Thử nghiệm phương pháp tách chiết dna trong đất nhằm khảo sát tính đa dạng của hệ vi sinh vật trong mối quan hệ tương tác giữa trùn đất Pheretima sp và thực vật siêu hấp thụ kim loại nặng

 PAGE 1 THỬ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TRONG ĐẤT NHẰM KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG CỦA HỆ VI SINH VẬT TRONG MỐI QUAN HỆ TƯƠNG TÁC GIỮA TRÙN ĐẤT Pheretima sp.VÀ THỰC VẬT SIÊU HẤP THỤ KIM LOẠI NẶNG CÂY THƠM ỔI (Lantana Camara L.) MỤC LỤC Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Giới hạn đề tài Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Ô nhiễm chì (Pb) và tác hại 2.1 Đặc tính của chì (Pb) 2.2 Tình hình ô nhiễm chì 2.2.1 Trên thế giới 2.2.2 Ở Việt Nam 2.3 Ảnh hưởng lên sức khỏe cộng đồng dân cư 2.3.1 Tác hại đến hệ thống tạo huyết của cơ thể 2.3.2 Tác hại đến hệ thống thần kinh 2.3.3 Tác hại đến thận 2.3.4 Tác hại đến hệ tiêu hoá 2.3.5 Tác hại đến hệ tim mạch 2.3.6 Tác hại đến hệ sinh sản 2.4 Giải ô nhiễm bằng biện pháp sinh học 2.5 Phương pháp Phytoremediation 2.5.1 Lịch sử phát triển 2.5.2 Định nghĩa 2.5.3 Nguyên tắc 2.5.4 Ưu điểm 2.5.5 Khuyết điểm 2.6 Ứng dụng 2.7 Thực vật siêu hấp thu kim loại nặng 2.7.1 Khái niệm thực vật siêu hấp thụ ( Hyperaccumulator) Nguyên nhân thực vật có khả năng hấp thụ kim loại nặng Giả thuyết sự hình thành phức hợp Giả thuyết về sự lắng đọng Giả thuyết hấp thụ thụ động Sự tích luỹ kim loại là cơ chế chống lại các điều kiện stress vô sinh hoặc hữu sinh 2.8 Cơ chế giải ô nhiễm của thực vật 2.9 Trùn đất 2.9.1 Đặc điểm 2.9.2 Điều kiện sống & sinh sản 2.9.2.1 Điều kiện sống 2.9.2.2 Sinh sản 2.10 Lợi ích đối với đất Chương 3 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm Đất ô nhiễm 3.2 Phương pháp phân tích đất 3.2.1 Độ pH (độ chua của đất) (pH H2O) 3.2.2 Độ hút ẩm tối đa của đất (CMR) 3.2.3. CEC 3.2.4. Chỉ tiêu N, P tổng số 3.2.4.1 Chỉ tiêu N tổng số 3.2.4.2 P tổng số 3.2.5 Chất mùn 3.2.6 N, P, K dễ tiêu 3.2.6.1 P dễ tiêu 3.2.6.2 N2 dễ tiêu (phương pháp Kjendhal) 3.2.6.3 K dễ tiêu 3.2 Thực vật 3.2.1 Ứng dụng của cây Lantana camara L. 3.2.2 Những nhược điểm 3.3 Trùn đất 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Bố trí 3.4.2 Theo dõi thí nghiệm 3.4.2.1 Chăm sóc 3.4.2.2 Theo dõi sinh trưởng của cây 3.4.2.3 Thời gian thí nghiệm 3.4.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm 3.4.3 Lấy mẫu và phân tích 3.4.3.1 Lấy mẫu 3.4.3.2 Các phương pháp trong phòng thí nghiệm Chương 4 DỰ ĐOÁN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dự đoán Đề nghị Tài liệu tham khảo DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase chain reaction DGGE: Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis Bp : Base pair DNA: Deoxyribonucleic acid OD: Optical density RNA: Ribonucleic acid Ta: Annealing temperperature Tm:Melting temperature TE: Tris EDTA TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid UV: Ultra Violet KLN: kim loại nặng VSV: vi sinh vật ppm: mg/l Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, vấn đề ô nhiễm kim loại nặng (KLN) trong đất ngày càng phức tạp (Pb, Cd, Mg, Zn, ….) đang xảy ra phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới. Rác thải từ các nhà máy công nghiệp (sản xuất pin, nhiệt điện, ximăng, nhuộm vải, hóa chất, khai