào tử sần xùi dài 350-500àm, 1 hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu đường kính 25-65 àm, bào tử có gai hình cầu đường kính 4-5,5àm. 4.3.7. Chủng A.flavus GL Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,4cm, hạch nấm ít, có màu đen, khuẩn lạc có màu xanh hơi vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc nhăn nheo, hơi hồng. Cuống sinh bào tử sù xì dài 600-1000àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hính cầu hoặc gần cầu đường kính 40-50àm, nhiều bào tử có gai, hình cầu, đường kính 3,5-6àm. 4.3.8. Chủng A.flavus ĐL3 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,8cm, hạch nấm màu đen, khuẩn lạc có màu xanh vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Cuống sinh bào tử dài 400-750àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu hoặc gần cầu, bào tử hình cầu hoặc gần cầu, đường kính 3,75-7àm. Mặt trái khuẩn lạc có nếp nhăn màu hồng nhạt chạy theo hình phóng xạ. 4.3.9. Chủng A.flavus CDC1 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,8cm, có hạch nấm, khuẩn lạc màu xanh vàng, không chuyển sàng màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc màu hồng chạy theo hình phóng xạ, nhăn nheo. Cuống sinh bào tử sần xùi, dài 300-450àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu hoặc gần cầu, đường kính 19-45 àm, bào tử có gai, hình cầu có đường kính 3-5àm. 4.3.10 Chủng A.flavus CS1 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 5,8 cm, hạch nấm ít, màu đen , khuẩn lạc màu xanh hơi vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc màu hồng nhăn nheo.Cuống sinh bào tử sần xùi dài 250-600mi mét, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu hoặc gần cầu, đường kính 19-45 mi mét, bào tử có gai, hình cầu có đường kính 3-5,5 mi mét. 4.3.11. Chủng A.flavus hỗn hợp (Ngô hỗn hợp Mộc Châu) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 7 cm, hạch nấm màu đen, khuẩn lạc màu xanh hơi vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Cuống sinh bào tử sần xùi dài 400-650àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình chuỳ hoặc hình gần cầu, đường kính 30-65àm, bào tử có gai, hình cầu có đường kính 2,5-4àm. Mặt trái khuẩn lạc nhăn nheo không có màu hồng. Kết quả ở bảng 6 cho thấy, mặc dù chủng A.flavus và A.parasiticus khác nhau ở kích thước khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc và bọng đỉnh giá, nhưng đều phù hợp với những đặc điểm trong khoá phân loại nấm mốc A.flavus và A. parasiticus của Raper và Fennell. Ảnh 8 và ảnh 9 cho thấy sự khác nhau về đặc điểm khuẩn lạc giữa chủng A.flavus CBH2 và chủng A.parasiticus VT3 Bảng 6: Một số đặc điểm phân loại A.flavus và A.parasiticus phân lập trên ngô đặc trưng nhất trong 22 mẫu đã phân lập ở bảng 5. STTChủng A. flavus và A. paraciticus Thể bìnhKhuẩn lạcBào tử trầnBọng đỉnh giáCuống sinh bào tửĐK(cm)Màu sắcHình dạngĐK(àm)Hình dạngĐK(àm)Hình dạngĐK(àm)123456789101101Chủng A. flavus BH21-2 hàng7Xanh vàngHình cầu có gai nhẹ4 – 6Hình cầu