Thiết kế và cố định tế bào tuỷ xương lên màng

Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 1 1.1. Coâng ngheä vaät lieäu trong y sinh hoïc: [1], [7], [8], [21], [29] Hình 1: Tai nhaân taïo, moät trong nhöõng thaønh töïu cuûa coâng ngheä vaät lieäu Coâng ngheä vaät lieäu laø moät trong nhöõng lónh vöïc tieàm naêng vì caùc cô quan caáy gheùp laáy töø cô theå ngöôøi cho thöôøng ñöôïc cung caáp raát haïn cheá. Moãi naêm coù khoaûng 19.000 ca caáy gheùp ñöôïc thöïc hieän taïi Myõ vaø khoaûng 56.000 beänh nhaân taïi ñaát nöôùc naøy caàn ñöôïc gheùp cô quan, thaäm chí coù tröôøng hôïp moät ngöôøi phaûi chôø ñôïi tôùi 13 naêm. Caùc ca moå naøy thöôøng raát khoù khaên vaø toán keùm, ñoøi hoûi beänh nhaân phaûi traûi qua moät cheá ñoä nghieâm ngaët vì heä mieãn dòch bò suy giaûm. Ñaây laø thöû thaùch lôùn trong ñieàu trò baèng phaãu thuaät caáy gheùp. Cho ñeán nay, moät soá saûn phaåm vaät lieäu ñöôïc ñöa ra thò tröôøng, vaät lieäu thay theá da, xöông vaø suïn. Vaät lieäu sinh hoïc trong nuoâi caáy moâ ñöôïc söû duïng ñeå hoã trôï, höôùng daãn caùc teá baøo trong caùc caáu truùc 2 vaø 3 chieàu chuyeân bieät. Chuùng ñöôïc bieát ñeán vôùi thuaät ngöõ ECM (Extracellular matrix), ECM coù caáu truùc khung bao goàm caùc proteins, carbohydrates vaø caùc phaân töû tín hieäu. Giaøn giaùo lí töôûng laøm baèng caùc vaät lieäu sinh hoïc mang ñeán cho caùc teá baøo nhöõng tín hieäu caàn thieát cho söï phaùt trieån, bieät hoùa vaø töông taùc vôùi nhau taïo neân caùc caáu truùc mong muoán. Beân caïnh ñoù, chuùng coøn coù khaû naêng phaân huûy chaäm taïo thaønh caùc hôïp chaát khoâng ñoäc haïi trong khi moâ môùi ñöôïc hình thaønh vaø xaùc nhaäp Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 2 vôùi moâ cuûa ngöôøi beänh. Hôn theá nöõa, vaät lieäu sinh hoïc caàn phaûi an toaøn, deã söû duïng vôùi giaù caû hôïp lí. Nhöõng vaät lieäu sinh hoïc ñaàu tieân ñöôïc söû duïng trong giaûi phaãu thöôøng ñöôïc nghieân cöùu sao cho khoâng ñoäc, khoâng gaây ñaùp öùng mieãn dòch vaø töï phaân huûy. Ngaøy nay, caùc nghieân cöùu thöôøng taäp trung vaøo söï phaùt trieån cuûa vaät lieäu sinh hoïc vôùi nhöõng ñaëc tính môùi nhö: khaû naêng phaân huûy coù theå ñieàu chænh, khaû naêng hoã trôï cho töông taùc teá baøo. Trong ñoù, quan taâm nhaát laø söï saùt nhaäp cuûa caùc phaân töû tín hieäu sinh hoïc vôùi vaät lieäu sinh hoïc. Hinh 2: Hình aûnh cuûa moät khuoân taùi sinh da ñieån hình coù caáu truùc loã xoáp döôùi kính hieån vi ñieän töû queùt. Caáu truùc naøy cho pheùp teá baøo len loûi beân trong. Vaät lieäu sinh hoïc coù theå ñöôïc laøm baèng caùc chaát toång hôïp (lactide, glycolide, ceramics), daïng töï nhieân (collagen, caùc polysaccharide töï nhieân) hay nhöõng vaät lieäu baùn toång hôïp (poly-4-hydroxybutyrate, axit polylactic vaø polyglycolic hay laø söï keát hôïp cuûa caùc thaønh phaàn treân ñeå taïo ra caùc loaïi vaät lieäu duøng trong thöû nghieäm laâm saøng vaø trong nghieân cöùu. Moät soá thaønh töïu ñieån hình cuûa coâng ngheä vaät lieäu coù theå keå ñeán nhö: Caùc polymer toång hôïp coù khaû naêng phaân huûy ñöôïc (VD: Chaát deûo chòu nhieät). Söï taïo thaønh cuûa chuùng coù theå bieán ñoåi bôõi nhieät ñoä (töø nhieät ñoä phoøng ñeán nhieät ñoä cuûa cô theå) [7]. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 3 ¾ Nhöõng vaät lieäu hoãn hôïp laøm töø polylactide-co-glycolide höùa heïn nhieàu tieàm naêng cho vaät lieäu thay theá xöông [7]. ¾ Caùc hydrogel toång hôïp ñöôïc bieán ñoåi ôû moät vaøi ñoaïn peptide giuùp cho caùc teá baøo coù theå ñònh cö vaøo gel. Bôûi tính thaám toát cho chaát dinh döôõng vaø khí, tính töông hôïp sinh hoïc vaø moät soá ñaëc ñieåm khaùc. Hydrogel laø vaät lieäu tieàm naêng cho caùc öùng duïng veà coâng ngheä moâ. ¾ Söï quang polymer hoùa coù theå taïo ra caùc khung coù tính linh ñoäng cao. ¾ Moät soá polymer nhö poly-4-hydroxybutyrate vôùi tính linh ñoäng cao vaø khaû naêng phaân huûy sinh hoïc ñöôïc kieåm soaùt ñaõ môû ra nhöõng khaû naêng môùi cho vieäc thieát keá caùc vaät lieäu sinh hoïc. ¾ Caùc polymer keát hôïp vôùi protein ñöôïc saûn xuaát döïa treân söï phaùt trieån cuûa kyõ thuaät gen vaø coâng ngheä vaät lieäu coù khaû naêng phaân huûy sinh hoïc vaø tính töông hôïp sinh hoïc cao. Söï keát hôïp cuûa caùc amino acid nhaân taïo coù theå mang ñeán cho vaät lieäu nhöõng ñaëc tính roõ raøng. 1.2. Vaät lieäu sinh hoïc thay theá da: 1.2.1. Giôùi thieäu: [1], [2], [7], [23], [24] Da ngöôøi laø cô quan phöùc taïp vôùi nhieàu chöùc naêng: ¾ Ñieàu nhieät. ¾ Baûo veä cô theå choáng laïi söï xaâm nhaäp cuûa vi sinh töø beân ngoaøi. ¾ Giöõ aåm. ¾ Baûo veä cô hoïc vaø laøm laønh veát thöông. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 4 Trong suoát hôn 30 naêm qua, ñaõ coù nhieàu noã löïc ñeå phaùt trieån caùc saûn phaåm gioáng nhö da cho moät vaøi tröôøng hôïp nguy kòch. Nhöõng saûn phaåm naøy khoâng nhöõng ñaõ ñaùp öùng ñöôïc nhöõng yeâu caàu neâu treân maø coøn mang nhieàu ñaëc ñieåm coù lôïi khaùc nhö: ¾ Taïo nhöõng ñaùp öùng taêng sinh töø veát thöông maø khoâng gaây ra vieâm hay loaïi thaûi. ¾ Beàn vaø ñaøn hoài ñeå coù chöùc naêng bình thöôøng vaø taïo veû beân ngoaøi. ¾ Coù saéc toá gioáng vôùi da thaät. ¾ Thích hôïp cho nhöõng ca nguy caáp vaø deã daøng söû duïng. Da nhaân taïo coù theå ñöôïc öùng duïng trong ñieàu trò boûng, loeùt, giaûi phaãu thaåm mó, khoaûng 150.000 beänh nhaân haèng naêm ôû mieàn taây Chaâu Aâu caàn ñöôïc ñieàu trò baèng da nhaân taïo, nhöng con soá naøy vaãn ít hôn soá ngöôøi bò loeùt. Ñaây laø moät toån thöông khoâng theå laønh trong 6 tuaàn vaø duy trì trong nhieàu naêm, gaây toán keùm trong ñieàu trò. Moät soá beänh gaây ra loeùt nhö tieåu ñöôøng hay beänh tónh maïch, soá ngöôøi maéc beänh taêng leân theo tuoåi vaø do loái soáng. Rieâng ôû Ñöùc, coù khoaûng 2-3 trieäu ngöôøi bò loeùt, chi phí ñieàu trò leân ñeán hôn moät tæ euro. Nhöõng maûnh da toång hôïp thöôøng ñöôïc söû duïng phoå bieán trong ñieàu trò nhöõng toån thöông neâu treân. So vôùi caùc kó thuaät truyeàn thoáng nhö söû duïng da ngöôøi cheát laø vaät thay theá, maûnh gheùp toång hôïp coù thuaän lôïi lôùn laø khoâng phuï thuoäc vaøo nguoàn da cuûa ngöôøi cho. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 5 Hình 3: AÛnh minh hoïa söï gaén keát cuûa teá baøo leân vaät lieäu Coù hai thaønh phaàn chính cuûa da nhaân taïo: khuoân, coù theå laøm baèng collagen, axit hyaluronic, nhöõng polymer phaân huûy sinh hoïc baùn toång hôïp khaùc vaø nhöõng teá baøo da khaùc nhau nhö keratin, fibroblast, melanin... Moät soá saûn phaåm ñaàu tieân treân thò tröôøng ñeå ñieàu trò caùc veát boûng saâu laø: Epicel (Enzyme Biosurgery, USA), Integra (Integra life sciences, USA), vaø Transcyte (Smith & Nephew, UK). Tuy nhieân ngaøy nay ñaõ coù nhieàu caùc saûn phaåm duøng ñeå ñieàu trò loeùt nhö: Apligraf (Organogenesis, USA), Dermagraft (Advanced Tissue Sciences)… Hình 4: Söï phoái hôïp cuûa vaät lieäu, teá baøo vaø caùc chaát taêng tröôûng trong vieäc taïo thaønh cô quan nhaân taïo. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 6 Caùc saûn phaåm da nhaân taïo cuõng ñöôïc söû duïng trong caùc thöû nghieäm invitro nhö thöû nghieäm ñoäc toá, döôïc lí hoïc vaø thaåm mó… 1.2.2. Tieâu chuaån cho vaät lieäu phuû veát thöông: [1] 1.2.2.1. Tính thaám öôùt neàn veát thöông vaø söï baùm dính: ¾ Laøm öôùt beà maët veát thöông. ¾ Thích öùng vôùi beà maët veát thöông. ¾ Baùm dính hoùa hoïc vôùi neàn veát thöông. Traùnh söï taêng sinh cuûa lôùp haït. ¾ Baùm dính ôû taát caû caùc vuøng. Neáu khoâng seõ hình thaønh caùc tuùi khoâng khí nhoû giuùp cho vi khuaån sinh soâi. ¾ Naêng löôïng beà maët cuûa maûnh gheùp vaø neàn veát thöông nhoû hôn giao dieän cuûa khoâng khí vaø neàn veát thöông. Neàn veát thöông ñöôïc laøm öôùt, tuùi khoâng khí ñöôïc thaûi ra. 1.2.2.2. Söï taïo loã cuûa maûnh gheùp: Maûnh gheùp phaûi thaám ñöôïc vaø aåm. Nhöng ñoä aåm lôùn seõ phaù huûy giao dieän cuûa veát thöông vaø maûnh gheùp. Ñoä aåm nhoû thì dòch tieát beân döôùi maûnh gheùp seõ naâng noù leân khoûi taám neàn veát thöông. Löôïng nöôùc toái öu: 5 mg/cm2/h. Coù khaû naêng taïo ra caùc loã giuùp cho teá baøo fibroblast phaân chia vaø di truù beân trong vaät lieäu. Bôûi vì caùc teá baøo bieåu bì, trung moâ trong veát thöông coù ñöôøng kính 10 µm neân caùc loã phuø hôïp vôùi traät töï naøy seõ taïo thuaän lôïi cho fibroblast ñi vaøo beân trong vaät gheùp. Söï di truù cuûa teá baøo phuï thuoäc vaøo: ¾ Kích thöôùc loã Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 7 ¾ Beà daøy maûnh gheùp Loã coù ñöôøng kính nhoû hôn 10 µm laøm cho caùc teá baøo fibroblast, bieåu bì khoâng di chuyeån xuyeân qua loã, ta phaûi phaân huûy khuoân giuùp teá baøo ñi vaøo beân trong vaät lieäu. Vaät lieäu neáu daøy seõ laøm chaát dinh döôõng töø neàn veát thöông ñeán maûnh gheùp bò haïn cheá. Maûnh gheùp moûng deã ñöùt gaõy coøn maûnh gheùp daøy seõ cöùng vaø khoâng dính vôùi veát thöông. Khoaûng caùch giôùi haïn ñeå duy trì chaát dinh döôõng tôùi teá baøo ñang di truù ñöôïc qui ñònh baèng bieåu thöùc khoâng thöù nguyeân baét nguoàn töø coâng thöùc Thiele vaø ñöôïc bieán ñoåi bôûi Wagner vaø Weisz: R* L2 S= D* C0 Trong ñoù: R : toác ñoä söû duïng chaát dinh döôõng tôùi haïn cuûa teá baøo. L : khoaûng caùch hoã trôï chaát dinh döôõng khuyeách taùn. D : söï khuyeách taùn chaát dinh döôõng qua maøng ñöôïc hydrate hoaù. C0 : noàng ñoä chaát dinh döôõng taïi neàn veát thöông. S : soá khoâng thöù nguyeân. S=1 thì töû vaø maãu caân baèng, söï sinh truôûng mao quaûn xaûy ra, cung caáp cho teá baøo cô chaát vaø oxi. 1.2.2.3. Ñoä beàn cuûa vaät gheùp: Vaät gheùp coù ñoä beàn cao giuùp cho thao taùc khoâng bò raùch, phuû veát thöông trong toaøn boä chu trình laønh hoùa. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 8 1.2.2.4. Toác ñoä phaân huûy sinh hoïc: Quaù trình phaân huûy sinh hoïc gaây ñaùp öùng vieâm toái thieåu ñoái vôùi vaät chuû. Ta caàn tính toaùn, caân baèng toác ñoä phaân huûy vaät lieäu vôùi thôøi gian caàn cho taùi sinh teá baøo. Neáu maûnh gheùp phaân huûy nhanh thì veát thöông khoâng ñöôïc che phuû hieäu quaû. Neáu maûnh gheùp phaân huûy chaäm thì seõ hình thaønh seïo vaø phoái hôïp vaät lieäu vaøo trong veát thöông. 1.2.2.5. Tính khaùng nguyeân: Vaät lieäu thay theá da coù khaû naêng bò loaïi ra vaø laøm vieâm cuïc boä neáu coù tính khaùng nguyeân. 1.2.2.6. Caáu truùc vó moâ: Neáu khoâng coù giaøn giaùo (scaffold), nguyeân baøo sôïi seõ xaép xeáp collagen ngaãu nhieân vaø hình thaønh seïo. 1.2.3. Phaân loaïi caùc loaïi maøng sinh hoïc dang döôïc söû duïng hieän nay: [1] 1.2.3.1. Vaät gheùp töï nhieân: Chuû yeáu laø autograft (da töï thaân) vaø allograft (da töø ngöôøi khaùc). Taùc duïng cuûa autograft vaø allograft: ¾ Giaûm soá löôïng vi khuaån treân beà maët ñöôïc laøm öôùt cuûa veát thöông. ¾ Giaûm söï maát dòch vaø protein. ¾ Giaûm ñau. ¾ Haïn cheá söï co cöùng cuûa veát thöông. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 9 ¾ Taêng söï taïo maïch môùi. Haïn cheá: ¾ Thieáu autograft ôû beänh nhaân phoûng naëng. ¾ Khoù khaên trong döï tröõ allograft, coù tính khaùng nguyeân. Xenograft töø heo, laø vaät lieäu che phuû taïm thôøi, ñoøi hoûi tieät truøng cao, beänh nhaân boûng phaûi ñöôïc xoùa boû mieãn dòch, maûnh gheùp cuoái cuøng bò ñaåy ra vaø thay theá baèng autograft. Maøng oái: maøng phuû veát thöông töï nhieân taïm thôøi nhöng taêng söï taïo haït cuûa neàn veát thöông. Do ñoù maûnh gheùp cuûa da soáng laâu hôn nhöng cuõng coù nhieàu seïo hôn. 1.2.3.2. Vaät gheùp toång hôïp: Maûnh gheùp ñôn lôùp: thöôøng söû duïng collagen do: ¾ Nguoàn chieát taùch lôùn. ¾ Lieân keát cheùo cuûa collagen laøm taêng ñoä beàn vaø söùc caêng nhöng cuõng coù khuynh höôùng laøm cho sôïi cöùng & doøn. ¾ Baùm dính töï nhieân vôùi veát thöông luùc ban ñaàu do keát hôïp vôùi fibrin. ¾ Collagenase xuaát hieän trong neàn veát thöông & vi khuaån töø neàn veát thöông coù theå laøm tuoät mieáng xoáp collagen naøy. Maûnh gheùp ña lôùp: Maøng 2 lôùp: beân trong laø collagen & chondroitin-6-sulfate vaø lôùp beân ngoaøi laø silastic. Coù taùc duïng ngaên chaën söï co veát thöông vôùi kích thöôùc loã toái öu laø 50 µm. Lôùp silastic daøy 0,1 mm, coù taùc duïng ngaên chaën vi khuaån trong khi vaãn duy trì doøng nöôùc thích hôïp qua maøng, cung caáp ñoä cöùng caàn thieát ñeå Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 10 khaâu maûnh gheùp vaøo ñuùng choã, ngaên chaën söï di chuyeån maûnh gheùp trong quaù trình laønh hoùa veát thöông. Vaät lieäu treân baùm dính vôùi veát thöông trong vaøi phuùt vaø taïo maïch môùi trong 3 - 5 ngaøy. Hình 5: Maøng 2 lôùp Maøng giai ñoaïn 2: caùc teá baøo ñaùy cuûa da ñöôïc taùch, nuoâi caáy vaø ñöôïc ñöa vaøo trong khuoân baèng caùch tieâm tröïc tieáp hay söû duïng löïc li taâm. Teá baøo bieåu bì nhanh choùng taêng sinh. Söï thay theá da chöùc naêng ñaït ñöôïc ôû heo sau 4 tuaàn, toác ñoä nhieãm truøng thaáp, beà maët ñoàng nhaát, meàm deûo vaø trôn laùng töông töï da bình thöôøng. 