Thay thế phân bón hóa học N bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường

ụng và có thay đổi cho phù hợp từ các công nghệ của các nước mà công nghiệp sản xuất chế phẩm thành công, đó là Mỹ và Úc. Các chủng cho sản xuất Dự án đã quyết định rằng CB1809 và NC92 sẽ được sử dụng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây đậu tương và lạc tại Việt nam bởi vì thí nghiệm thực hiện ở các vùng canh tác các cây này trong nước cho thấy các chủng này là các chủng tốt nhất. Chúng làm tăng trọng lượng nốt sần, tăng năng suất sinh khối và hạt so với các chủng bản địa Việt nam đã thử nghiệm. Trong tương lai, sự đánh giá các chủng sẽ có thể cần thiết để cố gắng phát triển các chủng tốt hơn nữa. Duy trì hoạt tính các chủng và chuẩn bị giống mẹ Để sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Việt nam đề nghị là giống mẹ sẽ được cung cấp hàng năm bởi phòng thí nghiệm quản lý chất lượng sản phẩm độc lập nơi này các chủng cho sản xuất được duy trì theo nghĩa là thuần chủng, sống và có hiệu quả cố định đạm cao (nốt 16 sần và hoạt tính cố định đạm). Sau khi nhận được giống mẹ, các nhà sản xuất phải bảo quản chúng trong năm sản xuất đó. Bước đầu tiên sau khi nhận được giống me, các nhà sản xuất là cấy chuyền sang các ống nghiệm có chứa môi trường YMA (yeast mannitol agar) (gọi là giống con), cùng một lúc thì cấy ria trên các môi trường YMA và CRYMA (congo red yeast mannitol agar) để kiểm tra tính thuần chủng. Nếu kiểm tra thấy giống mẹ bị nhiễm thì sẽ đề nghị phòng thí nghiệm quản lý chất lượng cung cấp giống mẹ mới. Giống mẹ cần phải chắc chắn là thuần chủng trước khi cung cấp cho nhà sản xuất. Tuy nhiên có thể có các rủi ro trong quá trình vận chuyển hoặc trao tay. Các giống con sau đó được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ thấp (1–4oC) cho tới khi sử dụng. Cần cấy chuyền các giống này sau mỗi 6 tháng. Số lượng các giống con này thì phụ thuộc vào đòi hỏi của sản xuất. Nhiệt độ cho sinh trưởng của rhizobium là 30oC trong tủ ấm. Phương pháp khác cũng có thể được áp dụng khi có đòi hỏi cao của sản xuất. Chuyển sinh khối từ ống nghiệm giống mẹ vào erlen có môi trường YM lỏng, ủ ở 30oC trong vòng 5 - 7 ngày. Lấy 2ml của dịch sinh khối này cho vào 2 ml 50% glycerol, đã được khử trùng trước trong lọ nhỏ. Các ống giống con này được bảo quản trong các tủ lạnh sâu cho sử dụng trước khi kiểm tra nhiễm trên môi trường CRYMA và YMA. Sự tăng trưởng của sinh khối Giống khởi đầu: Cấy ria các chủng sử dụng trên CRYMA và YMA để kiểm tra nhiễm. nuôi cấy ở 30°C trong 6–8 ngày. Nếu thấy không nhiễm thì cho vào ống nghiệm giống đó 10 ml nước vô trùng. Đóng nắp lại và lắc nhẹ. Đổ dịch sinh khối này một cách vô trùng vào một erlen có chứa môi trường nuôi cấy YM lỏng. Đóng erlen với nút bông và giấy. Nhẹ nhàng trộn đều dung dịch và đặt vào trong máy lắc nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C cho tới khi xuất hiện dịch có màu sữa (5-7 ngày), và quần thề rhizobium đạt được là 109/ml trong dịch sinh khối. Dịch sinh khối này sẵng sàng để cấy vào nồi lên men. Môi trường nhân sinh khối: Bảng 5. Số lượng tế bào/ml dịch sinh khối trong các môi trường cải tiến so sánh với môi trường cơ bản YMB Số lượng rhizobia/ml Chủng YMB SX1 SX2 CB1809 8,2 x 109 1,6 x 109 4,2 x 109 SL1 4,8 x 109 6,8 x 109 5,8 x 109 SL2 2,7 x 109 5,4 x 109 1,2 x 109 NC92 2,8 x 109 4,8 x 109 5,6 x 109 GL1 5,6 x 109 2,8 x 109 1,9 x 109 GL2 5,6 x 109 7,2 x 109 5,2 x 109 SX1(g/l): nước chiết đậu xanh 50 g; K2HPO4 0.5 g; KH2PO4 0.5 g; (NH4)2SO4 1.0 g; MgSO4. 7H2O 0.5 g; CaCO3 1,0g; Glucose 5,0g; Saccharose 5,0g; nước cất 1 litre. SX2: Glucose 10g; KH2PO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,25g; CaCO3 0,5g; Yeast Extract 0,5g; nước cất 1 litre. YMB: control – mannitol 10g; yeast extract 1g; 0,5g; KH2PO4 0,5 g; MgSO4. 7H2O 0,5g; NaCl 0,1 g; nước cất 1 litre Source: SFI 17 Môi trường cho rhizobium sinh trưởng bao gồm nguồn C, nitơ và khoáng chất. Hầu hết rhizobium sử dụng được pentoses, hexoses, disacharides, polysaccharides and sugar alcohols mặc dù nguồn C thích hợp cho các chủng rhizobium thì thay đổi. Nói chung là cải tiến môi trường nhân sinh khối cho rhizobium thì dựa trên căn bản môi trường YMB (yeast mannitol broth). Sản xuất lớn thì đòi hỏi môi trường rẻ tiền và sẵn có ví dụ như là dịch bắp và dịch thuỷ phân vỏ đậu. Bảng 5 trình bày ảnh hưởng của môi trường nhân sinh khối đến sự tăng trưởng của 6 chủng rhizobia. Các thử nghiệm là nước chiết đậu xanh, saccharose và glucose thay vì yeast extract và mannitol mắc tiền. Số lượng tế bào rhizobia của 6 chủng cao hơn 109/ml trong 2 môi trường đề nghị là SX1 và SX2, tương tự như môi trường YMB. Môi trường SX1 là môi trường tốt nhất theo nghĩa là hiệu quả và kinh tế. Số liệu rất hứa hẹn nhưng cần lập lại. Nếu rhizobia tăng trưởng tốt trong môi trường SX1 và SX2 vẫn tốt, thì chúng có thể xem xét như là môi trường sản xuất chế phẩm nốt sần tại Việt nam. Thời gian sinh trưởng : Kết quả cho thấy số lượng của tế bào rhizobium tăng theo thời gian và đạt cực đại ở ngày thứ 7 đối với tất cả cá chủng. (Bảng 6). Số lượng cao, 7 x 109 tế bào/ml. Bảng 6. Số lượng tế bào rhizobia trong dịch sinh khối ở các thời gian nuôi cấy khác nhau Số tế bào/ml Thời gian (ngày) CB1809 SL1 SL2 NC92 GL1 GL2 3 5,2 x 107 8,8 x 106 1,04 x 107 5,2 x 107 9,2 x 106 1,36 x 107 4 8,8 x 108 2,48 x 107 1,44 x 107 2,6 x 108 5,8 x 107 1,3 x 108 5 1,24 x 109 4,02 x 108 2,4 x 108 8,0 x 108 2,2 x 108 8,4 x 108 6 3,2 x 109 2,8 x 109 1,08 x 109 3,6 x 109 1,24 x 109 1,08 x 109 7 7,2 x 109 4,8 x 109 4,8 x 109 4,2 x 109 2,6 x 109 1,22 x 109 8 1,68 x 109 1,02 x 109 1,28 x 109 2,36 x 109 1,56 x 109 2,4 x 109 Nguồn: SFI Ảnh hưởng của pH: Bảng 7. Ảnh hưởng của pH đến tăng trưởng của rhizobia Tăng trưởng của các chủng pH CB1809 SL1 SL2 NC92 GL1 GL2 4 - - - - - - 4.5 - - - - - - 5 - - - - - - 5.5 + ++ ++ ++ ++ ++ 6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ 6.5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 7.5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ 8 - - - - - - 