thác mỏ quặng, than, …), không ngừng gia tăng đã tạo ra một sức ép nghiêm trọng đến môi trường đất làm ảnh hưởng đến sức khỏe môi trường và con người. Để xử lý ô nhiễm đất các phương pháp truyền thống và hiện đại được đưa ra sự dụng như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học - vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi ion, oxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, ...... là quá trình dài đòi hỏi nhiều vốn đầu tư, kĩ thuật và công nghệ phức tạp. Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí cao và có giới hạn về kĩ thuật. Phương pháp sinh học phytoremediation ra đời gần đây, có thể khắc phục được những nhược điểm trên. Phương pháp này dựa trên cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ kim loại nặng của một số loài thực vật. Nhằm tối ưu hoá khả năng xử lý ô nhiễm KLN đặc biệt là chì (Pb) trong đất bằng phương pháp phytoremediation. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu tiến hành sử dụng một số loài thực vật có khả năng hấp thụ KLN gấp nhiều lần thực vật hấp thụ KLN thông thường được gọi là thực vật siêu hấp thu KLN. Không chỉ vậy để tăng khả năng hoạt động của vùng rễ cây còn có sự kết hợp với một yếu tố rất quan trọng nữa là trùn đất Pheretima sp. Để cải thiện hoạt động của vùng rễ kích thích khả năng hấp thụ chì của cây, rút ngắn thời gian cải tạo môi trường đất bị ô nhiễm KLN. Từ ý nghĩa thiết thực trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, em đã thực hiện đề tài: “Thử nghiệm phương pháp tách chiết DNA trong đất nhằm khảo sát tính đa dạng của hệ vi sinh vật trong mối quan hệ tương tác giữa trùn đất Pheretima sp. và thực vật siêu hấp thụ kim loại nặng cây thơm ổi (Lantana Camara L.)” Mục đích Khảo sát khả năng hấp thụ của cây thơm ổi Lantana Camara L. khi bổ sung trùn đất Pheretima sp. Thiết lập cơ chế về mối quan hệ giữa thực vật và trùn khi trùn tác động trên đất làm thay đổi các tính chất của đất, gia tăng hệ VSV, hoạt hóa hệ enzyme. 1.3 Giới hạn đề tài Đề tài chỉ được tiến hành nghiên cứu với một giống cây là cây thơm ổi Lantana Camara L. có nguồn gốc từ Đồng Tháp và trùn đất Pheretima sp. thí nghiệm được lấy từ khu vực ở Biên Hoà. Đề tài thực hiện trong thời gian từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008. Tiến trình thực hiện Phần 1: Từ 1/4/2008 – 30/5/2008 bố trí thí nghiệm tại Phú An. Phần 2: Từ 1/6/2008- 15/7/2008 xử lý mẫu và phân tích các chỉ tiêu về đất ở trung tâm phân tích môi trường trường Đại học Nông Lâm Phần 3: Từ 15/7/2008- 30/8/2008 phân tích hệ vi sinh vật trong đất tại trung tâm phân tích hoá sinh của trường. Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Chì và các tác hại của chì 2.1 Đặc điểm của chì (Pb) Chì là kim loại nặng màu xám xanh nhạt (M = 207.1; d = 11.3 g/cm3), mềm dẻo, dễ cán mỏng, dễ cắt và dễ định hình. Có độ linh động kém và thời gian bán hủy trong đất từ 800 – 6000 năm, dẫn điện kém và rất độc. Chì nóng chảy ở 3270C và sôi ở 17440C nhưng ở 5000C chì đã bay hơi, nhiệt độ càng cao sự bay hơi càng mạnh, hơi chì bay lên sẽ kết hợp với oxy trong không khí tạo thành oxyt chì. Chì thường thấy ở dạng sunfua (PbS), oxyt chì vàng (PbO), sunfat chì (PbSO4) và hợp chất chì với các oxyt kim loại khác như cromat chì, silicat