Thu nhận và tinh chế Enzyme

Trường ĐH Nơng Lâm Tp HCM Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Lớp DH06SH CHỦ ĐỀ: GVHD: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM MSSV: 06126031 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 1 MỤC LỤC Y Z I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME ......................................................2 1. Định nghĩa .............................................................................................2 2. Tính chất của enzyme ............................................................................2 II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THƠ ............................................3 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế enzyme .....................................3 2. Thu nhận enzyme thơ .............................................................................5 III. TINH SẠCH ENZYME .........................................................................6 1. Các phương pháp tủa protein/enzyme.....................................................6 2. Sự thẩm tách ..........................................................................................8 3. Sắc ký ...................................................................................................8 4. Phương pháp dùng chất hấp phụ ............................................................14 IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM ..........................................................15 V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME ...................................15 1.Xây dựng đường biểu diễn về độ hịa tan ................................................15 2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel .....................................16 3. Phương pháp siêu ly tâm ........................................................................17 4. Kỹ thuật khối phổ ..................................................................................18 VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME ........................................................18 VII. TỔNG KẾT ...........................................................................................19 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ cĩ tính chất kinh nghiệm thực tế và thơng qua hoạt động của vi sinh vật. Ðĩ là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm...Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trị qua trọng của enzyme trong chuyển hố các chất trong quá trình lên men. Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mơ cơng nghiệp, hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD. Thực tế đã cĩ hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế cĩ mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn cơng nghiệp và ứng dụng. Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hố học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu việt hơn dạng tự nhiên. Chế phẩm enzyme khơng chỉ được ứng dụng trong y học mà cịn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực cơng nghiệp khác nhau, trong nơng nghiệp, trong hĩa học… Do vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trị cực kỳ quan trọng và khơng ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người. TĨM TẮT Enzyme bản chất là protein được thu nhận từ ba nguồn: động vật , thực vật, vi sinh vật. Do đĩ rất đa dạng về cấu trúc, tính chất, chức năng…Nên việc thu nhận và tinh chế enzyme khá phức tạp vì quá trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất của từng loại enzyme mục tiêu, và phải trải qua nhiều cơng đoạn khác nhau tùy từng loại enzyme. Tuy vậy, các quá trình tinh sạch enzyme vẫn ứng dụng các phương pháp cơ bản sau: thu dịch chiết (cơ học, lý , hố), tủa ( bằng muối, dung mơi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, từng bước tinh sạch bằng sắc ký ( sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết quả tinh sạch và kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn về độ hồ tan, điện di (điện di một chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm, khối phổ, I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1. Định nghĩa Enzyme (E) là những protein cĩ khả năng xúc tác cho các phản ứng hố học với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E cĩ tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã). Trong phản ứng E xúc tác các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), E sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. E cĩ hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vơ cơ khác. E khơng chỉ cĩ thể xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống , mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện nhất định.Cĩ trên 4000 phản ứng sinh hĩa được xúc tác bởi enzym [1]. E cĩ tính đặc hiệu cao, nghĩa là mỗi E chỉ tác dụng trên một hay một số S (cơ chất ) nhất định ở nhiệt độ và áp suất bình thường. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 3 2. Tính chất của enzyme 1. Enzym cĩ bản chất là protein nên cĩ tất cả thuộc tính lý hĩa của protein. Đa số E cĩ dạng hình cầu và khơng đi qua màng bán thấm do cĩ kích thước lớn. 2. Tan trong nước và các dung mơi hữu cơ phân cực, khơng tan trong ete và các dung mơi khơng phân cực. 3. Khơng bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Mơi trường axít hay bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động. 4. Enzym cĩ tính lưỡng tính: Tùy pH của mơi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hịa điện. 5. Enzym chia làm hai nhĩm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase... và các E hai cấu tử (trong phân tử cịn cĩ nhĩm khơng phải protein). ™ Trong phân tử enzyme hai cấu tử cĩ hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu. • Coenzym: Phần khơng phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp.. II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THƠ 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E Như đã nĩi ở trên, E là chất xúc tác sinh học cĩ bản chất là protein và rất khơng ổn định. Trong những điều kiện bất lợi rất khơng bền, cĩ thể dễ bị biến tính (denaturation) và bị mất hoạt độ. Do đĩ, khi làm việc với E phải chú ý tránh làm mất hoạt tính của nĩ. Thơng thường phần lớn E hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7+ 2). Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh đều dễ gây biến tính E. Nhiệt độ cao và các chất oxy hố và chất khử, …cũng là một trong số những nguyên nhân gây biến tính E. Tuy nhiên các E khác nhau cĩ thể nhạy cảm với những tác nhân gây biến tính khác nhau. Vì thế, khi tách và tinh sạch E cần tiến hành ở nhiệt độ thấp từ 0oC đến 5oC. Đối với các E khơng bền quá trình tinh sạch được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn từ -5oC đến -20oC. Trong trường hợp này người ta sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc… Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3oC Nước đá : H2SO4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 oC Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải của các E proteolytic cĩ mặt trong dịch chiết. Đối với nhiều E cĩ thể bổ sung chất ức chế của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm. Các E [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 4 proteolytic được phân thành 4 lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease chứa kim loại. Trên cơ sở 4 lớp của protease này, người ta cũng chia chất ức chế của E này thành 4 lớp tương ứng. chất ức chế hai E protease serine và protease cystein được sử dụng nhiều do sự phổ biến của hai E này. Đối với một số E nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4 loại chất ức chế đều được sử dụng. Bảng 2: Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch protein/E Chất ức chế Nồng độ và thời gian hiệu quả Dung mơi pha dung dịch gốc và nồng độ chất ức chế Điều kiện và thời gian bảo quản ở dạng dung dịch gốc E proteolytic bị ức chế Phenyle methyl sulphonyl fluoride (PMSF) 0,1-1mM vài giờ 100mM trong ethanol hoặc isopropanol 2-3 tháng ở nhiệt độ phịng Protease serine Leupeptin 10-100μM 10mM trong H2O 1 tuần ở 4oC hoặc 1 tháng ở -20oC Protease kiểu trypsin và một số kiểu protease cystein Iodoacetic acid hay iodoacetate (IAA) 10-100μM vài giờ 100mM trong H2O Chỉ chuẩn bị trước khi dùng Protease cystein Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) 1-2mM, lâu dài 500mM pH 8,0 6-12 tháng ở nhiệt độ phịng Protease chứa kim loại (trừ loại chứa Ca2+ thì phải dùng EGTA) Pepstain A 1μM vài giờ 1mM trong tanol 3-4 tháng ở -20oC Một số protease acid Bổ sung các yếu tố làm bền (như CaCl2 hay MgCl2 với nồng độ 2-5mM, glycerol 10- 20%...), chất chống oxy hố (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…). Xây dựng quy trình đơn giản cũng là cách để bảo tồn hoạt tính E. Đối với một số E bền nhiệt thì cĩ thể dùng bước xử lý nhiệt (70-80oC, trong vịng 15-30 phút) và xử lý acid (pH 3-4) đối với các E bền acid nhằm hạn chế tác dụng phân cắt của proteolytic, vừa loại bỏ một số protein khơng mong muốn. Tránh tạo bọt khí vì nhiều E sẽ biến tính ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh bọt khí. Chỉ sử dụng các gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng của kim loại nặng làm mất hoạt tính E. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 5 2. Thu nhận enzyme a . Chọn nguồn nguyên liệu Việc điều chế chúng bằng phương pháp hố học rất khĩ khăn và tốn kém, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học. Cĩ 3 nguồn nguyên liệu sinh học: ™ Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng cĩ chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác. Ví dụ: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đơng sữa trong sản xuất fomat. ™ Thực vật: Thơng thường E cĩ mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hố chất ấy. Ví dụ: hạt cây thầu dầu cĩ nhiều lipase, trong hạt đậu nành cĩ nhiều E urease, papain thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân và lá cây Ficus… Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì khơng thể sản xuất chế phẩm E với quy cơng nghiệp bởi các nhược điểm: - Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài - Nguồn nguyên liệu này khơng cải tạo được - Đây là nguồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm khơng thể dùng để sản xuất sản phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực. ™ Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E cĩ nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn nguyên liệu vơ tận, cĩ thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (16-100 giờ). Hệ E vi sinh vật vơ cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuơi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ. E vi sinh vật cĩ hoạt tính rất mạnh, trong vịng 24 giờ vi sinh vật cĩ thể chuyển hố một lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng. b. Thu dịch chiết E thơ Các E nội bào khơng cĩ khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào chứa chúng. Do đĩ, để chiết rút E nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào cĩ chứa E và chuyển chúng và dung dịch. Biện pháp cơ học như nghiền tế bào với cát thuỷ tinh hay cát thạch anh, làm đồng hố bằng thiết bị đồng hố (homogenizator). Đối với mơ thực vật thì ta thường thái nhỏ mẫu hoặc cho trương nước để tăng hiệu quả phá vỡ tế bào. Cịn ở mơ động vật khi chiết E người ta cần cắt bỏ mơ liên kết. Đối với các E trong cấu tử ( nhân, microsome, ty thể, lyosome…) tế bào, để thu nhận dịch chiết E ta cĩ thể dùng các yếu tố vật lý và hố học khác như sĩng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt, dùng E (lyoyme, mutanolizin), dung mơi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…), chất detergent. Các chất này cĩ tác dụng tốt trong phá vỡ cấu tử tế bào do trong các bào quan này thường cĩ chứa nhiều mỡ. Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, E được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính. * Một số lưu ý khi chiết rút E + Chiết rút và kết tủa E ở nhiệt độ thấp ( 3 - 5oC ) [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 6 + Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly được thêm vào để tăng hiệu quả chiết rút E như NaCl, ZnCl2, CaCl2… * Lưu ý: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường cĩ mặt những chất cĩ màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu. Dịch chiết cĩ thể được cơ đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ sung các tác nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất khơng mong muốn, sau đĩ hồ tan E trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. III. TINH SẠCH ENZYME Thu nhận E dựa trên độ hồ tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E sẽ phải trải qua nhiều cơng đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến hành xác định hoạt tính và nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký. 1. Các phương pháp tủa protein enzyme Cĩ nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung mơi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch cĩ chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đĩ tủa bằng muối được sử dụng nhiều nhất. a. Tủa bằng muối Khả năng hịa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hĩa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ nhất định. Lượng muối cĩ thể được loại bỏ thơng qua bước thẩm tách. Ở nồng độ muối cao, độ hịa tan tuân theo cơng thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đĩ S: độ hịa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối cĩ trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Hình1. Độ tan theo nồng độ muối ( Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, khơng phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngồi ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, cĩ thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 7 Để tủa E từ dịch chiết thơ ta cĩ thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese (NH4)2SO4, do nĩ cĩ độ hồ tan rất cao trong nước (720g/l,nhiệt độ 25oC), ít làm mất tác dụng E thậm chí cịn cĩ tác dụng làm bền E. Ngồi ra ammonium sulfatese cĩ khả năng tủa chọn lọc protein, do đĩ giúp loại một số protein khơng mong muốn ra khỏi dịch chiết. Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hịa + Dạng bột: Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải cĩ máy khuấy từ để đảm bảo sự hịa tan của muối. 0,515 x V (S2-S1) X(g) = 1-0,272S2 + Dịch bão hịa: Cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết E thì độ (NH4)2 SO4 khơng tăng dột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hồn tồn (ở phương pháp dùng dung mơi hữu cơ thì khơng cần để lâu). Kết được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hịa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca ++ làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt. Cĩ thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên khơng làm mất hoạt độ E. Muối cĩ trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các E cĩ trọng lượng phân tử lớn xuống trước. Giai đoạn tiếp theo là làm đơng khơ thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà khơng qua trạng thái lỏng. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2 SO4 bão hịa hồn tồn, cịn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hịa của dung dịch muối này. Ðiều đĩ nĩi lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác. 100 ( S1-S2 ) V (ml) = 1-S2 * Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfatese + Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E. + Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa. b. Tủa bằng các dung mơi hữu cơ Khi thêm dung mơi hữu cơ vào mơi trường, hằng số điện mơi tăng lên, khả năng hịa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung mơi hữu cơ lại cĩ ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đĩ, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung mơi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số dung mơi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethanol cĩ thể được sử dụng ở nồng độ cao. Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa cĩ thể cĩ tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau cĩ thể được tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung mơi (nồng độ dung mơi thường chiếm 80% (v/v) trở lên). Sau X: khối lượng (NH4)2SO4 S1: độ bão hồ cho trước S2: độ bão hồ cần thiết V: thể tích (NH4)2SO4 S1: độ bão hồ cho trước S2: độ bão hồ cần thiết [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 8 đĩ dung mơi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân khơng hay thậm chí trong khơng khí. Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống). Dùng dung mơi hữu cơ cĩ thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và cĩ thể đến – 20 oC, như vậy nĩ cĩ tác dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã cĩ kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung mơi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này cĩ lợi thế là khơng cần loại muối, nhưng cĩ nhược điểm là hay cĩ màu. Ví dụ: Hình 2: Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease cĩ trong dịch trích từ ruột cá Basa khi sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau (Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Trung Tâm Cơng Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM) c. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi pH của mơi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. + pH thấp, protein tích điện dương vì nhĩm amide bị proton hĩa (thu nhận proton). + pH cao, protein tích điện âm vì các nhĩm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). + Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein khơng tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein khơng cịn khả năng tương tác với mơi trường, khi đĩ, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi mơi trường. Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn. Đồ thị biểu diễn độ hịa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH. Hình 3: Tỷ lệ protein tủa theo pH ( ) Phương pháp này thường dùng cho các protein [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 9 đậu nành (cĩ pI= 4.6) d. Dùng nhiệt Ngồi ra cĩ thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein E tạp ra khỏi dịch chiết E. Tuy nhiên phương pháp này ít đuợc dùng vì hiếm E bền với nhiệt. 2. Sự thẩm tách Để loại bỏ muối khống và các loại đường... là các tạp chất cĩphân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm lỗng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch E vào túi colodion hoặc cellophane (thơng thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đĩ đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha lỗng (như đệm phosphate cĩ pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, cĩ kích thước lỗ cho các chất cĩ phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm lỗng theo định luật khuếch tán. Cịn lại trong màng là các chất protein cĩ phân tử lớn. 3. Sắc ký Sắc ký là phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nĩ thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch cĩ thể được sử dụng định lượng và định tính. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Tùy vào loại mẫu cần phân tách ta cĩ thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha tĩnh và pha động.Bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong tinh sạch E là: o Sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy) o Sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy) o Sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) o Sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng cĩ độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy). Hình 4: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein Túi cellophane Đệm phosphate cĩ pH = 7, nồng độ 0,01M Hình5: Hai phương pháp sắc ký cơ bản A: Sắc ký trao đổi ion, dựa vào sự tích điện của protein B: Sắc ký phân loại kích thước, dựa vào kích thước protein [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 10 a. Sắc ký trao đổi ion Nguyên tắc: là dựa vào điện tích thực của E tại một điểm pH nhất định (trừ điểm đẳng điện) ta cĩ thể phân tách hỗn hợp protein. Pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử mục tiêu mang điện tích trái dấu với chúng. Gel trao đổi ion được tổng hợp bằng cách gắn một nhĩm chức tích điện lên chất nền cellulose, sephadex, sepharose, molselect…cĩ 2 loại gel trao đổi ion: Trao đổi anion (anionit) và trao đổi cation (cationit). Một số nhĩm chức tích điện dương như DEAE (diethyaminoethyl), QAE (quaternary aminoethy)…Hoặc tích điện âm như CM (carboxyl methyl), SP (sulphoropyl)…Tuỳ theo nhĩm chức tích điện gì mà chúng sẽ trao đổi ion trái dấu với nhĩm chức, ví dụ: DEAE trao đổi ion tích điện âm (-), CM hay SP thì ion trao đổi tích điện dương (+). Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phĩng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ái lực liên kết giứ protein/E phụ thuộc vào mức độ tích điện của các phân tử trong mẫu và chúng được đẩy ra và rửa chiết (eluted) ra khỏi gel nhờ sự thay đổi muối hay pH của mơi trường. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein cĩ điện tích dương, do đĩ, những protein mang điện tích dương được phĩng thích ra ngồi cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Sắc ký trao đổi ion thường dùng ở bước tinh sạch đầu tiên để sơ bộ phân tách các protein khác nhau nhằm thu nhỏ thể tích mẫu khi việc tủa protein bằng các dung mơi hữu cơ hay ammonium sulfate cịn nhiều bất tiện. Ví dụ: Mẫu E Hình6: Minh họa sắc ký trao đổi ion Hình 7: Minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nĩ (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 11 Hình 9: Hình minh hoạ sắc ký lọc gel urease đậu nành sau khi tinh sạch bằng phương pháp tủa phân đoạn sunfatamon qua thẩm tích đối nước và qua cột trao dổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH7 1/15M, gradient bằng muối NaCl nồng độ từ 0 – 1M. Kết quả điện di cho thấy, hiệu quả tinh sạch cũng như kết quả tách phân đoạn qua cột sắc ký rất cao, đã loại bỏ gần tồn bộ các protein tạp, và chỉ cĩ một vạch sau chạy sắc ký là urease đậu nành (theo tài liệu của nghiên cứu). Kết luận của thí nghiệm: urease đậu rựa (jackbean) là loại enzymheterogeneous, cịn urease dậu nành (Glycine max) là homogeneous.(Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán cơng Tơn Ðức Thắng-Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7-2006) b. Sắc ký lọc gel Nguyên tắc: là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của E cĩ trong hỗn hợp để tách chúng ra, dựa trên mức độ di chuyển khác nhau của các phân tử đĩ trong hệ thống lưới phân tử của gel sắc ký. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt cĩ lỗ làm từ polymer khơng tan nhưng cĩ tính hydrate hĩa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, molselect và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường cĩ sẵn những hạt cĩ lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ cĩ thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đĩ những phân tử lớn hơn chỉ cĩ thể ở bên ngồi các hạt. Vì vậy, những phân tử cĩ kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngồi trước . Phân tử cĩ kích thước trung bình, cĩ thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; cịn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. Hình7: Sắc ký đồ trên DEAE-Cellullose Hình 8: kết quả điện di sau các bước tinh sạch [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 12 Các sephadex cĩ ký hiệu khác nhau từ G10 dến G200 phục vụ trongviệc lọc phân tử cho phép các chất cĩ trọng luợng phân tử khác nhau lọtvào ở các nguỡng sau đây: Các loại sephadex Trọng luợng phân tử G. 10 0 - 700 G. 15 0 - 1.500 G. 25 hạt tinh (F) 100 - 5000 hạt thơ (C) G. 50 hạt tinh (F) 1500 - 30.000 hạt thơ (C) G. 75 3.000 - 70.000 G. 100 4.000 - 150.000 G. 150 5.000 - 400.000 G. 200 5.000 - 800.000 Các Molselect cũng cĩ ký hiệu từ G10 dến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho phép các chất cĩ trọng luợng phân tử khác nhau lọt vào ở các nguỡng sau đây: Các loại Molselect Trọng luợng phân tử G - 10 <700 G - 15 <1500 G - 25 100 - 5000 G - 50 500 - 10.000 G - 75 1.000 - 50.000 G - 100 1.000 - 100.000 G - 200 1.000 - 200.000 Kỹ thuật này áp dụng để loại muối thay cho phương pháp thẩm tích. Và trong quá trình tinh chế protein enzyme, thì được sử dụng để cơ đặc dung dịch protein enzyme. Phương pháp lọc gel khơng áp dụng với phương pháp mẫu lớn vì vậy ít được dùng ở bước tinh sạch ban đầu. Tuy nhiên nếu lượng mẫu được cơ đặc lại thì vẫn cĩ thể dùng phương pháp lọc gel. Ví dụ: Tinh sạch urease từ đậu nành Sắc ký đồ trên gel acrylamide cho thấy hầu như tất cả các vạch trên mẫu trích ly đều xuấthiện ở mẫu đã qua tinh sạch trên sephadex. Ðiều đĩ cĩ nghiã trước và sau khi chạy sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-50 chưa cĩ hiệu quả lắm về mặt tinh sạch, cĩ thể do Sephadex G-50 khơng phù hợp nên chưa thể loại bỏ một số tạp chất.Ỵ Việc chọn kích thước hạt gel là vơ cùng quan trọng trong quá trình tinh sạch E. (Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán cơng Tơn Ðức Thắng- Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7 -2006) Hình 10: Sắc ký đồ của dịch trích ly từ đậu nành khi qua cột SephadexG-50 Hình 11: Kết quả điện di mẫu đã qua cột Sephadex, ở phân đoạn 4 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 13 c. Sắc ký ái lực Phương pháp này cho phép tinh sạch nhanh chĩng hợp chất hay E quan tâm. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tương tác đặc hiệu sinh học để tạo ra sự gắn kết đăc hiệu giữa chất cần tách với gel sắc ký. Đối với E,người ta sẽ gắn với gel một chất cĩ ái lực đặc hiệu với E như: cơ chất, cofactor, chất ức chế cạnh tranh, chất tương đồng (analogue) cơ chất. Quá trình gắn này cĩ thể trực tiệp hay qua một cầu nối hay cánh tay địn (spacer). Khi hỗn hợp protein chứa E đi qua cột sắc ký ái lực, E và những chất cĩ ái lực với nhĩm chất đặc hiệu trên gel sẽ được giữ lại, cịn các chất khác sẽ đi qua.E sẽ được tách ra bằng cách thay đổi nồng độ muối, pH của mơi trường hay dùng mộy chất cạnh tranh với E. Hiện nay, sắc ký ái lực được sử dụng rất nhiều trong tinh sạch E và hợp chất sinh học khác, tuy nhiên khĩ khăn lớn nhất của phương pháp này là tìmchất gắn kết thích hợp. d. Sắc ký lỏng cao áp Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột cĩ khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã cĩ sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ cĩ nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải cĩ một áp lực tác động lên cột để cĩ được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực cĩ sự phân giải cao và phân tách nhanh. 4. Phương pháp dùng chất hấp phụ Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp phụ nhất định như silicagel, bentonite, γ - aluminium hydroxid, hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng cĩ được làm sạch với hiệu suất cao. Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch E) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch E. Chất hấp phụ chủ yếu thuờng được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 14 phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzyme cĩ thể thực hiện bằng một trong hai cách : chất hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Bằng cách đổi độ pH hoặc lực ion của dung mơi thích hợp, các E được hấp phụ cĩ thể được chiết khỏi chất hấp phụ. IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYME Ðây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng. Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hồn tồn, trong những trường hợp riêng biệt, ta tiến hành kết tinh chúng. Chú ý: là protein enzyme ở trạng thái tinh thể khơng thể được coi là tinh khiết hồn tồn. Đặc biệt là các tinh thể protein E kết tinh lần đầu đơi khi cĩ độ sạch khơng vượt quá 50% và cĩ thể chứa các protein E khác. Quá trình kết tinh protein E được thực hiện trong dung dịch (NH4)2SO4. Quá trình kết tinh kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tinh khiết. Thường ta là thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein E khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch. Sau đĩ đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch. Cĩ thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách: + Thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt. + Thêm muối qua màng bán thấm. + Cĩ thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein E. Trong quá trình kết tinh cĩ thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Ðể kết tinh protein E được dễ dàng, ở những giai đoạn truớc đĩ, người ta thường tách từng phần các protein E bằng các dung mơi hữu cơ. Ðiều này liên quan đến việc các chất cĩ bản chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh. V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME Sau khi nhận được một E ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nĩ. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại cĩ thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Vì thế nếu dùng nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của E mà kết quả đều cho là đồng thể thì E đĩ được cơng nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể thường dùng là xây dựng đồ thị về độ hịa tan, điện di và siêu ly tâm. 1. Xây dựng đường biểu diễn về độ hịa tan Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích khơng đổi một loại dung mơi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng E khác nhau. Sau đĩ lọc và xác định số protein trong dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị. Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hịa tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein cĩ trong dịch lọc hay dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng. Sau đĩ dung dịch đạt được bão hịa. Nếu protein đem hịa tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịch lọc sẽ khơng tăng lên và đường biểu diễn cĩ một điểm uốn. Nếu trong mẫu cĩ một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão đối với protein ít hịa tan hơn, loại protein thứ hai cịn cĩ thể hịa tan nữa. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 15 Kết quả là cĩ một điểm bão hịa thứ hai và đường biểu diễn cĩ hai điểm uốn. Nếu dịch chiết cĩ nhiều protein E thì sẽ cĩ nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất cĩ kết quả đến nay vẫn cịn ứng dụng nhiều. 2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel Là phương pháp tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường. Tốc độ di chuyển của protein trong điện trường: V = Ez/f (1) V: Tốc độ di chuyển E: Lực điện trường z: Điện tích của protein f: Hệ số ma sát, tuỳ thuộc vào hình dạng và khối lượng protein và độ nhớt của mơi trường. Đây là phương pháp để đánh giá quá trình tinh sạch protein/E cĩ hiệu quả hay khơng, ngồi cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein/E cĩ tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, cịn một cách là làm phát hiện các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước tinh sạch. Tuy nhiên, phương pháp này là khĩ áp dụng ở quy mơ lớn. Gel là trạng thái trung gian giữa pha gắn và lỏng, bởi vì gel giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách, vì vậy, điện di luơn được thực hiện trên gel. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ cĩ thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đĩ những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như khơng di chuyển. Những phân tử cĩ kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. Điện di protein được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Gel polyacrylamide (PAGE), được tạo thành từ sự polymer hĩa acrylamide và sự liên kết chéo của methylenebisacrylamide, cĩ tính trơ về mặt hĩa học và được tạo hình nhanh chĩng. Trong nhiều trường hợp, để khẳng định chắc chắn băng protein tinh sạch trên điện di đồ là E cần quan tâm, người ta phải dùng đến phương pháp điện di gel hoạt tính. Thường dùng nhất là đồng trùng hợp cơ chất trong gel polyacrylamide, sau khi điện di rửa gel bằng một dung dịch thích hợp, sau đĩ ủ gel với dung dịch cơ chất trong điều kiện phản ứng thích hợp. Băng protein nếu cĩ hoạt tính sẽ chuyển cơ chất thành sản phẩm cĩ màu khác với màu của nền gel chứa cơ chất, nhờ đĩ dễ dàng nhận ra băng cĩ hoạt tính E. Ví dụ: Với protease, cơ chất casein, sau đĩ nhuộm gel với coomassie thì vị trí cĩ E sẽ khơng cĩ màu (do E phân giải cơ chất), tạo thành vệt sáng trên gel cĩ cơ chất nhuộm màu