8.5 - - - - - - 18 -: không phát triển +: phát triển yếu (104–105 CFU/ml) ++: phát triển bình thường (106–107 CFU/ml) +++: phát triển tốt (108–109 CFU/ml Nguồn: SFI Ảnh hưởng của nhiệt độ: Bảng 8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của rhizobia Nhiệt độ (ºC) Sự tăng trưởng của các chủng CB1809 SL1 SL2 NC92 GL1 GL2 25 ++ ++ ++ ++ ++ ++ 30 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 37 + + + + + + >45 - - - - - - -: không tăng trưởng +: Tăng trưởng yều (104–105 CFU/ml) ++: Tăng trưởng bình thường (106–107 CFU/ml) +++: Tăng trưởng tốt (108–109 CFU/ml Nguồn: SFI Kết quả từ bảng 7 và 8 cho thấy pH môi trường và nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng của rhizobiuam. Tất cả 6 chủng thử nghiệm đều phát triển tốt ở pH 6.5–7 và 300C. Quá trình nhân sinh khối: Phụ thuộc vào đầu tư trang thiết bị, thiết bị sẵn có và kinh nghiệm nhà sản xuất sẽ cần xem xét dung tích của nồi lên men. Các mẻ sản xuất lớn thì tiết kiệm thời gian nhưng rất dễ bị tạp nhiễm. Nồi lên men có thể thay đổi kích thước từ 1–2 L (bình thuỷ tinh trên các máy lắc hoặc là sục khí) tới >1600 L. Sinh khối lỏng có thể được sản xuất một cách đơn giản trong các bình thuỷ tinh, như là bộ lên men bằng bình thuỷ tinh 4-L với đầu ra lấy mẫu gắn vào phần đáy bình. Hệ thống này nuôi cấy tối đa 2–3 L môi trường. Để mà tránh tạp nhiễm thì không khí được lôc qua bộ phận lọc nhồi với bông gòn cotton. Tất cả các dây cao su và đầu mối đều được khử trùng. Nút bằng cao su giữ không khí vào và ra qua lọc được gắn chặt với cổ bình thuỷ tinh. Sử dụng máy bơm nuôi cá nhỏ để cung cấp khí. Nó được gắn với ống không khí ra. Không khí sẽ di chuyển tự do trong cả hai lọc khí và thổi vào bình lên men. Bông gòn trong bộ lọc khí cần phải nén vừa phải. Nếu nén chắt quá sẽ hạn chế không khí đi vào. Thiết bị bơm cần được tháo rời ra khỏi bộ lên men khi khử trùng. Khử trùng trong vòng 40 phút ở 1 atm nếu môi trường là 2 lít và tăng dần lên 10 phút cho mỗi lít môi trường thêm vào. Sau khi môi trường lên men nguội thì bỏ kẹp ở ống khí vào và nối nguồn cung cấp khí vào, kiểm tra lượng khí cho phù hợp và kiểm tra xem hệ thống có bị rò rỉ hay không. Hệ thống lên men như vậy đã sẵn sàng cho việc cấy giống mẹ vào môi trường lên men. Cấy giống vào qua đường khí vào và dùng kim khử trùng gắn với xylanh. Khử trùng bề bặt ống dần khí vào với cồn 70% hoặc là 3% hydrogen peroxide khoảng 2–3 cm phía trên đầu nối của nó với ống thuỷ tinh. Kim được châm vào xuống phía dưới vào ống cao su và bắt đầu cấy dịch sinh khối mẹ. Sau đó nuôi cấy ở 30oC. Sử dụng hệ thống lên men nhỏ sẽ phù hợp với điều kiện của Việt nam, đặc biệt khi chúng được phối hợp cùng với kỹ thuật pha loãng dung dịch nuôi cấy – lên men đặc. Với sự phối hợp này, dịch nuôi cấy có thể pha loãng đến 100 lần. Do đó 2 lít dịch lên men sẽ cho ra 10.000 túi chế phẩm (20 mL/túi). 19 Các nồi lên men cỡ nhỏ dùng trong công nghiệp thông thường khử trùng trong autoclave. Một hệ thống lên men cho rhizobia đã được thiết kế bởi NifTAL và sử dụng nhiệt trực tiếp bởi gas và hệ thống ống làm lạnh để tiết kiệm thời gian sau khi khử trùng. Thùng lên men này chịu áp lực và có dung tích là 141 L. Dung tích làm việc là 20–100 L. Chi tiết về hệ thống này có thể liên lạc Prof. Nantakorn Boonkerd tại Đại học Công nghệ Suranaree Thailand. Lựa chọn chất mang Chất mang đóng vai trò rất quan trọng trong sản xuất chế phẩm trên nền cứng. Hầu hết chế phẩm vi khuẩn nốt sần được sản xuất trên nền chất mang than bùn sau khi đã được xay, trung hoà. Các tính chất của một chất mang tốt là: - Bảo đảm cho rhizobia sinh trưởng và tồn tại - Khả năng hấp thu ẩm tốt - Dễ dàng sản xuất - Dễ dàng khử trùng bởi autoclave hoặc là chiếu xạ gramma - Sẵn có với số lượng đủ - Không mắc tiền - Bám dính tốt vào hạt - Khả năng đệm pH tốt Than bùn được nghiên cứu nhiều nhất và được sử dụng nhiều nhất như là chất mang cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng rhizobia thì được bảo vệ và tồn tại tốt trên than bùn. Bảng 9 và 10 chỉ ra các tính chất lý hoá học của các nguồn than bùn đã được nghiên cứu kỹ. Đó là các than bùn được dùng cho sản xuất thương mại tại Mỹ và Úc. Tuy nhiên, tính chất lý hoá học của than bùn không phải là chỉ tiêu duy nhất để xác định chúng có phù hợp cho sản xuất hay không. Chỉ có thử nghiệm liên quan đến tăng trưởng của rhizobia mới xác định được chúng có được chấp nhận hay không cho sản xuất. Ngoài các tính chất của than bùn như là độ măn, sét, lượng hữu cơ và sự tạp nhiễm bới các kim loại thì còn có các yếu tố không xác định được ảnh hưởng đến sự phù hợp của than bùn như là một chất mang. Than bùn từ các nguồn khác nhau cần thiết phải kiểm tra sau khi đưa về cùng kích thước hạt và ẩm độ (nếu có thể). Không thể đánh giá than bùn thông qua màu sắc hay là cấu trúc của nó. Bảng 9. Đặc trưng của than bùn dùng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Mỹ Loại Lượng Phân tích tro (%) N tổng (%) 1.62 K 1.12 Chất hữu cơ (%) 86.80 P 0.33 Tro (%) 13.20 Ca 5.21 K trao đổi (ppm) 62.00 Mg 1.14 N - NH4 và NO3 (ppm) 94.00 Fe 2.10 P dễ tiêu (ppm) 12.00 Si 28.00 pH 4.5 -5.0 Al 6.32 Ẩm độ (%) 7 – 8 Na 0.52 Burton (1979) 20 Bảng 10. Đặc trưng than bùn Bendenoch dùng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm tại Úc Đặc trưng Khoảng cao thấp Trung bình Chất hữu cơ (%) 28.8 – 75.4 64.3 Hữu cơ C (%) 16.4 – 42.1 36.1 Khoáng (%) 10.0 – 16.0 12.1 Muối hoà tan (%) 0.09 – 1.50 0.87 Cl (%) 0.01 – 0.31 0.11 N (%) 0.89 – 2.30 1.83 K2O (%) 0.12 – 0.17 - P2O5 (%) 0,09 – 0.22 - Khả năng giữ nước (%) 216 – 522 320 C/N 15.0 – 17.5 16.7 pH 5.8 – 7.8 6.8 Roughley (1970) Việt nam có rất nhiều mỏ than bùn, phân bố khắp nước nhưng chất lượng thì khác nhau rất nhiều, từ nghèo (Cần Giờ) cho đến trung bình (Bình Phú) và tốt (U Minh) (Bảng 11). Bảng 11. Đặc trưng của 3 nguồn than bùn Việt nam Đặc trưng Cần Giờ Bình Phú U Minh Tro (%) 50 - 70 40 - 60 7 – 9 OM (%) 14 - 21 25 - 40 46 – 51 Acid humic (%) 5 - 8 14 – 18 30 S (%) 1 - 8 0.3 – 1.5 0.25 Nguồn: Than bùn tại Việt nam và sử dụng trong nông ngjiệp (Nhà