chì... (Yếu tố hoá học trong sản xuất – Nhiễm độ chì) Trong tự nhiên, chì có nhiều dưới dạng PbS và bị chuyển hóa thành PbSO4 do quá trình phong hóa. Pb2+ sau khi được giải phóng sẽ tham gia vào nhiều quá trình Pb3(PO4)2 khác nhau trong đất như bị hấp phụ bởi các khoáng sét, chất hữu cơ hoặc oxit kim loại hoặc bị cố định dưới dạng các hợp chất Pb(OH)2, PbCO3, PbS, PbO, Pb3(PO4)2. Chì bị hấp phụ trao đổi chỉ chiếm một lượng nhỏ ( 12 kết quả thu nhận cũng không tốt. Thực hành Rửa điện cực bằng nước cất trước tiên dùng dung dịch chuẩn pH = 7 chỉnh máy. Rửa lại điện cực bằng nước cất lau khô, dùng chuẩn pH = 4 chỉnh máy. Rửa lại điện cực, lau khô, cho mẫu nước vào đo, đọc kết quả trên máy khi tín hiệu ổn định 30 giây. Độ kiềm của nước Ý nghĩa môi trường Độ kiềm biểu thị khả năng thu nhận proton H- của nước. Có 3 ion chính tạo ra độ kiềm đó là hydroxide, carbonic và bicarbonate. Ngoài ra còn có các thành phần khác như borax, silicat…. cũng ảnh hưởng đến độ kiềm. Có một vài acid hữu cơ bền với sự oxy hoá sinh học như acid humic và các muối chúng làm tăng độ kiềm. Nguyên tắc Độ kiềm chia làm 2 dạng là độ kiềm phenol và độ kiềm tổng cộng. Độ kiềm phenol được xác định bằng cách định phân các acid mạnh có chỉ thị màu phenolphtalein, tại điểm kết thúc chuẩn độ dung dịch sẽ chuyển từ màu hồng sang không màu, ứng với pH dung dịch từ 8.4 -8.2. Độ kiềm tổng cộng được xác định bằng cách định phân với acid mạnh và chỉ thị màu là methyl da cam. Điểm kết thúc chuẩn độ khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang da cam, ứng với pH từ 4.5 – 4.3. Các yếu tố ảnh hưởng Nếu dung dịch có màu hợac d8ục thì không thể sử dụng phương pháp chuẩn độ để xác định độ kiềm mà phải sử dụng phương pháp chuẩn độ điện thế. Dụng cụ - Hoá chất Dụng cụ - thiết bị Erlen 250 ml Ống đong 50 ml Bình định mức 100 ml Buret điện tử Hoá chất Dung dịch HCl 0.02N : hoà tan 1.72 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất thành 1l. Chỉ thị màu phenolphtalein 0.5%: hoà tan 0.5 g phenolphtalein trong 50 ml etanol rồi định mức bằng nước cất đến 100 ml. Chỉ thị màu metyl da cam 0.05%: Cân 0.05 g methyl da cam hoà tan trong 100 ml ethanol. H: Độ kiềm phenol Thực hành Mẫu có pH >8.3 (có 2 độ kiềm) Độ kiềm phenol Lấy 50 ml mẫu vào erlen 250 ml, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein, lắc đều. Dùng dung dịch HCL 0.02 N chuẩn độ cho tới khi dung dịch vừa mất màu hồng. Ghi nhận thể tích V1 của HCL tiêu hao. Độ kiềm tổng cộng Lấy 50 ml mẫu vào erlen 250 ml , thêm 3 giọt chỉ thị methyl da cam, lắc đềudung dịch tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch HCL 0.02 N cho tới khi dung dịch từ màu vàng sang màu da cam. Ghi nhận thể tích V2 của HCL tiêu tốn. Chú ý với mẫu pH 50 mg O2/l): Rửa sạch ống nghiệm có nút vặn kín với H2SO4 20 % trước khi sử dụng. Chọn thể tích mẫu và thể tích hoá chất dùng tương ứng như theo bảng ở phần IV.2.e. Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm dung dịch K2Cr2O7 0.0167 M vào, cẩn thận thêm H2SO4 reagent vào bằng cách cho acid chảy từ từ dọc theo thành của ống nghiệm. Đậy nút vặn ngay, lắc kỹ nhiều lần (cẩn thận vì phản ứng sinh nhiệt), đặt ống nghiệm váo giá inox và cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 1500C trong 2 giờ. Để nguội đến nhiệt độ phòng, đổ dung dịch trong ống nghiệm vào bình tam giác 100 ml, thêm 1-2 giọt chỉ thị ferroin và định phân bằng FAS 0.1 M. Dứt điểm khi mẫu chuyển từ màu xanh lá cây sang màu nâu đỏ. Làm hai mẫu trắng với nước cất (mẫu 0 và mẫu B) Phương pháp đun hoàn lưu hở (với mẫu có COD pHKCl và tác động NaF do phản ứng tạo phức của Al3+ với F tạo thành OH do đó làm tăng mạnh độ pH. Mức độ tăng pH khi tác động với NaF so với pHKCl phản ánh mức độ có mặt của Al3+. Phép đo thông dụng và tiêu chuẩn hiện nay là phép đo điện thế, sử dụng pH met điện cực thuỷ tinh. 1.2 Thiết bị pH mét điện cực thuỷ tinh Máy lắc Đồng hồ bấm giây. 1.3. Thuốc thử Các dung dịch đệm pH tiêu chuẩn : 4.01; 6.86; 9.18. Các dung dịch trao đổi : KCl 1 M . Nước cất có độ dẫn điện riêng không lớn hôn 0.2 ms/m và pH = 5.6-6.6 ở 250C. 1.4 Thực hành Xác định pH nước và pHKCl - Cân 10g đất mịn khô không khí cho vào vào trong bình nhựa dung tích 100ml miệng rộng. - Thêm 50ml H2O cất ( hoặc KCl nếu đo pH KCl) Lắc bằng tay cho phân tán đất và tiếp tục lắc bằng máy 30 phút (vận tốc maximum) sau đó để yên trong khoảng 2 giờ (không quá 3 giờ). Lắc xoáy lại 2-3 lần bằng tay cho phân tán huyền phù. Đo pH bằng pH mét điện cực thủy tinh. Vị trí bầu điện cực ở vị trí trung tâm và trung điểm độ sâu của dung dịch trong huyền phù. Đọc kết quả đo sau khi kim chỉ ổn định 30 giây (mẫu được đo 2 lần lặp lại). Theo số liệu kết quả thí nghiệm pH của đất là: …………… pH 6Xếp loạiRất chuaChua vừaChua nhẹGần trung tínhTrung tính2. Xác định tính thấm nước của đất (CMR) Có nhiều phương pháp khác nhau tùy theo dõi mỗi phòng thí nghiệm và có thể tùy theo số lượng mẫu. Sự sai số giữa các phương pháp không lớn. Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: Cân toàn bộ dụng cụ, ghi lại kết quả cân lần 1. Cân 50 g đất, cho vào phía trên tấm giấy lọc. Thêm H2O vào ngập đất, đầy tấm giấy lọc. Dể lắng hơn 2 h hoặc qua đêm (giai đoạn này để kiểm tra mức độ hấp thu nước cao nhất của đất). Mở đầu kẹp để nước thoát xuống erlen. Để yên khoảng 30 phút để rút nước hoàn toàn và làm khô bề mặt giấy thấm. Sau đó cân lại khối lượng của toàn bộ hệ thống. Dựa vào công thức tính ra %. Tính thấm nước của đất là: …………… Dung lượng cation trao đổi (CEC) 3.1 Nguyên lý và lý thuyết chung Dung lượng cation trao đổi (CEC) là dung lượng hấp thụ cation của phức hệ keo đất. Lượng và chất của CEC là một chỉ tiêu quan trọng về độ phì nhiêu của đất phản ánh khả năng chứa đựng và điều hoà dinh dưỡng có liên quan đến phương pháp bón phân hợp lý. Các bước tiến hành như sau: Bão hoà đất bằng một cation, cation này phải thay thế hết các cation đất đã hấp thu và chứa đấy khả năng hấp thu của đất ( hay gọi là cation bão hoà). Rửa sạch hết những cation ngoài tầng hấp thu của đất. Đẩy toàn bộ cation bão hoà ra bằng một cation khác. Xác định số meq của cation bão hoà được đẩy ra và tử đó suy ra CEC của đất bằng số me/100 g đất (hoặc Cmol/kg đất) Các lưu ý Để đảm bảo kết quả chính xác cần phải chú ý một số đặc điểm sau: Đảm bảo chiết liên tục, đúng tốc độ qui định. Không được để khô mặt mẫu, không được gián đoạn giữa các bước (cụ thể: sau khi bão hoà cation lập tức phải rửa, sau khâu rửa lập tức phải đẩy cation bão hoà). Không được để lọt mẫu, khô mẫu. Cân