1.2.3.3. Caùc ñaëc tính lí töôûng cuûa vaät lieäu thay theá da: ¾ Baùm dính nhanh, beàn leân beà maët veát thöông. ¾ Caáu truùc cho pheùp söï coá ñònh, di chuyeån, taêng sinh, taêng tröôûng cuûa caùc teá baøo moâ môùi. ¾ Khoâng thaám caùc vi khuaån ngoaïi sinh. ¾ Giaûm söï maát nöôùc, maát ñieän giaûi, protein. ¾ Khoâng taïo khaùng nguyeân, khoâng gaây dò öùng. ¾ Coù tính linh ñoäng, ñoä co giaõn cao nhöng vaãn baûo veä veát thöông. ¾ Khoâng gaây ñoäc. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 11 ¾ Coù theå tieät truøng ñöôïc. ¾ Coù theå haïn cheá söï nhieãm truøng beân döôùi. ¾ Giaûm thieåu söï taïo seïo. ¾ Giuùp baùm nhanh veát thöông. ¾ Coù khaû naêng thaám, chöùa caùc chaát khaùng khuaån. ¾ Khaû naêng phuïc hoài chöùc naêng da sau chöõa trò. ¾ Deã baûo quaûn vaø baûo quaûn ñöôïc laâu. ¾ Giaù thaønh reû. 1.2.4. Caùc loaïi maøng treân thò tröôøng: [16], [27] 1.2.4.1. Orcell: Khuoân teá baøo hai lôùp, laø saûn phaåm vaät lieäu nuoâi caáy moâ nhaèm muïc ñích haøn gaén caùc veát thöông nhö boûng, loeùt da goùt chaân do tieåu ñöôøng. Orcell laø vaät lieäu hai lôùp coù mang teá baøo maø cuï theå laø caùc teá baøo keratin vaø fibroblast cuûa ngöôøi. Hai loaïi teá baøo naøy ñöôïc nuoâi trong hai lôùp taùch bieät laøm baèng collagen boø loaïi1. Teá baøo fibroblast ñöôïc nuoâi ôû maët treân vaø beân trong caùc loã cuûa vaät lieäu trong khi teá baøo keratin thì ñöôïc nuoâi ôû beà maët khoâng coù loã ñöôïc phuû ôû treân. Orcell laø vaät lieäu töông hôïp sinh hoïc coù khaû naêng haáp thu toát, taïo ñieàu kieän lí töôûng cho söï di truù cuûa caùc teá baøo khôûi ñoäng cho quaù trình taùi taïo moâ da. Caùc teá baøo treân cuõng tieát ra caùc cytokine vaø caùc hormon taêng tröôûng. Orcell cuõng cung caáp moät caáu truùc môû. Caáu truùc naøy giuùp caùc teá baøo coù theå di cö vaøo vaø xuyeân qua caùc loã. Caùc loã treân vaät lieäu cho pheùp teá baøo fibroblast coù theå di chuyeån vaø taïo laïi da. Tröôùc khi ñöa teá baøo leân, vaät lieäu ñöôïc taïo thaønh vaø sau ñoù ñöôïc phuû leân moät lôùp gel moûng laøm baèng collagen. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 12 Nhieàu thöû nghieäm ñaõ ñöôïc thöïc hieän treân Orcell ñeå ñaûm baûo raèng khoâng coù caùc phaûn öùng nguy hieåm xaûy ra. Caùc teá baøo cuõng ñöôïc thöû nghieäm ñeå cho keát quaû aâm tính vôùi virus ngöôøi, retrovirus, vi khuaån, naám… 1.2.4.2. Dermagraft: Hình 6: Maøng Dermagraft Dermagraft laø moät maøng thay theá trung bì daãn xuaát nguyeân baøo sôïi ngöôøi. Caáu taïo maøng Dermagraft goàm nguyeân baøo sôïi, chaát neàn ngoaïi baøo vaø moät giaøn ñôõ coù theå haáp thu sinh hoïc. Caùc nguyeân baøo sôïi nuoâi caáy ñöôïc ñöa vaøo giaøn ñôõ maïng löôùi polyglactin coù theå haáp thu sinh hoïc. Caùc nguyeân baøo sôïi taêng sinh ñeå laáp kín caùc keõ hôû cuûa giaøn ñôõ naøy, saûn xuaát collagen trung bì, caùc protein neàn, caùc nhaân toá taêng tröôûng vaø cytokine cuûa ngöôøi. 1.2.4.3. Transcyte: Hình 7: Maøng Transcyte Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 13 Teá baøo fibroblast ñöôïc phaùt trieån treân moät maïng löôùi, nôi chuùng phaân chia vaø saûn xuaát ra caùc nhaân toá taêng tröôûng, collagen vaø caùc protein khaùc ñeå taïo thaønh da ngöôøi coù chöùc naêng cuï theå. 1.2.4.4. Integra: [30] Hình 8: Maøng integra Integra laø moät neàn polymer collagen – glucoaminoglycan (CG) coù khaû naêng phaân huûy sinh hoïc, ñöôïc phuû moät lôùp polysiloxane (silicone) moûng. Collagen loaïi 1 cuûa boø vaø chondroitin-6-sulfate (moät trong soá caùc glycoaminoglycan chính) ñöôïc uû chung vôùi nhau, ñöôïc laøm laïnh khoâ vaø khaâu maïch. Kích thöôùc loã ñöôïc xaùc ñònh ñeå toái ña söï taêng tröôûng cuûa teá baøo vaø möùc ñoä khaâu maïch cuõng nhö thaønh phaàn GAG ñöôïc thieát keá ñeå kieåm soaùt toác ñoä phaân huûy cuûa chaát neàn. Sau 2 – 3 tuaàn gheùp, trung bì môùi vaø maïch môùi ñöôïc hình thaønh. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 14 1.2.4.5. Apligraf: [25], [26] Hình 9: Maøng Apligraft Ñöôïc söû duïng baèng caùch ñöa caùc teá baøo fibroblast leân treân vaät lieäu ñeå taïo lôùp döôùi. Khi teá baøo fibroblast di chuyeån xuyeân qua collagen, lôùp da ñöôïc thay ñoåi, saûn xuaát ra nhieàu collagen hôn. Luùc naøy, caùc teá baøo keratin ñöôïc ñaët leân treân, taïo thaønh lôùp bieåu moâ ôû treân. Lôùp bieåu moâ naøy tieáp xuùc vôùi khoâng khí, laø lôùp beân ngoaøi coù chöùc naêng baûo veä cuûa da. 1.2.4.6. EZ Derm: [3] Hình 10: Maøng EZ Derm EZ Derm laø moät maûnh gheùp da dò loaïi töø heo ñaõ ñöôïc bieán ñoåi hoùa hoïc ñeå baûo quaûn. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 15 Taát caû caùc yeáu toá cuûa trung bì töø trung bì heo goác bò baát hoaït theo quy trình hoùa hoïc, khoâng gioáng nhö trung bì heo ñoâng laïnh saün coù. Tuy nhieân, maøng phuû naøy khoâng kích thích laøm laønh veát boûng. 