Xuất bản Nông nghiệp, 1997) Bảng 12. Số lượng rhizobia trong các nguồn than bùn khác nhau ở Miền nam Nghiệm thức Ban đầu 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần 1. Australia 59 x 107 30 x 108 16 x 108 20 x 108 17 x 108 2. Komix 1 40 x 107 22 x 108 29 x 108 32 x 108 25 x 108 3. Komix 2 18 x 107 63 x 107 33 x 107 42 x 107 34 x 107 4. DakNong 20 x 107 15 x 108 19 x 108 20 x 108 24 x 108 5. U Minh 46 x 107 25 x 108 24 x 108 18 x 108 22 x 108 Treament 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng 1. Australia 31 x 108 20 x 108 14 x 108 12 x 108 10 x 108 2. Komix 1 28 x 108 24 x 108 15 x 108 17 x 108 12 x 108 3. Komix 2 25 x 107 32 x 107 10 x 107 74 x 106 34 x 106 4. DakNong 20 x 108 15 x 108 11 x 108 12 x 108 78 x 107 5. U Minh 25 x 108 19 x 108 15 x 108 14 x 108 11 x 108 Nguồn: OPI Chủng: CB1809 21 Kết quả trong bảng 12 cho thấy ảnh hưởng của nguồn than bùn đến chất lượng chế phẩm. Ngoại trừ Komix 2, 3 nguồn than bùn của Việt nam trong thí nghiệm này tốt cho tăng trưởng của rhizobia. Số lượng của rhizobia trong các than bùn này đạt ≥ 109 cfu/g than bùn ấm, tương đương với than bùn Úc dùng cho sản xuất thương mại. Số lượng rhizobia trong komix 2 chỉ đạt 3.4 x 107 cfu/g than bùn ẩm sau 6 tháng. Tương tự, nguồn than bùn ở Sơn La và Thái nguyên cũng giúp rhizobia tăng trưởng và tồn tại tốt, đó là các chủng CB1809, NC92, GL2, SL2. Số lượng rhizobia đạt ≥ 109 cfu/g than ùn ẩm Bảng 13. Số lượng rhizobia trong hai nguồn than bùn ở Miền Bắc Number of rhizobia/g moist peat inocualnts Rhizobium strain Nguồn than bùn Ban đầu 1 tuần 2 tuần 1 tháng 2 tháng 3 tháng Sơn La 3,2 x 109 1,8 x 109 4,2 x 109 7,2 x 109 8,0 x 109 4,0 x 109 NC92 Thái Nguyên 2,4 x 109 1,3 x 109 3,6 x 109 7,6 x 109 4,0 x 109 6,8 x 109 Sơn La 1,6 x 109 1,2 x 109 1,8 x 109 2,1 x 109 1,4 x 109 1,3 x 109 GL2 Thái Nguyên 1,2 x 109 2,4 x 109 1,2 x 109 1,1x 109 3,6 x 109 1,2 x 109 Sơn La 6,5 x 109 1,8 x 109 7,5 x 109 3,4x 109 3,2 x 109 3,6 x 109 CB1809 Thái Nguyên 5,3 x 109 2,8 x 109 5,3 x 109 2,2 x 109 2,4 x 109 1,4 x 109 Sơn La 6,6 x 109 1,4 x 109 1,6 x 109 1,5 x 109 5,2 x 109 1,1 x 109 SL2 Thái Nguyên 4,0 x 109 1,2 x 109 4,8 x 109 1,0 x 109 1,0 x 109 1,2 x 109 Nguồn: ISF Bảng 14. Số lượng của tế bào rhizobia trong các chất mang khác nhau sau 1 tháng STT Chủng rhizobium Chất mang Số lượng tế bào rhizobium (CFU/g) 1 NC 92 Peat 2.7 x 107 2 CB 1809 Peat 5.4 x 106 3 NC 92 Peat + worm casts 8.3 x 108 4 CB 1809 Peat + worm casts 5.4 x 108 5 NC 92 Peat + worm casts + coconut coir dust 2.5 x 109 6 CB 1809 Peat + worm casts + coconut coir dust 6.8 x 108 Nguồn : IAS 1 NC92 Peat 1,2 x 10 8 2 NC92 Peat + molasses + “rare soil” 1,5 x 10 9 3 NC92 Peat + worm casts + coconut coir dust 3,8 x 10 9 Nguồn : ISF 22 Có nhiều nguồn thay thế cho than bùn, ví dụ bã mía, bột giấy, vermiculite, polyacrylamide, đất khoáng, than, tàn dư cây. Các vật liệu này cũng có thể trộn với than bùn để cải thiện chất lượng. Bã mía, bụi xơ dừa và phân trùn cải thiện chất lượng than bùn thông qua tăng khả năng giữ nước (Bảng 14). Số lượng rhizobia tăng lên khi than bùn được trôn với phân trùn Sản xuất chất mang Kích thước hạt của chất mang: Than bùn hiện tại là chất mang được xem xét nhiều hơn trong sản xuất chế phẩm tại Việt nam. Nghiên cứu của dự án đã chỉ ra một số cơ chất trộn với than bùn. Chúng là phân trùn và bụi xơ dừa. Mật rỉ và “đất hiếm” có thể thêm vào như là nguồn dinh dưỡng thêm vào. Than bùn được khai thác, làm khô nếu ướt, rây để loại bỏ đất đá, rễ cây sau đó thì làm khô. Than bùn sau đó được xay bằng kỹ thuật nghiền búa. Và được qua rây: 1mm, 355µm, 150 µm và 75 µm. hạt 75 µm hoặc là nhỏ hơn sẽ tốt hơn cho bao hạt. pH chất mang: pH chất mang quan trọng và tính acid của than bùn cần được trung hoà với calcium hay là magnesium carbonate. pH thích hợp là 6.5–7.0. Vôi mịn dùng trong nông nghiệp thì thích hợp cho việc trung hoà than bùn. Chỉnh pH của than bùn cần phải thực hiện tật cẩn thận, chờ thời gian cân bằng. Phả ứng giữa vôi và H+ trong than bùn phụ thuộc kích thước của cả vôi và than bùn. Hạt càng nhỏ thì phản ứng càng nhanh. Ẩm độ của than bùn cũng quan trọng. Số lượng vôi để trung hoà cũng phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ, sét và khả năng đệm của than bùn. Sau khi trộn lẫn than bùn và vôi thì cần thiết cho phép phản ứng xảy ra trong vài tuần trước khi đo pH. Cũng cần thiết đo pH theo thời gian. Vôi mịn dùng trong nông nghiệp (Aglime, calcium carbonate qua rây 150 µm mesh) là vôi tốt nhất sử dụng để trung hoà than bùn. Vôi xây dựng thì quá mạnh còn các vôi khác thì lại nhẹ. Tính toán lượng vôi như sau: - Cho 10 g chất mang vào trong 90 ml nước chứa trong erlen 400 ml - Quậy đều bằng khuấy từ trong khi đo pH bằng pH meter và cho thêm từ từ vôi vào cho đến khi đạt pH of 6.5 - Ghi nhận số lượng vôi trung hoà với 10 g cơ chất - Cho lượng vôi đã xác định vào trong lượng xác định của cơ chất. Trộn kỹ. Khả năng giữ nước: Khả năng giữ nước của chất mang xác định số lượng dịch sinh khối cần cho vào cơ chất. Cơ chất thì rất thay đổi trong khả năng giữ nước của nó. Kích thước hạt, lượng hữu cơ, sét của than bùn ảnh hưởng đến khả năng giữ nước. Tăng khả năng giữ nước là điều mng muốn để có số lượng lớn hơn dịch sinh khối đưa vào than bùn trước khi ủ. Ẩm độ ban đầu của than bùn cần được xác định. Điều này được thực hiện thuận lợi trên cân ẩm độ nhưng cũng có thể sử dụng tủ sấy. Cân chính xác lượng 10 g than bùn trong giấy bạc hoặc là cân trong đĩa thuỷ tinh và đặt nó vào trong tủ sấy 700C trong 48 hrs. Kiểm tra ẩm độ cuối cùng (không đổi). Ẩm độ = [(W1 – W2) x 100%]/W2 W1: trọng lượng chất mang trước khi sấy khô W2: Trọng lượng chất mang sau khi sấy khô 23 Xác định khả năng giữ nước của chất mang. Cân 100 g chất mang đã được làm khô vào erlen 500 ml. Thêm nước vào từ từ cho đến khi nó bão hoà. Thêm nước vào để có dịch sệt đều. Chuyển lượng này vào phễu thuỷ tinh đã được cân trước. Cho phép nước thoát ra qua đêm, sau đó cân phễu cộng với than bùn trong đó. Chỉ ra khả năng giữ nước trên trọng lượng khô của chất