Thí nghiệm công nghệ sinh học

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 1 BÀI MỞ ĐẦU: MÔ PHỎNG THÍ NGHIỆM 1. Mô phỏng điện di protein trên điện di đứng. 2. Mô phỏng điện di protein bằng phương pháp điện di 2 chiều. 3. Mô phỏng các phương pháp lai. BÀI 1: CHIẾT TÁCH ADN TỪ TẾ BÀO LÁ NON 1. Vật liệu và hóa chất 1.1 Vật liệu sinh học Lá non 1.2 Hóa chất Dung dịch đệm 1.5 CTAB (Cetyltrimethyllammonium bromide) 1.5% CTAB 75mM Tris-HCL 15mM EDTA 1.05M NaCl Đệm kết tủa CTAB 1% CTAB 50mM Tris-HCL 10mM EDTA Đệm TE 10mM Tris-HCl 1mM EDTA Đá khô Nitơ lỏng Chloroform: isoamylalcohol (24:1) 10mg/ml RNase 99.5% , 70% ethanol 1M NaCl 10% CTAB Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 2 2. Dụng cụ thiết bị Máy xay Máy li tâm Eppendorf 1.5ml Ống dùng để quay li tâm loại 50 ml Micropipette 20, 200, 1000µl Bình tam giác 3. Nguyên tắc Để tiến hành tách ADN từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa ADN bằng cồn. Tủa sau khi thu được được hòa tan lại trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy theo mục đích nghiên cứu. Khác với tách mô động vật, khi tách mô thực vật thì ta phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thực vật. Ở đây ta dùng phương pháp tách CTAB tức là dùng dung dịch đệm CTAB để tách ADN ra khỏi mô thực vật. Chất này chỉ hòa tan ADN chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà có thể loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách ADN. 3.1 Phá bỏ màng tế bào và màng nhân Người ta có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa học hay cơ học. Ở đây chúng ta dùng phương pháp cơ học, nghiền nát bằng máy xay và dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bào lá lúa. 3.2 Chiết ADN và loại bỏ protein Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm CTAB để hòa tan ADN. Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và ARN nên để thu nhận được ADN tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và ARN. Ở đây thường dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch có chứa ADN. Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa hai pha nước và pha chloroform. Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 3 3.3 Kết tủa CTAB và ADN Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và ADN rồi sau đó hòa tan ADN trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trong dung dịch này. 3.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa ADN bằng etanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa ta có thể pha thêm dung dịch muối CH3COONa 3M (2 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa. Ngoài ra còn có thể tủa bằng isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần tủa. Muối lẫn trong ADN sẽ ảnh hường đến kết quả các thí nghiệm sau này nên người ta thường tiến hành rửa tủa ADN bằng dung dịch ethanol 70%. 4. Các bước tiến hành 4.1. Nghiền nhỏ mẫu thực vật - Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn. - Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng. 4.2. Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách ADN và loại bỏ protein - Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã được xử lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ. - Ngâm trong bể nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút. - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút) - Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn đều. - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng.Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút). Thu lớp nước trên vào ống nghiệm mới. Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 4 4.3 Kết tủa CTAB và ADN - Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu được ở thí nghiệm trên) đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNA màu trắng đục nổi lên. - Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng thu phần kết tủa. 4.