có gai nhẹ25,5 – 36,5Sần xùi200 – 40002Chủng A. flavus NN11-2 hàng7,1Xanh vàngHình cầu có gai 2,5 – 4,5Hình cầu có gai nhẹ30 – 40Xù sì380 – 72003Chủng A. flavus NN21-2 hàng,5Xanh nâuHình cầu có gai 4 – 4,8Hình cầu có gai nhẹ25 – 35Xù sì400 – 60004Chủng A. flavus YT61-2 hàng6,5Xanh vàngHình cầu hay gần cầu 3 – 4Hình cầu có gai nhẹ36,5 – 40Sần xùi300 – 55005Chủng A. flavus VT31-2 hàng5,6Xanh lá câyHình cầu hay gần cầu 2,5 – 3Hình cầu có gai nhẹ36,5 – 40Xù sì250 – 50006Chủng A. flavus YT51-2 hàng6,9Xanh hơi nâuHình cầu 4 – 5,5Hình cầu có gai nhẹ25 – 65Xù sì350 – 50007Chủng A. flavus GL71-2 hàng6,4Xanh hơi vàngHình cầu 3,5 – 6Hình cầu có gai nhẹ40 – 50Xù sì600 – 100008Chủng A. flavus ĐL31-2 hàng6,8Xanh vàngHình cầu hay gần cầu3,7 – 7Hình cầu có gai nhẹ36 – 60Xù sì400 – 75009Chủng A. flavus DC11-2 hàng6,8Xanh vàngHình cầu hay gần cầu3 – 5Hình cầu có gai nhẹ19 – 45Xù sì300 – 45010Chủng A. flavus CS11-2 hàng5,8Xanh vàngHình cầu hay chuỳ3 – 5,5Hình cầu có gai nhẹ25 – 60Xù sì250 – 60011Chủng A. flavus ngô hỗn hợp1-2 hàng7Xanh vàngHình cầu hay chuỳ2,5 – 4Hình cầu có gai nhẹ30 – 65Xù sì400 – 650  PAGE  Ảnh 8: Hình thái khuẩn lạc Aspergillus flavus CBH2 ảnh 9: Hình thái khuẩn lạc Aspergillus parasiticus YT10 4.4. Khả năng tạo độ tố aflatoxin của một số chủng A.flavus và A.paraciticus đã tuyển chọn Kết quả ở bảng 7 cho thấy, 2/11 chủng A.flavus và A.paraciticus (chiếm 18% số mẫu phân tích) có khả năng tạo aflatoxin với sản lượng trong khoảng 100-331ppb, trung bình là 216 ppb, 9/11 chủng A.flavus và A.paraciticus không có khả năng tạo aflatoxin (82% số mẫu phân tích) . So sánh kết quả này với kết quả của Nguyễn Hương Trà-1995 [16] chủng A.flavus và A.paraciticus mà Nguyễn Thị Hương Trà phân tích cũng như kết quả của Kawashima và cộng sự [39] phân lập từ ngô. Theo Kawashima và cộng sự(1990) thì khả năng tạo độc tố aflatoxin của các chủng A.flavus phân lập từ ngô Thái Lan dao động từ 2461 ng/g đến 32446 ng/g. Kết quả khác biệt trên cho phép kết luận: yếu tố sinh thái như nhiệt độ, độ ẩm, vùng đất... Đã đóng vai trò quan trọng trong việc xuất hiện các chủng A.flavus và A.paraciticus sinh độc tố và không sinh độc tố. Bảng 7: Khả năng tạo độc tố aflatoxin ở một số chủng A.flavus và A.paraciticus SỐ TTTÊN CHỦNG A.FLAVUS VÀ A.PARACITICUSĐỊA ĐIỂM THU HOẠCHSẢN LƯỢNG AFLATOXIN B1(PPB)1Chủng A.flavus CBH2Đồng Nai1002Chủng A.flavus NN1ĐH NNIKPHĐ3Chủng A.flavus YT6Nghệ AnKPHĐ4Chủng A.flavus NN2ĐH NNI3315Chủng A.flavus CS1Nghệ AnKPHĐ6Chủng A.flavusYT5Nghệ AnKPHĐ7Chủng A.flavus GLHà NộiKPHĐ8Chủng A.flavus DC1Nghệ AnKPHĐ9Chủng A.flavus VT3Nghệ AnKPHĐ10Chủng A.flavus ĐL3Nghệ AnKPHĐ11Chủng A.flavus hỗn hợpMộc ChâuKPHĐGhi chú: KPHĐ : không phát hiện được. 4.5. Tác dụng giảm độc tố aflatoxin trên ngô bằng sử dụng một số loài nấm có tính chất đối kháng với aflavus có khả năng tạo aflatoxin : 4.5.1. Khả năng giảm sản lượng aflatoxin bằng các chủng A.flavus, A.paraciticus và Tricoderma không có khả năng tạo độc tố: Việc sử dụng các chủng nấm