mang. Nếu 100 g than bùn khô có khả năng giữ 120 ml nước, thì khả năng giữ nước của nó là 120%. Xác định dịch sinh khối cho vào chất mang. Chuẩn bị 6 túi PE trong đó có chứa 50 g chất mang. Đối với túi đầu ti6n cho vào đó lượng nước ít hơn khả năng giữ nước của chất mang 5 ml. Nếu khả năng giữ nước là 60 ml (hay là 120%) thêm vào 55 ml. Túi thứ hai, ít hơn 5 ml (50 ml). Cứ như thế cho đến hết. Túi thứ 6 sẽ nhân được 30 ml. án các túi này vào và massage cho đến khi tất cả ẩm được hấp thu và hỗn hợp chất mang/nước trở nân đồng đều. Để các túi này trong 2 giờ sau đó mở túi ra và lấy ở mỗi túi vài gam và đặt lên tay. Hỗn hợp này cần ẩm nưng không được ướt. Nó cần rời ra trong tay và không được dính. Ghi số liệu tỷ lệ chất mang/nước đã sử dụng và sử dụng tỷ lệ này để tính toán mức ẩm độ cho mỗi chất mang. Mức ẩm độ này thường được chỉ trong % dựa trên trọng lượng ẩm. Bảng 15. pH và số lượng dịch sinh khối thêm vào trong than bùn ẩm* Than bùn pH Lượngdịch sinh khối Australia 7 65 IAS 6.5 24 Nghe An 5 50 U Minh 6 60 DakNong 6 38 Komix 1 5 35 Komix 2 5 25 Nguồn: OPI Than bùn Úc và IAS đã được chỉnh pH với vôi Than bùn ẩm*: 20% ẩm độ Lượng dịch sinh khối thêm vào than bùn thay đổi phụ thuộc vào nguồn than bùn (Bảng 15). Than bùn U Minh rất giống với than bùn thương mại của Úc với chất lượng chế phẩm cao. Ẩm độ 40 đến 50% thì thuận lợi nhất cho sự tăng trưởng và tồn tại của nhiều chủng rhizobia. Cải thiện ẩm độ than bùn hoặc là hỗn hợp của than bùn và các chất mang khác thì cần chú ý (Bảng 16). Trước khi trộn than bùn với dịch sinh khối, than bùn cần được khử trùng ở ẩm độ 20%. Hiệu quả khử trùng cần được xác định bằng cách tiêm dịch môi trường vào than bùn và xác định nhiễm trong 1 tháng. Hoà tan than bùn và pha loãng khi đếm rhizobia và trải lên trên môi trường glucose peptone.mà ở đó cơ chất bị nhiễm. Bảng 16. Nghiệm thức xác định ẩm độ tối ưu cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần Ẩm độ (%) Nước thêm vào (mL) Thể tích dịch (mL) Thể tích nước khử trùng (mL) 40 29.5 29.5 0 50 52.5 29.5 23 60 87.5 29.5 58 24 Tính toán dựa trên 70 g than bùn khô sau khi đã chỉnh về ẩm độ 20%. Cân bằng [1] được dùng cho tính toán ẩm độ của 70 g than bùn khô. Cân bằng giống như vậy cũng sẽ được sử dụng cho bất cứ số lượng than bùn nào nhưng nếu than bùn ẩm thì khối lượng than bùn khô cần được tính toán trước 70 100 x y x =+ [1] Trong đó x là lượng dịch thêm vào và y là ẩm độ cuối cùng (ví dụ là 50). Để điều chỉnh 70 g than bùn khô đến 20% cho sự khử trùng thì 17.5 ml nước cần thêm vào Ví dụ: Bao nhiêu dịch nghĩa là sinh khối lỏng được thêm vào 150g than bùn với 20% ẩm độ để có được ẩm độ là 35%? a) Khối lượng của than bùn khô 20 100 x 150 g = 30 g 150 g – 30 g = 120 g b) Ẩm độ thêm vào cho than bùn khô 35 120 100 x x =+ 0.35(120 )x x= + 42 0.35x x= + 0.35 42x x− = 0.65 42x = 64.6x = 64.6 g ẩm cần thêm vào 120 g than bùn khô để thu được 35%. Nếu than bùn đã có ẩm độ là 30 g thì 64.6 g – 30 g = 34.6 g cần thêm vào cho 150 g than bùn. Thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả của hỗn hợp than bùn, phân trùn và bụi xơ dừa cần có thiết kế như trình bày trong Bảng 10. Tất cả các chất mang cần phải được mang về ẩm độ 20% trước khi khử trùng và hiệu quả của khử trùng cũng phải được xác định như trong mô tả phần 2.1. Số lượng tế bào sống/g trong chất mang cần được xác định ở 1 tuần và 1 tháng. Phương pháp cần được xác định bởi đếm khuẩn lạc và MPN bằng cách nhiễm 2 cây cho pha mỗi nồng độ loãng 10-5 và 10-6 (nghĩa là 4 chất mang x 3 ẩm độ x 3 lập lại). Đếm số lượng rhizobium và xác định rhizobium trong các chế phẩm than bùn như sau: pha loãng chế phẩm trong nước vô trùng (10g chế phẩm trong 90 ml nước), sau đó chuẩn bị các dịch pha loãng cho đến 10-6. Cấy trải trên đĩa petri có môi trường CRYMA và đếm số khuẩn 25 lạc phát triển đồng thời nhiễm vào cây ở hai nồng độ pha loãng 10-5 và 10-6, lập lại hai lần cho mỗi nồng độ. Quan sát sự hình thành nốt sần Bảng 17. Thiết kế thí nghiệm xác định hiệu quả của các chất mang khác nhau Ẩm độ (%) Chất mang 40 50 60 Than bùn Than bùn + phân trùn Than bùn + bụi xơ dừa Than bùn + phân trùn + bụi xơ dừa Cần có 3 lần lập lại cho mỗi treatment. Số lượng tế bào đếm sau 1 tuần và 1 tháng. Phương pháp đếm là đếm khuẩn lạc và xác định bằng nhiễm vào cây. Hai cây cần được nhiễm cho mỗi pha loãng 10-5 và 10-6 . . Hình 7. Xác định số lượng và rhizobium sống trong chế phẩm trên nền than bùn tạp nhiễm Chế độ khử trùng: Khử trùng than bùn tốt hơn bằng chiếu xạ gamma. Khi mà rhizobia được tiêm vào than bùn trước đó đã sấy khô 100oC, chúng sẽ tồn tại rất kém do nhiệt tạo ra khi tạo hỗn hợp than bùn với dịch sinh khối và có sự tạo thành các chất ức chế từ xử lý nhiệt. Tại Úc than bùn được đóng gói sau đó khử trùng bằng tia gamma. Hiệu quả của việc khử trùng phụ thuộc sự sắp xếp các túi khi nó được chiếu cobalt 60 rods, độ ẩm của than bùn trong quá trình khử trùng và mức độ nhiễm. Nếu than bùn bị ướt trong thời gian dài sau khi khai thác thì có khả năng phát triển nhiều vi sinh vật tạp nhiễm. Một số vi sinh vật này có khả năng kháng với nhiệt và sự chiếu xạ và do đó trở thành trở ngại cho sản xuất. Khử trùng bằng tia gamma thì tăng đáng kể giá thành sản phẩm. 