Tách và tinh chế các dẫn xuất curcuminoid trích từ củ nghệ vàng Curcuma longa L

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TÁCH VÀ TINH CHẾ DẪN XUẤT CURCUMIN TRÍCH LY TỪ CỦ NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L.) SVTH : NGUYỄN THỊ MẠC PHƯỢNG CBHD : PGS TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA ThS. PHAN THỊ HOÀNG ANH KS. LÊ XUÂN TIẾN TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2008  Đại học Quốc gia Tp.HCM CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ----------- -- -------------- Số:_______/BKĐK KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN : Nguyễn Thị Mạc Phượng MSSV : 60302187 NGÀNH : Kỹ thuật hữu cơ LỚP : HC03CHC 1. Đầu đề luận án: Tách và tinh chế các dẫn xuất curcuminoid trích từ củ nghệ vàng Curcuma longa L. 2. Nhiệm vụ: • Tổng quan về curcuminoid, phương pháp tinh chế,cô lập ba thành phần curcuminoid. • Tinh chế, cô lập ba thành phần curcuminoid bằng phương pháp kết tinh lại và sắc ký cột. • Xác định độ tinh khiết của ba thành phần curcuminoid cô lập được bằng TLC, điểm chảy, HPLC. • Xác định cấu trúc của ba thành phần curcuminoid bằng phổ UV-Vis, MS, NMR. • Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH và MDA. 3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 08/2007 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 31/12/2007 5. Họ và tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn PGS.TS Trần Thị Việt Hoa …………………………………… ThS. Phan Thị Hoàng Anh …………………………………… KS. Lê Xuân Tiến …………………………………… Nội dung và yêu cầu của Luận án tốt nghiệp đã được thông qua Bộ môn Ngày………tháng ……năm 2007 Ngày………tháng ……năm 2007 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) TS. Phan Thanh Sơn Nam ThS. Phan Thị Hoàng Anh PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): Đơn vị: Ngày bảo vệ: Điểm tổng kết: Nơi lưu trữ luận án:  i  LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn cô Trần Trần Thị Việt Hoa, cô Phan Thị Hoàng Anh, thầy Lê Xuân Tiến, Bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ, đã hướng dẫn tận tình tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn phòng thí nghiệm hữu cơ đã hỗ trợ dụng cụ, máy móc thiết bị và cảm ơn cô Nguyễn Thị Thu Hương trưởng bộ môn dược lý hóa sinh trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn các bạn lớp Hữu cơ 03 đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên trong thời gian làm thí nghệm tại trường. Cảm ơn gia đình và người thân đã động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 01 năm 2008 Xin chân thành cảm ơn  ii  TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn này đã tiến hành phân lập ba thành phần curcuminoid có trong bột curcuminoid thương phẩm và xác định cấu trúc, hoạt tính của chúng. Các kết quả thu được từ thực nghiệm: 1. Phân lập ba thành phần curcuminoid trong hỗn hợp curcuminoid ban đầu bằng phương pháp TLC, CC, HPLC. 2. Xác định độ tinh khiết, cấu trúc và một số tính chất hóa học của các curcuminoid phân lập được. Khảo sát hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid và ba thành phần curcuminoid pheo hai phương pháp DPPH và MDA. Kết quả tất cả các mẫu đều có hoạt tính sinh học trong hai phép thử này.  iii  LỜI MỞ ĐẦU Từ xa xưa, ở các nuớc Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nuớc Đông Nam Á, nghệ đã được sử dụng như môt loại gia vị truyền thống và một loại thuốc gia truyền sử dụng trong gia đình. Nghệ được biết đến là một loại cây có tác dụng dược lý rất tốt chữa nhiều bệnh khác nhau. Curcuminoid là một hỗn hợp gồm ba dẫn xuất diferuloylmethane đã đuợc nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh là thành phần chủ yếu đem lại hoạt tính sinh học của củ nghệ. Hoạt tính của các curcuminoid thành phần có thể khác nhau và khác với curcuminod hỗn hợp. Do vậy, việc tách các thành phần này ra khỏi hỗn hợp là cần thiết cho việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính dược học của nghệ. Nội dung đề tài luận văn này xin trình bày việc tách chiết các curcuminoid thành phần từ bột curcuminoid thương phẩm và khảo sát cấu trúc, tính chất hóa học cũng như hoạt tính kháng oxy hóa của các đơn thành phần, đem đến hiểu biết sâu hơn về curcuminoid và khả năng ứng dụng các thành phần của curcumioid trong thực phẩm và dược phẩm.  iv  DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC  Bảng 1.2. Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối lượng mẫu ban đầu 500mg)  Bảng 1.3. Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg)  Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC  Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng  Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hệ dung môi (trichloromethane:methanol)  Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hệ dung môi (dichloromethane:methanol)   Bảng 3.3. Kết quả kết tinh curcuminoid thô 3 lần trong hỗn hợp methanol:nước Bảng 3.4. Kết quả tính diện tích peak, % diện tích peak các curcuminoid thành phần  Bảng 3.5. Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid sau kết tinh  Bảng 3.6. Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid trong nước cái dưới lọc  Bảng 3.7 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của curcumin Bảng 3.8 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của DMC  Bảng 3.9 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của BDMC  Bảng 3.10. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcumin theo phương pháp DPPH  Bảng 3.11. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, DMC và BDMC theo phương pháp DPPH Bảng 3.12. Hoạt tính bắt gốc tự do của trolox theo phương pháp DPPH Bảng 3.13. Giá trị IC50 của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC  Bảng 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid thô, curcumin, DMC và BDMC theo phương pháp MDA Bảng 3.15. Hoạt tính bắt gốc tự do trolox theo phương pháp MDA  Bảng 3.16. Giá trị IC50 của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC   v  DANH SÁCH CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây nghệ Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid Hình 1.3. Các đồng phân của curcumin Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH Hình 1.7. Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm Hình 1.8. Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin Hình 1.9. Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do Hình 1.10. Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin Hình 1.11. Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, HPLC hỗn hợp các curcuminoid, curcumin, DMC và BDMC và cấu trúc của các curcuminoid xác định được Hình 1.12. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin Hình 1.13. Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione, 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene- 3,5-dione Hình 1.14. Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin và các chất tương tự curcumin không chứa nhóm phenol Hình 1.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6 Hình 1.16. Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO•: gốc ethyl linoleate hydoperoxyl) Hình 1.17. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy Hình 2.1. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm Hình 2.2. Bột curcuminoid ban đầu Hình 2.3. Sắc ký bản mỏng (TLC): (A) Triển khai bản mỏng (B) Cách đo khoảng cách trên bản mỏng sau khi triển khai để tính giá trị Rf Hình 2.4. Các bước thực hiện sắc ký cột Hình 2.5. Dung dịch curcumin, DMC, BDMC dùng để đo phổ UV-Vis  vi  Hình 2.6. Dãy hỗn hợp sau phản ứng Hình 2.7. Phương pháp định lượng MDA Hình 3.1. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH3Cl:CH3OH Hình 3.2. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH Hình 3.3. Kết quả TLC của các mẫu hỗn hợp curcuminoid ban đầu (M) và hỗn hợp curcuminoid sau lần kết tinh thứ nhất (I), thứ hai (II) và thứ ba (III) Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp curcuminoid: (A)ban đầu; (B) sau kết tinh Hình 3.5. Kết quả TLC của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của curcumin, DMC, BDMC Hình 3.7. (A) curcumin; (B) demethoxycurcumin (DMC); (C) bisdemethoxycurcumin (BDMC) Hình 3.8. Phổ UV-Vis của curcumin Hình 3.9. Phổ UV-Vis của DMC Hình 3.10. Phổ UV-Vis của BDMC Hình 3.11 Curcumin C21H20O6 (M=368) Hình 3.12: Demethoxyurcumin C20H18O5 (M=338) Hình 3.13 Bisdemethoxycurcumin C19H16O4 (M=308) Hình 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC theo phương pháp DPPH Hình 3.15. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy trong cấu trúc curcumin Hình 3.16. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC theo phương pháp MDA  vii  DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur : curcumin DMC : demethoxycurcumin BDMC : bisdemethoxycurcumin TLC : sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography) HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) MS : phổ khối lượng (Mass spectrometry) IR : phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) UV-Vis : phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – visible spectroscopy) IC50 : Nồng độ cần thiết để tác động lên 50% chất cần khảo sát (Effective concentration 50) Oleoresin : nhựa dầu Chương 1: Tổng quan 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về curcumin Curcumin là hợp chất được chiết từ củ nghệ (Curcuma longa L) – một loài cây phân bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Á và được dùng như một loại gia vị. Curcumin có dạng bột màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của nghệ.[6] Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn con người ngay cả với lượng lớn. Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người với lượng lên tới 10g /ngày. [2] Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành dược. Curcumin đã được sử dụng trong thuốc truyền thống để chữa các bệnh như : bệnh vàng da, bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh về da, bong gân, viêm, bệnh cúm [5]. Trong những năm gần đây, người ta rất quan tâm đến nhiều tác dụng dược lý khác của curcumin như: tính chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống đông máu…[2] Hình 1.1 Cây nghệ (1) Củ nghệ; (2) Thân và lá nghệ; (3) Bột nghệ. 1.1.1. Các thành phần và các dạng đồng phân của curcumin Thành phần của curcuminoid trên thị trường ngoài curcumin thực chất còn có một số loại chất màu khác cùng đem lại màu vàng cho nghệ gọi chung là curcuminoid. Curcuminoid là các dẫn xuất dicinnamoylmethane. Curcuminoid gồm3 thành phần chính: [6] 1) Curcumin [1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione] (công thức phân tử: C21H20O6 , khối lượng phân tử : 368) (Cur) (1) (2) (3) Chương 1: Tổng quan 2 (3) (1) (2) O O H H O CH3 O H O CH3 O H O H3C O H O O H O CH3 H H O O H3C OH O H H O O CH3 O H 2) Demethoxy curcumin [1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- hepta-1,6-diene-3,5-dione] (DMC) (công thức phân tử: C20H18O5, khối lượng phân tử : 338) 3) Bis-demethoxy curcumin [1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5- dione] (công thức phân tử : C19H16O4, khối lượng phân tử : 308) (BDMC) Trong đó, curcumin chiếm chủ yếu, khoảng 77% đối với sản phẩm thương mại, tiếp theo là DMC (17%) và BDMC (3%). [14] O O OHOH R1 R2 1) R1 = R2 = OCH3 : Curcumin (Cur) 2) R1 = OCH3 ; R2 = H : Demethoxy curcumin (DMC) 3) R1 = R2 = H : Bis-demethoxy curcumin (BDMC) Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid Mỗi thành phần kể trên còn có các đồng phân hình học: s-cis-diketone, s-trans- diketone, cis-cisenol. Ngoài ba thành phần chính ở trên, mỗi thành phần nhỏ còn có thể chia thành các thành phần nhỏ hơn là các đồng phân hình học của chúng. Curcumin tồn tại ở 3 dạng đồng phân: cis-diketone, trans-diketone và enol. Hình 1.3. Các đồng phân của curcumin: (1) s-cis-diketone; (2) s-trans-diketone; (3) enol. Cấu trúc cis-diketone bền hơn dạng trans-diketone và tỉ lệ cis-trans này phụ thuộc vào điều kiện dung môi [18]. Trong môi trường acid hay trung tính, curcumin tồn tại dưới dạng cân bằng enol – ketone đối xứng và ổn định. Dạng ketone tồn tại ở dạng rắn còn dạng enol tồn tại ở dạng lỏng. Cân bằng này phụ thuộc vào loại dung môi và pH. [18] Chương 1: Tổng quan 3 OH R1 O O OH R2 OH R1 O OH R2 O H Dạng enol bền hơn ketone nhờ có liên kết hydro nội phân tử và phân tử ở dạng liên hợp. Ở dạng dung dịch, dạng enol chiếm ưu thế. Cấu trúc của dạng enol hoàn toàn phẳng và cho phép cộng hưởng bên trong 2 phần benzene. Kết quả là curcumin dạng enol thể hiện một mũi hấp thu mạnh ở vùng nhìn thấy. Ngược lại, cấu trúc của dạng ketone lại xoắn nên hấp thụ ở vùng tử ngoại gần [2]. Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone. Dạng đồng phân enol có 3 proton có thể ion hóa tương ứng với 1 nhóm enolic và 2 nhóm phenolic. Khi phân ly, dạng enol phân ly thành 2 loại anion. Một loại hình thành do sự phân ly proton của nhóm enolic có bước sóng hấp thu cực đại là 429 nm và loại kia do sự phân ly proton của nhóm phenolic có bước sóng hấp thu cực đại là 531 nm. [2] Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin. Enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và enolic proton có tính acid trội nhất trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá trình phân ly và trao đổi proton liên quan đến cơ chế loại bỏ gốc tự do của curcumin. Điều đó có nghĩa là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu tiên tách ra. [2] (1) (2) OH3CH OH O OCH3H-H+ -H+ Chương 1: Tổng quan 4 O H C O H O H3CO OCH3 O H O H C H3CO OCH3 O H O O H O2 .- HO2 . Và trong cơ chế SPLET (Sequential proton loss electron), curcumin đầu tiên chuyển sang dạng monoanion bằng cách tách enolic proton. [2] H3CO O H C O H H O OCH3 O H +H+ -H + H3CO O H C H OCH3 O H OO -e H3CO O H C H OCH3 O H OO Ngoài ra các thành phần kể trên, một lượng nhỏ các chất dầu và nhựa tồn tại trong bột nghệ (turmeric) có thể vẫn tồn tại trong curcumin. Đó là các sesquiterpene ketone và các alcolhol như : α-turmeron, β-turmeron, curlon, zingiberen, ar-turmeron, turmenorol A, turmeronol B ...[3] 1.1.2. Tính chất hóa lý của curcumin 1.1.2.1. Tính chất vật lý [6] ƒ Curcumin được trích từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L., có dạng bột màu vàng, điểm chảy 184-185°C. ƒ Curcumin là chất màu tan trong dầu, ethanol, methanol, dichloromethane, acetone, hầu như không tan trong nước ở môi trường acid và trung tính, tan trong môi trường kiềm. ƒ Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng khoảng từ 420 – 430 nm. 1.1.2.2. Tính chất hóa học a. Sự điện ly Trong môi trường pH <1, curcumin có màu đỏ thể hiện trạng thái proton hóa H4A+. Ở pH từ 1 – 7, hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạng trung hòa H3A, có khả năng hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng. Ở pH > 7.5, màu dung dịch chuyển sang đỏ. Giá trị hằng số phân ly pKa của 3 proton dạng acid của curcumin ( dạng H2A-, HA2, A3-) được xác định tương ứng là 7.8, 8.5 và 9.0. [3] Chương 1: Tổng quan 5 Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH. b. Phản ứng với H2 Do có nối đôi ở mạch carbon nên curcumin có khả năng phản ứng cộng với H2 với xúc tác PtO2. H4A+ H3A H2A- HA2- A3- OH H3CO OH OH + OCH3 OH OH H3CO O OH OCH3 OH OH H3CO O OH OCH3 O - OH H3CO O O - OCH3 O - O - H3CO O OH OCH3 O - Chương 1: Tổng quan 6 OH H3CO O OH OCH3 OH H + H2 Ni (PtO2) OH H3CO O OH OCH3 H O dihydrocurcumin OH H3CO O OH OCH3 H O tetrahydrocurcumin OH H3CO O OH OCH3 OH hexahydrocurcumin Trong đó tetrahydrocurcumin (THC) cũng là một chất có hoạt tính chống oxy hóa có khả năng loại bỏ gốc tự do như gốc tert-butoxyl và peroxyl. [7] c. Phản ứng phân hủy trong môi trường kiềm Curcumin tương đối bền ở pH acid nhưng lại nhanh chóng bị phân hủy ở pH kiềm. Đầu tiên ferulic acid và ferulolylmethane được tạo thành. Sau đó, eruolylmethane nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đến vàng nâu. Tiếp theo, eruolylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và aceton và lượng các chất này tăng theo thời gian ủ. [3] Chương 1: Tổng quan 7 OH OCH3 O O OH OCH3 O OH OCH3 OH OH OCH3 O feruloylmethane OH OCH3 CHO + O vanillin acetone ferulic acid Hình 1.7. Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm. Người ta ứng dụng sự thủy phân này của curcumin để sản xuất vanillin và các loại hương thiên nhiên khác. [9] Erika Pfeiffer [20] tiến hành ủ các hỗn hợp curcumin có tỉ lệ 3 thành phần curcuminoid khác nhau trong hệ đệm phosphate pH 7.4 trong điều kiện có và không có huyết thanh. Kết quả cho thấy curcumin bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường không có huyết thanh. Độ bền của các curcuminoid cũng khác nhau: kém bền nhất là curcumin và bền nhất là BDMC. Kết quả HPLC cho thấy sản phẩn phân hủy của quá trình này là: vanillin, ferulic acid, feruolylmethane và trans-6-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal. d. Phân hủy dưới tác dụng ánh sáng [3] Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch[3]. Curcumin bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn. Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid. [11] OH‐  OH‐  Sản phẩm ngưng tụ Chương 1: Tổng quan 8 Khi bị chiếu xạ, curcumin bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillic acid, vanillin và ferulic acid ( Sasaki et al, 1998)[3]. Khi có mặt của oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinyl guaialcol và vanillin: OH H3CO O O H OH OCH3 OHC OCH3 OH + CH OCH3 OH CH2 + H3C CO CH3 + CO2 e. Phản ứng tạo phức với kim loại Curcumin là hợp chất β-diketone nên cũng có tính chất hóa học của một β-diketone. Proton của nhóm methyl ở dạng keto và proton của nhóm hydroxyl ở dạng enol của hợp chất β-diketone có tính acid. Khi các hydro này bứt ra, diketone sẽ tạo thành anion 1,3-diketonate. Diketonate anion này có thể tạo phức vòng càng với các kim loại chuyển tiếp và những nguyên tố phân nhóm chính. Muối kim loại thường được sử dụng cho phản ứng tạo phức là muối acetate, clorua, nitrate, sulfate, carbonate của các kim loại chuyển tiếp như: Cu, Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg. [15] Các phức này cũng có hoạt tính loại bỏ gốc tự do được ứng dụng trong ngành dược. [14] H3CO OH C OCH3 OH O O Cu OH2H3CCOO H3CO OH C OCH3 OH O O Cu OCH3 OH C H3CO OH OO Hình 1.8. Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin. f. Phản ứng của nhóm phenolic OH [13] Một trong những hoạt tính đáng chú ý của curcumin là khả năng loại bỏ gốc oxygen hoạt động và các gốc nitrogen tự do. Đó là do curcumin có 2 nhóm o-methoxy phenolic OH đính vào mạch heptadience-dione. Các electron chưa liên kết của nhóm OH liên hợp với vòng benzen làm cho H của nhóm này linh động hơn. Điều đó giải thích cho tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin. Chương 1: Tổng quan 9 H3CO OH O O OCH3 OH R*-H + H3CO OH O O OCH3 O H3CO OH O O OCH3 O H3CO O O O OCH3 OH H3CO OH O O OCH3 O H3CO OH O O OCH3 OH H3CO OH O O OCH3 OH Curcumin Hình 1.9 Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do [13]. 1.1.3. Phương pháp phân lập 3 thành phần của curcumin Như đã đề cập ở phần trên, curcumin trên thị trường là hỗn hợp của 3 curcuminoid: curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC). Trong đó curcumin chiếm chủ yếu (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC (3%) [14]. Các thành phần này có cấu trúc hóa học khác nhau nên cũng có màu sắc và tính chất hóa học khác nhau. Curcumin tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DMC và BDMC vẫn chưa có trên thị trường. Do đó, việc tách các curcuminoid thành những đơn chất riêng biệt là cần thiết cho việc nghiên cứu và có ý nghĩa kinh tế. Nhiều nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp nhằm phân lập các thành phần này trong hỗn hợp curcumin thô ban đầu. Rasmussen và các đồng sự [15] đã đưa ra phương pháp tách các curcuminoid đơn giản và hiệu quả sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) silica gel đã được tẩm dihydrogen phosphate. Tuy phương pháp này có thể tách và xác định các curcuminoid thành phần nhưng vẫn còn hạn chế do không định lượng được hàm lượng mỗi curcuminoid có trong hỗn hợp. Chương 1: Tổng quan 10 Marsin [4] đã sử dụng phương pháp HPLC CO2 siêu tới hạn với pha động là hệ đệm acetonitrile/acetate [4]. Một phương pháp khác của Xian-Guo He là tách và xác định curcumin sử dụng cột Supelcosil LC-18 với pha động là ammonium acetate/ acetic acid và acetonitrile[16]. Taylor và McDowell đã tách được 3 thành phần curcuminoid sử dụng cột polymer non-silica với pha động là dung dịch acetonitrile 55%. Opa Vajragupta và các đồng sự [17] đã tách hỗn hợp curcuminoid ra các thành phần đơn lẻ bằng phương pháp sắc kí. Bột curcumin trước tiên được hòa tan trong acetone, sau đó được tách bằng sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2). Theo phương pháp này, curcumin được rửa giải trước, sau đó là hỗn hợp của curcumin với DMC, kế đó là BDMC tinh. DMC tinh khiết được tách lần thứ hai cũng bằng phương pháp sắc kí với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (95:5). Độ tinh khiết của các thành phần được kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng TLC, các phổ cộng hưởng từ NMR, phổ hồng ngoại IR, khối phổ ion nguyên tử ESI-MS và phân tích nguyên tố EA. Guddadarangavvanahally K.Jayaprakasha và các đồng sự [4] đã tách ba thành phần của curcumin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Các curcuminoid được tách từ oleoresin sử dụng cột sắc kí silicagel sau khi rửa với hexane để loại béo. Đầu tiên, tinh dầu nhựa nghệ thương phẩm (CRIO) được hấp phụ lên silica gel, sau đó được nạp lên cột sắc ký silica gel và rửa với dung môi hexane. Tiếp đó, cột được rửa với benzene và ethyl acetate với độ phân cực tăng dần. Curumin thu được với hệ dung môi benzene:EtOAc (82:18 v/v), trong khi DMC và BDMC đươc rửa tương ứng bằng các hệ benzene:EtOAc (70:30 v/v), benzene:EtOAc (58:42 v/v). Các phân đoạn thu được qua cột được cô chân không và kết tinh lại. Hiệu suất tách tương ứng của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là đạt 2.2, 4.46 và 3.4%. Các chất thu được cho một chấm đơn trên sắc kí bản mỏng (TLC) silica gel với hệ dung môi chloroform/methanol (98:2). Giá trị Rf tương ứng là 0.55, 0.50, 0.43. Các chất này cũng cho một mũi đơn trên HPLC. Nhiệt độ nóng chảy đo được của curumin, DMC và BDMC tương ứng là 186 -187, 175 -176 và 231 - 232°C [4]. Bằng phổ 1H và 13C NMR, các curcuminoid này được xác định tương ứng là curcumin, DMC và BDMC. Các kết quả trên chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid có oleoresin nghệ và khẳng định đó chính là curcumin, DMC và BDMC. Péret-Almeida và các đồng sự [1] đã tách được và xác định một số tính chất hóa lý của từng curcuminoid riêng biệt. Nghiên cứu đã khảo sát một số hệ dung môi để tách 3 thành phần trên bằng sắc kí bản mỏng silica gel 60G (Merk, Darmstadt, Germamy) (4.5 x 10 mm). Chương 1: Tổng quan 11 Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC [1] TLC mobile phases Rf Curcumin DMC BDMC Toluene:ethyl acetate (97:3) 0.9 0.86 0.8 Toluene:ethyl acetate (90:10) 0.84 0.8 0.75 Chloroform:methanol (95:5) 0.4 0.34 0.25 Dichloromethane:methanol (99:1) 0.47 0.28 0.16 Dichloromethane:methanol (95:5) 0.53 0.42 0.33 Dựa vào giá trị Rf, nhóm nghiên cứu kết luận hệ dung môi dichloromethane:methanol (99:1) là hệ dung môi thích hợp nhất để tách 3 thành phần curcuminoid ra khỏi hỗn hợp ban đầu bằng TLC. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tách các curcuminoid bằng sắc kí cột silica gel 60G được tẩm natri hydrogen phosphate và dung môi rửa giải dichloromethane. Hỗn hợp các curcumin trước khi tách bằng sắc kí cột được kết tinh 3 lần curcumin trong hỗn hợp methanol:nước (5:1 v/v). Kết quả cho thấy sau các lần kết tinh, hàm lượng curcumin tăng lên rõ rệt. Sau lần kết tinh thứ nhất, hàm lượng curcumin tăng lên 56.9%, còn lại là các curcuminoid khác. Đến hết lần kết tinh thứ ba, hàm lượng này lên đến 92.2%, còn lại là DMC và hầu như không còn BDMC trong hỗn hợp. Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình này rất thấp, lượng curcumin thu được chỉ còn 40% so với ban đầu. Bảng 1.2. Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối lượng mẫu ban đầu 500mg) [1] Lần kết tinh Khối lượng (mg) Thành phần (%) Curcumin DMC BDMC 1 294 56.9 30.1 13.0 2 214 72.8 19.5 7.7 3 193 92.2 7.8 - Nước cái thu được từ quá trình kết tinh được gộp lại và nạp lên cột sắc ký Silica gel 60G. Silica gel trước khi nhồi được tẩm natri hydrogen phosphate (NaH2PO4), dung môi dùng để rửa giải là dichloromethane. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột được gom lại thành các nhóm dựa vào kết quả chạy TLC. Chương 1: Tổng quan 12 Bảng 1.3. Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg) [1] Phân đoạn Tổng thể tích (ml) Thành phần Khối lượng (mg) 14-1 1120 C 31.2 15-17 240 C , DMC 4.14 18-30 960 DMC 30.97 31-33 240 DMC, BDMC 3.88 34-47 1120 BDMC 31.06 Độ tinh khiết của các curcuminoid riêng lẻ được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC và xác định điểm chảy. Kết quả phân tích HPLC cho các peak đơn chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid thành các đơn chất tinh khiết. Kết quả đo điểm chảy của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là 184, 172 và 222°C [1]. Hình 1.10. Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin. [1] Các curcuminoid thu được còn được định tính bằng phổ các phổ tử ngoại, phổ khả kiến, hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp đo màu. Các kết quả đo đã xác định các chất thu được chính là curcumin, DMC và BDMC. Chương 1: Tổng quan 13 Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC. [1] 13C Cur DMC BDMC 1 100.9 100.9 100.9 2, 2' 183.2 183.2/183.1 183.2 3, 3' 121.1 121.1/120.8 121.1 4, 4' 140.7 140.7/140.4 140.1 5, 5' 126.4 126.4/125.8 126.8 6, 6' 111.4 111.2/130.4 130 7, 7' 148 148.0/115.7 115.9 8, 8' 149.4 149.8/159.8 159.7 9, 9' 115.7 115.9/115.7 115.9 10, 10' 123.1 123.2/123.1 130 O - Me 55.7 55.7 - W. Chearwae và các đồng sự [18] cũng đã tách được các tách được ba thành phần nói trên từ củ nghệ. Đầu tiên, bột nghệ được trích ly từ củ nghệ bằng dung môi ethanol trong 24h sau đó được loại béo bằng petroleum ether để thu được curcumin thô. Phân tích HPLC cho thấy bột curumin này chứa ba chất khác nhau với hàm lượng tương ứng là 78%, 16% và 5%. Các curcuminoid này được tách bằng sắc kí cột silicagel 60 với dung môi CHCl3, sau đó thay bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH với độ phân cực tăng dần để thu lần lượt ba thành phần riêng rẽ. Các thành phần này được kiểm tra lại bằng sắc kí bản mỏng (TLC) silica gel 60 F254 và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Kết quả cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm thu được vào khoảng 95-99%. Chương 1: Tổng quan 14 Hình 1.11. (A) Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, các mẫu từ trái sang lần lượt là hỗn hợp các curcuminoid: curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III). (B) Kết quả HPLC của các chất theo thứ tự từ trên xuống: hỗn hợp các curcuminoid, curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III). (C) Cấu trúc của các curcuminoid xác định được curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) [18] 1.2. Hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất curcuminoid Từ xa xưa, ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á, nghệ (Curcuma longa L.) đã được sử dụng làm gia vị, chất bảo quản và màu thực phẩm. Nghệ còn là vị thuốc trong gia đình để chữa các bệnh khác nhau: rối loạn mật, chứng biếng ăn, ho, viêm gan, xoang … Những thập niên gần đây, người ta ngày càng chú ý nhiều đến hoạt tính sinh học của nghệ và curcumin. Nhiều công trình đã nghiên cứu hoạt tính và tác dụng dược lý của curcumin. Kết quả cho thấy, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, bao gồm: hoạt tính chống viêm, chống ung thư, chống đột biến, chống đông máu, chống vi khuẩn, chống nấm, chống virus, làm lành vết thương, giảm cholesterol; chữa một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS … [6, 22] Vì hoạt tính của curcumin khá đa dạng và phong phú, nội dung của luận văn này chỉ xin trình bày hoạt tính chống ung thư và chống oxy hóa của curcumin. Chương 1: Tổng quan 15 1.2.1. Hoạt tính chống ung thư Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u. Hình 1.12. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin [23]. Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và bị biến đổi thành các tế bào ung thư. Curcumin có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như: gốc hydroxyl OH•, gốc peroxyl ROO•, singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONOO¯ [18, 24]. Curcumin có khả năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa. Curcumin tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin [24]. Kết quả nghiên cứu của Conney [24] cho thấy curcumin còn có tác dụng ức chế các chất gây ung thư benzo[a]pyrene (BaP) và 7,12- dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) trên da chuột. Curcumin được chứng minh là có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này curcumin phụ thuộc vào nguồn gốc của khối u và loại khối u ác tính [22, 24]. 1.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa Như đã nói ở phần giới thiệu chung về hoạt tính của curcumin, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng. Một vài hoạt tính sinh học đó bắt nguồn từ tính kháng oxy hóa của curcumin. Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh in vitro curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác nhân gây oxy hóa (ROS) như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite đồng thời làm giảm lượng ROS in vivo. Các dẫn xuất của curcumin là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin cũng có hoạt tính kháng oxy hóa.[22] Cấu trúc curcumin có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa mạch đều có khả năng tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tranh cãi xung quanh việc hoạt tính của curcumin thực chất do hydrogen ở vị trí nào đem lại. Liang Shen [2] cho rằng enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và là proton có tính acid trội nhất trong ba proton. Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá Tế bào bình thường Tế bào ung thư Khối u tăng trưởng Khối u di căn Curcumin Biến đổi Phát triển Lan rộng Chương 1: Tổng quan 16 trình phân ly và trao đổi proton liên quan đến cơ chế loại bỏ gốc tự do của curcumin. Điều đó có nghĩa là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu tiên tách ra. [2] O H C O H O H3CO OCH3 O H O H C H3CO OCH3 O H O O H O2 .- HO2 . Wei-Feng Chen [25] đã nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’-azobis(2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH) và Cu2+ trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin và một số chất có cấu trúc tương tự curcumin nhưng cấu tạo không có nhóm phenol. Các chất đó là: 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione (1), 1,7-bis(4- methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5- dione (3). Kết quả hoạt tính của các chất này yếu hơn curcumin. Do đó, nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng nhóm phenol trong phân tử đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin. Hình 1.13. Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione (1), 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-diphenyl-1,6- heptadiene-3,5-dione (3) [25]. Wright, J. S. [19] lại chỉ ra rằng vai trò của nhóm phenol và methyl đối với khả năng kháng oxy hóa của curcumin phụ thuộc vào loại gốc tự do và môi trường phản ứng. Nghiên cứu cho rằng curcumin bắt gốc tự do curcumin theo cơ chế HAT (H-atom transfer): FR• + Cur – H → FR – H + Cur•+ Trong đó: FR•: gốc tự do tấn công (1) O O OCH3 OCH3 H3CO H3CO (2) O O OCH3H3CO (3) O O Chương 1: Tổng quan 17 Cur – H : phân tử curcumin FR – H : gốc tự do sau khi nhận thêm một nguyên tử H Cur• : gốc curcumin hình thành do mất nguyên tử H của O-H hoặc C-H Ví dụ: DPPH• + trans-diketo curcumin → DPPH2 + trans-diketo curcumin. K. Indira Priyadarsini [13] cho rằng hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin là do cả nhóm phenol lẫn nhóm methyl . Quá trình phản ứng của chất oxy hóa với curcumin diễn ra theo hai hướng: (1) sự dịch chuyển electron sau khi phân tử curcumin mất một proton; (2) sự tách ra của hydro ở nhóm phenol.(Hình 1.10) Khi nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng phản ứng với monocation của 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sunfonic acid (ABTS•+) trên curcumin và một vài chất có cấu tạo tương tự curcumin mà không chứa nhóm phenol, W. M. Weber [5’] đã kết luận curcumin phản ứng đánh bắt gốc tự do và tạo thành gốc phenoxy bền theo cả hai cơ chế sau: (1) Tách trực tiếp hydrogene ở nhóm phenol. (2) Ion hóa proton của nhóm methyl ở giữa mạch, sau đó thông qua sự dịch chuyển electron tạo thành gốc carbon trung tâm và đồng phân hóa hình thành gốc phenoxy. Chương 1: Tổng quan 18 OH OCH3 C C C O O H H OH OCH3 C C C O O H H + ABTS OH OCH3 C C C O O H OCH3 C C C O O H O H + H + O OCH3 C C C O O H H C C C O O R H C C C O O R C C C O O R ABTS Hình 1.14. Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin (trên) và các chất tương tự curcumin không chứa nhóm phenol (dưới).[26] Toshiya Masuda [27] cho rằng quá trình bắt gốc tự do của curcumin xảy ra theo cơ chế: S – OO• + AH  SOOH + A• (1) A• + X• → nonradical material (2) Trong đó: S: chất được oxy hóa AH: chất chống oxy hóa có nhóm phenolic A• : gốc kháng oxy hóa X• : gốc cùng loại hoặc khác loại với A• Chương 1: Tổng quan 19 Quá trình (1) là thuận nghịch, quá trình thứ (2) là bất thuận nghịch, sản phẩm cuối cùng là hợp chất bền. Chuỗi phản ứng trong dây chuyền phản ứng chống gốc tự do của curcumin cũng kết thúc bằng phản ứng ghép đôi giữa A• và X•. Khi có mặt các lipid không bão hòa, gốc lipid hydroperoxyl đóng vai trò là X• và tạo thành một vài đồng phân peroxide bằng phản ứng ghép đôi với gốc curcumin. Toshiya Masuda [27] đã xác định được 6 sản phẩm của quá trình kháng oxy hóa của curcumin với sự có mặt của linoleate. Các sản phẩm được đánh dấu từ 1 đến 6 trên hình 1.15. Chương 1: Tổng quan 20 Hình 1.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6 [27]. Chương 1: Tổng quan 21 Hình 1.16. Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO•: gốc ethyl linoleate hydoperoxyl)[27] Cơ chế kháng oxy hóa của curcumin với sự hiện diện của linoleate được biểu diễn trên hình 1.16. Curcumin bắt giữ gốc tự do bằng nhóm phenolic và chuyển thành gốc tự do curcumin. Gốc tự do curcumin phản ứng với gốc peroxyl của ethyl linoleate tạo thành một sản phẩm ghép nối thông qua liên kết peroxyl. Sản phẩm này không bền nên tiếp tục phản ứng Diels-Alder cho sản phẩm cuối cùng là một trong 6 sản phẩm đã nêu ở trên. Linoleate tạo ra 4 gốc đồng phân peroxyl trong suốt quá trình tự oxy hóa, gồm: 9-trans 11-trans- diene 13-hydroperoxide, 9-cis-11-trans-diene 13-hydroperoxide, 10-trans-12 cis-diene 9- hydroperoxide, và 10-trans-12-trans-diene 9-hydroperoxide. Phản ứng ghép đôi tương ứng giữa các gốc peroxyl này và gốc curcumin tạo ra các sản phẩm trung gian. Các sản phẩm này tiếp tục biến đổi thành một trong số 6 sản phẩm cuối cùng kể trên thông qua phản ứng Diels-Alder.[27] Khả năng kháng oxy hóa của curcumin còn thể hiện ở khả năng tạo phức với các ion kim loại gây độc cho cơ thể động vật như: Pb, Cd, Fe. Do đó, giảm những tổn thương thần Chương 1: Tổng quan 22 kinh và mô động vật nhờ giảm quá trình oxy hóa lipid gây ra bởi các kim loại trên não [28, 29]. Hoạt tính kháng oxy hóa không giống nhau giữa các curcuminoid có trong nghệ. Hoạt tính in vitro của các chất này thay đổi theo thứ tự curcumin > demethoxycurcumin > bisdemethoxycurcumin [30]. Sở dĩ như vậy là do ảnh hưởng của nhóm methoxyl ở vị trí ortho tồn tại trong cấu tạo. Nhóm methoxyl ở vị trí ortho tạo liên kết hydro nội phân tử với hydro của nhóm phenol làm cho hydro này tách ra dễ dàng hơn [25]. Điều đó giải thích vì sao hoạt tính của curcumin cao hơn các curcuminoid còn lại: DMC chỉ còn một nhóm ortho-methoxy và BDMC không còn ortho-methoxy nào. O H O CH3 O O CH3 H Hình 1.17. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy [25] Chương 1: Tổng quan 23 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Mục đích nghiên cứu - Tách 3 thành phần riêng biệt trong hỗn hợp curcuminoid thương phẩm. - Xác định độ tinh khiết, cấu trúc hóa học của mỗi thành phần. - Xác định hoạt tính sinh học từng thành phần tách được. 2.2. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm. Bột curcuminoid Kết tinh lại Curcumin đã kết tinh Nước cái dưới lọc Sắc kí cột (CC) Sắc kí cột (CC) Curcumin DMC, BDMC Xác định cấu trúc, định lượng Xác định hoạt tính sinh học Chương 1: Tổng quan 24 Bột curcuminoid thương phẩm đầu tiên được kết tinh lại trong hệ dung môi methanol:nước. Sau đó, cả curcumin sau kết tinh và nước cái dưới lọc đểu được chạy sắc ký cột để tách lấy các curcuminoid thành phần. Qua sắc ký cột, curcuminoid sau kết tinh cho nhiều curcumin và curcuminoid trong nước cái cho nhiều DMC và BDMC. Các curcuminoid thành phần cô lập được xác định độ tinh khiết bằng TLC, đo điểm chảy, HPLC và xác định cấu trúc bằng đo phổ UV-Vis, MS, NMR. Hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminod ban đầu và các curcuminoid thành phần được xác định bằng phương pháp DPPH và MDA. 2.3. Phương pháp thực hiện 2.3.1. Kết tinh 2.3.1.1. Mục đích - Làm sạch curcumin, loại bỏ một số tạp chất, các chất nhựa còn tồn tại trong nguyên liệu. - Thu bột curcumin đã kết tinh có hàm lượng curcumin cao và nước cái dưới lọc có hàm lượng BMC, BDMC cao. 2.3.1.2. Nguyên tắc Dựa vào tính tan khác nhau của các chất trong dung môi. 2.3.1.3. Phương pháp thực hiện Hóa chất, nguyên liệu: - Bột curcuminoid thô (Viện dược liệu, Bộ Y Tế, Hà Nội). - Methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). - Nước cất. Chương 1: Tổng quan 25 Hình 2.2. Bột curcuminoid ban đầu Phương pháp: Bột curcuminoid thương phẩm được kết tinh lại 3 lần trong hỗn hợp methanol:nước. Các bước thực hiện như sau: - Hòa tan hoàn toàn 500mg bột curcumiod thô bằng một lượng tối thiểu methanol ở 60°C. - Thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đục. - Cho tiếp thêm một lượng nhỏ methanol khuấy cho đến khi dung dịch trong trở lại. - Giữ lạnh hỗn hợp ở 5°C trong 2h. - Đem hỗn hợp sau kết tinh lọc chân không. - Bột curcumin trên lọc được hút chân không, chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. - Nước cái dưới lọc đem đi cô quay thành dạng bột khô, hút chân không, chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. 2.3.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) 2.3.2.1. Mục đích - Xác định hệ dung môi để chạy sắc ký cột. - Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn sắc ký cột. 2.3.2.2. Nguyên tắc Chương 1: Tổng quan 26 Sắc ký bản mỏng là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một bản mỏng, chất hấp phụ là silica gel hay oxyde nhôm cộng thêm bột bó để trải một lớp mỏng bám trên bề mặt tấm kính. Phương pháp này có ưu điểm: hiệu ứng tách tốt, nhạy hơn các phương pháp khác, thời gian tiến hành nhanh, lượng chất phân tích nhỏ và dụng cụ đơn giản. 2.3.2.3. Phương pháp thực hiện Dụng cụ, hóa chất: - Bình sắc ký bản mỏng. - Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) 9 Bản mỏng khảo sát hệ dung môi: 2x10cm. 9 Bản mỏng chạy các mẫu curcuminod sau kết tinh và mẫu sau khi qua cột sắc ký: 5x10cm. Chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Dung môi: 9 dichloromethane 99.5% (Shantou Vilong Chemical Factory). 9 trichloromethane 99.7% (Shantou Vilong Chemical Factory). 9 methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). 9 acetone 99.7% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). Các bước tiến hành: - Hoạt hóa silica gel bằng cách sấy bản mỏng ở nhiệt độ 110°C trong 1h, sau đó để cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút. - Chấm chất cần phân tích lên bản mỏng: 9 Hòa tan một ít mẫu curcumin vào một lượng vừa đủ acetone. 9 Vuốt ống mao quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa ống mao quản 2 lần bằng acetone. 9 Dùng ống mao quản, hút một lượng mẫu đã hòa tan rồi chấm lên bản mỏng. Khoảng cách của vết chấm đến bờ dưới khoảng 1cm, các vết chấm cách hai bờ Chương 1: Tổng quan 27 (A) y x (B) hai bên bản 1cm và cách nhau 1cm. Độ lớn của vết chấm càng nhỏ, sự tách càng tốt. - Triển khai bản mỏng: 9 Chuẩn bị bình sắc ký: rửa sạch, sấy khô, lót giấy lọc xung quanh thành. 9 Pha hệ dung môi khai triển cho vào bình, bão hòa khí quyển trong bình từ 15- 20 phút. 9 Đặt tấm bản mỏng vào bình, đậy nắp bình. 9 Theo dõi vạch dung môi chạy đến cách đầu trên của bản 1cm, dùng kẹp gắp bản mỏng ra. 9 Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. - Phát hiện vết và tính trị số Rf : 9 Phất hiện vết qua màu sắc tự nhiên của vết. 9 Phun thuốc thử H2SO4 10% trong C2H5OH. 9 Tính trị số Rf Gọi x: khoảng cách từ điểm xuất phát đến trung tâm vết. y: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi. ௙ܴ ൌ ௫ ௬ Hình 2.3. Sắc ký bản mỏng (TLC): (A) Triển khai bản mỏng (B) Cách đo khoảng cách trên bản mỏng sau khi triển khai để tính giá trị Rf . 2.3.3. Sắc kí cột (CC) Chương 1: Tổng quan 28 2.3.3.1. Mục đích: phân lập các đơn chất từ hỗn hợp. 2.3.3.2. Nguyên tắc: Sắc ký hấp phụ có thể được tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng với chất hấp thụ đóng vai trò tướng tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò tướng động chảy qua chất hấp phụ dưới ảnh hưởng của trọng lực. Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau. 2.3.3.3. Phương pháp thực hiện: Hóa chất, dụng cụ: - Cột đường kính 13cm. - Silica gel 60G F254 (Merck) 0.063 – 0.200 mm. - Dichloromethane 99.8% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). - Methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP. Hồ Chí Minh). - Cát biển (Merck) 0.1 – 0.315mm. Các bước tiến hành: Bước 1: chuẩn bị - Sấy silica gel ở 110°C trong 1h, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút. Ngâm qua đêm với dung môi chạy cột (dichloromethane). - Cột được rửa sạch, sấy khô, cho bông gòn vào đáy, kẹp thẳng góc trên giá. Bước 2: nhồi cột - Cho dung môi vào đến nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silica gel vào cột cho đến hết lượng silica gel cần nhồi. - Cho dung môi lên đầy cột, cho dung môi chạy tuần hoàn khoảng 2-4h để nén lớp silicagel ổn định trong cột. Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silica gel để tránh hiện tượng khô cột. - Cho một lớp cát biển khoảng 0.5-1cm lên trên lớp silica gel để bảo vệ bề mặt cột. Bước 3: đưa chất phân tích vào cột. Chương 1: Tổng quan 29 Có nhiều phương pháp nạp mẫu cần phân túch vào cột. Ở trong luận văn này, có hai phương pháp được sử dụng: - Cách 1: hòa tan hoàn toàn mẫu cần nạp bằng dichloromethane rồi nạp hết lượng dung dịch sau hòa tan vào cột. - Cách 2: hòa tan hoàn toàn lượng mẫu cần nạp bằng acetone, cho từ từ một lượng vừa đủ bột silica gel khô vào → trộn đều → cô đuổi dung môi → nạp vào cột. Tuy áp dụng cách nào thì các bước thực hiện cũng theo trình tự như sau: - Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mặt lớp cát trên cùng. Khóa van cột. - Dùng pasteur pipet (đối với mẫu nạp lỏng) hoặc đũa khuấy (đối với mẫu nạp rắn) từ từ nhẹ nhành nạp lớp mẫu lên trên bề mặt cột mà không làm xáo trộn bề mặt. - Mở van cột, tiếp tục cho dung môi vào để mẫu được hấp phụ vào silica gel. Bước 4: triển khai cột. - Dung môi dùng để rửa giải là hệ dichloromethane. - Đầu tiên, dùng hệ 100% dicholomethane. Sau đó theo thời gian tăng dần độ phân cực của dung môi bằng cách pha thêm vào dung môi lượng tăng dần methanol: (99.5: 0.5 v/v), (99:1 v/v), (98:2 v/v) … Bước 5: hứng và kiểm tra các phân đoạn. - Dung môi chạy qua cột được hứng bằng các phân đoạn thể tích bằng nhau v=10ml. - Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng với hệ dung môi thích hợp. Ở đây sử dụng hệ dung môi chạy bản mỏng dichloromethane: methanol (98:2 v/v) Bước 6: thu hồi và định lượng các phân đoạn. Các phân đoạn có kết quả kiểm tra TLC như nhau được gom lại và cô quay chân không, hút chân không và cân định lượng. Chương 1: Tổng quan 30 Hình 2.4. Các bước thực hiện sắc ký cột: (A) nhồi cột; (B) nạp mẫu; (C) hứng các phân đoạn. 2.3.4. Xác định cấu trúc 2.3.4.1. Phổ UV-Vis Mục đích: Xác định bước sóng hấp thu cực đại và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm. Nguyên tắc: Khi phân tử hấp thu bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hóa trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích và thu được phổ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible Spectra, UV-Vis). Phương pháp thực hiện: pha các mẫu curcumin tinh, DMC tinh, BDMC tinh với nồng độ 0.6x10-5mol/l. Tiến hành đo phổ UV-Vis. Máy đo: 6505 UV-Vis Spectrophotometer JENWAY. (A) (B) (C) Chương 1: Tổng quan 31 Hình 2.5. Dung dịch curcumin, DMC, BDMC dùng để đo phổ UV-Vis. 2.3.4.2. Đo điểm chảy Mục đích: xác định độ tinh khiết của curcumin, DMC, BDMC thu được. Máy đo: Electrothermal 9100. 2.3.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR, 13 C NMR) Phổ NMR được phân tích tại Viện Hóa học Việt Nam, Hà Nội. Dung môi hòa tan: DMSO. Thông số máy: máy Bruker av 500 tần số 500MHz. 2.3.4.4. Phổ MS Phổ MS được phân tích tại Viện Hóa học Việt Nam, Hà Nội. 2.3.4.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Mục đích: Khảo sát thành phần của curcuminoid ban đầu, curcumin sau kết tinh và xác đinh độ tinh khiết của curcumin, DMC, BDMC tách được từ sắc ký cột. Nguyên tắc: Phân tách các chất dựa trên sự tương tác khác nhau của các chất với pha tĩnh, pha tĩnh với pha động, các chất với pha động. Phương pháp thực hiện: Phổ HPLC được phân tích tại Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký, Tp. Hồ Chí Minh. - Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Cân m(g) mẫu thử. Chuyển phần mẫu thử vào bình định mức 10ml. Định mức bằng acetonitrile, lắc đều. Đánh siêu âm khoảng 5 phút. Pha loãng mẫu 20 lần. Lọc qua giấy lọc 0.45µm. Dung dịch sau lọc được tiêm vào máy. Chương 1: Tổng quan 32 - Tiến hành phân tích trên máy HPLC: 9 Cột sắc ký: cột pha đảo C18 (250x4.6mm, 5cm). 9 Nhiệt độ cột: 40°C. 9 Pha động: ACN:H3PO4 0.05%/ 55:45 (v/v). 9 Tốc độ dòng: 0.8ml/ phút. 9 Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV-Vis là 422nm. 2.3.5. Xác định hoạt tính sinh học Mục đích: đáng giá hoạt tính chống oxy hóa ở mức độ in vitro của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC. 2.3.5.1. Phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng man tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác đinh bằng cách đo quang ở bước sóng λ=517 nm. Phương pháp thực hiện: - 0.5ml mẫu thử được pha loãng ở các nồng độ khác nhau bằng methanol và cho phản ứng với đồng lượng dung lượng DPPH 1mM pha trong methanol. Thêm methanol cho vừa đủ 4ml. - Hỗn hợp phản ứng được pha theo bảng sau: Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng Ống Dung dịch thử Methanol (ml) Dung dịch DPPH(ml) Trắng 0 4 0 Chứng 0 3.5 0.5 Thử 0.5 3 0.5 Lắc đều các ống trong 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đo quang ở bước sóng λ=517 nm. Chương 1: Tổng quan 33 Malonyl dialdehyd Acid thiobarbituric  Phức trimethin  N N OHSH H OH + C CH2 O H C O H HCl H2O N N OH OH S CH C CH H N N OH OH S H O H H H + Cl - O H H Hình 2.6. Dãy hỗn hợp sau phản ứng. Hoạt tính kháng oxy hóa được tính theo trị số IC50. Các bước tính toán như sau: - Vẽ đồ thị OD của các mẫu thử theo nồng độ (µg/ml). - Từ đồ thị, nội suy tìm nồng độ của mẫu thử tương ứng với giá trị OD=½ODchứng = 0.7505 (ODchứng trong phép thử DPPH là 1.501). Đó chính là giá trị IC50 của mẫu thử. 2.3.5.2. Phương pháp xác định sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid (định lượng MDA) Nguyên tắc: Malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm được sinh ra bởi quá trình peroxy hóa màng lipid tế bào. Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric (TBA), một phân tử MDA sẽ phản ứng với hai phân tử TBA tạo thành phức trimethin (màu hồng) có hấp thu cực đại ở bước sóng λ=532nm. Phản ứng này thực hiện trong môi trường pH=2-3, nhiệt độ 90- 100°C trong vòng 15 phút. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàm lượng MDA. Phương trình phản ứng: Phương pháp thực hiện: Chương 1: Tổng quan 34 0.1ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0.5ml dịch đồng thể não và thêm đệm phosphate vừa đủ 2ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37°C trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1ml acid