Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN VĂN NAM ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Khóa : 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ISOLATION, PURIFICATION AND CHARTERIZATION OF PROTEASE FROM THE HEPATOPANCREAS AND HEADS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Graduation thesis Major : Biotechnology Advisor: Student: Dr. NGUYEN TIEN THANG NGUYEN VAN NAM Ms. NGUYEN LE HA Term : 2003 – 2007 HCMC, 08/2007 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại viện. Cô Nguyễn Lệ Hà, người đã tận tình hướng dẫn giải đáp những thắc mắc của tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy Bùi Minh Trí và các anh chị cán bộ nghiên cứu của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi thực tập nghiên cứu đề tài tại trung tâm. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài. Các bạn thực tập cùng phòng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ rất nhiều trong quá trình nghiên cứu đề tài. Con cảm ơn cha me, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành trang cho con bước vào đời. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007. “TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Hội đồng giáo viên hƣớng dẫn:  PGS-TS. Nguyễn Tiến Thắng.  Ths. Nguyễn Lệ Hà. Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease. Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ƣu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100. Xác định trọng lƣợng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris- HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 47oC, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... IV TÓM TẮT KHÓA LUẬN ....................................................................................... V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ IX DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................... X DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................ XI Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ........................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME ............................................................. 3 2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme .............................................. 3 2.1.2. Định nghĩa về enzyme ............................................................................... 4 2.1.3. Cấu tạo phân tử ......................................................................................... 4 2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại ............................................................... 6 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme .......................................... 6 2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM ............................... 8 2.2.1. Giới thiệu về tôm ....................................................................................... 8 2.2.2. Khái quát protease .................................................................................. 10 2.2.2.1. Định nghĩa protease ......................................................................... 10 2.2.2.2. Protease của tôm .............................................................................. 11 2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc .............. 12 a). Nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................ 12 b). Nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................................ 13 2.2.3. Ứng dụng của protease ........................................................................... 14 2.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU ...................................................................................................................... 15 2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. ................................................................. 15 2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme ............................................................... 16 2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel ................................................... 18 2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp ............................................................... 18 2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel .................................................................. 20 a). Chọn lựa gel ......................................................................................... 20 b). Chuẩn bị gel và bảo quản ..................................................................... 20 2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ............................................................... 20 a). Dựng cột lọc gel ................................................................................... 20 b). Chuẩn bị mẫu ....................................................................................... 21 2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel ...................................... 21 vii 2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel .............................................. 22 a). Ƣu điểm ................................................................................................ 22 b). Nhƣợc điểm ......................................................................................... 22 2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE ..... 22 2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME ..... 24 2.5.1. Phương pháp Biuret ................................................................................ 24 2.5.2. Phương pháp Lowry ................................................................................ 25 2.5.3. Phương pháp Bradford ........................................................................... 25 2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) .................................... 26 2.5.5. Phương pháp đo phổ ............................................................................... 26 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 27 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .......................................................................... 27 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU ............................. 27 3.2.1. Vật liệu .................................................................................................... 27 3.2.2. Hóa chất .................................................................................................. 28 3.2.3. Thiết bị .................................................................................................... 