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Carrier suspended in sterile water (10 g in 90 mL, 10-1 dilution) Spread 0.1 mL on the surface of duplicate CRYMA plates and count colonies after growth taking note of diltuions with contamination Prepare dilution series to 10-6 Inoculate 2 plants from each of the 10-5 and 10-6 dilutions and check for nodules to confirm colonies are rhizobia on the corresponding plates 26 Hiện tại ở Việt nam khử trùng bằng nhiệt ẩm. Ẩm độ than bùn trước khi khử trùng cần được mang về 20%. Phụ thuộc vào mức độ nhiễm của than bùn theo nghĩa số lượng và loại vi sinh vật có trong cơ chất, chế độ khử trùng thì khác nhau. Thông thường than bùn được khử trùng ở 1210C từ 45–60 phút, hai lần và mỗi lần các nhau 24 giờ. Bảng 18. Ảnh hưởng của các phương pháp khử trùnhg khác nhau đến đ65 vô trùng của than bùn khử trùng Than bùn khử trùng Dịch sinh khối trong GPB, 3 giờ Dịch sinh khối trong GPB, 24 giờ Dịch sinh khối trong GPB, 36 giờ Dịch sinh khối trong GPB, 72 giờ Nghiệm thức M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 10 kGy - - - - + + + + + + 20 kGy - - - - - - + + + + 30 kGy - - - - - - + + + + A-30 min - - - - + + + + + + A-45 min - - - - + + + + + + A-60 min - - - - + + + + + + P-2 hrs - - + + + + + + + + P-4 hrs - - + + + + + + + + P-6 hrs - - + + + + + + + + Nguồn: OPI M1: CRYMA M2: Glucose Peptone Agar medium 10 kGy: 10 Kilogray – chiếu xạ gamma 20 kgy: 20 Kilogray – chiếu xạ gamma 30 kgy: 30 Kilogray – chiếu xạ gamma A-30 min: khử trùng bằng autoclave, 30 phút A-45 min: khử trùng bằng autoclave, 45 phút A-60 min: khử trùng bằng autoclave, 60 phút P-2 hrs: phương pháp pasteur, 2 giờ P-4 hrs: phương pháp pasteur, 4 giờ P-6 hrs: phương pháp pasteur, 6 giờ - không nhiễm + nhiễm Một thí nghiệm đã được hoàn tất so sánh các phương pháp khử trùng than bùn khác nhau. Sau khi than bùn được khử trùng một số mẫu được sử dụng trực tiếp để xác định tạp nhiễm. Các mẫu than bùn khác cấy vào môi trường Glucose Pepton lỏng và sau đó dịch lỏng này được đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật sau 3 giờ, 24, 36 và 72 giờ. Các mẫu này cũng đã được nhiễm với rhizobium và sau đó xác định số lượng trong mẫu theo thời gian. Kết quả được trình bày trong các bảng 18 – 20. Nghiệm thức tốt nhất tính theo số lượng rhizobium cao nhất và số lượng tạp nhiễm thấp nhất là nghiệm thức khử trùng bằng nhiệt ẩm và chiếu xạ gamma liều 30 kGy. 27 Bảng 19. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến số lượng của rhizobia trong than bùn Số lượng rhizobia/g than bùn ẩm Nghiệm thức 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần 10 kGy 50 x 107 45 x 107 53 x 107 13 x 108 20 kGy 10 x 108 16 x 108 98 x 107 25 x 108 30 kGy 12 x 108 18 x 108 16 x 108 32 x 108 A-30 min 12 x 107 65 x 107 12 x 108 27 x 108 A-45 min 22 x 108 20 x 108 12 x 108 28 x 108 A-60 min 31 x 108 28 x 108 20 x 108 30 x 108 P-2 hrs 19 x 107 44 x 107 25x107 12 x 107 P-4 hrs 22 x 107 32 x 107 30x107 21 x 107 P-6 hrs 63 x 107 10 x 107 26x108 10 x 107 Nguồn: OPI M1: CRYMA M2: Glucose Peptone Agar medium 10 kGy: 10 Kilogray – chiếu xạ gamma 20 kgy: 20 Kilogray – chiếu xạ gamma 30 kgy: 30 Kilogray – chiếu xạ gamma A-30 min: khử trùng bằng autoclave, 30 phút A-45 min: khử trùng bằng autoclave, 45 phút A-60 min: khử trùng bằng autoclave, 60 phút P-2 hrs: phương pháp pasteur, 2 giờ P-4 hrs: phương pháp pasteur, 4 giờ P-6 hrs: phương pháp pasteur, 6 giờ - không nhiễm + nhiễm Bảng 20. Ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng đến số lượng vi sinh vật tạp nhiễm trong than bùn Số lượng tạp nhiễm/ g than bùn ẩm Nghiệm thức 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần 10 kGy 38 x 106 50 x 106 16 x 107 27 x 107 20 kGy 17 x 106 17 x 106 12 x 106 30 x 106 30 kgy <102 <102 <102 16 x 105 A-30 min 16 x 107 70 x 106 19 x 107 Nhiễm vi nấm A-45 min 10 x 106 60 x 106 78 x 106 12 x 107 A-60 min 60 x 105 12 x 106 20 x 106 21 x 106 P-2 hrs 12 x 107 27 x 107 25 x 107 35 x 107 P-4 hrs 10 x 107 16 x 107 20 x 107 42 x 107 P-6 hrs 58 x 106 11 x 107 14 x 107 36 x 107 Nguồn: OPI M1: CRYMA M2: Glucose Peptone Agar medium 10 kGy: 10 Kilogray – chiếu xạ gamma 20 kgy: 20 Kilogray – chiếu xạ gamma 30 kgy: 30 Kilogray – chiếu xạ gamma A-30 min: khử trùng bằng autoclave, 30 phút 28 A-45 min: khử trùng bằng autoclave, 45 phút A-60 min: khử trùng bằng autoclave, 60 phút P-2 hrs: phương pháp pasteur, 2 giờ P-4 hrs: phương pháp pasteur, 4 giờ P-6 hrs: phương pháp pasteur, 6 giờ - không nhiễm + nhiễm Tạo chế phẩm Qui trình tạo chế phẩm trên nền chất mang cứng như sau: - Chuẩn bị các túi đựng than bùn đã khử trùng (hoặc là nguồn chất mmang khác) - Từ đường cong tiềm năng ẩm độ của chất mang, xác định số lượng sinh khối sẽ trộn vào than bùn để đạt được ẩm độ thích hợp cho sự tồn tại của rhizobia trong chất mang đó. - Làm sạch bề mặt của túi ở ngay vùng sẽ tiêm bằng cốn - Sử dụng xy lanh và kim tiêm khử trùng, cẩn thận lấy lượng dịch sinh khối đã xác định cho vào trong túi chất mang, tránh dịch này tràn ra ngoài theo đường tiêm. Khử trùng vùng tiêm này bằng cồn và sau đó thì dán với nhãn dính với tên chủng và ngày tiêm. - Cùng thời điểm đó, lấy một giọt dịch sinh khối đặt vào môi trường CRYMA, ria và ủ ở nhiệt độ 30°C trong vài ngày. Kiểm tra tạp nhiễm trong dịch sinh khối. - Xoa bóp nhẹ nhàng túi chế phẩm cho đến khi dịch sinh khối phân phối đều trong chất man, kiểm tra xem dịch sinh khối có phân bố đều ở 4 góc túi không. - Ủ các túi chế phẩm ở nhiệt độ phòng từ 1–4 tuần Công suất sản xuất qui mô nhỏ sử dụng than bùn/chất mang khử trùng có thể tăng lên bằng cách áp dụng klỹ thuật pha loãng dịch sinh khối. Chất lượng chế phẩm phụ thuộc vào chất lượng chất mang và chủng rhizobium Bảng 21. Ảnh hưởng pha loãng dịch sinh khối đến số lượng rhizobia trong chế phẩm Số lượng rhizobia/g than bùn ẩm Nghiệm thức (nguồn than bùn và múc độ pha loãng) Ban đầu 1 tuần 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng Úc 40x107 21x108 25x108 31x108 24x109 15x108 17x108 23x108 Komix 38x107 42x108 34x108 28x108 60x108 55x108 17x108 12x108 DakNong 20x107 15x108 25x108 25x108 25x108 14x108 11x108 10x108 DakNong+pha loãng 1/5 10x107 20x108 12x108 10x108 11x108 10x108 10x108 12x108 DakNong+ pha loãng 1/10 65x106 21x108 14x108 10x108 13x108 15x108 90x107 10x108 DakNong+pha loãng 1/100 70x105 12x107 10x108 56x107 40x107 32x107 70x107 50x107 Nguồn: OPI Chủng Rhizobium: CB1809 29 Kết quả (Bảng 21 và 22) cho thấy pha loãng sinh khối 1:10 hoặc 1:100 có thể sử dụng tạo chế phẩm. Tuy nhiên cần thiết kiểm tra với mỗi loại than bùn và xác định nồng độ pha loãng nào là phù hợp. Bảng 22. Ảnh hưởng dịch sinh khối pha loãng đến số lượng của rhizobia trong chế phẩm từ các chủng rhizobium khác nhau Số lượng rhizobia/g chế phẩm ẩm Chủng rhizobia 1: 1 1:10 1:100 1:1000 NC92 3,2 x 109 2,5 x 109 1,6 x 108 3,2 x 106 GL2 1,6 x 109 1,2 x 109 