đồng nhất các yếu tố với tất cả các mẫu. Kĩ thuật chung của 3 bước CEC là rửa, trao đổi và thay thế cation bão hoà là như nhau chỉ cần thực hiện được 3 yêu cầu đã nêu là đảm bảo kết quả tốt. Nhưng cần phải biết với từng loại đất khác nhau khả năng hấp thu và trao đổi khác nhau nên tỉ lệ đất: dung dịch và thời gian trao đổi có thể khác nhau. 3.2 Phương pháp amon acetate Nguyên lý: amon acetate là phương pháp sử dụng dung dịch amon acetate 1M (pH = 7) là dung dịch bão hoà cation. Cation NH4+ sẽ đẩy hết các cation trong tầng cation hấp thu của đất và làm no cation toàn bộ khả năng hấp thụ của đất. Xác định NH4+ - CEC bằng phương pháp Kjendhal. Ưu điểm của phương pháp - Có độ đệm 2 chiều cao, pH của dịch hầu như không thay đổi trong quá trìh trao đổi cation và pha loãng. - Ion bão hoà NH4+ là ion biểu kiến được xác định dễ dàng và chính xác bằng phương pháp Kjendhal. Mặc dù vậy phương pháp cũng có những nhược điểm như: - Đối với đất có chất hữu cơ cao, những đất có chứa kaolin đáng kể, halloysit hoặc những khoáng sét dạng 1:1 khác thì chiết rút bằng amon axetat đều đứa đến kết quả thấp hơn của dịch bari axetat hoặc bari clorua- trietanolamin. - Những loại đất có chứa vecmiculit thì các cation Ca2+, Mg2+, Na+ hay H+ không thể đẩy ra. - Đất canxit cũng cho kết quả thấp do một ít CaCO3 hoà tan sẽ cung cấp một lượng Ca2+ đồng bão hoà amon. Ngoài ra sử dụng NH4+ làm cation bão hoà và là cation biểu thị thì việc rửa bằng nước là không thể được do NH4+ bị thuỷ phân tạo thành NH4OH hoà tan làm giảm CEC. Do đó cần rửa bằng etanol 95% hoắc 80 %( Nếu nồng độ thấp NH4+ không rửa hết và làm tăng CEC). 3.3 Thiết bị- dụng cụ Semi micro Kjendhal và các thiết bị đo thể tích tương ứng. Bình 250 ml Phễu thuỷ tinh Cát acid Bông thuỷ tinh Giấy lọc 3.4 Hoá chất Amon axetat NH4CH3COOH (pH=7): Cân 77.08 g NH4CH3COOH pha 400 ml nước rồi thêm đế gần 1 lít. Kiểm tra độ pH và thêm NH4OH cho đúng pH=7.0 rồi định đến 1 lít. Etanol 80%: 800 ml etanol pha với 200 ml nước cất. KCl hay NaCl 10%: hoà tan 100 g KCl (hay NaCl) vào khoảng 1 lít nước cất. 3.5 Thực hiện thí nghiệm Để thực hiện phần này nên làm vào buổi sáng để có thời gian lọc. Mẫu thực hiện 2 lần lặp lại cùng với 1 mẫu đối chứng. - Cân 3 g cát đã xử lý ( H2SO4, nung, rửa sạch), dùng tay lắc nhẹ để tạo thành lớp mịn trên bề mặt. - Cân 7g + 3 g đất trộn đều thành 1 dãy đồng nhất, đổ thật nhẹ để tạo thành 1 lớp thứ 2 phủ trên bề mặt lớp thứ nhất. H: phễu được nhồi làm CEC - Cân tiếp 3 g cát đã xử lý, trải đều thật nhẹ, tạo thành 1 lớp phủ thứ 3. Cắt 1 mẫu giấy lọc nhỏ, vừa với đường kính của phểu, đặt lên trên bề mặt nhằm giảm áp lực nước và dung dịch cho vào. Dung dịch cho vào: - 50 ml cồn ở 80%, để lắng. - 200ml dung dịch NH4CH3COOH (pH=7), để lắng. - 100 ml cồn 80%, để lắng. Chú ý : Các dung dịch cho vào liên tiếp tránh để cho bề mặt giấy thấm bị khô. Chỗ dung dịch thứ 3 lọc qua thay thế bằng 1 bình nhựa V= 150-200 ml mới. - Thêm nhẹ nhàng 100ml KCl ( pH 1g, và ngược lại đất đen 100 ml. Mỗi chỉ tiêu được thực hiện 2 lần lặp lại. Cho 50 ml dung dịch vào bình nhựa với từng loại hóa chất tương ứng cho từng chỉ tiêu mẫu. K dễ tiêu : NH4Cl 1M P dễ tiêu : H2SO4 0.1N N dễ tiêu : KCl 2N Lắc 1 h với vận tốc lớn nhất sau đó để lắng một thời gian lọc