không có hại cho con người mà lại có khả năng giảm tạođộc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Biện pháp phòng trừ nấm mốc độc bằng các chủng đối kháng căn cứ vào những đặc điểm di truyền học (trao đổi chất, tự phân đôi nhân, đột biến, tiết enzym có tác dụng thuỷ phân ...). Các chủng nấm mốc có tác dụng đối kháng này cần đảm bảo tính an toàn thực phẩm không độc hại với con người. Do đó để giảm độc tố aflatoxin trên ngô, chúng tôi đã lấy các chủng A.flavus và A.paraciticus không tạo độc tố và chủng Tricoderma làm đối tượng thí nghiệm. Bảng 8 : Hiệu quả giảm độc tố aflatoxin trên ngô bằng các chủng A. flavus không có khả năng sinh độc tố: SỐ TTCÔNG THỨC THÍ NGHIỆMSẢN LƯỢNG AFLATOXIN (PPB)HIỆU QUẢ GIẢM AFLATOXIN (%)Đối chứng A.flavus NN2331 1A.flavus GL + A.flavus NN25982A.flavus NN1+ A.flavus NN214953A.flavus YT6 + A.flavus NN259824A.flavus YT5 + A.flavus NN259825A.flavus CS1 + A.flavus NN259826A.flavus DC1 + A.flavus NN285747A.flavus hỗn hợp (Mộc Châu) + A.flavus NN289738A.flavus ĐL3 + A.flavus NN2100709Chủng tricoderma +A.flavus NN2 2372810A.flavus VT3 + A.flavus NN2330 0 Kết quả ở bảng 8 cho thấy, việc nuôi cấy phối hợp các loài A.flavus không sinh độc tố với A.flavus sinh độc tố đã làm giảm sản lượng afalatoxin một cách đáng kể từ 331ppb xuống còn 5ppb đến100ppb tức là hiệu quả giảm sản lượng aflatoxin đạt 70-98%. Trong số các chủng khảo sát có hai chủng A. flavus không sinh độc tố phân lập từ ngô GLvà NN1 đã có tác dụng ức chế sự phát triển của các nấm sản sinh aflatoxin và quá trinh tạo aflatoxin của nấm A. flavus sinh độc tố, đạt hiệu quả giảm sản lượng aflatoxin cao nhất theo thứ tự là 98% và 95%. 4.5.2. Ảnh hưởng của số lượng nấm không có khả năng sinh độc tố đến hàm lượng aflatoxin trong ngô : Bảng 9: Hiệu quả giảm độc tố aflatoxin trên cơ chất ngô bằng chủng A. flavus GL không có khả năng sinh tạo độc tố SỐ KHUẨN LẠC ĐƯỢC DỤNG NUÔI CẤY (KL/ML)HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1 (PPB)HIỆU QUẢ GIẢM ĐỘC TỐ(%)TRƯỚC XỬ LÝSAU XỬ LÝ7,2.10630001410533 x 7,2.1063000355895 x 7,2.106300025492 Kết quả ở Bảng 9 cho thấy, hiệu quả giảm độc tố aflatoxin tăng tỉ lệ thuận với số bào tử A.flavus không sinh độc tố cho vào môi trường cơ chất chứa 3000 ppb aflatoxin. Điều này đã chứng tỏ luận điểm của Petter Cotty là đúng đắn, tác giả đã chứng minh rằng chủng không sinh độc tố aflatoxin đã có một loại enzym nào đó có khả năng phân huỷ aflatoxin do chủng A. flavus tạo ra trong môi trường nuôi cấy. Tất cả những vấn đề trên cần được làm sáng tỏ trong thời gian tới vì nó có ý nghĩa quan trọng trong việc kìm chế và khử độc tố aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Mặc dù hiệu quả khử aflatoxin B1 chưa đạt đến mức tuyệt đối, nhưng nó có tác dụng khử độc tố bằng cách sử dụng một số loài nấm có tính đối kháng với aflavus có khả năng tạo aflatoxin đã được chứng minh và có kết quả cụ thể. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận: 1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu ngô lấy ở Ngệ An, và thị trường Gia Lâm- Hà Nội.20/21 mẫu ngô ở Ngệ An bị nhiêm mốc (chiếm 95% số mẫu phân tích) có tỷ lệ nhiễm mốc từ 10% đến 100% trung bình là 69%. 10/11 mẫu ngô thu thập tại thị trường Ngệ An, Đồng Nai và thị trường Hà Nội nhiễm mốc (chiếm 95% số mẫu phân tích) có tỷ lệ nhiễm mốc từ 10% đến 100% mức nhiễm trung bình là 50%. Mức độ nhiễm nấm trên 19 mẫu lạc thu thập ở Nghệ An và Đồng Nai là 100% với tỷ lệ nhiễm mốc tư 2% đến 100%, mức nhiễm trung bình là 34%. 2. Các loài nấm chính nhiễm trên ngô là Aspergillus flavus, Aspergillus niger và penicillium. Trên lạc là các loại nâm Aspergillus flavus, mucor và số ít mốc khác. 3. 4/11 mẫu ngô (25% số mẫu phân tích) đẫ nhiễm aflatoxin với hàm lượng từ 25ppb đến 36 ppb. 4. Phân lập được 22 chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, đã sắp xếp thành 11 chủng có đặc điểm khuẩn lạc, cấu trúc vi học khác nhau. 5. 9/11 chủng Aspergillus flavus và Aspergillus phân lập không sinh độc tố, còn lại 2 chủng sinh độc với hàm lượng 100ppb và 331ppb. 6. Các chủng Aspergillus flavus không sinh độ tố aflatoxin có khả năng giảm sản lượng của chủng Aspergillus flavus sinh độc tố từ 331 xuống còn 5ppb dến 100ppb. Nấm không có khả năng sinh độc tố có khả năng giảm hàm lượng aflatoxin trong ngô đã nhiễm độc tố. 5.2. Đề nghị 1. Việc phát hiện một tỷ lệ cao ngô trước thu hoạch đã nhiễm mốc, đặc biệt là Aspergillus cho ta thấy công tác sơ chế ngô (tẽ hạt, làm khô, đóng gói) có ý nghĩa rất quan trọng. Vì theo kết quả nghiên cứu của nhiều nước, nếu ngô không kịp làm khô sau 3 đến 6 ngày độc tố nấm sẽ tăng lên nhanh chóng. Vì vậy cần giới thiệu cho bà con nông dân phương pháp sấy thuận lợi khi thu hoạch ngô, cũng như việc bảo quản ngô, lạc sau thu hoạch. 2. Việc sử dụng môt số loại nấm có tính đối kháng với có khả năng tạo độc tố cần được nghiên cứu thêm để có thể ứng dụng vào thực tiễn phòng trừ aflatoxin trên nông sản bằng phương pháp sinh học. TÀI LIỆU THAM KHẢO I/- Tiếng việt: 1. Nguyễn Thuỳ Châu, Lê Hữu Hiếu , Trương Thanh Bình, Cao Văn Hùng, Vũ Xuân Dũng và Lê Văn Trường(1997). Nghiên cứu mức độ nhiễm mốc sinh độc tố trên ngô - biện pháp phòng trừ. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994-1995, XB Nông Nghiệp. Bộ nông nghiệp và pháp triển nông thôn, trang 200-2003. 2.Nguyễn Thuỳ Châu(1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố Mycotoxin) ngô, gạo ở Việt Nam và biện pháp phòng trừ Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học. Bộ giáo dục và đào tạo , Trường Đại học khoa học tự nhiên tr 138. 3.Nguyễn Thuỳ Châu, Lê Doãn Diên, Nguyễn Hoà Bình, Nguyễn Mỹ Hà, Vũ Xuân Diên (1995). Mức độ nhiễm aflatoxin ở một số tỉnh ở Việt Nam. Sử dụng công nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản thu hoạch. XB Nông nghiệp. 4.Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm. Độc tố của vi nấm- Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật 2: trang 82- 83. 5.