1,2 x 107 1,8 x 106 CB1809 6,5 x 109 7,4 x 109 5,8 x 109 1,5 x 106 SL2 6,6 x 109 3,4 x 108 1,4 x 107 1,6 x 105 Nguồn: ISF Sau hai tuần bảo quản Kiểm tra chất lượng sản phẩm Sau 1- 2 tuần ủ, chế phẩm cần phải kiểm tra chất lượng, như sau: • Kiểm tra ẩm độ (đối với chế phẩm trên nền chất mang rắn) • Đếm số lượng rhizobia/g bằng phương pháp đếm trực tiếp và gián tiếp (MPN) • Kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm • Nhuộm gram từ khuẩn lạc từ đếm trực tiếp • Kiểm tra phản ứng kháng nguyên – kháng thể Chỉ khi nào các kiểm tra này được thực hiện và chất lượng đạt chất blượng thì chế phẩm mới đưa vào nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm đồng ruộng. Qui trình QA: Hiện chưa có tiêu chuẩn dành riêng cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Việt nam, mà chỉ có tiêu chuẩn cho phân bón vi sinh vật cố định đạm. Tuy nhiên, rất cần thiết để có sự quản lý chất lượng (QA) hiệu quả cho chế phẩm. Đã cải tiến một số nội dung của tiêu chuẩn quôc gia Việt nam (TCVN 6166-1996), làm cho nó phù hợp hơn với chế phẩm rhizobium, dựa trên công nghệ sản xuất và các yêu cầu có hiệu quả. Tiêu chuẩn mới này sử dụng cấu trúc tốt của tiêu chuẩn hiện tại. Tên của tiêu chuẩn đề nghị là: Tiêu chuẩn Quốc gia Việt nam đối với Chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây họ đậu 1. Định nghĩa - Chế phẩm vi khuẩn nốt sần là các sản phẩm sinh học: • Bao gồm một hoặc hơn các chủng vi khuẩn rhizobium sống, mà chúng đã được chọn lọc để có khả năng cố định N và tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy • Sản xuất trên các chất mang khử trùng (cứng hoặc dịch thể) 30 2. Chỉ tiêu kỹ thuật CFU/g hoặc ml Tại lúc sản xuất Tại cuối hạn sử dụng Số lượng rhizobia ≥ 5 x 108 ≥ 5 x 107 Số lượng vi sinh vật tạp nhiễm Không có ở độ pha loãng 10-6 Không có ở độ pha loãng 10-6 MPN ≥ 5 x 107 ≥ 5 x 106 Ẩm độ 35 – 50% 35 – 50% Đặc trưng tế bào (ở các khuẩn lạc phát triển trên môi trường nuôi cấy ở độ pha loãng 10-6) Gram âm Phản ứng với huyết thanh tương ứng Kiểm tra PCR ngẫu nhiên. Gram âm Phản ứng với huyết thanh tương ứng Kiểm tra PCR ngẫu nhiên. - Ảnh hưởng đối với đất và cây: sản phẩm có ảnh hưởng dương tính đối với đất và cây. Điều này sẽ được công bố và chỉ ra trên nhãn hàng hoá và được xác định tại các phòng thí nghiệm được công nhận hoặc là chỉ định. - Hạn sử dụng: không ít hơn 6 tháng 3. Phương pháp xác định: Mỗi mẻ sản xuất sẽ lấy 5 mẫu đại diện (túi hay lọ) và được kiểm tra chất lượng theo thứ tự như sau: 1) Ẩm độ (nếu cần thiết) 2) Số lượng rhizobia/g hoăc ml được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp trên môi trường nuôi cấy đặc và gián tiếp MPN (số lượng có xác suất cao nhất). 3) Mẫu giống từ nuôi cấy trên môi trường đặc ở trên được quan sát dưới kính hiển vi, nhuộm gram và xác định gram 4) Mầu giống từ nuôi cấy trên môi trường đặc ở trên được kiểm tra phản ứng huyết thanh (nếu có thể). 5) 5 mẫu chế phẩm này sau đó được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi có kết quả đếm số lượng rhizobium trên môi trường đặc, chúng sau đó bỏ đi trong thùng rác công nghiệp. 4. Tính toán kết quả và báo cáo Kết quả số lượng rhizobium phương pháp trực tiếp và gián tiếp (MPN), ẩm độ, gram và huyết thanh từ 5 mẫu chế phẩm được ghi vào trong sổ nhật ký và dữ liệu trong máy vi tímh. Một báo cáo nhanh về kết quả (thành công hay thất bại của sản phẩm) sẽ được gởi đến nhà sản xuất về số lượng rhizobium (trực tiếp), gram và kết quả phản ứng huyết thanh. Báo cáo hoàn thất sẽ được chuyển đến nhà sản xuất sau khi hoàn thành thử nghiệm đếm gián tiếp MPN, khoảng 3 – 4 tuần sau khi thử nghiệm. 5. Tiêu chuẩn về nhãn hàng, bảo quản và hướng dẫn sử dụng - Nhãn hàng cần có các phần sau: • Tên của nhà sản xuất • Tên của sản phẩm và tên khoa học của chủng rhizobium sử dụng • Số lượng rhizobia • Ẩm độ • Loại cây họ đậu • Ngày sản xuất và hạn sử dụng 31 • Trọng lượng • Số đăng ký sản phẩm - Hướng dẫn sử dụng: • Liều lượng áp dụng • Cách sử dụng 5.3. Kết quả trình diễn đồng ruộng, bao gồm đánh giá sinh học và kinh tế, chỉ ra lợi nhuận sau này đối với hệ thống canh tác xen canh và hiệu quả của trình diễn đồng ruộng trong việc cải thiện hiểu biết của nông dân về lợi nhuận mang lại từ chế phẩm Các trình diễn đồng ruộng, bao gồm đánh giá sinh học và kinh tế Tổng số 168 trình diễn đã được thực hiện cho đến nay A total of 168 tại 10 tỉnh. Trình diễn đồng ruộng bao gồm hai nghiệm thức: +nhiễm và không hay có sử dụng phân bón N nhưng ở liều lượng thấp. Kết quả chỉ ra trong Phụ lục 3. Một cách tổng quát, sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần làm tăng thu nhập của nông dân, trung bình 4.500.000VNĐ/ha. Múc độ tăng thì thay đổi tuỳ theo địa diểm. Ở Bầu Đồn, Tây Ninh nông dân trồng lạc lợi được khoảng 500.000VNĐ/ha nhưng ở Châu Thành, Trà Vinh nông dân thu lợi cao hơn nhiều 14.200.000VNĐ/ha. Tương tự đối với đậu tương, lợi nhuận tăng thêm là 11.640.000VNĐ ở Dương Minh Châu, Tây Ninh. Tại tỉnh Đồng Tháp nông dân thu lợi từ chế phẩm trung bình là 4.900.000VNĐ/ha. Tại Đồng Tháp, làng Phú Hữu, huyện Châu Thành, đã thực hiện trình diễn trên diện tích đất lớn (61.5 ha) và với sự tham gia của 120 nông dân, năng suất tăng trung bình là 12.5%, tương đương với 300 kg hạt/ha. Nông dân thu lợi khoảng 4.900.000 VNĐ/ha so với lối canh tác cũ dùng phân bón N hoá học (Biểu đồ 11). Graph 11. Profits from inoculation of soybean in Dong Thap Province -6000000 -4000000 -2000000 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 0 20 40 60 80 100 120 140 Field sites Pr of its (V N D ) Lợi nhuận đối với hệ thống trồng luân canh Lợi nhuận kinh tế chính trong hệ thống cây trồng trong đó phân bón hoá học N đã được thay thế bằng chế phẩm vi khuẩn nốt sần đã được trình bày trong phần trước (Biểu đồ 11 và Phụ 32 lục 3). Tiềm năng lợi nhuận khác hơn đã không (và sẽ không thể) đánh giá bởi vì các trọng tâm của dự án này là sản xuất, chất lượng, phân phối, thị trường và đào tạo nông dân. Hơn nữa, đây là dự án ngắn hạn (2 năm) nên lợi nhuận kế tiếp của chế phẩm không thể đánh giá