Tạo virus cúm a tái tổ hợp mang gene na của chủng H5n1 Việt Nam bằng kỹ thuật di truyền ngược

Vật liệu và phương pháp Phaàn 2: VAÄT LIEÄU & PHÖÔNG PHAÙP Vật liệu và phương pháp 29 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Hóa chất - 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (QIAGEN) - 10x TAE (Tris base, Acetic Acid (Glacial), EDTA 0.5M pH 8.0) - 500 bp DNA Ladder (TAKARA) - 99% Ethanol (Merck) - Agarose (Promega) - Ampicillin (Invitrogen) - Bromophenol blue - ddH2O - Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) mix, 10 mM mỗi loại (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - DNase I, RNase-free (Fermentas) - Na2-EDTA 100 mM, pH 8,0. - Ethidium bromide (Promega) - Expand High Fidelity PCR System (Roche) - FastDigest® BsmBI (Fermentas) - Fetal bovine serum (FBS) - Glycerol (Merck) - Glycogen 20 mg/ml (Beckman Coulter) - Isopropanol (Prolabo) - Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion Broth, Bio-Rad) - Môi trường MEM (Invitrogen) - Môi trường optiMEM (Invitrogen) - Môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion Agar, Bio-Rad) - Môi trường VIM (virus infection medium) - Phosphate-buffered saline 0,01 M, pH 7,2 (PBS) Vật liệu và phương pháp 30 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam - Restriction endonuclease BsaI (NEB, England) - Restriction endonuclease EcoRI (NEB, England) - Sample Loading Solution (Beckman Coulter) - S.O.C medium (Invitrogen) - Sodium Acetate 3M, pH 5,2 - T4 DNA ligase (Invitrogen) - TPCK-Trypsin 2.1.2 Các bộ Kit sử dụng - DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter) - QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN) - QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN) - QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) - QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) - TA Cloning® Kit and One Shot® TOP10 Chemically Competent E.coli (Invitrogen) - ThermoScriptTM RT-PCR System (Invitrogen) - TransIT®-LT1 Transfection Reagent Kit (Mirus, USA) 2.1.3 Các plasmid Các plasmid sau đây được giáo sư R. G. Webster, bệnh viện Nhi St. Jude, Memphis cung cấp: - pHW191-PB2 (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW192-PB1 (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW193-PA (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW194-HA (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW195-NP (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW197-M (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW198-NS (A/PR/8/34 (H1N1)) - pHW2000 Vật liệu và phương pháp 31 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Các plasmid sau được tác giả xây dựng tại phòng Sinh Học Phân Tử, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh: Bảng 2.1. Các plasmid mang cDNA gene N1 của các chủng H5N1 Việt Nam Stt Plasmid Gene Mã bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm Địa điểm Năm lấy mẫu 1 p1CM-NA N1 A/DK/Viet Nam/CM-1/2006 (H5N1) Vịt Cà Mau 2006 2 p7BTV-NA N1 A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 3 p19ATV-NA N1 A/DK/Viet Nam/19A-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 4 p38ST-NA N1 A/DK/Viet Nam/38ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 5 p39ST-NA N1 A/DK/Viet