Đậu Ngọc Hào (1995). Thức ăn nhiễm nấm gây chết vịt tại trung tâm vịt giống Đại Xuyên- tạp chí chăn nuôi số 2 (5)/1995 trang 47 –48. 6.Đậu Ngọc Hào, Nguyễn Thị Thuận(1994), nghiên cứu ứng dụng một vài biện pháp sinh học, hoá học phòng chống nấm mốc cho ngô và khô lạc sử dụng làm thức ăn cho gia súc-Tạp chí khoa học và kỹ thuật thú y, tập I, số 4. 7.Đậu Ngọc Hào(6/1993)kết quả nghiên cứu phương pháp sắc kí lớp mỏng xác định aflatoxin trong thức ăn gia súc gia cầm. Tạp chí nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, trang 228- 230. 8.Đậu Ngọc Hào(1993), Sử dụng các hợp chất Amin và NaHSO3 làm giảm hoạt tính aflatoxin B1 trong ngô hạt và khô dầu lạc bị nhiễm nấm mốc. Kết quả nghiên cứu khoa học khoa chăn nuôi thú y. 9.Đậu Ngọc Hào(1992), Thức ăn nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin của chúng đối với gà công nghiệp- Tạp chí nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, 9,trang345-348. 10.Đậu Ngọc Hào, Nguyễn Thị Thuận , Đào Tú Khánh- một số loài nấm mốc được phát hiện trong thức ăn gia cầm. Công trình nghiên cứu khoa học Viện thú y Quốc gia, 1990-1991. 11.Đậu Ngọc Hào(1986). Nghiên cứu phát hiện các đặc tính nấm mốc bằng phương pháp vi sinh vật học- Tạp chí khoa học và kỹ thuật thú y 6,9-14. 12.Đào Thị Hảo- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của aflatoxin và chất chống aflatoxin đối với chăn nuôi gà công nghiệp tại Trung tâm chăn nuôi gia cầm Thụy Phương- Viện chăn nuôi- Luận án thạc sĩ nông nghiệp-Viện khoa học và kỹ thuật nông nghiệp-1995. 13.Lê Hữu Hiếu, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Thuỳ Châu(1995). Xác định thành phần giống nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trong ngô hạt sau thu hoạch. Kết quả nghiên cứu đề tài khoa học cấp Nghành. Bộ nông nghiệp và pháp triển nông thôn- Viện công nghệ sau thu hoạch. 14.Đặng Hồng Miên(1982). Nấm mốc trên một số sản phẩm công nông nghiệp. Phương pháp khử và biện pháp phòng chống. 15.Bản dịch của Đặng Hồng Miên, NXB khoa học kỹ thuật: Moreau Claude (1980). 16.Nguyễn Thị Hương Trà(1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và khả năng tạo aflatoxin trên ngô ở một số tỉnh miền Bắc Việt nam- luận án tốt ngiệp cử nhân sinh học, Trường đại hoạc khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội. 17.Nguyễn Thị Thanh Trà(1998), khảo sát sự nhiễm nấm Aspergillus và aflatoxin trên một số giống ngô lai và ngô địa phương ở vùng Gia Lâm –Hà Nội và vùng phụ cận-Luận án tốt nghiệp chuyên ngành bảo quản chế biến, Trường Đại Nông nghiệp I -Hà nội. 18.Nguyễn Phùng Tiến(1983), Nấm môc trên một số sản phẩm thực phẩm- luận án Phó tiến Sỹ y học, Viện sinh học dịch tễ Hà Nội. 19.Tiêu chuẩn Việt nam 5617-1991. Phương pháp xác định aflatoxin ở ngũ cốc. 20.Nguyễn Thị Hồng Hà, nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô ở một số tỉnh và khả năng phòng chống 21.Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự, Kiểm soát aflatoxin trên ngô và lạc có sử dụng các biên pháp xử lý thích ứng. II/. Tiếng anh: 1.AOAC(1990), Official methods of analysis. Carnaghan, R.B.A Hartlay, R.D., and Okelly, J.Toxicity va fluorescence properties of the aflatoxin. Nature(lond), 200:1101. 2.Christensen Clyde, M.Kaufmann Henry(1969). Grain Storage, Mineapolis, University of Minesota Press. 3.Coker R.D Jewers k.Jones B.D .1988: The treatment of the aflatoxin contamination. Tropical Science 30:125-136.1985. 4.Coker R.D Jewers k.Jones B.D- the destruction of aflatoxin by ammonia:practical possibilities. Tropical Science 41:89-13. 5.Coker R.D Jewers k.Jones B.D(1998) , aflatoxin control and detoxinfication. Tropical Science 41:89-13. 6.Dian-Sheng Wang, Yoshitsugu Sugiura,Yoshio Veno, Pravitr buddhanont and Maitue Suttafit(1993), A linuted survey for the nature occurrence of fumonisin in Thailand, Thai j.Toxicolony 42-43. 7.Donald and Pieter (1994)- the contamination of A.flavus in maize in the preharvest stage. Symposium of toxic microogarnism in the US. 8.De long, H., Beerthus, R.K Vles, R.O., Barret, CB., and Ord, W.O.(1962), investigation of the factor in groundnut meal responsible for Turkey disease Biochem. Biophys. Acta, 65:548-551. 9.Doronina, O. and Makshimenko, k., (1984)-Analytical methods of detection, identification, aquatitive determination of aflatoxin in foodstuff and fodder, FAO/ UNEP / USSR International training course “Training activities on food contamination control and monitoring with special reference to mycotoxin” Moscow. MỤC LỤC  TOC \H \Z \T "2,2,3,3,4,4,5,5"  HYPERLINK \L "_TOC135887038" PHẦN I:  PAGEREF _TOC135887038 \H 1  HYPERLINK \L "_TOC135887039" PHẦN MỞ ĐẦU  PAGEREF _TOC135887039 \H 1  HYPERLINK \l "_Toc135887040" 1.1.Đặt vấn đề:  PAGEREF _Toc135887040 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc135887041" 1.2.Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:  PAGEREF _Toc135887041 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc135887042" 1.2.1.Mục tiêu nghiên cứu:  PAGEREF _Toc135887042 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc135887043" 1.2.2.Nội dung nghiên cứu:  PAGEREF _Toc135887043 \h 3  HYPERLINK \L "_TOC135887044" PHẦN II:  PAGEREF _TOC135887044 \H 4  HYPERLINK \L "_TOC135887045" TỔNG QUAN TÀI LIỆU  PAGEREF _TOC135887045 \H 4  HYPERLINK \l "_Toc135887046" 2.1. Hệ nấm mốc trên lương thực:  PAGEREF _Toc135887046 \h 4  HYPERLINK \l "_Toc135887047" 2.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng:  PAGEREF _Toc135887047 \h 4  HYPERLINK \l "_Toc135887048" 2.1.2. Hệ nấm mốc bảo quản:  PAGEREF _Toc135887048 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc135887049" 2.2. Đại cương về độc tố nấm:  PAGEREF _Toc135887049 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc135887050" 2.3. Độc tố aflatoxin:  PAGEREF _Toc135887050 \h 7  HYPERLINK \l "_Toc135887051" 2.3.1. Tính chất hoá lý:  PAGEREF _Toc135887051 \h 8  HYPERLINK \l "_Toc135887052" 2.3.2. Các phương pháp phân tích:  PAGEREF _Toc135887052 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc135887053" 