được. Kết quả từ các nghiên cứu khác cho chúng tôi kết luận rằng ảnh hưởng đến môi trường dài hạn đặc biệt là đối với chất lượng nước, và ở mức độ hẹp hơn, chất lượng đất, cũng như lợi nhuận kinh tế. Hiệu quả của trình diễn đồng ruộng trong việc tăng cường hiểu biết của nông dân về lợi ích của chế phẩm vi khuẩn nốt sần Nông dân đã được mời đến ruộng trình diễn ít nhất là một lần, ở nhiều điểm trình diễn nông dân thăm ruộng, lấy mẫu nốt sần, mẫu sinh khối và thu hoạch hạt. Có hơn 3400 lượt người tham gia. Tại làng Phú Hữu đã có 360 lượt nông dân đến điểm trình diễn 3 lần, ở lúc trồng, rộ hoa và thu hoạch (Xem Phụ lục 4 và 5). Nông dân cũng được cung cấp tài liệu khuyến nông. Hơn nữa, cán bộ dự án, khuyến nông viên giải thích cho nông dân hiểu biết về cố định đạm sinh học, vi khuẩn nốt sần hoạt động như thế nào và điều kiện gì để quá trình nhiễm đạt hiệu quả cao. Nông dân rất hứng thú trong việc tìm hiểu về quá trình cố định đạm khí trời bởi rhizobium. Đánh giá về hiệu quả của hiệu quả của các trình diễn đồng ruộng tăng hiểu biết của nông dân về lợi ích của chế phẩm vi khuẩn nốt sần đã được thực hiện bởi điều tra từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2009. Chi tiết sẽ được trình bày trong báo cáo kế tiếp về Đánh giá Dựán. Phụ lục 1. Tóm tắt thí nghiệm đồng ruộng 2007–09. Ảnh hưởng của CB1809 và NC92 đến nốt sần, sinh khối và năng suất hạt Vùng Tỉnh Làng Cây Thời gian gieo Ảnh hưởng nhiễm với NC92 hoặc CB1809) lên - Nốt sần Năng suất sinh khối Năng suất hạt Northern Highland Son La Muong Chum Soybean April ‘07 Small (+18%) Large (+44%) Large (+68%) Co Noi Soybean April ‘07 Large (+44%) Moderate (+22%) Moderate (+37%) Soybean April 08 Small (+13) Small (+9) Small (+8) Chieng Ban Soybean April ‘07 Moderate (+36%) Moderate (+17%) Moderate (+31%) Soybean April 08 Small (+17) Small (+10%) Large (70%) Son La town Sobean April 08 Small (+13) Small (+16) Small (+4) Coastal North Nghe An Dien Phong Groundnut Jan 08 Moderate (+37%) Moderate (+32%) Small (9%) Dien Ky Groundnut Jan 08 Small (13%) Moderate (20%) Small (18%) Nghi Phong Groundnut Mar 08 Large (+58%) Moderate (24%) Large (50%) Central Coastal South Binh Dinh Phu Cat Groundnut Jan 08 Large (+94%) Moderate (+20%) Moderate (+33%) An Nhon Soybean Jan 08 Small (+18%) Moderate (+37%) Moderate (+24%) Central Highlands DakLak Quang Hiep Soybean August ‘07 Small (-2%) Small (+19%) Small (5%) Groundnut August ‘07 Large (+79%) Large (+48%) Moderate (+25%) CuMgar Soybean August ‘07 Large (+57%) Moderate (+44%) Moderate (+20%) Groundnut August ‘07 Large (+55%) Large (+47%) Moderate (+34%) DakNong CuJut Soybean August ‘07 Large (+46%) Large (+47%) Moderate (+24%) Groundnut August ‘07 Small (+3%) Small (+7%) Small (+13%) Soybean May ‘08 Moderate (+25%) Moderate (+29) Large (+43%) South East Upland Binh Thuan Bac Binh Groundnut May 08 Large (+69) Moderate (+30) Moderate (32) Tuy Phong Groundnut May 08 Large (+46) Moderate (+22) Large (+32) Tuy Phong Groundnut May 08 Large (+66) Moderate (+40) Moderate (+40) Tuy Phong Groundnut May 08 Large (+58) Large (+49) Moderate (31) Tay Ninh Bau Don Groundnut Dec 07 Large (104%) Small (15%) Moderate (+28%) Phuoc Dong Groundnut Dec 07 Large (+65%) Small (+5%) Moderate (+30%) Bau Don Groundnut Nov 08 Large (+65%) Moderate (+24%) Moderate (+24%) Phuoc Dong Groundnut Nov 08 Large (+104%) Moderate (+20%) Moderate (+27%) 34 Phuoc Dong Groundnut Dec 08 Large (+119%) Moderate (+20%) Small (+18%) Phuoc Dong Groundnut Dec 08 Large (+84) Moderate (+20%) Moderate (+20%) Mekong Delta Dong Thap Cao Lanh City Soybean March 08 Large (+61%) Large (+51%) Large (+40%) Cao Lanh Soybean March 08 Large (+166%) Large (+58%) Small (+9%) An Giang Chau Phu Soybean March 08 Large (+78%) Moderate (+28%) Moderate (+20%) Tan Chau Soybean March 08 Large (+125%) Large (+46%) Large (+46%) Cho Moi Soybean March 08 Large (139%) Large (+60%) Large (+41%) Tra Vinh Duyen Hai Groundnut Jan 08 Small (+15%) Large (+46%) Small (+12%) Cau Ngang Groundnut Jan 08 Large (+43%) Small (+9%) Small (+6%) Chau Thanh Groundnut April 08 Large (+53%) Large (+86%) Large (+59%) Large effect: > 40% Moderate effect: 20 – 40% Small effect: <20% Phụ lục 2. Tóm tắt thí nghiệm đồng ruộng 2007–09. Ảnh hưởng của CB1809 và NC92 so với các chủng Việt nam Vùng Tỉnh Làng Cây Thời gian gieo % Tăng do CB1809 hoặc NC92 so với các chủng Việt nam Nốt sần Sinh khối Năng suất hạt Local1 Local2 Local1 Local2 Local1 Local2 Northern Highland Son La Muong Chum Soybean April ‘07 9 18 19 7 32 7 Co Noi Soybean April ‘07 (-) (-) 7 7 13 14 Soybean April 08 6 3 12 7 5 5 Chieng Ban Soybean April ‘07 (-) (-) (-) (-) 10 12 Soybean April 08 5 4 10 7 51 28 Son La town Sobean April 08 6 3 10 14 1 2 Coastal North Nghe An Dien Phong Groundnut Jan 08 9 3 5 6 6 6 Dien Ky Groundnut Jan 08 2. 8 7 13 4 4 Nghi Phong Groundnut Mar 08 13 4 13 2 48 22 Central Coastal South Binh Dinh Phu Cat Groundnut Jan 08 50 35 (-) 3 (-) 3 An Nhon Soybean Jan 08 23 27 2 10 3 5 Central Highlands DakLak Quang Hiep Soybean August ‘07 8 15 7 3 7 3 Groundnut August ‘07 3 (-) 10 9 12 8 CuMgar Soybean August ‘07 (-) 7 (-) 2 1 6 Groundnut August ‘07 43 53 26 24 25 15 DakNong CuJut Soybean August ‘07 29 26 17 22 16 15 Groundnut August ‘07 1 1 5 9 5 15 South East Upland Binh Thuan Bac Binh Groundnut May 08 27 8 12 6 20 8 Tuy Phong Groundnut May 08 54 23 7 4 35 26 Tuy Phong Groundnut May 08 34 15 12 7 20 12 Tuy Phong Groundnut May 08 15 9 11 5 18 9 Tay Ninh Bau Don Groundnut Dec 07 26 36 12 3 13 5 Phuoc Dong Groundnut Dec 07 21 32 6 8 11 14 Bau Don Groundnut Nov 08 21 31 6 8 11 14 Phuoc Dong Groundnut Nov 08 26 36 12 3 13 5 Phuoc Dong Groundnut Dec 08 14 25 3 1 5 4 36 Phuoc Dong Groundnut Dec 08 8 4 5 4 3 2 Mekong Delta Dong Thap Cao Lanh City Soybean March 08 38 42 28 30 22 15 Cao Lanh Soybean March 08 28 41 13 5 5 (-) An Giang Chau Phu Soybean March 08 54 59 16 15 14 13 Tan Chau Soybean March 08 63 61 7 7 13 16 Cho Moi Soybean March 08 70 39 28 19 12 6 Tra Vinh Duyen Hai Groundnut Jan 08 13 16 7 9 (-) (-) Cau Ngang