Nam/39ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 6 p40ST-NA N1 A/DK/Viet Nam/40ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 7 p11ALA-NA N1 A/DK/Viet Nam/11A-LA/2008 (H5N1) Vịt Long An 2008 8 p12ALA-NA N1 A/DK/Viet Nam/12A-LA/2008 (H5N1) Vịt Long An 2008 9 pHW7BTV-NA N1 A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 2.1.4 Các dòng tế bào và chủng E.coli - 293T (Human embryonic kidney cells) (ATCC) - MDCK (Madin-Darby canine kidnay cells) (ATCC) - TOP10 (Invitrogen) 2.1.5 Các thiết bị - Bể ổn nhiệt 420C, tủ ấm lắc và không lắc 370C. - Bộ nguồn điện di EC 105 - Cân điện tử Sartorius - Kính hiển vi soi ngược CKX41 (Olympus) - Máy chụp hình gel ChemiDoc (Bio-Rad) - Máy giải trình tự DNA tự động CEQTM 8000XL (Beckman Coulter) Vật liệu và phương pháp 32 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam - Máy li tâm Eppendorf Centrifuge 5417C - Máy luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) - Máy ly tâm chân không JOUAN RC1010 - Máy ly tâm lạnh SIGMA 3K12 - Thiết bị điện di Wide Mini-Sub® Cell BT (Bio-Rad) - Thiết bị soi DNA bằng tia UV (Bioblock) - Thiết bị định lượng RNA/DNA calculator (GeneQuantII, Pharmacia Biotech) - Tủ ấm CO2 (Sanyo) 2.1.6 Các vật liệu khác - 6-well plate (Nunc) - Cuvette bằng thạch anh (quartz cuvette) - Đĩa pettri (NUNC) - Eppendof tube các loại: 200 µl, 500 µl, 1,5 ml, 2 ml. - Falcon centrifuge tube - Hồng cầu gà (red blood cells) - Plate 96 giếng đáy chữ V hay chữ U (96-well microtiter plate, Nunc) Vật liệu và phương pháp 33 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 2.2 Phương pháp 2.2.1 Biến nạp (transformation) các plasmid vào tế bào khả nạp TOP10 Mục tiêu của bước này chuyển được các plasmid mang cDNA mong muốn vào tế bào E.coli TOP10, từ đó có thể dễ dàng tăng sinh tế bào và thu nhận được số lượng lớn plasmid mang cDNA mong muốn. 2.2.1.1 Nối DNA mục tiêu vào vector Các đoạn DNA gene NA được tạo ra từ phản ứng PCR hay từ phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn BsaI sẽ được nối vào các vector tương ứng (PCR®2.1 hoặc pHW2000 đã được mở vòng bằng enzyme FastDigest® BsmBI). Phản ứng được thực hiện trong eppendorf 0,5 ml với các thành phần: 1 µl 10X Ligation Buffer, 2 µl DNA vector (25 ng/µl), 3 µl mẫu DNA (15 ng/µl), 1 µl T4 DNA Ligase (4 Weiss units) và 3 µl nước cất vô trùng. Ủ 160C ít nhất trong 4 giờ hoặc qua đêm. 2.2.1.2 Biến nạp các plasmid vào tế bào E.coli khả nạp TOP10 [29] Ly tâm kỹ tube chứa plasmid cần biến nạp, đặt vào đá. Rã đông tube chứa tế bào khả nạp TOP10 (50 µl/tube). Hút 2 µl sản phẩm plasmid cho vào tube chứa tế bào khả nạp, khuấy nhẹ bằng đầu cone, tuyệt đối không trộn bằng pipette. Ủ trên đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào trong 30 giây, 420C, không lắc, sau đó chuyển ngay vào đá. Bổ sung 250 µl môi trường S.O.C ở nhiệt độ phòng vào mỗi tube. Lắc theo phương ngang ở 370C, chính xác 1h, 225 rpm. Trải khoảng 10 µl đến 200 µl dịch tế bào lên đĩa thạch BHIA chứa ampicillin 100 µg/ml và 40 mg/ml X-Gal. Ủ qua đêm ở 370C đến sáng. Kiểm tra khuẩn lạc trắng rời mọc trên đĩa thạch. 