qua giấy. Thu vào bình nhựa tiếp tục chuẩn độ . P dễ tiêu Nguyên lí Phương pháp Oniani dựa trên nguyên lí hoà tan các dạng hợp chất photpho trong đất bằng dung dịch H2SO4 0.1 N. Hàm lượng photpho trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc quang với “ màu xanh molypden”. Dụng cụ - hoá chất Dụng cụ và thiết bị Bình nhựa 100 ml Ống đong 50 ml Pipette: 2ml, 5 ml Bình định mức 50 ml,100 ml. Giấy lọc Cân phân tích Spectrophotometer Máy lắc Hoá chất H2SO4 0.1 N Thuốc thử photpho (pha tương tự như photpho tổng). Dùng cân phân tích cân 5 g đất vào mỗi bình nhựa 100 ml. (Mỗi chỉ tiêu được thực hiện 2 lần lặp lại). Cho 50 ml dung dịch H2SO4 0.1N vào bình nhựa, lắc 1 h với vận tốc tối đa sau đó để lắng một thời gian lọc qua giấy lọc. Thu vào bình nhựa tiếp tục thực hiện phép so màu như làm với photpho tổng. Tính toán kết quả P2O5 (mg /100g đất) = C. V. V2 . 100 W . V1 Trong đó: C: nồng độ so màu mg P2O5/ml V1: số ml dung dịch lấy so màu (2ml) V2: số ml dung dịch chiết rút mẫu (50 ml) W: khối lượng mẫu cân được. N dễ tiêu (phương pháp Kjendhal) Trong đất nitơ (đạm) tồn tịa chủ yếu ở dạng N – hữu cơ. Tuy nhiên cây trồng chỉ sử dụng dưới dnạg N- khoáng ( NH4+, NO3-). Đây là nitơ dễ tiêu trực tiếp nhưng thường có hàm lượng nhỏ trong đất; NH4+ chiếm ưu thế hơn NO3- trong đất ngập nược, còn NO3- lại nhiều hơn trong đất kho có quá trình oxi hoá mạnh. Do hàm lượng amôn (NH4+) và nitrat (NO3-) thấp và luôn biến động, lại thường xuyên được bổ sung do quá trình khoáng hoá ccá chất hữu cơ nên trên thực tế kết quả phân tích NH4+, NO3- không phản ánh đầy đủ khả năng cung cấp N- dễ tiêu của đất. Vì vậy nitơ dễ tiêu trong đất còn được đánh giá thông qua N- thuỷ phân. NH4+ trong đất tồn tại một phần ở dạng hoà tan trong dung dịch đất, phần lớn chúng ở dnạg trao đổi, do vậy phải dùng muối troa đổi . Mặt khác NH4+ dễ bị biến đổi thành các dạng khác ( NO3-), nên xác định NH4+ cần phải phân tích ngay trong mẫu đất tươi mới lấy về. Nguyên lí phương pháp: NH4+ được rút trích ra từ đất bằng dung dịch muối thích hợp (KCl 2 N) sẽ tác dụng với thuốc thử Nessler trong môi trường kiềm tạo thành phức chất màu vàng: NH4+ + 2 K2(HgI4) + 4 KOH = NH2Hg2IO + 7 KI + 3 H2O + K+ Dụng cụ - hoá chất Dụng cụ và thiết bị Ống đong 50 ml Lọ nhựa đựng mẫu 100 ml Bình định mức 1000 ml Giấy lọc Erlen 250 ml Cân phân tích Máy lắc Bộ cất N Buret điện tử Hoá chất KCl 2 N : 14.9 g KCl pha với nước cất định mức đến 1000 ml. Chỉ thị Nessler : 15 g HgI2 và 10 g KI hoà trong 500 ml nước cất rồi cho vào 40 g NaOH. Khuấy cho tan, để lắng vài ngày gạn dung dịch trong bình màu nâu để dùng. Nếu không có sẵn HgI2 thì pha như sau: 9 g HgCl2 với 15.5 g KI hoà vào 500 ml nước cất. Thêm 40 g NaOH khuấy đều cho tan. Đề sau vài ngày và gạn nước trong để dùng. H3BO3 3 %: Cân 30 g H2BO3 tinh khiết cho vào nước cất định mức đến 1000 ml. HCl 0.02 N : 1.62 ml HCl đậm đặc pha trong 1000 ml nước cất. Dung dịch hấp thụ: 100 ml H3BO3 với 1 ml Nessler . Thuốc thử phenolphtalein Thực hành Dùng cân phân tích cân 5 g đất vào mỗi bình nhựa 100 ml. (Mỗi chỉ tiêu được thực hiện 2 lần lặp lại). Cho 50 ml dung dịch KCl 2 N vào bình nhựa rồi chuyển lên máy lắc với tốc độ tối đa trong 1 giờ. Đem xuống để lắng mẫu một thời gian tiếp tục lọc mẫu bằng