1.2.4.7. Promogran: Hình 11: Maøng Promogran Maøng phuû collagen Promogran laø maøng keát hôïp collagen ñoäng vaät (55%) vôùi cellulose taùi sinh ñöôïc oxi hoùa (oxidized regernerated cellulose – ORC) (45%). Vai troø cuûa cellulose laø haáp thu. ORC/collagen haáp thu caùc protease thöøa töø beà maët veát boûng. Maøng phuû ORC/collagen taïo ra moät moâi tröôøng collagen haáp daãn teá baøo vaø kích thích taêng tröôûng moâ. 1.3. Nguyeân lieäu thieát keá maøng phuû veát thöông: 1.3.1. Chitosan: [1], [7], [17] Hình 12: Caáu taïo hoùa hoïc cuûa chitosan Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 16 Chitosan laø moät polysaccharide, poly[β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D- glucopyranose], ñöôïc taïo ra do quaù trình deacetyl hoùa chitin töï nhieân. Chitin vaø chitosan ñöôïc bieát töø laâu, nhöng gaàn ñaây chitin vaø chiosan môùi ñöôïc chuù yù nghieân cöùu vaø söû duïng. Saûn löôïng chitosan treân theá giôùi hieän nay khoaûng 2000 taán/naêm, ñieàu naøy cho thaáy möùc ñoä vaø nhu caàu söû duïng noù treân thöïc teá. Trong hoùa hoïc, chitosan ñöôïc ñieàu cheá töø chitin. Chitin coù nhieàu trong töï nhieân nhaát laø trong voû caùc loaøi ñoäng vaät giaùp xaùc nhö toâm, cua…. Maãu chitin nhaän ñöôïc töø nguoàn voû toâm, cua qua quaù trình xöû lí nhö sau: voû toâm, cua ñöôïc xay nhoû, loaïi protein baèng NaOH 0,005N, loaïi muoái phosphate baèng HCl 1N, loaïi protein trong caáu truùc voû baèng NaOH 2N ôû 100oC. Sau ñoù röûa saïch, saáy khoâ thu ñöôïc chitin. Chitin ñöôïc xöû lí 1 hoaëc 2 giôø trong dung dòch NaOH 47% ôû 110oC (hoaëc 60oC) trong moâi tröôøng coù nitrogen, sau ñoù röûa nöôùc ôû 80oC ñeán trung hoøa. Saûn phaåm thu ñöôïc coù ñoä deacetyl hoùa khoaûng 80%. Vieäc xöû lí kieàm vaø röûa trong nöôùc ñöôïc laëp laïi nhieàu laàn ñeå thu ñöôïc saûn phaåm chitosan coù ñoä deacetyl hoùa cao hôn. Chitosan vaø caùc daãn xuaát cuûa chitosan ñöôïc nghieân cöùu vaø öùng duïng trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau: ¾ Trong lónh vöïc moâi tröôøng, chitosan ñöôïc xem nhö vaät lieäu môùi coù taùc duïng laøm saïch nöôùc, khí thaûi coâng nghieäp, thu hoài kim loaïi naëng, protein choáng oâ nhieãm moâi tröôøng. ¾ Trong noâng nghieäp, chitosan daïng dung dòch ñöôïc phuû leân haït gioáng, coù taùc duïng choáng naám moác vaø kích thích naåy maàm haït gioáng laøm taêng naêng suaát vuï muøa. Ngöôøi ta coøn söû duïng chitosan laøm nguyeân lieäu chính ñeå ñieàu cheá cheá phaåm baûo quaûn hoa töôi, hoa quaû ñoùng hoäp, thòt, tröùng, laøm chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng cho caây, baûo quaûn thöïc phaåm, cheá phaåm phoøng choáng naám beänh thöïc vaät…. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 17 ¾ Trong mó phaåm, chitosan duøng laøm keo xòt toùc, kem döôõng da, laøm chaát keo caûm quan trong coâng nghieäp in, laøm vaûi coân, laøm taêng ñoä beàn maøu vaûi nhuoäm trong coâng nghieäp deät. ¾ Caùc keát quaû nghieân cöùu döôïc lyù cuûa chitosan cho thaáy: chitosan coù tính töông hôïp sinh hoïc khaù cao: khoâng gaây ñoäc tính ôû caùc möùc ñoä caáp, baùn caáp, ñoäc tính taïi choã, hay toaøn thaân. Chuùng cuõng khoâng gaây aûnh höôûng ñoái vôùi troïng löôïng cô theå, troïng löôïng gan, caùc chöùc naêng gan, thaän, cô quan taïo maùu, caùc chæ tieâu sinh hoùa cuûa maùu vaø nöùôc tieåu trong caùc thöû nghieäm daøi haïn… nghóa laø chuùng coù tính an toaøn sinh hoïc cao. ¾ Veà taùc duïng chöõa beänh, chitosan coù taùc duïng khaùng khuaån vaø naám, coù khaû naêng thuùc ñaåy söï laønh hoùa veát thöông. Theá neân noù ñöôïc söû duïng laøm thuoác vaø maøng sinh hoïc trong ñieàu trò toån thöông boûng. Chitosan coøn duøng laøm giaûm löôïng cholesterol trong maùu, laøm chæ khaâu phaãu thuaät töï tieâu, laøm kính aùp troøng, laøm thuoác caàm maùu, kích thích heä thoáng mieãn dòch vaø laøm chaát mang ñöa thuoác ñeán vuøng caàn trò lieäu nhö khoái u trong ñieàu trò ung thö. ¾ Chitin vaø chitosan toû ra thích hôïp ñeå öùng duïng trong lónh vöïc döôïc phaåm vì chuùng coù tính töông hôïp sinh hoïc, thoaùi bieán sinh hoïc vaø an toaøn sinh hoïc. Chitosan coù theå duøng laøm caùc chaát phuï gia, taù döôïc caùc loaïi, chaát taïo maøng, taïo voû vieân nang meàm vaø cöùng, chaát mang sinh hoïc daãn thuoác…. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 18 1.3.2. Collagen vaø gelatin: [3], [12], [19] Hình 13: Caáu taïo hoùa hoïc cuûa gelatin Khoaûn ¼ protein trong cô theå laø collagen. Collagen laø moät protein caáu truùc chính hình thaønh caùc sôïi phaân töû, taïo söï raén chaéc cho gaân vaø caùc phieán ñaøn hoài naâng ñôõ da vaø caùc cô quan beân trong. Xöông vaø raêng ñöôïc taïo thaønh do vieäc theâm caùc tinh theå khoaùng vaøo collagen. Nguyeân baøo sôïi taïo collagen. Quaù trình toång hôïp collagen laø tieán trình keát hôïp caùc axit amin thaønh nhöõng chuoãi lieân keát vôùi nhau ñeå thaønh caùc phaân töû taïo ra caùc tô, chuùng gaén boù vôùi nhau thaønh sôïi roài thaønh caùc boù collagen. Collagen goàm ba chuoãi keát hôïp taïo caáu truùc xoaén ba chaët, moãi chuoãi coù chieàu daøi hôn 1400 axit amin, chuû yeáu goàm glycin (xaáp xæ 1/3 goác axit amin), prolin vaø hydroxyprolin (hôn ¼ goác axit amin). Collagen bò bieán tính ôû nhieät ñoä cao. Khi xoaén ba naøy ñöôïc thaùo xoaén, caùc chuoãi taùch rôøi, ñöôïc laøm laïnh vaø haáp thu nöôùc maïnh seõ taïo thaønh gelatin. Nhö vaäy, gelatin ñöôïc thu nhaän khi thuûy phaân giôùi haïn sôïi collagen khoâng hoøa tan. Thaønh phaàn vaø trình töï axit amin cuûa gelatin töông töï collagen. Gelatin coù haøm löôïng glycin, prolin vaø hydroxyprolin cao. Caáu truùc xoaén ba cuûa tropocollagen ñöôïc baûo toàn trong gelatin, vì vaäy gelatin coù theå giöõ nöôùc ñeå taïo thaønh gel. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 19 Hình 14: Thaønh phaàn axit amin cuûa collagen vaø gelatin Gelatin khoâng tan trong nöôùc laïnh nhöng deã hoøa tan trong nöôùc aám. Khi theâm nöôùc laïnh, nhöõng haït gelatin tröông phoàng, taêng ñeán 5 – 10 laàn troïng löôïng trong nöôùc. Khi taêng nhieät ñoä leân 40oC, nhöõng haït gelatin naøy hoøa tan ñeå taïo thaønh dung dòch. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán ñoä hoøa tan cuûa gelatin laø nhieät ñoä, noàng ñoä vaø kích thöôùc haït. Collagen theå hieän tính khaùng nguyeân ôû ñieàu kieän sinh lí khi söû duïng trong sinh y. Gelatin ñöôïc söû duïng nhieàu trong caùc öùng duïng sinh y, ñaëc bieät öùng duïng laøm maøng phuû veát thöông, nhôø moät soá öu ñieåm: khoâng coù tính khaùng nguyeân, hoaït hoùa ñaïi thöïc baøo, hieäu quaû caàm maùu cao, coù theå ñöôïc haáp thu hoaøn toaøn invivo. 