2.3.2.1. Các phương pháp sinh học:  PAGEREF _Toc135887053 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc135887054" 2.3.2.2. Phương pháp hoá học:  PAGEREF _Toc135887054 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc135887055" 2.3.3. Sự tạo aflatoxin do các nấm mốc:  PAGEREF _Toc135887055 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc135887056" 2.3.4. Sự nhiễm aflatoxin ở các ngũ cốc ở ngoài đồng:  PAGEREF _Toc135887056 \h 12  HYPERLINK \l "_Toc135887057" 2.3.5. Sự nhiễm aflatoxin trong thực phẩm:  PAGEREF _Toc135887057 \h 12  HYPERLINK \l "_Toc135887058" 2.3.6. Độc tính của aflatoxin.  PAGEREF _Toc135887058 \h 13  HYPERLINK \l "_Toc135887059" 2.3.6.1. Tác động lên tế bào:  PAGEREF _Toc135887059 \h 13  HYPERLINK \l "_Toc135887060" 2.3.6.2 Tác động lên động vật:  PAGEREF _Toc135887060 \h 14  HYPERLINK \l "_Toc135887061" 2.3.6.3. Tác động ở người  PAGEREF _Toc135887061 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc135887062" 2.3.7. Giới hạn aflatoxin cho phép sử dụng:  PAGEREF _Toc135887062 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc135887063" 2.4. Vấn đề khử nhiễm các mycotoxin:  PAGEREF _Toc135887063 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc135887064" 2.4.1. Vấn đề phòng ngừa:  PAGEREF _Toc135887064 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc135887065" 2.4.2. Giảm hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sinh học:  PAGEREF _Toc135887065 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc135887066" 2.4.3. Biện pháp phân tách vật lý:  PAGEREF _Toc135887066 \h 22  HYPERLINK \l "_Toc135887067" 2.4.5. Các phương pháp khử độc tố bằng hoá chất:  PAGEREF _Toc135887067 \h 24  HYPERLINK \L "_TOC135887068" PHẦN III:  PAGEREF _TOC135887068 \H 27  HYPERLINK \L "_TOC135887069" VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  PAGEREF _TOC135887069 \H 27  HYPERLINK \l "_Toc135887070" 3.1. Vật liệu:  PAGEREF _Toc135887070 \h 27  HYPERLINK \l "_Toc135887071" 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu:  PAGEREF _Toc135887071 \h 27  HYPERLINK \l "_Toc135887072" 3.1.2. Các môi trường PDA:  PAGEREF _Toc135887072 \h 27  HYPERLINK \l "_Toc135887073" 3.1.3. Môi trường Czapex – Dox (g/l):  PAGEREF _Toc135887073 \h 27  HYPERLINK \l "_Toc135887074" 3.1.4. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B1  PAGEREF _Toc135887074 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc135887075" 3.2. Phương pháp:  PAGEREF _Toc135887075 \h 29  HYPERLINK \l "_Toc135887076" 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố aflatoxin:  PAGEREF _Toc135887076 \h 29  HYPERLINK \l "_Toc135887077" 3.2.2. Phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm mốc bên trong hạt ngô; lạc.  PAGEREF _Toc135887077 \h 29  HYPERLINK \l "_Toc135887078" 3.2.3. Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc:  PAGEREF _Toc135887078 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc135887079" 3.2.4. Phân loại các loài nấm mốc:  PAGEREF _Toc135887079 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc135887080" 3.2.5. Phương pháp phân tích aflatoxin:  PAGEREF _Toc135887080 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc135887081" 3.2.6. Quy trỡnh nuụi cấy nấm mốc Aspergillus flavus cho việc nghiên cứu khả năng tạo aflatoxin:  PAGEREF _Toc135887081 \h 34  HYPERLINK \l "_Toc135887082" 3.2.7. Thăm dũ khả năng giảm aflatoxin bằng các chủng aflavus không tạo độc tố:  PAGEREF _Toc135887082 \h 35  HYPERLINK \L "_TOC135887083" PHẦN III:  PAGEREF _TOC135887083 \H 37  HYPERLINK \L "_TOC135887084" KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  PAGEREF _TOC135887084 \H 37  HYPERLINK \l "_Toc135887085" 4.1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên một số mẫu ngô:  PAGEREF _Toc135887085 \h 37  HYPERLINK \l "_Toc135887086" 4.2. Hàm lượng aflatoxin B1 của ngô ở một số tỉnh  PAGEREF _Toc135887086 \h 45  HYPERLINK \l "_Toc135887087" 4.3.1. Chủng A.flavus CBH2  PAGEREF _Toc135887087 \h 51  HYPERLINK \l "_Toc135887088" 4,3,2, Chủng A.flavus NN1 (Đại học Nông nghiệp I)  PAGEREF _Toc135887088 \h 51  HYPERLINK \l "_Toc135887089" 4.3.3. Chủng A.flavus NN2(Đại học Nông nghiệp 1)  PAGEREF _Toc135887089 \h 51  HYPERLINK \l "_Toc135887090" 4.3.4 Chủng A.flavus YT6  PAGEREF _Toc135887090 \h 51  HYPERLINK \l "_Toc135887091" 4.3.5 Chủng A.parasiticus VT3  PAGEREF _Toc135887091 \h 52  HYPERLINK \l "_Toc135887092" 4.3.6. Chủng A .flavus YT5  PAGEREF _Toc135887092 \h 52  HYPERLINK \l "_Toc135887093" 4.3.7. Chủng A.flavus GL  PAGEREF _Toc135887093 \h 52  HYPERLINK \l "_Toc135887094" 4.3.8. Chủng A.flavus ĐL3  PAGEREF _Toc135887094 \h 52  HYPERLINK \l "_Toc135887095" 4.3.9. Chủng A.flavus CDC1  PAGEREF _Toc135887095 \h 53  HYPERLINK \l "_Toc135887096" 4.3.10 Chủng A.flavus CS1  PAGEREF _Toc135887096 \h 53  HYPERLINK \l "_Toc135887097" 4.3.11. Chủng A.flavus hỗn hợp (Ngô hỗn hợp Mộc Châu)  PAGEREF _Toc135887097 \h 53  HYPERLINK \l "_Toc135887098" 4.5. Tác dụng giảm độc tố aflatoxin trên ngô bằng sử dụng một số loài nấm có tính chất đối kháng với aflavus có khả năng tạo aflatoxin :  PAGEREF _Toc135887098 \h 58  HYPERLINK \l "_Toc135887099" 4.5.1. Khả năng giảm sản lượng aflatoxin bằng các chủng A.flavus, A.paraciticus và Tricoderma không có khả năng tạo độc tố:  PAGEREF _Toc135887099 \h 58  HYPERLINK \l "_Toc135887100" 4.5.2. Ảnh hưởng của số lượng nấm không có khả năng sinh độc tố đến hàm lượng aflatoxin trong ngô :  PAGEREF _Toc135887100 \h 59  HYPERLINK \L "_TOC135887101" PHẦN V:  PAGEREF _TOC135887101 \H 61  HYPERLINK \L "_TOC135887102" KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  PAGEREF _TOC135887102 \H 61  HYPERLINK \l "_Toc135887103" 5.1. Kết luận:  PAGEREF _Toc135887103 \h 61  HYPERLINK \l "_Toc135887104" 5.2. Đề nghị  PAGEREF _Toc135887104 \h 61  HYPERLINK \L "_TOC135887105" TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _TOC135887105 \H 63  HYPERLINK \L "_TOC135887106" LỜI CẢM ƠN  PAGEREF _TOC135887106 \H 66