28 3.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG .................................... 29 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 29 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú ....................... 29 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease .................................................................. 29 3.4.3. Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 30 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp ............................................................................................ 31 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC .......... 32 3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT ..... 33 a). Nhiệt độ ................................................................................................ 33 b). pH ......................................................................................................... 33 c). Nồng độ muối ăn .................................................................................. 34 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel..................................................... 35 3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .. 35 3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................... 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 36 4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME ................... 36 4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau ......... 36 4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 38 4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 39 4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 41 4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp ....................... 42 4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC ................... 44 viii 4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau ........................... 44 4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau............... 46 4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau ................................................................................................................... 47 4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân ................................... 49 4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT ......................................................................................... 51 4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................ 51 4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................................... 52 4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................ 53 4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL ........................ 55 4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE .............. 59 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 64 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 64 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 66 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 1 Phụ lục chƣơng 3 .................................................................................................... 69 1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford .......................... 1 2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano ............................ 3 3. Phương pháp sắc ký lọc gel ............................................................................ 7 4. Điện di SDS-PAGE ......................................................................................... 9 a). Chuẩn bị hộp điện di .............................................................................. 9 b). Chuẩn bị mẫu protein ........................................................................... 10 c). Đƣa mẫu vào các giếng ........................................................................ 10 Phụ lục chƣơng 4 .................................................................................................... 80 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT NT: nội tạng. DC: dịch chiết. CPT: chế phẩm thô. TN: thí nghiệm. ĐC: đối chứng. dd: dung dịch. HT: hoạt tính. HTR: hoạt tính riêng. HL: hàm lƣợng. MW: molecular weight OD: optical density SDS: sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine UV: ultra viole x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme .. ................................................................................................................................... 24 Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của mẫu nội tạng và đầu .................................................................................................. 42 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protease của CPT ....................................................................................................... 49 Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme protease sau sắc ký lọc gel ........................................................................................ 58 Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE .... 62 Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE ........... 62 xi DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình Trang Hình 2.1. Tôm sú ......................................................................................................... 9 Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease ....................................................................... 10 Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký .............................................................. 17 Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel ................................................................... 18 Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối ............................................................................ 21 Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. .................................................. 26 Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú ...................................................................... 27 Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu nội tạng ............................................................................................ 55 Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu đầu tôm ............................................................................................ 55 Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu nội tạng ...................................................................................... 