2.2.1.3 Phân tích kết quả biến nạp Chọn ít nhất 10 khuẩn lạc trắng (white colonies). Tăng sinh mỗi khuẩn lạc trong 2 - 5 ml môi trường BHI lỏng chứa ampicillin 100 µg/ml, ủ 370C qua đêm. Tách plasmid và kiểm tra gene mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI hoặc bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự. Vật liệu và phương pháp 34 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Hình 2.1. Sơ đồ minh họa quá trình nối DNA vào plasmid vector và biến nạp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt. 2.2.1.4 Tách plasmid mục tiêu từ tế bào TOP10 [55] Ly tâm 1 - 5 ml dịch E.coli nuôi qua đêm 10.000 rpm trong 3 phút để thu cặn tế bào (pelleted bacterial cells). Tái huyền phù cặn tế bào trong 250 µl Buffer P1 và chuyển dịch sau khi huyền phù vào tube ly tâm eppendorf 2 ml. Thêm 250 µl Buffer P2 và trộn kỹ bằng inverting tube 4 - 6 lần. Thêm 350 µl Buffer N3 và trộn kỹ bằng Vật liệu và phương pháp 35 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam inverting tube 4 - 6 lần. Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút. Hút dịch nổi từ bước trước cho vào QIAprep spin column bằng cách gạn hay bằng pipette. Ly tâm để loại bỏ dịch nước thải (13.000 rpm trong 30 - 60 giây). Rửa QIAprep spin column bằng cách cho 0,75 ml Buffer PE và ly tâm 13.000 rpm trong 30-60 giây. Tiếp tục ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút để loại hoàn toàn buffer còn lại. Để rửa giải DNA, đặt QIAprep column trong tube ly tâm 1,5 ml, cho 50 µl Buffer EB vào giữa QIAprep spin column, đợi 1 phút, ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút. Trên đây là phương pháp tách plasmid DNA ở qui mô nhỏ (mini) phục vụ cho quá trình xác định cDNA chèn vào vector plasmid có phải là cDNA mục tiêu hay không, bằng enzyme cắt giới hạn và phương pháp giải trình tự. Với qui mô mini này, lượng plasmid DNA thu được không đủ nồng độ để phục vụ cho quá trình chuyển nhiễm (transfection) sau này. Vì vậy, để thu được dung dịch plasmid mục tiêu nồng độ cao (1 µg/µl) chúng tôi sử dụng kit QIAGEN plasmid Midi theo hướng dẫn của nhà sản xuất [54]. 2.2.1.5 Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn Các enzyme cắt giới hạn được sử dụng trong đề tài gồm: EcoRI, BsaI, và FastDigest® BsmBI. Phản ứng cắt được thực hiện trong eppendorf 1,5 ml, thành phần gồm có: 2,5 µl 10X Buffer, 0,25 - 1 µl restriction enzyme, 2 - 7 µl plasmid DNA và bổ sung nước cất vô trùng để đạt thể tích cuối cùng 25 µl. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 370C trong 60 phút đối với EcoRI, 500C trong 60 phút đối với BsaI và 370C trong 5 phút đối với FastDigest® BsmBI. 2.2.2 Định lượng plasmid DNA [53] Dung dịch DNA thường được định lượng bằng phương pháp hấp phụ quang phổ ở bước sóng 260 nm. GeneQuantII là thiết bị đo sự hấp phụ ánh sáng của dung dịch DNA ở các bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm và 320 nm. Từ đó sẽ đọc được kết quả cho biết nồng độ của DNA trên các đơn vị thể tích khác nhau như µg/ml, µg/µl, pmol/µl. Ở đây chúng tôi sử dụng thiết bị GeneQuantII để đo nồng độ plasmid DNA ở bước sóng hấp phụ 260 nm (A260). Vật liệu và phương pháp 36 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Pha loãng mẫu DNA cần định lượng 50 lần trong buffer thích hợp (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Hút mẫu đã pha loãng cho vào cuvette thạch anh, gắn cuvette vào khe nạp mẫu trên máy. Nhấn nút sample để chuẩn bị đo, khi nghe tiếng bíp, ấn mạnh cuvette xuống, nghe tiếng bíp lần hai, rút mẫu ra. Kết quả đo sự hấp phụ dung dịch DNA đã pha loãng này bằng máy GeneQuantII ở bước sóng 260 nm sẽ cho giá trị A260. Nồng độ dsDNA của dung dịch cần đo được tính bằng công thức: Đơn vị chuyển đổi hấp phụ x A260 x Độ pha loãng. Bảng 2.2. Chuyển đổi 1 đơn vị hấp phụ ở bước sóng 260 nm 1 A260 unit Nồng độ (µg/ml) dsDNA 50 ssDNA 33 RNA 40 Oligonucleotides 20-30 2.2.