1.3.3. Axit Hyaluronic: [13], [14] Axit hyaluronic, hay coøn goïi laø hyaluronan (HA), laø moät trong soá caùc polysaccharide nhaày coù troïng löôïng phaân töû cao toàn taïi vôùi soá löôïng lôùn ôû huyeát thanh, maøo gaø, da caù maäp vaø suïn caù voi. HA coù caáu taïo cuûa moät glucoaminoglycan, goàm moät maïch khoâng phaân nhaùnh chöùa caùc chuoãi β-(1,4)-glucoronic acid vaø β-(1,3)-N- Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 20 acetylglucosamine saép xeáp moät caùch tuaàn töï taïo thaønh moät dimer, moãi dimer nhö vaäy coù khoái löôïng laø 450 dalton. Moät phaân töû HA coù khoaûng töø 1000 dimer nhö vaäy. Protein gaén vôùi HA (HABP) lieân keát vôùi HA baèng noái H+, moãi vò trí gaén HABP chöùa khoaûng 10 ñôn vò dimer, phaân töû HA phaûi chöùa toái thieåu 20 ñôn vò cho hai vò trí gaén. Hình 15: Caáu taïo hoùa hoïc cuûa axit hyaluronic HA chuû yeáu do teá baøo fibroblast vaø caùc teá baøo lieân keát moâ taïo ra. HA ôû dòch khôùp ñi vaøo trong huyeát töông thoâng qua heä thoáng baïch huyeát vaø nhanh choùng rôøi khoûi maùu baèng moät cô cheá phuï thuoäc receptor ôû caùc teá baøo bieåu moâ cuûa gan vaø baèng hoaït ñoäng cuûa enzyme hyaluronidase. HA ñöôïc tìm thaáy nhieàu ôû traïng thaùi lieân keát vôùi protein vaø chondroitin sulfate ôû khoaûng khoâng giöõa caùc teá baøo cuûa moâ lieân keát nhö da vaø noù ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc duy trì caáu truùc, aåm ñoä cuûa moâ vaø baûo veä, choáng laïi söï xaâm nhieãm cuûa vi khuaån. Khaû naêng giöõ nöôùc tuyeät vôøi cuûa HA cho pheùp noù coù theå duy trì aåm ñoä ôû trong maét, khôùp noái vaø caùc moâ da. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 21 Vì khoâng beàn ôû daïng axit neân HA thöôøng ñöôïc chieát xuaát vaø tinh cheá ôû daïng muoái natri. Natri hyaluronate coù khaû naêng giöõ nöôùc cao vaø dung dòch muoái hyaluronate coù ñoä nhôùt cao. Hình 16: Caáu taïo hoùa hoïc cuûa muoái hyaluronate Trong lónh vöïc y döôïc, muoái hyaluronate ñöôïc söû duïng trong giaûi phaãu beänh ñuïc nhaân maét, laø thuoác chöõa beänh vieâm khôùp (daïng tieâm), giaûm thò löïc… ÖÙNG DUÏNG: HA-protein: Khuoân xoáp ñöôïc taïo thaønh töø gelatin vaø hyaluronan baèng caùch nhuùng hoãn hôïp gelatin, hyaluronan vaøo hoãn hôïp aceton:nöôùc theo tæ leä 9:1 cuøng vôùi moät löôïng nhoû carbodiimide (EDC) ñeå taïo lieân keát cheùo. Vaät lieäu xoáp ñöôïc hình thaønh ñeå phuû veát thöông hoaëc laøm khuoân cho nhöõng öùng duïng nuoâi caáy moâ. Khi ñöôïc taåm vôùi sulfadiazine baïc, vaät lieäu treân coù taùc duïng laøm laønh veát thöông ôû chuoät [14]. Vaät lieäu ñöôïc laøm töø collagen vaø hyaluronan baèng caùch keát hôïp caùc thaønh phaàn treân trong dung dòch axit acetic loaõng. Sau ñoù taïo lieân keát cheùo Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 22 vôùi glyoxal hay periodate-oxidized dialdehyde. Vaät lieäu naøy khaùng ñöôïc collagenase vaø cho pheùp teá baøo fibroblast phaùt trieån [14]. Beân caïnh ñoù, vaät lieäu laøm töø hydroxyapatite-collagen-hyaluronan ñöôïc taïo thaønh baèng caùch theâm hydroxyapatite vaøo dung dòch hyaluronan. Sau ñoù, troän vôùi caùc sôïi collagen. Vaät lieäu sau cuøng coù 90% hydroxyapatite, 9,2% collagen vaø 0,8% hyaluronan coù tính töông hôïp sinh hoïc cao, ñöôïc söû duïng ñeå ñieàu trò caùc toån thöông ôû xöông [14]. Hyaluronan-chitosan Hoãn hôïp hyaluronan vaø chitosan glutamate ñöôïc taïo thaønh coù ñoä nhôùt cao, coù khaû naêng mang vaø thaûi gentamycin. Ñaây laø söï keát hôïp giöõa khaû naêng baùm dính toát cuûa hyaluronan vôùi hieäu quaû xaâm nhaäp maïnh meõ cuûa chitosan. Phöùc hôïp naøy ñöôïc taïo thaønh ngay trong moâi tröôøng axit vaø beàn vöõng vôùi moät khoaûng pH roäng. Hoãn hôïp cuõng cho thaáy khaû naêng baùm dính, taêng sinh teá baøo vaø laøm laønh veát thöông [14]. 1.3.4. EDC [1–ethyl–3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide]: [3] Trong khi thieát keá maøng phuû sinh hoïc, caùc taùc nhaân khaâu maïch coù vai troø laøm giaûm toác ñoä phaân huûy cuûa vaät caáy gheùp do noù taïo thaønh caùc lieân keát cheùo hoùa hoïc. Coù nhieàu taùc nhaân khaâu maïch nhö : ¾ Taùc nhaân vaät lí: nhieät, böùc xaï ion hoùa. ¾ Taùc nhaân hoùa hoïc : formaldehyde, glutaraldehyde, carbodiimide… Tuy nhieân, tính ñoäc cuûa caùc taùc nhaân khaâu maïch coù aûnh höôûng raát lôùn trong vieäc phaùt trieån caùc vaät lieäu sinh hoïc. Glutaraldehyde laø taùc nhaân khaâu maïch coù hieäu quaû, nhöng coù tính ñoäc cao khi thaûi vaøo cô theå vaät chuû sau quaù trình phaân huûy sinh hoïc thaäm chí ôû noàng ñoä 3 ppm. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 23 Vôùi taùc nhaân khaâu maïch laø 1–ethyl–3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ñöôïc bieát laø khoâng coù tính ñoäc vaø töông hôïp sinh hoïc do EDC khoâng hôïp nhaát vaøo trong caáu truùc xoáp ñöôïc khaâu maïch, maø chæ bieán ñoåi thaønh moät daãn xuaát urea hoøa tan trong nöôùc. Tính ñoäc cuûa daãn xuaát urea raát thaáp so vôùi EDC. EDC laø daãn xuaát tan trong nöôùc cuûa carbodiimide. Carbodiimide xuùc taùc söï taïo thaønh lieân keát amide giöõa axit carboxylic vaø hoaëc nhoùm phosphate vaø amine baèng caùch hoaït hoùa nhoùm carboxyl hoaëc nhoùm phosphate hình thaønh daãn xuaát O-urea. EDC deã bò maát hoaït tính trong moâi tröôøng nöôùc neân thöôøng söû duïng dung moâi höõu cô ñeå hoøa tan. Yeâu caàu caàn thieát cuûa vaät caáy gheùp laø caáu truùc loã beân trong xoáp. Caáu truùc loã coù hai chöùc naêng laâm saøng : ¾ Caùc keânh coù loã laø coång vaøo cho söï di truù teá baøo töø moâ keà caän vaøo chaát thòt cuûa vaät gheùp hay ñoái vôùi söï thaám dòch töø maïch maùu xuaát huyeát gaàn keà. ¾ Caùc loã seõ töông taùc ñaëc tröng vôùi teá baøo ñang xaâm laán hay töông taùc vôùi caùc yeáu toá ñoâng maùu khi maùu chaûy vaøo trong vaät lieäu (nhö mieáng xoáp caàm maùu). Caùc loã ñöôïc taïo ra ñaàu tieân baèng ñoâng tuï huyeàn phuø loaõng sôïi collagen vaø sau ñoù thaêng hoa tinh theå nöôùc ñaù baèng caùch phôi baøy huyeàn phuø vôùi chaân khoâng ôû nhieät ñoä thaáp. Caáu truùc loã cuoái cuøng laø moâ hình aâm tính cuûa maïng löôùi tinh theå nöôùc ñaù, kích thöôùc cuûa loã giaûm khi nhieät ñoä ñoâng giaûm. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 24 1.4. Teá baøo maàm cuûa tuûy xöông: [6], [33] Hình 17: Teá baøo maàm cuûa tuûy xöông quan saùt döôùi kính hieån vi Moät quaàn theå teá baøo trong tuûy xöông chòu traùch nhieäm trong vieäc hình thaønh taát caû caùc daïng teá baøo maùu khaùc nhau trong cô theå laø nhöõng teá baøo maàm cuûa moâ taïo maùu (HSC: hepatopoietic stem cell). HSC ñaõ ñöôïc nhaän dieän töø hôn 40 naêm nay. Ngoaøi ra, moät quaàn theå teá baøo khaùc trong tuûy xöông laø quaàn theå teá baøo neàn cuûa tuûy xöông (Bone marrow stromal cell). Nhöõng teá baøo neàn trong tuûy xöông laø moät hoãn hôïp caùc quaàn theå teá baøo coù theå saûn sinh ra xöông, suïn, môõ, moâ lieân keát daïng sôïi vaø heä thoáng maïng löôùi hoã trôï cho söï hình thaønh nhöõng teá baøo maùu. Nhöõng teá baøo maàm trung moâ cuûa tuûy xöông (MSC: Mesenchymal stem cell) cuõng coù theå taïo ra nhöõng moâ naøy vaø taïo thaønh cuøng moät quaàn theå teá baøo nhö nhöõng teá baøo neàn tuûy xöông. Gaàn ñaây, moät quaàn theå nhöõng nguyeân baøo ñònh höôùng bieät hoùa thaønh nhöõng teá baøo noäi maïc, moät loaïi teá baøo naèm loùt trong maïch maùu vaø ñöôïc phaân laäp töø voøng tuaàn hoaøn maùu, ñöôïc nhaän bieát laø coù nguoàn goác töø tuûy xöông. Duø raèng nhöõng nguyeân baøo noäi maïc gioáng vôùi nhöõng nguyeân baøo maïch, loaïi teá baøo taïo thaønh maïch maùu trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, nhöng vieäc chuùng coù ñaïi dieän cho moät quaàn theå teá baøo maàm cuûa tuûy xöông ôû caù theå tröôûng thaønh thaät hay khoâng vaãn coøn laø ñieàu khoâng chaéc chaén. Do ñoù, tuûy xöông döôøng nhö coù Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 25 chöùa 3 quaàn theå teá baøo maàm laø: HSC, MSC vaø coù theå laø caû nguyeân baøo noäi maïc. 1.4.1. Teá baøo maàm cuûa moâ taïo maùu (HSC: Hematopoietic Stem Cell): Teá baøo maùu laø moät trong nhöõng teá baøo coù khoaûng thôøi gian soáng ngaén nhaát trong taát caû caùc loaïi teá baøo cuûa cô theå (ví duï teá baøo hoàng caàu khoâng nhaân chæ soáng ñöôïc khoaûng 120 ngaøy), cho neân cuoäc soáng cuûa ñoäng vaät phuï thuoäc vaøo khaû naêng boå sung lieân tuïc nhöõng teá baøo hoàng caàu vaø nhöõng teá baøo maùu khaùc cuûa cô theå. Quaù trình boå sung naøy xaûy ra chuû yeáu ôû tuûy xöông nôi maø nhöõng HSC cö truù, phaân chia vaø bieät hoùa thaønh nhöõng loaïi teá baøo maùu. Nhöõng HSC coù khaû naêng töï laøm môùi vaø taïo ra taát caû caùc loaïi teá baøo maùu cuûa cô theå. Ñieàu naøy coù nghóa laø moät HSC ñôn coù khaû naêng taùi sinh ra moät heä teá baøo taïo maùu hoaøn chænh. Hôn nöõa, chuùng coøn coù khaû naêng taùi sinh laïi heä thoáng moâ taïo maùu cuûa ñoäng vaät. Cô sôû cuûa keát luaän naøy laø moät thöû nghieäm treân ñoái töôïng chuoät nhaét. Nhöõng con chuoät naøy nhaän lieàu phoùng xaï gaây töû vong ñeå phaù huûy hoaøn toaøn heä thoáng moâ taïo maùu cuûa baûn thaân chuùng. Sau ñoù, nhöõng HSC ñöôïc caáy gheùp vaøo tuûy xöông cuûa chuùng vaø heä thoáng moâ taïo maùu cuûa chuùng ñöôïc taùi sinh trôû laïi. Caû voøng ñôøi cuûa HSC laãn voøng ñôøi cuûa caùc loaïi teá baøo maùu ñeàu baét ñaàu töø tuûy xöông ñeán maùu vaø quay trôû laïi tuûy xöông döôùi aûnh höôûng cuûa moät loaït nhöõng yeáu toá ñöôïc tieát ra ñeå ñieàu hoøa söï taêng sinh, bieät hoùa vaø di truù cuûa chuùng. Nhöõng HSC ñöôïc chöùng minh laø nhöõng teá baøo maàm taïo maùu laàn ñaàu tieân trong moät loaït thí nghieäm ôû chuoät vaø nhöõng teá baøo maàm taïo maùu töông töï cuõng ñöôïc chöùng minh laø coù hieän dieän ôû ngöôøi. Coù hai loaïi HSC laø HSC daøi haïn (long-term HSC) vaø HSC ngaén haïn (short-term HSC). Nhöõng HSC daøi haïn taêng sinh trong suoát ñôøi soáng cuûa sinh Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 26 vaät. ÔÛ con chuoät nhaét coøn non thì coù khoaûng töø 8-10% löôïng HSC daøi haïn böôùc vaøo chu trình teá baøo vaø phaân chia moãi ngaøy. Nhöõng HSC ngaén haïn thì chæ taêng sinh trong moät khoaûng thôøi gian giôùi haïn coù theå laø vaøi thaùng. Nhöõng HSC daøi haïn coù hoaït ñoäng telomerase (telomerase laø moät enzyme giuùp duy trì ñoä daøi cuûa ñaàu nhieãm saéc theå, maø chuùng ta goïi laø telomere, baèng caùch theâm vaøo nhöõng nucleotide) ôû möùc cao. Telomerase hoaït ñoäng laø moät ñaëc tính cuûa nhöõng teá baøo chöa bieät hoùa, nhöõng teá baøo ñang phaân chia vaø nhöõng teá baøo ung thö. ÔÛ chuoät nhaét, coù khoaûng 1 trong 10.000 hay 1 trong 15.000 teá baøo cuûa tuûy xöông laø nhöõng HSC daøi haïn. Nhöõng HSC ngaén haïn bieät hoùa thaønh nguyeân baøo baïch caàu vaø nguyeân baøo tuûy, hai loaïi nguyeân baøo chính cuûa nhöõng doøng teá baøo maùu. Nguyeân baøo baïch caàu bieät hoùa thaønh nhöõng doøng teá baøo lympho T, nhöõng teá baøo lympho B vaø teá baøo tìm dieät töï nhieân (NK-Natural killer cell). Nhöõng cô cheá vaø con ñöôøng daãn ñeán söï bieät hoùa cuûa chuùng vaãn coøn ñang ñöôïc nghieân cöùu. Nguyeân baøo tuyû bieät hoùa thaønh baïch caàu ñôn nhaân vaø ñaïi thöïc baøo, baïch caàu öa axit, baïch caàu öa bazô, teá baøo coù nhaân khoång loà cuõng nhö hoàng caàu. Moät nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy nhöõng HSC ngaén haïn laø moät quaàn theå teá baøo khoâng ñoàng nhaát vaø khaùc nhau ñaùng keå trong khaùi nieäm veà khaû naêng töï laøm môùi vaø taùi phuïc hoài quaàn theå cuûa heä thoáng moâ taïo maùu. Trong ñieàu kieän invivo, coù nhieàu yeáu toá ñieàu hoøa söï bieät hoùa cuûa nhöõng HSC trong tuûy xöông, ñoù laø nhöõng cytokine. Nhöõng cytokine naøy ñöôïc taïo ra bôûi nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau vaø sau ñoù ñöôïc taäp trung veà tuûy xöông nhôø chaát neàn ngoaïi baøo cuûa nhöõng teá baøo neàn, nôi nhöõng teá baøo maùu ñöôïc taïo thaønh. Cho ñeán nay, hai cytokine ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát laø yeáu toá kích hoaït taïo quaàn theå baïch caàu haït vaø ñaïi thöïc baøo (GM-CSF-Granulocyte- macrophage colony-stimulating factor) vaø interleukin-3 (IL-3). Nhöõng moái quan heä giöõa caùc teá baøo vôùi nhöõng phaân töû ñính vaøo chaát neàn ngoaïi baøo cuûa Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 27 tuûy xöông cuõng ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc taêng sinh vaø bieät hoùa maàm taïo maùu cuûa tuûy xöông. 