Groundnut Jan 08 5 12 8 9 6 2 Chau Thanh Groundnut April 08 22 27 21 27 22 27 (-): no increase 37 Phụ lục 3. Tóm tắt các trình diễn đồng ruộng 2007–2009. Phân tích hiệu quả kinh tế Vùng Tỉnh Làng Cây Thời gian gieo Nghiệm thức Năng suất hạt Tổng chi Tổng thu Lãi ròng Lợi nhuận từ chế phẩm Farmer practice Inoculation 2.46 2.59 6.050 5.270 6.588 7.716 538 2.446 - 1.908 Co Noi Soybean April ‘07 Farmer practice Inoculation 3.20 3.56 6.050 5.270 19.182 21.336 13.132 16.066 - 2.934 Soybean April 08 Farmer practice Inoculation 3.58 3.63 8.600 7.720 35.770 36.320 27.170 28.990 - 1.820 Chieng Ban Soybean April ‘07 Farmer practice Inoculation 3.47 3.53 6.950 5270 20.802 21.180 14.752 15.910 - 1.158 Soybean April 08 Farmer practice Inoculation 3.45 3.46 8.60 7.720 34.500 34.600 25.900 26.880 - 980 Son La town Sobean April 08 Farmer practice Inoculation 1.48 1.51 8.600 7.720 14.820 15.050 6.220 7.330 - 1.100 Coastal North Nghe An Dien Phong Groundnut Jan 08 Farmer practice Inoculation 2.38 2.45 19.570 19.140 59.50 61.300 39.930 42.160 - 2.230 Dien Ky Groundnut Jan 08 Farmer practice Inoculation 1.82 1.85 19.570 19.140 45.425 46.625 25.855 27.85 - 1.63 Nghi Phong Groundnut Mar 08 Farmer practice Inoculation 3.56 3.62 19.570 19.141 88.900 90.600 69.330 71.46 - 2.13 Mar 08 Farmer practice Inoculation 3.70 3.91 19.570 19.141 92.500 97.675 72.93 78.535 - 5,70 Nghi Thinh Groundnut Mar 08 Farmer practice Inoculation 3.58 3.58 19.570 19.141 85.125 89.500 65.555 70.360 - 4.81 Central Coastal South Binh Dinh Phu Cat Groundnut July 08 Farmer practice Inoculation 2.70 3.16 17.500 16.200 37.800 44.240 20.300 28.040 - 7.740 Phu Cat Groundnut Dec 08 Farmer practice Inoculation 2.52 3.00 18.750 17.230 24.696 29.400 5.946 12.170 - 6.224 Phu Cat Groundnut July 09 Farmer practice 2.83 17.650 28.300 10.650 - 38 Inoculation 3.35 16.250 33.350 17.100 6.450 An Nhon Soybean Jan 09 Farmer practice Inoculation 1.20 1.42 12.810 12.540 15.600 18.460 2.790 5.920 - 3.130 An Nhon Soybean Jan 09 Farmer practice Inoculation 1.71 1.95 13.648 12.700 22.233 25.350 8.580 12.650 - 4.070 An Nhon* Soybean July 09 Farmer practice Inoculation Central Highlands DakLak Quang Hiep Soybean August ‘07 Farmer practice Inocultion 2.33 2.56 10.200 6.335 23.300 25.600 13.100 19.265 - 6.165 Groundnut August ‘07 Farmer practice Inoculation 2.10 2.20 8.869 7.989 21.000 22.000 12.131 14.011 - 1.880 CuMgar Soybean August ‘07 Farmer practice Inoculation 2.21 2.35 10.200 6.335 22.100 23.500 11.900 17.165 - 5.265 groundnut August ‘07 Farmer practice Inoculation 2.00 2.20 8.869 7.989 20.000 22.000 11.131 14.011 - 2.880 DakNong CuJut Soybean August ‘07 Farmer practice Inoculation 3.43 3.57 11.228 9.559 34.300 35.750 23.072 26.195 - 3.119 groundnut August ‘07 Farmer practice Inoculation 1.68 1.87 9.507 7.890 16.800 18.700 7.293 10.810 - 3.517 Soybean May ‘08 Farmer practice Inoculation 1.51 2.78 11.500 10.980 15.100 27.800 3.600 12.700 - 9.100 Soybean May ‘08 Farmer practice Inoculation 2.71 3.05 12.400 11.880 27.100 30.500 14.700 18.620 - 3.920 groundnut Aug ‘08 Farmer practice Inoculation 2.04 2.75 13.400 12.880 28.560 38.500 15.160 25.620 - 10.460 South East Upland Binh Thuan Bac Binh groundnut May 08 Farmer practice Inoculation 2.00 2.10 16.000 15.242 26.000 27.326 10.000 12.058 - 2.058 Tuy Phong groundnut May 08 Farmer practice 2.30 17.000 29.900 12.900 - 39 Inoculation 2.70 16.231 35.100 18.869 5.969 groundnut May 08 Farmer practice Inoculation 2.10 2.30 16.500 15.560 27.300 29.900 10.800 14.340 - 3.540 groundnut May 08 Farmer practice Inoculation 2.10 2.20 16.800 15.697 27.300 28.600 10.500 12.903 - 2.403 Tay Ninh Bau Don groundnut Dec 07 Farmer practice Inoculation 3.39 3.29 21.000 19.206 44.070 42.770 23.070 23.564 - 494 Phuoc Dong groundnut Dec 07 Farmer practice Inoculation 3.86 4.05 22.500 20.955 50.180 52.650 27.680 31.695 - 4.015 Phuoc Dong Groundnut Nov 08 Farmer practice Inoculation 3.10 3.08 25.870 23.073 27.900 27.810 2.030 4.737 - 2.707 Phuoc Dong Groundnut Dec 08 Farmer practice Inoculation 2.97 2.98 25.125 23.073 26.730 26.820 1.605 3.747 - 2.142 Duong Minh Chau ** Groundnut Dec 08 Farmer practice Inoculation 3.42 4.05 22..400 20.800 46.200 55.900 23.800 35.100 - 11.300 Duong Minh Chau Soybean Dec 08 Farmer practice Inoculation 2.40 3.75 12.300 10.500 26.700 36.540 14.400 26.040 - 11.640 Mekong Delta Dong Thap Cao Lanh City Soybean March 08 Farmer practice Inoculation 2.95 3.06 14.498 13.018 35.400 36.720 20.902 23.702 - 2.800 Cao Lanh Soybean March 08 Farmer practice Inoculation 2.61 2.73 13.980 11.119 31.320 32.760 17.360 21.641 - 4.281 Chau Thanh** Soybean Feb 09 Farmer practice Inoculation 1.80 2.14 14.173 12.641 17.100 20.311 2.927 4.903 - 4.903 An Giang Chau Phu Soybean March 08 Farmer practice Inoculation 2.84 3.45 12.983 11.783 28.400 34.500 15.417 22.717 - 7.300 Tan Chau Soybean March 08 Farmer practice Inoculation 2.74 3.31 14.275 13.315 27.400 33.100 13.125 19.785 - 6.660 Cho Moi Soybean March 08 Farmer practice Inoculation 2.94 3.57 11.213 10.253 29.400 35.700 18.187 25.447 - 7.260 Tra Vinh Duyen Hai groundnut Jan 08 Farmer practice Inoculation 2.89 3.01 25.170 24.540 46.240 48.160 21.070 23.620 - 2.550 40 Cau Ngang groundnut Jan 08 Farmer practice Inoculation 3.45 3.86 25.170 24.540 55.200 61.760 30.030 37.210 - 7.180 Chau Thanh groundnut April 08 Farmer practice Inoculation 2.25 3.05 23.000 22.120 38.500 50.850 15.50 29.73 - 14.230 Chau Thanh*** groundnut Jan 09 Farmer practice Inoculation 4.00 4.50 24.300 23.170 40.000 45.500 15.70 22.33 - 6.630 Cau Ngang*** groundnut Jan 09 Farmer practice Inoculation 3.90 5.00 21.200 18.900 39.000 45.000 17.800 26.100 - 8.300 *: data on average of 2 fields **: data on average of 120 field sites, 61.5 ha **: data on average of 5 field sites ***: data on average of 3 field sites 41 42 Phụ lục 4. Tờ bướm cho công tác khuyến nông về chế phẩm nốt sần cho cây đậu tương 43 Phụ lục 5. Tờ bướm cho công tác khuyến nông về chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây đậu phộng