giấy lọc. Thu vào bình nhựa tiếp tục chạy máy chưng cất. (Thao tác thực hiện như với N tổng số) Chạy máy chưng cất Kjeldahl, mẫu sau khi lọc được đo lại thể tích bằng ống đong 50 ml. (Ghi nhận số liệu thể tích). Cho toàn bộ mẫu vào các ống chưng cất, nhỏ thêm 2 – 3 giọt phenolphtalein rồi cho vào máy. Cho NaOH xuống màu dung dịch trong ống có màu hồng nhạt, tiếp tục chạy máy cho đến khi dịch hấp thụ có màu tím chuyển sang xanh ở mức từ 100 – 150 ml. Tắt máy, đem định lượng bằng phương pháp màu. Chuẩn độ dung dịch từ màu xanh chuyễn sang màu tím trở lại với HCl 0.02 N. Ghi thể tích HCl đã dùng chuẩn độ. Phương pháp chuẩn độ tương tự như với chuẩn N2 tổng . Tính toán kết quả NH4+ ( mg/100gđất) = C . V .V2 . k . 100 W. V1 V: số ml dung dịch chiết rút (ml) V1: số ml mẫu đem chạy máy (ml) V2: thể tích HCl 0.02 N chuẩn độ (ml) W : Khối lượng mẫu (g) C: nồng độ so màu (mg/ml) k: hệ số cô kiệt K dễ tiêu Dụng cụ - hoá chất Dụng cụ và thiết bị Ống đong 50 ml Lọ nhựa đựng mẫu 100 ml Bình định mức 1000 ml Giấy lọc Erlen 250 ml Cân phân tích Máy lắc Máy trắc quang kế ngọn lửa. Hoá chất NH4Cl 1M: Thực hành Dùng cân phân tích cân 5 g đất vào mỗi bình nhựa 100 ml. (Mỗi chỉ tiêu được thực hiện 2 lần lặp lại). Cho 50 ml dung dịch NH4Cl 1M vào bình nhựa, lắc 1 h với vận tốc tối đa sau đó để lắng một thời gian lọc qua giấy lọc. Thu vào bình nhựa tiếp tục đem đi làm quang kế ngọn lửa. Tính toán kết quả Đánh giá theo phương pháp 5 mgK2O / 100 g đấtgiàu Kết quả phân tích đất trước khi làm thí nghiệm cho thấy : Độ pH: Chất mùn: CMR: CEC( meq/100g): N tổng số: P tổng số: N dể tiêu : P dễ tiêu: K dễ tiêu: Như vậy khu vực đất sử dụng có tính chất : Có thành phần kim loại lớn, đất chua, có nhiều chất hữu cơ. Thí nghiệm này được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu khả năng hấp thu nước của đất, những đặc điểm riêng của đất thí nghiệm. Chương 4 DỰ ĐOÁN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Dự đoán Việc so sánh khả năng hấp thu của các bộ phận cây cho ta thấy ở mỗi bộ phận cây hàm lượng Pb tích lũy là khác nhau. Việc phân tích mẫu đất cho thấy khả năng hấp thụ đất ở mức độ nào cây hấp thụ là bao nhiêu. Điều này cho biết hiệu suất giải ô nhiễm . So sánh kết quả phân tích của 2 lô 1 tháng và 2 tháng cho thấy tác động của thời gian ảnh hưởng lên cây . Sự khác biệt của các chỉ tiêu về đất. Số lượng và trọng lượng trùn đất trước và sau thí nghiệm cho thấy ảnh hưởng của trùn đất trong đất ô nhiễm. Tương tác vi sinh vật trong hệ giải quyết ô nhiễm môi trường bằng thực vật. Như vậy ta có thể thấy được rằng trùn đất chuyển hóa hoạt động vi sinh vật trong đất giúp cho cây tăng cường khả năng hấp thu kim loại nặng và ngược lại cây hấp thụ kim loại giúp đất giảm ô nhiễm thì vi sinh vật cũng phát triển mạnh hơn. Đề nghị Tài liệu tham khảo Trang tiếng Việt Chương 7, chương 8: ngành Giun đốt (Annelida). I. Đại cương về ngành giun đốt. Các động vật thuộc ngành giun đốt có mức độ tổ chức cao hơn hẳn các động vật trước đó.  HYPERLINK "" www.elearning.hueuni.edu.vn/file.php/106/pdf/GTDVKXSC7  HYPERLINK "" www.elearning.hueuni.edu.vn/file.php/57/PDF/GTDVKXS-10_Chuong8.pdf Diệp Thị Mỹ Hạnh, E. Garnier Zarli, 01 – 2007. Tạp trí phát triển KH&CN, tập 10. Lantana Camara L., thực vật có khả năng hấp thụ Pb trong đất để giải ô nhiễm Gs. Bùi Tấn Anh - Võ Văn Bé - Phạm Thị Nga. Ðộng vật có xoang thứ sinh  HYPERLINK "" ThS. Lê Xuân Phương.  