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tế bào [28, 39] Sau khi đã có đầy đủ 8 plasmid mang 8 cDNA cần thiết của virus cúm A với nồng độ cao đủ đáp ứng cho phản ứng chuyển nhiễm. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm chuyển nhiễm 8 plasmid này vào hỗn hợp tế bào 293T+MDCK, sử dụng Kit TransIT ® -LT1 Transfection Reagent theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một ngày (24h) trước khi chuyển nhiễm, trộn hai dòng tế bào MDCK và 293T theo tỉ lệ thích hợp để thu được mật độ lớp đơn tế bào từ 50 - 70% là phù hợp cho phản ứng chuyển nhiễm. Đối với mỗi giếng trên plate 6 giếng. Bổ sung 2 - 8 µl TransIT-LT1 Reagent vào 250 µl môi trường OptiMEM I không chứa huyết thanh, trộn kỹ. Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng. Cho 1 µg mỗi loại plasmid đối với 8 plasmid mang các cDNA của virus cúm A vào hỗn hợp trên, trộn nhẹ bằng pipette. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Thay môi trường OptiMEM I không chứa huyết thanh cho hỗn hợp tế bào. Bổ sung hỗn hợp TransIT-LT1 Reagent/OptiMEM/plasmid DNA phía trên vào các giếng, lắc nhẹ nhàng các cạnh của plate để trộn đều. Ủ qua đêm Vật liệu và phương pháp 37 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 370C, 5% CO2, thay môi trường bằng 2 ml OptiMEM I. Sau 30h chuyển nhiễm, bổ sung 1 ml OptiMEM I chứa TPCK-Trypsin để đạt nồng độ cuối cùng 0,5 µg/ml. Ủ tiếp đến 48h và 72h. Sau mỗi 48h và 72h dịch nổi tế bào chuyển nhiễm sẽ được thu hoạch, kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test) và tính nồng độ virus tạo ra bằng phương pháp chuẩn độ TCID50. Virus thu được từ dịch nổi hỗn hợp tế bào chuyển nhiễm sẽ được cấy truyền hai lần trên tế bào MDCK, thu hoạch dịch virus sau cấy truyền, tách RNA, RT-PCR và giải trình tự các gene để so sánh trình tự nucleotide. 2.2.4 Phương pháp chuẩn độ virus TCID50 [73] TCID50 (50% The Tissue Culture Infectious Dose) là phương pháp xác định hiệu giá virus dựa trên điểm tới hạn (end point) cho biết liều virus tại đó gây hủy hoại 50% số giếng tế bào. Để thực hiện, ta tiến hành pha loãng virus theo bậc 10 (10-1 - 10-10): cho 900 µl môi trường VIM vào các tube 1,5 ml đã được ký hiệu các nồng độ pha loãng, chuyển 100 µl mẫu virus vào tube đầu tiên để được độ pha loãng 10-1, cho 100 µl dịch 10-1 này vào tube thứ hai để được độ pha loãng 10-2, tiếp tục lặp lại các bước như trên để được các nồng độ pha loãng tiếp theo. Tế bào MDCK được cấy trên plate 96 giếng khi đã phủ đều lớp đơn được sử dụng để xác định hiệu giá virus. Hút bỏ môi trường trong plate tế bào, rửa tế bào bằng dung dịch PBS 2 - 3 lần, chuyển 200 µl các dịch virus đã pha loãng trên vào các giếng tế bào, mỗi độ pha loãng sử dụng 4 giếng. Ủ plate 96 này trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Sau 72 giờ, kiểm tra xác định sự hiện diện của virus trong các giếng bằng phản ứng HA. Đọc kết quả ngưng kết hồng cầu và tính TCID50 theo phương pháp Reed-Muench. 