56 Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu đầu tôm ..................................................................................... 56 Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu nội tạng................................................................................. 57 Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu đầu............................................................................... 57 Hình 4.7. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng .......................... 60 Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu .................................. 60 Đồ Thị Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng ............................................................................................ 36 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu /nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu tôm sú ........................................................................................ 37 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng ..................................................................... 38 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ............................................................................ 38 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .................................................................... 39 Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ............................................................................ 40 xii Đồ thị 4.7. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .......................................................................... 41 Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ................................................................................. 41 Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .................................................................................. 43 Đồ thị 4.10. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ......................................................................................... 43 Đồ thị 4.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC NT/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT ...................................................................................... 45 Đồ thị 4.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC đầu/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT ...................................................................................... 45 Đồ thị 4.13. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng .............................................................................. 46 Đồ thị 4.14. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu ...................................................................................... 47 Đồ thị 4.15. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng .......................... 48 Đồ thị 4.16. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu ................................. 48 Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ DC mẫu nội tạng ........................................................................ 49 Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ DC mẫu đầu ............................................................................... 50 Đồ thị 4.19. Yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT ................ 51 Đồ thị 4.20. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT ................................... 53 Đồ thị 4.21. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT ............. 54 Đồ thị 4.22. Ảnh hƣởng của quá trình tinh sạch sắc ký lọc gel đến HTR của enzyme ................................................................................................................ 58 Đồ thị 4.23. Sự tƣơng quan giữa giá trị Rf và Lg (trọng lƣợng phân tử) .................. 61 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme đƣợc phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nƣớc, sản lƣợng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trƣờng thế gới tăng 20-30% mỗi năm. Việt Nam là nƣớc có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Trong đó protease là enzyme thủy phân có giá trị thƣơng mại rất lớn. Nó đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại. Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât. Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lƣợng và do đó, chế phẩm protease từ vi sinh vật ngày càng cao. Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật luôn đƣợc coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng nhƣ các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thƣơng mại. Tôm là loại động vật thuỷ sinh đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thuỷ sản. Với mức đóng góp 70 - 80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein – nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng quốc tế. Tôm dùng cho chế biến đƣợc cung cấp từ hai nguồn: đánh bắt và nuôi trồng, trong đó nguồn tôm nuôi đang chiếm ƣu thế và nuôi tôm ở Việt Nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng. Các sản phẩm chế biến tôm chủ yếu là tôm bỏ vỏ, bỏ đầu, tôm bỏ đầu bóc vỏ còn đuôi, tôm 2 thịt xẻ lƣng … Trong quá trình gia công chế biến tôm thƣờng loại ra các phế phụ phẩm nhƣ nội tạng, đầu và vỏ tôm. Phế phụ phẩm này của tôm là nguồn thu nhận protease cao, mang lại lợi nhuận lớn cho công nghiệp sản xuất enzyme. Để hiểu về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có biện pháp hữu hiệu trong bảo quản, chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm cho việc thu nhận protease chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú”. 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Mục đích chung của đề tài là tách chiết và tinh sạch protease từ nội tạng và đầu của tôm sú cũng nhƣ tính chất của nó. Để đạt điều này, đề tài tập trung vào các nội dung cụ thể sau:  Xác định quy trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu của tôm sú Xác định tỷ lệ dung môi tách chiết protease thích hợp. Xác định loại dung môi tách chiết protease thích hợp. Xác định nồng độ tác nhân tủa thu hồi protein. Xác định tác nhân tủa thu hồi protein.  Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động protease của chế phẩm enzyme. Khảo sát hoạt tính theo pH. Khảo sát hoạt tính theo nhiệt độ. Xác định độ bền của protease.  Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.  Xác định trọng lƣợng phân tử của protease bằng điện di protein. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 2.1.1. Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme Khi con ngƣời chƣa có khái niệm về enzyme là gì nhƣng con ngƣời đã biết sử dụng nó trong chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền. Khoảng 5.000 năm trƣớc công nguyên ở Jerico, ngƣời ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rƣợu vang, sản xuất dấm, tƣơng chao,… ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xƣa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Những mốc thời gian quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học Năm 1833, Payen và Persoz tách đƣợc diatase từ malt. Năm 1874, Hansen là ngƣời đầu tiên tách đƣợc renet từ bao tử cừu. Năm 1876, Kihne là ngƣời đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme. Năm 1897, hai anh em Buchner chứng minh dịch từ nấm men có thể chuyển hóa đƣờng glucose thành cồn và CO2. Năm 1913, Rohm là ngƣời đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa. Năm 1917, Boidin và Effront nghiên cứu α.amylase của B.Subtilis và ứng dụng trong ngành dệt. Năm 1920-1928, Will Slitter tinh sạch đƣợc enzyme. Năm 1926, Samner kết tinh đƣợc urease; Northrop kết tinh đƣợc protease. Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicilline. Từ thế chiến thứ hai, bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp, sử dụng amyloglusosidase đƣờng hóa tinh bột. Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline. 4 Năm 1972, Boyer và các cộng sự đƣa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực cho công nghệ enzyme. Năm 1984, Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry-lamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme. 2.1.2. Định nghĩa về enzyme Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hoá cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với tốc độ đặc hiệu cơ chất vô cùng hoàn hảo, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hoá học ở điều kiện bình thƣờng mà các chất xúc tác hoá học khác không thể thực hiện nổi. Enzyme tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống. Trong đó nhiều enzyme đóng vai trò điều hoà chủ đạo trong việc điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng của quá trình trao đổi chất. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hoá học rất khó xảy ra trong các điều kiện bình thƣờng ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, môi trƣờng acid mạnh hay kiềm mạnh...) nhƣng trong cơ thể, nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức “êm dịu nhẹ nhàng” nhiệt độ 37oC, áp suất thƣờng, môi trƣờng trung tính, ở nồng độ cao… Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hoá sẽ đình trệ, các hoạt động sống, sinh sản, phát triển của của cơ thể sống không đƣợc bình thƣờng. Tóm lại: enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hoá sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. 2.1.3. Cấu tạo phân tử Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn ở nhiệt độ thƣờng và có tính đặc hiệu rất cao cho nên cấu tạo phân tử của enzyme rất tinh vi và phức tạp. Enzyme có bản chất protein, phân tử lƣợng lớn thƣờng là 10.000 đến 1.000.000 Datol. 5 Ví dụ phân tử lƣợng của ribonuclease là 12.000 Da, glutamt dehydrogenase là 1.000.000 Da, urease là 483.000 Da; đa số enzyem có hình dạng phân tử thuộc loại protein hình cầu. Có loại enzyme đơn nguyên nhƣng cũng có loại enzyme đa nguyên do nhiều đơn vị nhỏ tạo nên, mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi poplypeptit. Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo. Enzyme không bền với nhiệt, ở nhiệt độ cao enzyme mất hoạt tính xúc tác. Các yếu tố gây biến tính protein nhƣ acid hay kiềm, muối kim loại nặng làm cho enzyme mất hoạt tính.  Thành phần cấu tạo của enzyme Enzyme có thể chia hai loại theo cấu tạo hoá học: Enzyme đơn giản và enzyme phức tạp. Loại đơn giản chỉ là những phân tử protein đơn thuần, sản phẩm thuỷ phân chỉ gồm các acid amin. Enzyme phức tạp ngoài phần protein còn có phần khác không phải protein apoenzyme thể hiện tính chất cơ bản của enzyme và tính đặc hiệu của nó. Phần không phải protein đƣợc gọi là coenzyme, còn gọi là nhóm ngoại thƣờng có chứa vitamin, phần này chung cho nhiều enzyme, trong quá trình xúc tác thì biến đổi. Trong thành phần cấu tạo của nhiều enzyme có chứa kim loại.  Trung tâm hoạt động của enzyme Mỗi hoạt động xúc tác của enzyme đều thông qua bộ phận đặc biệt của phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trung tâm này gồm những nhóm hoá học, những liên kết peptit tiếp xúc trực tiếp với cơ chất. Một phần hoặc toàn bộ phân tử enzyme đƣợc coi là có khung cấu trúc thích hợp để duy trì hình dạng cần thiết đối với tính chất đặc hiệu và hiệu lực xúc tác. Do vậy khi làm thay đổi hình dạng của chúng dẫn đến khả năng xúc tác bị thay đổi. Trung tâm hoạt động của enzyme thƣờng bao gồm những acid amin có nhóm hoá học có hoạt tính cao nhƣ serin (-OH), histidin (vòng inmidozol), cytein (-SH), lysin (-NH3), tryptophan (indol), glutamic (-COOH). Các gốc acid amin tạo nên trung tâm hoạt động không nhất thiết sắp xếp ở cạnh nhau trong cấu trúc bậc 1 nhƣng gần nhau trong cấu trúc bậc 2, 3 và 4. 6 2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại  Danh pháp: theo quy ƣớc quốc tế, tên gọi của enzyme thƣờng đƣợc gọi theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên một enzyme thƣờng có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất. Trong trƣờng hợp phản ứng đó là phản ứng lƣỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau hai chấm. Phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn đƣợc gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại. Ví dụ nhƣ trypsin, chimotrypsin, pepsin…  Phân loại Hội nghị sinh hoá quốc tế lần thứ V (1962) chia enzyme làm 6 loại ký hiệu E.C. 1. Oxydoreductase là men ......... Oxy hoá khử. 2. Transferase ............................ Vận chuyển nhóm. 3. Hydrolase .............................. Thuỷ phân. 4. Lyase ..................................... Phân cắt. 5. Isomerase .............................. Đồng phân. 6. Ligase .................................... Tổng hợp. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động enzyme  Nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất tăng độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhƣng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao thì tốc độ phản ứng đạt đến cực đại không tăng nữa. Thời điểm này enzyme bão hoà cơ chất.  Nồng độ enzyme Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với hàm lƣợng enzyme nhƣng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức độ bão hoà. 7  Tác dụng của nhiệt độ Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực đại đến chừng nào enzyme chƣa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10oC tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần. Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 60 – 70oC thì phần lớn các enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn. Mỗi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ƣu riêng ở nhiệt độ này enzyme đạt tốc độ cao nhất. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp của enzyme gần với nhiệt độ của cơ thể vào khoảng 40oC. Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzyme của chúng có nhiệt độ thích hợp, ví dụ amylase động vật có nhiệt độ cao, enzyme ứng dụng khoảng 45 – 50oC nhƣng - amylase của vi sinh vật chịu nhiệt có nhiệt độ thích hợp là 70oC, đối với các enzyme của các vi sinh vật cảm ứng sống trong các suối nƣớc nóng thì nhiệt độ thích hợp vào khoảng gần nhiệt độ sôi của nƣớc. Nhiều enzyme thực vật có nhiệt độ thích hợp khá cao nhƣ papain ở 800C vẫn còn khả năng hoạt động.  Tác dụng của pH Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trƣờng; nó ảnh hƣởng rất lớn đối với tốc độ của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một giá trị pH cho hoạt động của mình. Rất nhiều enzyme có pH thích hợp ở vùng trung tính nhƣng có enzyme hoạt động tốt ở vùng acid hay ở vùng kiềm. pH ảnh hƣởng đối với các phản ứng của enzyme do nhiều tác dụng rất khác nhau do pH tác dụng vào trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nhất là do các nhóm hoạt động của enzyme, vào trạng thái ion hoá của cơ chất, vào độ bền vững của phân tử enzyme và ảnh hƣởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein. Đối với enzyme có những nhóm hoạt động đặc biệt có thể tồn tại dƣới nhiều dạng ion khác nhau và thƣờng chỉ ở một trạng thái có tác dụng xúc tác. pH có tác dụng quyết định đối với trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nói chung và các nhóm hoạt động của enzyme nói riêng, nên ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme. 8  Tác dụng của ion kim loại Sự có mặt hay vắng mặt ion kim loại không thể hiện rõ đối với một số enzyme nhƣng nhiều enzyme chịu ảnh hƣởng sâu sắc đến nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có một số ion kim loại hầu nhƣ tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động một số enzyme; nhƣng cũng có những ion kim loại nhƣ Ag+, Hg+, Pb+ có độc tính cao với hầu hết các enzyme. Một số ion kim loại ức chế enzyme này nhƣng hoạt hóa enzyme kia. Có những ion kim loại ức chế một enzyme ở nồng độ này nhƣng lại hoạt hoá chính enzyme đó ở nồng độ khác. Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn tác dụng với cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzyme.  Tác dụng của chất hoạt hoá Chất hoạt hoá có khả năng làm tăng tác dụng xúc tác của enzyme. Chất hoạt hóa thƣờng có bản chất rất khác nhau. Ví dụ các amino nhóm halogen nhƣ Cl-, Br-, I - có tác dụng hoạt hoá - amylase. Glutathion có tác dụng hoạt hoá nhiều protease thực vật, một số enzyme oxy hoá khử có nhóm hoạt động – SH. Cystein là acid amin hoạt hoá nhiều men có nhóm – SH hoạt động. Tác dụng hoạt hoá của glutathion, cystein là do khả năng khử liên kết disulfur của phân tử enzyme. Các enzyme nhóm – SH hoạt động thƣờng chỉ hoạt động đƣợc khi các nhóm này ở dạng khử. Nhiều ion kim loại cũng có tác dụng hoạt hoá enzyme.  Chất ức chế Là những chất làm giảm tốc độ xúc tác của enzyme. Chất ức chế có thể gây ra quá trình ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế trên phức hợp enzyme cơ chất. 2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM 2.2.1. Giới thiệu về tôm Tôm sú còn gọi là tôm cỏ, tôm nƣơng, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác, bộ mƣời chân, họ tôm he, giống tôm he, loài tôm sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tên thƣơng mại là Black Tiger Shrimp. Tôm sú đƣợc đánh bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới. Theo thống kê của tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization - FAO), sản lƣợng tôm sú năm 1997 chiếm 9 52% sản lƣợng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trƣởng trung bình 2%/năm. Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Ðông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lƣợng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê của FAO năm 1997). Hình 2.1. Tôm sú Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm đƣợc nuôi trồng phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam Tôm sú (Black tiger shrimp) - Penaeus monodon. Tôm thẻ (Banana shrimp) - Penaeus merguiensis. Tôm chân trắng (White leg shrimp) - Penaeus vannamei. Tôm Nhật Bản (Kuruma shrimp) - Penaeus japonicus. Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn). Nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây, trở thành ngành kinh tế quan trọng. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thủy sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%. Năm 2004, xuất khẩu thủy sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nƣớc trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Hiện nay, tôm sú vẫn là đối tƣợng chủ lực, thu hút sự chú ý lớn của ngƣời dân và chính quyền và cung cấp trong chuyển dịch cơ cấu kinh tế ven biển. 10 2.2.2. Khái quát protease 2.2.2.1. Định nghĩa protease Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L-acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Và chúng thƣờng tác động lên các liên kết ester đơn giản. Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease  Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm Protease nội bào. Protease ngoại bào.  Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch. Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch.  Dựa vào pH hoạt động Protease acid tính. Protease kiềm tính. Protease trung tính.  Dựa vào nguồn thu nhận enzyme Protease động vật. Protease thực vật. Protease vi sinh vật.  Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme 11 Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin… Thiol protease (SH): papain, bromeline… Aspartic protease (COOH): pepsin, renin… Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+ hoặc Mg2+). 2.2.2.2. Protease của tôm Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều. Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có xƣơng sống. Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase… Protease của tôm cũng nhƣ của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác. Có nhiều cách phân loại protease, tuỳ vào khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có đặc tính khác nhau. Nhóm enzyme này có tác dụng thuỷ phân protien, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptid mà còn có thể thuỷ phân các liên kết ester và cũng có thể xúc tác cho chuyển về gốc acid amin. Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau. Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thƣờng có tính chất chung của một enzyme: Hòa tan đƣợc trong nƣớc, dung dịch nƣớc muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng. 12 Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme. Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dƣới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế. Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hƣởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trƣờng. Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và Th.s Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trƣờng kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trƣờng gần trung tính. Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài. Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô đƣợc xác định nhƣ khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm đất (Metapenaecus ensis) thấp hơn ở Penaeus pencillatus, Penaeus monodon và Penaeus japonnicus. 2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc a). Nghiên cứu trong nước Ở nƣớc ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease. Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghê ̣ thực phẩm và mỹ phẩm, dƣợc phẩm. Nguyễn Liêu Ba và Lê Văn Nhƣơng (2001), nghiên cứu thu nhận và tinh sạch protease kiềm từ dịch nuôi cấy B.brevis B1. Lê Đức Mạnh và các cộng sự (1996) nghiên cứu thu nhận và bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis. Phan Thị Hồng Hải và các cộng sự (2001), nghiên cứu tinh chế protease từ sáng lá gan (Fasciolagigatica). 13 Đỗ Văn Ninh (2004), tối ƣu hóa quá trình phân giải protein của protease trong thị cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein đƣợc thủy phân. Vũ Văn Bội (2004), nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ Bacillus subtilis S5. b). Nghiên cứu ngoài nước Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên đƣợc thu nhận nhƣng chƣa tinh sạch. Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phƣơng pháp hấp phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng nhƣ protein. Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách đƣợc Chymosin. Wurtz (1879) chiết tách đƣợc papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách đƣợc bromelain… Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nƣớc mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lƣợng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain đƣợc tăng lên. Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phƣơng pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dƣơng cho hiệu suất thủy phân khá cao. 14 2.2.3. Ứng dụng của protease Các protease nói chung đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.  Trong công nghiệp: Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,… Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến,… Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,… Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ. Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải. Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.  Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.  Trong mỹ phẩm : Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.  Trong y học : Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch. Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch… Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng. 15 Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…  Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. 2.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp trích ly enzyme. Emzyme là loại protein đƣợc tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Các enzyme này thƣờng không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, ngƣời ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phƣơng pháp. Các phƣơng pháp phá vỡ tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ tế bào nhƣ: Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền nhƣ bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa… Phương pháp vật lý nhƣ dùng sóng siêu âm. Phương pháp hóa học nhƣ dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate. Quá trình trích ly enzyme từ nội tạng và đầu tôm sú chịu tác động của các yếu tố: tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly protease Tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm lƣợng lipit nhiều, ảnh hƣởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly đƣợc những protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biết tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích 16 hợp enzyme hoạt động mạnh thủy phân protein lẫn nhau. Thƣờng nhiệt độ ly trích protease từ mô động vật ở nhiềt độ không quá 5oC. Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích. pH là yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình ly trích, có những enzyme acid thì cần phải trích ly ở pH acid thì thu protein của enzyme đó cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngƣợc lại. 2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch enzyme Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, ngƣời ta thực hiện những phƣơng pháp sau  Phương pháp gây biến tính chọn lọc Phƣơng pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phƣơng pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt. Ngƣời ta đƣa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70oC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó, bằng phƣơng pháp ly tâm hoặc phƣơng pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.  Phương pháp kết tủa phân đoạn Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thƣờng sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, ngƣời ta đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, acetone để kết tủa protein. 17  Phương pháp hấp thu chọn lọc Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ hydrocyapatite . Phƣơng pháp này có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, thƣờng thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC. Sau khi hấp thụ ta lại tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp.  Phương pháp sắc ký Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nƣớc và tác nhân trao đổi ion , có thể áp dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) để làm sạch enzyme. Thƣờng sử dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion sau: o Nhựa trao đổi ion. o Dẫn suất ester của cellulose nhƣ carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl- cellulose. Dựa vào đặc tính phân cực của protein : o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography). o Sắc ký giấy. o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography). o Sắc ký t