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN - Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56 oC NaCl 1M và cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA . - Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN. - Quay li tâm, lấy phần tủa. - Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa. - Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa. - Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN. Lúc này ADN sẽ chuyến sang trong suốt không màu - Hòa tan ADN thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20 oC cho thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 5 BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA ADN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HẤP THỤ 1. Nguyên tắc 1.1 Đo hàm lượng ADN Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định. Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260 nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230 nm-240 nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310 nm. Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí nghiệm này pha loãng ADN trong dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng. Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của ADN. Hàm lượng ADN (ng/µl) =50×HSPL×OD260 (1) Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi. Đối với ADN biến tính sợi đơn hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm tăng lên và được tính bởi công thức sau: Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD260 (2) Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD260 (3) Trong đó HSPL : hệ số pha loãng OD260 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm OD280 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm 1.2 Đo độ tinh sạch của ADN Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm.Được tính bằng công thức sau: Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 6 Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4) Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch ADN sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy. 1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect) Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN biến tính tức là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. ADN không bền đối với nhiệt. Khi tăng nhiệt độ của ADN lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro. Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt cặp lại khi làm lạnh đột ngột sau khi biến tính. 2. Dụng cụ và hóa chất Mẫu ADN: mẫu được tách ra từ lá mía ở bài trước Nước cất tuyệt trùng Đá lạnh Eppendorf 1.5ml Micropipette 20, 200, 1000µl Máy soi màu Máy lắc Vortex Bếp 3. Các bước thí nghiệm Biến tính ADN - Hút 5µl ADN mẫu cho vào 2 eppendorf loại 1.5ml. Chú ý trước khi hút mẫu cần phải vortex để trộn đều mẫu. - Đun cách thủy mẫu ADN trong vòng 10 phút . - Làm lạnh đột ngột một ống bằng cách đặt trên đá đang tan trong 10 phút. Ống còn lại thì làm nguội ở nhiệt độ phòng. Chuẩn bị mẫu - Pha loãng 100 lần mẫu ADN bằng nước cất tuyệt trùng (5µl ADN + 495µl nước cất tuyệt trùng). - Pipetting hoặc Vortex chộn đều dung dịch pha Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 7 Đo độ hấp thụ trên máy soi màu - Rửa sạch cuvet thạch anh rồi tráng bằng nước cất để khô ráo. - Nước cất tuyệt trùng (nước dùng pha loãng ADN) để làm chuẩn chuẩn chỉnh cân bằng máy. - Lắc đều dung dịch mẫu đo trước khi tiến hành đo mẫu. - Đo ở bước sóng 260nm và 280nm. 4. Kết quả Bảng 1 : Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN Bước sóng ADN không biến tính ADN biến tính ADN phục hồi sau biến tính 260 nm 280 nm Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 8 BÀI 3: XÁC ĐịNH HÀM LƯỢNG ADN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI NGANG 1. Khái niệm về điện di Điện di là một kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm sinh học, hóa học, đặc biệt là sinh học phân tử để tách các hạt tích điện như là ADN, ARN, protein...Như chúng ta đã biết các phân tử nucleic acid tích điện âm và khi đặt chúng trong một điện trường thí các phần tử tích điện này sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Khi tiến hành điện di trên bản gel (gel agarose hoặc là gel polyacrylamid), các phần tử này sẽ dịch chuyển qua các lỗ gel để đến cực dương. Các hạt có kích thước nhỏ dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel, các hạt có kích thước lớn thì di chuyển chậm hơn. Chính vì vậy mà có thể phân tách các hạt tích điện này theo kích thước bằng cách điện di trên gel. Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel polyacrylamid. Gel agarose cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đôi có kích thước từ 100 đến 10000 bp. Còn gel polyacrylamid cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotid và còn có thể tách riêng từng phân tử ADN có kích thước khác nhau một nucleotid. Tùy theo kích thước đối tượng ADN muốn tách mà ta có thể pha gel với các nồng độ khác nhau. Nồng độ Agarose Kích thước phân tử ADN cần phân li (bp) 0.6% 1000 - 20000 0.7% 800 - 10000 1% 500 - 7000 1,2% 400 - 6000 1,5% 200 - 3000 2,0% 100 - 2000 Trong điện di ADN thường sử dụng hai loại đệm đó là đệm TBE và đệm TAE. Đệm TAE dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước lớn còn đệm TAE thường dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước nhỏ. Nhưng Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 9 λHinIII digest bp 23130 9416 6557 2322 2027 564 125 trong trường hợp cần làm sạch ADN thì phải dùng đệm TAE vì đệm TBE có chứa boric acid làm ảnh hưởng đến qúa trình làm sạch sau này. Sau khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử ADN trên gel. Đối với gel Agarose thì người ta dùng thuốc nhuộm ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử ADN và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại.Đối với gel polyacrylamid các phần tử được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng được phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ tự ghi. Máy điện di ngang HOEFER HE33 Máy HOEFER HE 33 là thiết bị điện di trên gel agarose loại nhỏ, có cấu tạo dạng nằm ngang. Máy HE 33 được chế tạo dựa trên ý tưởng cần tiến hành điện di nhanh với một lượng nhỏ ADN trên gel agarose. Thiết bị gồm có các bộ phận chính sau: - Nắp: là phần trên của thiết bị có thể tháo rời. - Các dây dẫn: gồm hai dây dẫn màu đen và màu đỏ nối vào cực dương và cực âm của bộ điện di với nguồn điện. - Điện cực: cắm trong gel gồm hai điện cực dương (có màu đỏ), âm (có màu đen) - Khuôn đổ gel: dùng để đổ gel chạy điện di. Khuôn gồm khay, giá đỡ, các miếng gạc hút bọt và lược. - Buồng điện di: dùng để chạy điện di, gồm buồng chạy điện di, điện cực, buồng làm lạnh. Thang ADN (maker) Khi điện di thì người ta thường điện di với thang ADN chuẩn hay còn gọi là maker để dựa vào đó mà ta có thể xác định được mẫu ADN đem đi điện di. Trong bài thí nghiệm này chúng ta sử dụng λ-HinIII, các phân tử ADN của phase λ sau khi được cắt bởi enzyme cắt hạn chế HinIII. Kích thước của các phần tử có trong thang được biểu diễn ở hình bên. 2. Dụng cụ và hóa chất 2.1 Vật liệu sinh học ADN tách từ lá lúa ở bài 1 Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 10 Thang DNA (maker) : λHinIII 2.2 Hóa chất + Agarose (0.8%) : pha 4g agarose trong 50ml dung dịch đệm TAE + Đệm điện di TAE 1× Tris base 0,4M 44,8g Acetic acid 0,2M 11,4g EDTA 0,01M 20,0ml Định mức đến 1000ml + Đệm tải mẫu Glycerol 30% Brommophenol Blue 0,25% Tris 200mM Na2EDTA 20mM + Thuốc nhuộm ADN: dung dịch ethidiume bromide 10mg/ml 2.3 Dụng cụ Máy li tâm Eppendorf 1.5ml Micropipette 20, 200, 1000µl Máy điện di ngang HOEFER HE33 Bộ nguồn điện di điện thế từ 80 -150V Bộ chụp ảnh trên đèn UV Lò vi sóng Bình tam giác 3 Các bước tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị gel Trong bài thí nghiệm này tiến hành điện di ADN được chiết tách ra từ lá mía ở bài 1 và điện di trên gel agarose 0.8% với đệm