2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test) [73] Dịch virus thu nhận từ phản ứng chuyển nhiễm sẽ được kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test - phản ứng HA) nhằm xác định có virus được tạo ra trong phản ứng chuyển nhiễm hay không. Phản ứng này dựa vào nguyên tắc gắn kết giữa các phân tử HA của virus với các thụ thể trên bề mặt hồng Vật liệu và phương pháp 38 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam cầu (red blood cells – RBCs), từ đó hình thành mạng lưới liên kết giữa các virus và hồng cầu, giữ cho hồng cầu không tụ lại một chỗ trong dung dịch. Hình 2.2. Nguyên tắc của phản ứng ngưng kết hồng cầu. 2.2.5.1 Chuẩn bị hồng cầu gà Lọc qua miếng gạc y tế khoảng 5 ml máu gà cho vào tube ly tâm Falcon 50 ml hình nón, ly tâm 1.200 rpm trong 10 phút, gạn bỏ dịch nổi. Rửa hồng cầu hai lần bằng cách bổ sung 50 ml PBS và trộn nhẹ nhàng, ly tâm 1.200 rpm trong 5 phút, gạn bỏ dịch nổi. Huyền phù cặn hồng cầu trong thể tích PBS thích hợp, xác định nồng độ hồng cầu bằng buồng đếm hồng cầu (hemacytometer). Cuối cùng pha loãng hồng cầu tới nồng độ 0,5% để chuẩn bị cho phản ứng ngưng kết. 2.2.5.2 Phản ứng ngưng kết Cho 50 µl PBS vào các giếng từ hàng số 2 cho đến hàng cuối cùng trên plate 96-giếng (đáy chữ V hoặc U). Cho 100 µl dịch mẫu chứa virus vào hàng 1, hút 50 µl từ hàng này và trộn đều theo bậc hai cho đến hàng cuối cùng, hút bỏ 50 µl. Bổ sung 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng trên plate, trộn đều. Ủ ở nhiệt độ phòng từ 30 - 45 phút, đọc kết quả. Kết quả phản ứng được xác định bằng cách Vật liệu và phương pháp 39 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam quan sát hồng cầu bị ngưng kết ở giếng nào và không ngưng kết ở giếng nào. Nếu bị ngưng kết, sẽ không thấy hạt màu đỏ tròn của các hồng cầu tụ lại dưới đáy giếng và ngược lại. Đơn vị phản ứng được tính bằng 2x với x là số thứ tự giếng cuối cùng mà không có hiện tượng hồng cầu bị tụ lại. 2.2.6 Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Phản ứng RT-PCR được sử dụng để định danh virus từ dung dịch RNA đã tách với các cặp primers đặc hiệu, cũng như khuếch đại các gene mục tiêu phục vụ cho việc dòng hóa vào plasmid, giải trình tự. 2.2.6.1 Tách RNA virus [56] RNA virus có thể được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm thu nhận được hoặc dịch tế bào MDCK sau khi cho virus tái tổ hợp tạo ra từ phản ứng chuyển nhiễm xâm nhiễm bằng kit QIAamp Viral RNA (QIAGEN). Hút 560 μl Buffer AVL chứa các hạt mang RNA đã chuẩn bị cho vào tube ly tâm 1,5 ml. Cho 140 μl dịch mẫu cần tách RNA vào tube chứa Buffer AVL - hạt mang RNA trên. Trộn bằng pulse-vortexing trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng (15 - 250C) trong 10 phút. Cho 560 μl Ethanol (96 - 100%) vào mẫu, trộn bằng cách pulse-vortexing trong 15 giây. Cẩn thận hút 630 μl dung dịch hỗn hợp này cho vào QIAamp Mini spin column (trong một tube 2 ml) tránh làm ướt miệng và thành column, đậy nắp, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Lấy column ra đặt vào 1 tube 2 ml mới, bỏ tube ly tâm chứa dịch lọc đi, và lặp lại bước này. Cẩn thận mở QIAamp Mini spin column đã đặt vào tube 2 ml mới, và cho 500 μl Buffer AW1, đóng nắp, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Lấy QIAamp Mini spin column ra đặt vào tube 2 ml sạch, bỏ tube chứa dịch lọc. Cẩn thận mở QIAamp Mini spin Column, và cho 500 μl Buffer AW2. Đóng nắp và ly tâm 14.000 rpm trong 3 phút. Đặt QIAamp Mini spin column vào một tube 2 ml mới, bỏ tube cũ chứa dịch lọc. Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút. Đặt QIAamp Mini spin column vào tube 1,5 ml sạch. Cẩn thận mở QIAamp Mini spin column, cho 60 μl Buffer AVE vào ở nhiệt độ phòng. Đóng nắp, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Vật liệu và phương pháp 40 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 2.2.6.2 Tổng hợp cDNA RNA được tách chiết từ virus cúm A đầu tiên được tổng hợp thành cDNA bằng Kit ThermoScriptTM RT-PCR System (Invitrogen). Thành phần phản ứng gồm: 9μl RNA, 1 μl Universalflu 12 primer 20 μM và 2 μl dNTP Mix 10 mM. Ủ hỗn hợp ở 650C trong 5 phút, chuyển ngay vào đá. Sau đó, chuẩn bị hỗn hợp cho tổng hợp cDNA (cDNA synthesis mix) với các thành phần: 4 μl 5X cDNA Synthesis Buffer, 1 μl DTT 0,1 M, 1μl RNAaseOUTTM (40 U/μl), 1 μl DEPC-treated water và 1 μl ThermoScriptTM RT (15 U/μl). Bổ sung 8 μl cDNA synthesis mix này vào hỗn hợp RNA trên, trộn đều và cho vào máy luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 chạy chương trình: 650C trong 60 phút, sau đó 850C trong 5 phút. Sau đó, lấy sản phẩm ra, bổ sung 1 μl Rnase H (2 U/μl), ủ 370C trong 20 phút. cDNA tổng hợp xong có thể sử dụng ngay cho phản ứng PCR hoặc trữ - 200C. 2.2.6.3 PCR với các cặp primers đặc hiệu Thực hiện phản ứng PCR gene NA từ cDNA hoặc plasmid DNA với các thành phần: 2,5 μl 10X Expand High Fidelity Buffer, MgCl2 25mM, 2 μl Deoxynucleotide mix 10 mM, 0,5 μl Expand High Fidelity Enzyme mix, 2,5 μl Upstream primer 10 μM, 2,5 μM Downstream primer, 1 μl cDNA hoặc plasmid DNA, và bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng là 25 μl. Chương trình phản ứng PCR: 1 chu kỳ cho 940C trong 4 phút; 35 chu kỳ cho 940C trong 20 giây, 520C trong 30 giây và 720C trong 5 phút; kết thúc chương trình là một chu kỳ 720C trong 7 phút. 2.2.6.4 Điện di Sản phẩm PCR hay sản phẩm plasmid DNA sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn được phát hiện bằng cách điện di trên gel Agarose từ 1 - 1,5% trong dung dịch TAE 1X, có bổ sung Ethidium Bromide để đạt nồng độ cuối cùng 0,5 μg/ml với dòng điện 100V trong 30 phút. Sau đó, lấy gel agarose ra và quan sát dưới đèn UV bước sóng 312nm, chiều dài đoạn DNA mục tiêu được so sánh với các vạch trên Vật liệu và phương pháp 41 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam thang 500bp DNA ladder. Kết quả được chụp hình bằng máy chụp hình gel ChemiDoc (Bio-Rad). 2.2.7 Phương pháp giải trình tự DNA Chúng tôi sử dụng hệ thống giải trình tự DNA tự động CEQTM 8000 Genetic Analysis System để giải trình tự các mẫu DNA nhằm xác định trình tự gốc gene NA cũng như để so sánh sự thay đổi về trình tự (nếu có) của các plasmid DNA mang gene NA sau khi biểu hiện trong phản ứng chuyển nhiễm. Hệ thống CEQTM 8000 này giải trình tự theo nguyên tắc của Sanger, tức là dựa vào sự tổng hợp chuỗi mới có bổ sung các dideoxynucleotides (ddNTP) đánh dấu phát huỳnh quang [2]. Các đoạn DNA ngắn với kích thước khác nhau mới tổng hợp xong chứa các ddNTP này sẽ được điện di trong ống mao dẫn. Sau đó, nhờ đầu laser đọc các trình tự tương ứng dựa vào các màu huỳnh quang khác nhau và xuất ra máy tính qua phần mềm CEQTM 8000 Genetic Analysis System. Hình 2.3. Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tự động CEQTM 8000 Genetic Analysis System với 8 ống mao dẫn (capillaries). (1) Xilanh chứa gel polyacrylamide dùng để bơm gel polyacrylamide vào các ống mao dẫn. (2) Bình chứa dung dịch thải. (3) Phiến nhựa 96 giếng chứa các mẫu cần phân tích trình tự DNA. Nạp mẫu vào phiến nhựa theo hàng ngang 8 giếng. (4) Hàng kim hút mẫu và dung dịch buffer đưa vào ống mao dẫn. (5) Hệ thống các ống mao dẫn. (6) Đèn laser đọc các trình tự DNA đã được gắn chất phát huỳnh quang. (7) Hệ thống nối với máy vi tính thu nhận dữ liệu. Vật liệu và phương pháp 42 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 2.2.7.1 Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự [57] Cắt mẫu gel chứa DNA cần tinh sạch bằng dao sắc, sạch. Cân trọng lượng gel. Bổ sung ba lần thể tích Buffer QG vào một thể tích gel (100 mg ~ 100 µl), thường khoảng 600 - 800 µl. Ủ ở 500C trong 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn, có thể vortex type sau mỗi 2 - 3 phút trong quá trình ủ. Đặt cột lọc QIAquick vào tube 2 ml sẵn có. Cho mẫu vào cột lọc QIAquick, ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịch lọc và đặt cột lọc lại tube ban đầu. Cho thêm 500 µl Buffer QG vào cột lọc và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Bước rửa, cho 750 µl Buffer PE vào cột lọc và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Ly tâm lại 10.000 rpm trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. Sau khi rửa, chuyển cột lọc sang một tube 1,5 ml mới, sạch, ghi tên mẫu. Để hòa tan DNA, cho 25 µl Buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) vào giữa màng của cột lọc. Để yên trong một phút rồi ly tâm ở 10.000 rpm trong 1 phút. 2.2.7.2 PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự [8] PCR đánh dấu các đoạn DNA đã tinh sạch bằng bộ Kit DTCS Quick Start. Thành phần phản ứng PCR đánh dấu: 8 µl sản phẩm DNA đã tinh sạch, 2 µl Sequencing primer 1,6 µM, 8 µl DTCS Quick Start Master Mix và bổ sung nước cất vô trùng đến thể tích cuối cùng 20 µl. Chương trình đánh dấu: 30 chu kỳ cho 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây và 600C trong 4 phút, kết thúc giữ lạnh ở 40C. 2.2.7.3 Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy CEQTM 8000 [8] Chuyển sản phẩm đánh dấu vào eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 5 µl hỗn hợp Stop Solution/Glycogen bao gồm 2 µl Sodium Acetate 3M, 2 µl Na2-EDTA 100mM, và 1 µl Glycogen 20 mg/ml, trộn đều. Cho 60 µl Ethanol 95% (v/v) vào, vortex nhẹ, ly tâm 14.000 rpm ở 40C trong 15 phút. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi, rửa 2 lần bằng 200 µl Ethanol 70%, ly tâm 14.000 rpm ít nhất 2 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, làm khô cặn còn lại bằng máy ly tâm chân không trong 10 phút. Bổ sung 40 µl dung dịch Sample Loading Solution vào mỗi mẫu. Chuyển mẫu DNA vào các giếng trên plate thích hợp theo từng hàng, bổ sung một giọt dầu khoáng (mineral oil) lên bề mặt. Lập chương trình và chạy máy.