HYPERLINK "" vi sinh vật - Sự phân bố của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Phần môi trường đất và sự phân bố của vi sinh vật trong đất.  HYPERLINK "" www.vocw.edu.vn/content/m10757/latest/content_info. Hồ Huỳnh Thùy Dương , 2002. Sinh học phân tử . Nhà xuất bản giáo dục Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu , 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Võ Văn Minh, Võ Châu Tuấn. Công nghệ xử lý kim loại nặng trong đất bằng thực vật – hướng tiếp cận và triển vọng.  HYPERLINK "" www.kh-sdh.udn.vn/zipfiles/So12/10_minh_vovan.doc Trang tiếng Anh . Biology and Ecology of Earthworms by C. A. Edwards and P. J. Bohlen, 1996 (Chapman & Hall, London, UK) and The farmer’s earthworm handbook, by David Ernst, 1995 (Lessiter Publications, Inc., Brookfield, Wis.).  HYPERLINK "" www.pubs.cas.psu.edu/freepubs/pdfs/UC182.pdf D.J. Diaz Cosin và cộng sự, volume 43-No.6-1999. Pedobiologia. Internationaal Journal of soil biology.  HYPERLINK "" . Ganhn, D. Trigo, DJ. Diaz Cosin: Some data on the reproductive biology of Hormogaster ..... Journal of Soil and Water Conservation 34, 276-278. Horwath,W....  HYPERLINK "" www.nrs.fs.fed.us/pubs/jrnl/1999/nc_1999_jordan_001.pdf George G. Brown, Isabelle Barois, Patrick Lavelle . 1999. Regulation of soil organic matter dynamics and microbial activity in the drilosphere and the role of interactions with other edaphic functional domains . GerardMuyzer & KorneliaSmalla.(1997) Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) inmicrobial ecology. Earthworms. college of agricultural sciences agrigultural research and copperative extension., 2003.  HYPERLINK "" www.ias.ac.in/currsci/nov102000/1158.pdf;  HYPERLINK "" www.ias.ac.in/currsci/nov102000/contents.htm Patrick J. Bohlen. EARTHWORMS, 2002. Archbold Biological Station, Lake Placid, Florida, U.S.A - Encyclopedia of Soil Science. Prabha K. Padmavathiamma và Loretta Y. Li., (2006). Phytoremediation Technology: hyper-accumulation Metals in Plants. Kazuya Watanabe, (2001). Microorganisms relevant to bioremediation. O. N. Belyaeva R. J. Haynes O. A. Birukova, (2004). Barley yield and soil microbial and enzyme activities as affected by contamination of two soils with lead, zinc or copper. Thierry Becquer và ctv, (2004). Sources of bioavailable trace metals for earthworms from a Zn-,Pb- and Cd-contaminated soil. Timothy Oppelt E., Introduction to Phytoremediation. National Risk Management Research Laboratory, Office of Research and Development, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio 45268, 2000. Von der Fakultät für Lebenswissenschaften,2005. The role of earthworm gut – associated microorganism in the fate of prions in soil. Trang Wed  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK "" .  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK "" .  HYPERLINK "" .  HYPERLINK ""   HYPERLINK "" www.mhhe.com/biosci/pae/botany/botany_map/articles/article_10.html.  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK " Đất "  Đất   HYPERLINK "" .  HYPERLINK "" .  HYPERLINK "" .  HYPERLINK ""