1.4.2. Teá baøo maàm trung moâ cuûa tuûy xöông (MSC: Messenchymal Stem Cell): Nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông ñoùng vai troø quan troïng trong söï bieät hoùa caùc teá baøo maùu tröôûng thaønh coù nguoàn goác töø nhöõng teá baøo maàm taïo maùu cuûa tuûy xöông. Nhöng nhöõng teá baøo neàn naøy cuõng coù nhöõng chöùc naêng quan troïng khaùc. Ñeå cung caáp moâi tröôøng vaät lyù cho söï bieät hoùa cuûa nhöõng HSC, nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông saûn sinh ra suïn, xöông vaø môõ. Nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông coù nhieàu ñaëc ñieåm beân ngoaøi ñeå phaân bieät chuùng vôùi nhöõng HSC. Hai loaïi teá baøo naøy raát deã phaân laäp trong ñieàu kieän in vitro. Khi tuûy xöông ñöôïc taùch rôøi ra vaø hoãn hôïp teá baøo ñöôïc traûi ra treân beà maët nuoâi caáy vôùi maät ñoä thaáp thì nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông baùm dính vaøo beà maët ñóa nuoâi caáy trong khi nhöõng HSC thì khoâng. Trong nhöõng ñieàu kieän in vitro ñaëc bieät, caùc teá baøo neàn cuûa tuûy xöông hình thaønh quaàn theå teá baøo coù daïng gioáng vôùi nguyeân baøo sôïi töø moät teá baøo ñôn vaø ñöôïc goïi laø ñôn vò hình thaønh quaàn theå F (colony forming unit-F CFU- F). Sau ñoù, nhöõng quaàn theå naøy coù theå bieät hoùa thaønh nhöõng teá baøo môõ hay chaát neàn laøm giaù ñôõ cho tuûy. Ñaây laø moät kó thuaät ñeå chöùng minh raèng nhöõng teá baøo neàn coù baûn chaát gioáng teá baøo maàm. Khaùc vôùi HSC, laø nhöõng teá baøo khoâng coù khaû naêng phaân chia trong ñieàu kieän in vitro hay chæ taêng sinh trong moät khoaûng thôøi gian giôùi haïn, teá baøo neàn cuûa tuûy xöông coù theå taêng sinh vaø ñaït ñeán 35 laàn nhaân ñoâi trong ñieàu kieän in vitro. Nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông seõ taêng tröôûng raát nhanh döôùi aûnh höôûng cuûa nhöõng taùc nhaân gaây ra söï phaân baøo nhö yeáu toá taêng tröôûng coù nguoàn goác töø tieåu caàu (Platelet-derived Growth Factor-PDGF), yeáu toá taêng Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 28 tröôûng bieåu bì (Epidermal Growth Factor-EGF), yeáu toá cô baûn taêng tröôûng nguyeân baøo sôïi (Basic Fibroblast Growth Factor-bFGF) vaø yeáu toá taêng tröôûng gioáng insulin 1 (Insulin-like Growth Factor-1 IGF-1). Gioáng nhö HSC, nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông phaùt sinh töø trung phoâi bì trong suoát quaù trình phaùt trieån maëc duø chöa coù nguyeân baøo hay teá baøo maàm ñaëc tröng naøo cuûa chuùng ñöôïc phaân laäp vaø xaùc ñònh. Moät giaû thuyeát ñöôïc cho raèng nhöõng teá baøo maàm naøy ñöôïc ñeå daønh laïi trong quaù trình phaùt trieån cuûa thai vaø bò ngaên caûn khoûi söï bieät hoùa. Moät giaû thuyeát khaùc veà nguoàn goác cuûa chuùng ñoù laø moät loaïi nguyeân baøo phoå bieán coù theå laø moät teá baøo noäi maïc nguyeân thuûy loùt beân trong nhöõng maïch maùu cuûa phoâi taïo ra caû nhöõng HSC vaø nhöõng nguyeân baøo cuûa trung bì. Nguyeân baøo cuûa trung bì coù theå bieät hoùa thaønh nguyeân baøo cô vaø nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông. Trong ñieàu kieän in vivo, söï bieät hoùa cuûa nhöõng teá baøo neàn thaønh teá baøo xöông ñeàu khaù phöùc taïp. Nhöõng teá baøo môõ cuûa tuûy xöông vaø nhöõng teá baøo neàn laøm giaù ñôõ cho tuûy ñeàu coù nguoàn goác töø teá baøo neàn cuûa tuûy xöông vaø coù theå ñöôïc xem nhö nhöõng kieåu hình coù theå hoaùn ñoåi ñöôïc. Nhöõng teá baøo môõ khoâng phaùt trieån cho ñeán khi con non ñöôïc sinh ra . Ñoù cuõng chính laø luùc xöông lôùn leân vaø khoâng gian daønh cho tuûy môû roäng ra ñeå ñieàu tieát söï gia taêng cuûa moâ taïo maùu. Khi boä xöông ngöøng taêng tröôûng thì khoái HSC seõ giaûm theo tuoåi cuûa ñoäng vaät. Luùc ñoù, nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông seõ bieät hoùa thaønh nhöõng teá baøo môõ ñeå laáp ñaày nhöõng choã troáng. Söï hình thaønh xöông môùi hieån nhieân laø lôùn hôn trong quaù trình taêng tröôûng cuûa boä xöông maëc duø söï phaùt trieån xöông quay voøng trong suoát ñôøi soáng sinh vaät. Nhöõng teá baøo hình thaønh xöông laø nhöõng nguyeân coát baøo nhöng moái quan heä cuûa noù vôùi chaát neàn cuûa tuûy xöông thì chöa ñöôïc bieát ñeán roõ raøng. Nhöõng laù xöông môùi naèm beân trong cuûa xöông saùt vôùi tuûy cho neân coù theå suy ra moät caùch hôïp lí raèng chuùng phaùt trieån töø nhöõng teá baøo neàn cuûa tuûy xöông. Nhöng ôû beà maët ngoaøi cuûa Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 29 xöông cuõng coù söï quay voøng nhö caùch maø xöông hoaït ñoäng beân caïnh heä Havers (heä thoáng keânh coù hình daïng caét ngang laø nhöõng voøng troøn ñoàng taâm naèm trong xöông). Vaø khoâng coù baát cöù beà maët naøo cuûa heä naøy tieáp xuùc vôùi chaát neàn cuûa tuûy xöông. 1.5. ÖÙng duïng nuoâi caáy tuûy xöông: 1.5.1. ÖÙng duïng nuoâi caáy tuûy xöông trong y hoïc [6]: Nhöõng teá baøo maàm laø chìa khoùa cho söï thay theá nhöõng teá baøo ñaõ maát trong raát nhieàu caên beänh coù söùc taøn phaù lôùn nhö beänh Parkinson, beänh tieåu ñöôøng, beänh tim maõn tính, giai ñoaïn cuoái cuûa nhöõng beänh veà thaän, söï hö hoûng gan vaø ung thö… Ñoái vôùi nhöõng beänh aûnh höôûng tôùi tuoåi thoï con ngöôøi thì muïc ñích cuûa caùc nhaø khoa hoïc vaø caùc nhaø nghieân cöùu laø tìm caùch thay theá nhöõng chu trình töï nhieân ñaõ bò maát ñi. Noùi caùch khaùc, hoï ñang tìm caùch söû duïng nhöõng teá baøo maàm ñeå phuïc hoài laïi nhöõng chöùc naêng ñaõ maát duø chæ laø moät phaàn naøo ñoù. Ngoaøi ra, vì khaû naêng loaïi boû nhöõng teá baøo maàm caáy gheùp nhö moät vaät laï cuûa ngöôøi nhaän laø raát cao neân caùc nhaø khoa hoïc vaø nghieân cöùu coøn ñang tìm caùch bieán ñoåi nhöõng teá baøo maàm cuõng nhö bieán ñoåi heä mieãn dòch cuûa ngöôøi beänh. Caû hai vaán ñeà treân laø nhöõng ñieàu kieän chính taát yeáu ñeå ñaït ñöôïc muïc ñích cuoái cuøng laø phuïc hoài laïi chöùc naêng cuûa cô theå soáng. 1.5.2. ÖÙng duïng nuoâi caáy tuûy xöông trong döôïc hoïc [6]: Nhöõng teá baøo maàm saün saøng ñöôïc khaûo saùt nhö moät phöông tieän ñeå phaân phaùt gen ñeán nhöõng moâ ñaëc bieät trong cô theå. Nhöõng lieäu phaùp chöõa beänh döïa vaøo teá baøo maàm laø moät lónh vöïc chính trong nghieân cöùu veà ung thö. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 30 Trong nhieàu naêm, caùc nhaø sinh hoïc ñaõ söû duïng nhöõng teá baøo maàm ñeå phuïc hoài laïi heä maùu vaø chöùc naêng cuûa heä thoáng mieãn dòch cho nhöõng beänh nhaân bò ung thö ñaõ ñöôïc ñieàu trò baèng hoùa trò cuõng nhö baèng xaï trò. Trong töông lai, teá baøo maàm (vaø nhöõng teá baøo coù nguoàn goác töø chuùng) coù theå ñöôïc söû duïng ñeå thöû nghieäm hieäu quaû cuûa döôïc phaåm cuõng nhö thöû nghieäm moät soá lieäu phaùp trò beänh khaùc. Maëc duø nhöõng maãu vaät ñeå thöû laø ñoäng vaät vaø chuùng laø choã döïa chính cho nhöõng nghieân cöùu döôïc hoïc, nhöng khoâng phaûi luùc naøo thoâng qua maãu thöû naøy chuùng ta cuõng tieân ñoaùn ñöôïc nhöõng hieäu öùng cuûa moät loaïi thuoác coù theå coù treân nhöõng teá baøo cuûa ngöôøi trong quaù trình phaùt trieån. Nhöõng teá baøo maàm chaéc chaén seõ ñöôïc söû duïng ñeå phaùt trieån thaønh nhöõng teá baøo gan chuyeân hoùa ñeå ñaùnh giaù naêng löïc khöû ñoäc tieàm taøng cuûa thuoác vaø ñaïi dieän cho moät kieåu heä thoáng caûnh baùo môùi sôùm ñeå ngaên chaën nhöõng phaûn öùng ngöôïc vaø nhöõng phaûn öùng phuï trong cô theå beänh nhaân. 1.5.3. ÖÙng duïng nuoâi caáy tuûy xöông trong coâng ngheä moâ: 1.5.3.1. ÖÙng duïng trong coâng ngheä moâ xöông nhaân taïo [36], [37]: ÖÙng duïng chuû yeáu cuûa nuoâi caáy tuûy xöông trong coâng ngheä vaät lieäu laø taïo ra caùc moâ xöông nhaân taïo, nhaèm giaûi quyeát nhöõng beänh gaây ra do xaâm nhieãm, maát ñi nguoàn teá baøo maùu hay moät caên beänh thöôøng xaûy ra ôû ngöôøi giaø, ñoù laø beänh loaõng xöông. Trong nghieân cöùu, ngöôøi ta ñaõ söû duïng caùc teá baøo trung moâ cuûa tuûy xöông, döïa vaøo söï lan toûa cuûa caùc teá baøo naøy trong moâi tröôøng nuoâi caáy hai chieàu ñeå thu nhaän moät löôïng lôùn teá baøo vaø töø ñoù ñöa leân vaät lieäu ñöôïc taïo thaønh baèng caùc sôïi poly (L-lactic-co-glycolic acid) (PLLGA) vaø boå sung caùc taùc nhaân taïo xöông. ÔÛ ñaây, vieäc toái öu hoùa caùc ñieàu kieän nuoâi caáy teá baøo xöông laø yeáu toá tieân quyeát cho söï thaønh coâng. Sau ñoù, giaûi quyeát caùc vaán ñeà nhö maät ñoä teá baøo toát nhaát ñeå coá ñònh, aûnh höôûng cuûa Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 31 moâi tröôøng taïi thôøi ñieåm coá ñònh teá baøo, aûnh höôûng cuûa caùc taùc nhaân moâ taïo xöông, nhöõng haïn cheá cuûa vaät lieäu khuoân ngoaïi baøo khi nuoâi caáy teá baøo vôùi caùc taùc nhaân treân. Baát chaáp nhöõng vaán ñeà phöùc taïp treân, caùc nhaø khoa hoïc ñang töøng ngaøy noã löïc nghieân cöùu, taïo ra caùc moâ töông töï moâ xöông nhaèm muïc ñích chöõa beänh. Moät döï aùn khaùc söû duïng caùc teá baøo tuûy xöông chuoät nhaèm muïc ñích thieát keá nhöõng maûnh gheùp xöông, töø ñoù giaûm nhu caàu söû duïng maûnh gheùp töï thaân vaø maûnh gheùp ñoàng loaïi. Yeâu caàu quan troïng laø tìm kieám moät giaøn giaùo sinh hoïc thích hôïp cho teá baøo baùm dính vaø taêng sinh. Nghieân cöùu naøy söû duïng loã collagen ñeå taïo ra maûnh gheùp thay theá xöông. Collagen coù söï cöùng chaéc vaø caáu truùc oån ñònh cho moät soá löôïng lôùn caùc moâ trong cô theå nhö da, maïch maùu, gaân, suïn vaø xöông. Nhö theá, ñaây laø vaät lieäu lyù töôûng ñeå nghieân cöùu teá baøo taïo xöông. Sau khi thieát keá giaøn giaùo, ngöôøi ta khaûo saùt söï baùm dính, taêng sinh, söï taïo khuoân ngoaïi baøo vaø söï khoaùng hoùa treân giaøn giaùo cuûa caùc teá baøo tuûy xöông chuoät. 1.5.3.2. ÖÙng duïng trong coâng ngheä moâ da nhaân taïo [11]: Caùc teá baøo tuûy xöông khoâng chæ ñöôïc söû duïng taïo ra caùc moâ xöông maø chuùng coøn ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu da nhaân taïo bôûi khaû naêng baùm dính toát, deã nuoâi caáy, thôøi gian nuoâi caáy ngaén cuûa chuùng. Hoaït ñoäng sinh hoïc cuûa giaøn giaùo söû duïng trong coâng ngheä moâ tuøy thuoäc vaøo maät ñoä caùc lieân keát, vò trí treân giaøn giaùo nôi maø dieãn ra quaù trình gaén cuûa teá baøo. Söû duïng giaøn giaùo taïo bôûi collagen-glucoaminoglycan (CG) cho vieäc nghieân cöùu söï taùi taïo da. Giaøn giaùo treân khoâng coù hoaït tính khi kích thöôùc trung bình cuûa loã nhoû hôn 20 µm hay lôùn hôn 120 µm. Ñeå nghieân cöùu moái quan heä giöõa khaû naêng baùm dính, soáng soùt cuûa teá baøo vaø caáu truùc cuûa giaøn giaùo, caùc giaøn giaùo CG ñöôïc taïo thaønh vôùi 4 kích côõ loã khaùc nhau baèng Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 32 kó thuaät laøm laïnh khoâ. Caùc teá baøo tuûy xöông cuûa chuoät ñöôïc ñöa leân 4 daïng giaøn giaùo treân vaø ñöôïc duy trì trong ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp. Taïi caùc moác thôøi gian (24 giôø hay 48 giôø), caùc teá baøo soáng ñöôïc ñeám ñeå khaûo saùt khaû naêng baùm dính. Söï khaùc nhau ñaùng tin caäy ôû soá löôïng teá baøo baùm dính ñöôïc quan saùt ôû 4 loaïi giaøn giaùo khaùc nhau sau 24 giôø vaø 48 giôø. Soá löôïng caùc teá baøo dính soáng soùt giaûm ñi töông öùng vôùi söï taêng daàn kích thöôùc loã. Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 33 2.1. Muïc tieâu nghieân cöùu: 2.1.1. Thieát keá maøng töø caùc thaønh phaàn gelatin, chitosan, axit hyaluronic, chaát khaâu maïch EDC. 2.1.2. Phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo maàm cuûa tuûy xöông, khaûo saùt khaû naêng coá ñònh caùc teá baøo treân leân maøng. 2.2. Ñoái töôïng nghieân cöùu: Chuoät nhaét traéng Mus musculus var.Albino coù troïng löôïng 29- 31 g/con ñöôïc thu nhaän töø khoa döôïc lyù Beänh Vieän Y Hoïc daân Toäc TP. HCM. Hình 18: Chuoät nhaét traéng ñöôïc nuoâi chuaån taïi phoøng thí nghieäm. 2.3. Duïng cuï _ Thieát bò _ Nguyeân vaät lieäu: 2.3.1. Duïng cuï: Micropipette (100 µl, 1000 µl) Ñaàu típ (100 µl, 1000 µl) Pipette thuûy tinh (10 ml) Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 34 Quaû boùp cao su Becher (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml) Loï thuûy tinh (250 ml) Muoãng muùc hoùa chaát Ñóa petri nhöïa (5 cm x 1,2 cm) Giaáy nhoâm Giaáy thaám Buoàng ñeám hoàng caàu (Neubauer – Ñöùc) Lamelle Caù töø Ly thuûy tinh Kim tieâm (1 ml, 5 ml, 10 ml) (Vinahankbook Medical Supplies – Vieät Nam) Eppendorf (1 ml) Ñóa 4 gieáng (Sigma – Singapore) Parafilm Erlen (50 ml) Goøn khoâng thaám, goøn thaám OÁng ñong (100 ml, 500 ml, 1000 ml) 2.3.2. Thieát bò: Caân phaân tích (Mettler AEO) Caân ñieän töû (A&D – Nhaät Baûn) Thieát keá vaø coá ñònh teá baøo tuûy xöông leâøn maøng 35 Maùy khuaáy töø gia nhieät (IKA – Myõ, OSA – Anh vaø Stuart) Maùy laéc (IKA, Myõ) Tuû caáy voâ truø