điện di là đệm TAE. - Pha loãng 10 lần đệm 10×TAE bằng nước cất. - Cân 0.8g agarose vào bình tam giác loại 300ml, có cho lắc từ vào - Cho 100ml đệm 1×TAE đã được chuẩn bị ở trên. - Bao miệng hình tam giác bằng nilông rồi đun nóng trong lò vi sóng 30 giây, lắc cho gel tan hoàn toàn. Nếu chưa tan hoàn toàn thì lại làm tiếp như trên Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 11 cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chú ý không để cho gel trào ra miệng bình ra ngoài vì gel agarose nóng chảy gây bỏng rất nặng. - Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khoảng 60 - 50 độ (cho đến khi có thể sờ tay vào thành bình trong vòng 1 phút, nếu nóng quá sẽ làm hỏng thiết bị điện di còn nguội quá gel sẽ đông trước khi cho gel vào khuôn gel, hoặc gel đông không đều) - Cài lược và cho gel vào khuôn gel - Chờ cho gel đông tụ hoàn toàn (khoảng 30 phút đến 1 tiếng) rồi sau đó đặt gel vào buồng điện di rồi tháo lược. - Sau khi gel đông tụ hoàn toàn, đổ đệm vào buồng điện di. Đổ cho đến khi mức dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel khoảng 1cm. 3.2 Chuẩn bị mẫu và điện di - Cho vào ống eppendorf 1,5ml 2µl mẫu ADN và 1µl dung dịch tải mẫu, 7µl nước cất tuyệt trùng. - Trộn đều bằng pipetman (pipetting). Nếu dung dịch pha mẫu dính trên thành ống thì li tâm để mẫu rơi xuống hết đáy (spin down). - Dùng pipetman nạp mẫu và nạp chuẩn (2µl) vào giếng gel. - Đậy nắp buồng điện di, cắm điện cực - Điện di với hiệu điện thế 90V-120V trong vòng 30 phút 3.3 Nhuộm và hiển thị trên gel. - Sau khi điện di xong, rút điện mở nắp và lấy bản gel ra - Cho bản gel vào chậu dung dịch nhuộm ethidium bromide ngâm trong vòng 30 phút. Chú ý phải đeo bao tay khi tiếp xúc với ethidium bromide vì chất này gây ung thư. - Vớt bả gel ra và xem kết quả trên đèn UV, hoặc chụp hình kết quả Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 12 BÀI 4: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CHỦNG E. coli 1. Nguyên tắc Phương pháp PCR thường được dùng để phát hiện các khuẩn mang mầm mống bệnh hay các chủng vi sinh vật có trong môi trường. Đem nhân dòng bằng phương pháp PCR một gen đặc hiệu của một chủng vi sinh vật nào đó, nếu đoạn gen đó được nhân lên thì chứng tỏ chủng vi sinh vật đó có chứa trong mẫu cần kiểm tra. Ở đây chúng ta sử dụng đầu mồi của gen rnhA có trong chủng E. Coli để kiểm tra sự hiện diện của chủng E.coli trong mẫu cần phân tích . Một thí nghiệm để phát hiện khuẩn mang mầm mống bệnh gồm các bước sau: Tăng sinh: Tăng số lượng vi khuẩn có trong mẫu trước khi đem tiến hành nhân dòng bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trong dịch nuôi. Xử lí mẫu: Thu vi sinh vật sau khi nuôi cấy và phá bỏ màng tế bào để thu ADN Phản ứng PCR: nhân dòng bằng phương pháp PCR Phân tích sản phẩm sau khi nhân dòng bằng phương pháp điện di ADN 1.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR PCR là phương pháp khuếch đại tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục đích thu một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định. Đầu tiên ADN đích (target ADN) được làm biến tính để tách mạch đôi thành mạch đơn (annealing) Nhiệt độ sau đó được hạ thấp cho phép mồi (primer) có thể bắt cặp với sợi khuôn. Với sự có mặt của các dNTP, DNA polymerase và trong môi trường phản ứng thích hợp đoạn mồisẽ được nối dài để tạo ra mạch ADN mới.Chu trình trên được lặp đi lặp lại nhiều lần từ một lượng ADN nhỏ ta có thu được hàng triệu bản sao. 1.2 Mồi (primer) Mồi là đoạn ADN ngắn khoảng trên dưới 20 nucleotid có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu mạch khuôn ADN có mang một đầu 3'-OH tự do giúp ADN polymerase khởi đầu sự tổng hợp một chuỗi mạch mới. Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt: mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer) để bắt cặp bổ xung với hai đầu của một trình tự ADN thì sau nhiều chu kì thì ta thu được sản phẩm chủ yếu là đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Kết quả phản ứng PCR phụ Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 13 thuộc nhiều vào đoạn mồi được thiết kế. Mồi thiết kế phải tuân thủ theo các nguyên tắc sau. -Mồi thường khoảng trên dưới 20 nucleotid và có lượng GC vào khoảng 50-60%. - Tm của mồi xuôi và ngược không khác nhau quá xa. -Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. -Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ xung giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có những cẩu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ xung giữa các phần khác nhau của một mồi. Muốn thực hiện được phản ứng PCR thì nhiệt độ annealing phải thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi. Cách tính nhiệt độ Tm Có nhiều cách tính nhưng ở đây người ta thường dùng cách tính đơn giản sau Tm= 4(G+C) + 2(A+T) + 35 - 2n n: tổng số nucleotid G, C, A, T: tổng lượng các nucleotid G, C, T, A Cách tính này đúng với các đoạn mồi từ 16 đến 35 nucleotid 1.3 Tag polymerase Được chiết tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquticus sống ở suối nước nóng. Enzyme Tag Polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của các acid nucleotid và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình. 2. Hóa chất và dụng cụ 2.1 Hỗn hợp Primer Nồng độ 2.5 pmol/µl Nhân dòng đoạn ADN dài 967bp có chứa gen rnhA Trình tự Nucleotid: 5'-CCATGTACGCCAAAGAATTCCGGAT-3' 3'- CTCTCTTTGTTGAATTTTGAAGTGC-5' 2.2 Hóa Chất Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 14 Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl) Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM ( NH4)2SO4 20mM Tween 20 0,01% dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại MgCl2 1,5mM Các hóa chất dùng cho điện di ADN 2.3 Dụng cụ Máy li tâm Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml Micropipette 20, 200, 1000µl Máy PCR Máy điện di ngang80 -150V Bộ nguồn điện di điện thế từ Bộ chụp ảnh trên đèn UV Tủ ấm Máy lắc Vortex 3. Các bước thí nghiệm 3.1 Xử lí mẫu - Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn. Chú ý không để thạch nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR. - Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất tuyệt trùng. - Đun sôi trong vòng 5 phút - Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy phần nước dịch lỏng có chứa ADN đem đi nhân dòng. 3.2 Phản ứng PCR Thiết lập chương trình cho máy PCR Step1. 94 độ 1min (Biến tính ADN) Step2. 98 độ 20 sec (Tách ADN sợi đôi thành sợi đơn) Step3. 60 độ 20 sec (Mồi bắt cặp với sợi khuôn) Step4. 68 độ 1min (Phản ứng kéo dài) Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 15 Step5. lặp lại Step2 đến Step4 29 lần Step6. 72 độ 10min ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh) Step7 4 độ ∞ Pha chế dung dịch phản ứng (Dung dịch phản ứng phải được pha chế trên đá) - Hút 45µ l hỗn hợp phản ứng PCR vào trong ống eppendof 0.2ml. Sau đó cho 4µl dung dịch hỗn hợp primer. Cuối cùng cho 2µl dung dịch mẫu đã được xử lí ở trên. - Lắc nhè và quay li tâm cho dung dịch phản ứng chảy hết xuống đáy không còn bám trên thánh ống ( Spin down) - Đặt eppendof và máy PCR - Khởi động chương trình (khoảng từ 1 đến 2 tiếng) 3.3 Điện di sản phẩm sau phản ứng-Điện di trên gel Agarose (0.8%) - Gel pha trong dung dịch đệm điện di 0.5×TBE rồi đun nóng bằng lò vi sóng cho đến khi gel được nóng chảy hoàn toàn. - Trong khi để cho gel nguội đến 50 độ, tiến hành lắp dụng cụ điện di. Sau khi gel nguội đổ gel vào khuôn gel có cắm lược và chờ cho gel đông tụ hoàn toàn. - Sau khi gel đông tụ rút lược đổ đệm điện di ngập bản gel 1-2mm - Pha 2µl ADN mẫu + 1µl thuốc nhuộm + 7µl nước cất tuyệt trùng. Dùng pipetman tra hỗn hợp mẫu và 2µl maker vào từng giếng gel. - Chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút. - Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong vòng 30 phút. - Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.