xanh. Hình 12: Đường biểu diễn độ hịa tan protein A: Protein đơn thể B: Hỗn hợp 2 protein A B Số lư ợn g pr ot ei n tro ng d ịc h lọ c Số lượng protein cho thêm Hình 13: Minh hoạ phương pháp điện di [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 16 a. Điện di một chiều Các protein/E cĩ thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên gel polyacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Một số chất biến tính protein như: SDS (sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Uréa, Formamide. Thường dùng nhất là SDS. Hỗn hợp protein cĩ chứa E được hịa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối khơng cộng hĩa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2- thioethanol) hay dithiothreitol cũng cĩ thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính cĩ một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Điện tích âm cĩ được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu. Vì thế, điện tích ban đầu của protein khơng ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đĩ sẽ là mẫu để chạy điện di. Và những protein/E trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu phĩng xạ cĩ thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phĩng xạ tự ghi. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần giếng. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng cĩ vài protein giàu carbohydrate và protein màng khơng tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE cĩ độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug) vẫn cĩ thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid amin) cĩ thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.[2] b. Điện di dựa vào điểm đẳng điện Các protein/E cịn cĩ thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin cĩ tính base và số acid amin cĩ tính acid của chúng mà khơng cần biến tính. Điểm đẳng điện của một protein (pI) là điểm pH mà ở đĩ điện tích thực của nĩ bằng 0. Tại điểm pH này, tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z bằng 0(cơng thức 1). Mỗi một protein cĩ một pI riêng. Ví dụ: pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion cĩ tính base cao, là 10.6, trong khi pI của albumin huyết thanh, một protein cĩ tính acid trong máu, là 4.8. Khi ta cho hỗn hợp protein chạy trong điện trường trên một miếng gel với một khuynh độ pH, khơng cĩ sự hiện diện của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nĩ đến vị trí mà tại đĩ pH bằng pI của nĩ. Dựa vào hiện tượng này, ta cĩ phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) cĩ nhiều giá trị pI, sau đĩ điện di hỗn hợp. Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng cĩ thể được phân tách bằng phương pháp này. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 17 c. Điện di hai chiều Đây là phương pháp cĩ khả năng phân tách cao do sự kết hợp SDS-PAGE với điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đĩ, đặt khoảng gel cĩ chứa protein vừa được điện di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều dọc. Kết quả là một mơ hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Những protein/E được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau cĩ thể phân tách được bằng phương pháp này, sau đĩ cường độ của tính hiệu sẽ được xác định. Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này cĩ một hạn chế là cĩ rất nhiều protein được phân tách nhưng lại khơng phân biệt rõ. Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổ. d. Capillary Electrophoresis (Điện di mao dẫn) Phương pháp này được ứng dụng trong giám sát quá trình tinh sạch protein/E-protein/E tinh sẽ cho một band đơn. Ngồi ra phương pháp này cịn giúp xác định khối lượng phân tử tương đối của protein/E. 3. Phương pháp siêu ly tâm Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein E. Dưới tác động của lực ly tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua một mơi trường lỏng. Để biết được tốc độ di chuyển của phân tử ta cần phải tính hệ số lắng (s). ™ Vận tốc lắng của một phân tử phụ thuộc vào: + Khối lượng: một phân tử cĩ cùng hình dạng cũng như tỉ trọng với các phân tử khác nhưng nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn. Hình 14: Hình minh hoạ phương pháp điện di hai chiều Hình 15: Hình minh hoạ phương pháp điện di mao dẫn [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 18 + Hình dạng: cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nĩ tác động đến độ nhớt. Hệ số ma sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng cĩ cùng khối lượng. Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những phân tử hình cầu dù chúng cĩ cùng khối lượng. + Tỉ trọng của dung dịch (p): các phân tử lằng khi p 1 và khơng di chuyển khi p = 1. ™ Các bước tiến hành: với tốc độ ly tâm rất lớn, bằng cách tăng số vịng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng vạn vịng trong một phút. Ta cĩ thể tách ra được các phân tử E cĩ trọng lượng phân tử khác nhau.Tốc độ kết tủa của protein E trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng lượng phân tử của nĩ. Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Do đĩ, để quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm người ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch cĩ một loại protein E thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị cĩ một đỉnh. Nếu làm việc với hai hay nhiều protein enzyme thì sẽ cĩ hai hoặc nhiều đỉnh... Sau ly tâm mẫu được hút ra nhẹ nhàng theo từng phân lớp, hay đục lỗ nhỏ ở đáy ống ly tâm để lấy từng phân lớp. 4. Kỹ thuật phân tích khối phổ (mass spectrometry – MS) Với phương pháp phân tích này, các protein được phân cắt bằng một protease đặc hiệu (thường dùng là trypsin) thành các peptide nhỏ, sau đĩ cho qua hệ thống phân tích khối phổ. Nhờ hệ thống này, phổ các peptide được xác định khối lượng phân tử chính xác và kết quả được so sánh với khối phổ của các protein trong ngân hàng dữ liệu quốc tế. Protein phân tích được nhận dạng chính xác là loại protein hay E gì. VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME Ngồi ra sau mỗi bước tinh sạch, cần đánh giá quá trình tinh sạch E dựa vào những thơng số sau : + Protein tổng số: lượng protein cĩ trong một phân đoạn - bằng cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân đoạn đĩ. + Hoạt tính tổng: hoạt tính của E trong phân đoạn đĩ - tính bằng cách nhân hoạt tính E cĩ trong lượng mẫu được xét nghiệm với tổng thể tích của phân đoạn đĩ. + Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số. + Yield: hoạt tính cịn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính của dịch chiết thơ với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%. + Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng, được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu. Thực tế, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm. kỹ thuật điện di, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng E mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng . Vì vậy, mức độ tinh sạch và yield là 2 thơng số để đánh giá quá trình tinh sạch. Một quá trình tinh sạch tốt sẽ cĩ mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao cịn mức độ tinh sạch thấp cĩ nghĩa là cịn nhiều tạp nhiễm trong mẫu. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 19 ™ Phương pháp xác định hoạt độ enzyme Khác với trong hĩa học phân tích bình thường, trong E học, người ta khơng định lượng E một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thơng qua xác định độ hoạt động (cịn gọi là hoạt độ) của E. Trong phán ứng cĩ E xúc tác, sự hoạt động của E được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hĩa lý cũng như tính chất hĩa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đĩ cĩ thể biết được chính xác mức độ hoạt động của E thơng qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Ðể xác định hoạt độ của E ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hĩa học. Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ... được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng E. Cĩ thể chia ra ba nhĩm phương pháp sau: + Ðo lượng cơ chất bị mất di hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ E xác định. + Ðo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ E nhất định. + Chọn nồng độ E như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. Ðơn vị hoạt độ E (U) là lượng E cĩ khả năng xúc tác làm chuyển hĩa 1 micromole (1μmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1μmol cơ chất (10 -6 mol)/ phút. Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat) Katal (Kat) là lượng E cĩ khả năng xúc tác làm chuyển hĩa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn 1 Kat = 6.10 7 U 1 Và 1 U = microkatal 60 VII. TỔNG KẾT Để thu được một chế phẩm E tinh khiết và vẫn đảm bảo hoạt tính xúc tác, thì quá trình tách từng phần và tinh sạch E phải trải qua nhiều cơng đoạn khác nhau. Tuỳ theo nguồn cho, loại E, mục đích sử dụng và điều kiện sẵn cĩ mà ta lựa chọn phương pháp cũng như trật tự các phương pháp sao cho đạt hiệu tinh sạch quả tốt nhất. Trong từng bước tinh sạch các điều kiện nhiệt độ, pH… phải luơn được kiểm sốt ở mức cho phép, nhằm tránh làm biến tính E cũng như mất hoạt tính. Và sau mỗi bước tinh sạch cần kiểm tra hiệu quả tinh sạch cũng như hoạt độ của E, nhằm đánh giá hiệu quả của từng phương pháp để đưa ra một quy trình tinh sạch hiệu quả cao đồng thời ít tốn chi phí. Ngày nay, E được ứng dụng ngày càng rộng rãi hơn, nhưng giá thành chế phẩm E vẫn cịn khá cao. Để giải quyết vấn đề này, cần tìm nguồn nguyên liệu thích hợp, hoặc tìm biện pháp sử dụng E lặp lại nhiều lần, ứng dụng cơng nghệ sinh học vào sản xuất cũng như thu nhận E. TÀI LIỆU THAM KHẢO [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 20 1. Cơng Nghệ Sinh Học (tập ba) Enzyme và ứng Dụng-Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa -Chương2: Các phương pháp nghiên cứu enzyme (trang 15-28). 2. Enzyme Học – Giáo trình điện tử - - Chương 2: Phương pháp nghiên cứu enzyme (trang 19-41) 3. Chromatographic Methods For Protein Purification - My Hedhammar, Amelie Eriksson Karlstrưm, Sophia Hober - Royal Institute of Technology, AlbaNova University Center, Dept. of Biotechnology, SE-106 91 Stockholm, Sweden. (p. 3-23) 4. Nghiên Cứu Thu Nhận, Tinh Sạch Urease Từ Đậu Nành - Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt - Truờng Ðại học Bán cơng Tơn Ðức Thắng - Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7 -2006. 5. Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti) -Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Trung Tâm Cơng Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM 6. Sự phân bố, thu nhận và ứng dụng enzym protease - 7. Enzym – Wikipedia Tiếng Việt - 8. Protein Purification - Joseph Conner 9. Tinh sạch protein – Dương Văn Cường – 10. Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (27-12-2006) – V.T.M.Tâm