Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng monensin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN ngày tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) THỨC ĂN HỖN HỢP HOÀN CHỈNH CHO GÀ SINH SẢN HƯỚNG THỊT

doc8 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 2641 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng monensin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10TCN 835:2006 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method HÀ NỘI - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 835 : 2006 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN ngày tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) 1. Ph¹m vi ¸p dông Tiªu chuÈn nµy ¸p dông ®Ó ph©n tÝch hµm l­îng kh¸ng sinh monensin trong thøc ¨n ch¨n nu«i b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC). Giíi h¹n ph¸t hiÖn cña ph­¬ng ph¸p lµ 40mg/kg. 2. Tµi liÖu viÖn dÉn C¸c tµi liÖu viÖn dÉn sau ®©y rÊt cÇn thiÕt cho viÖc ¸p dông tiªu chuÈn. §èi víi c¸c tµi liÖu viÖn dÉn ghi n¨m ban hµnh th× ¸p dông phiªn b¶n ®­îc nªu. §èi víi c¸c tµi liÖu viÖn dÉn kh«ng ghi n¨m ban hµnh th× ¸p dông phiªn b¶n míi nhÊt, bao gåm c¶ c¸c söa ®æi: TCVN 4851 (ISO 3696). N­íc dïng ®Ó ph©n tÝch trong phßng thÝ nghiÖm. Yªu cÇu kü thuËt vµ ph­¬ng ph¸p thö. ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs - Sampling. 3. Nguyªn t¾c Monensin trong mÉu thøc ¨n ch¨n nu«i ®­îc t¸ch chiÕt b»ng metanol, sau ®ã t¹o dÉn xuÊt b»ng 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNP) trong m«i tr­êng axit ë 55oC, t¸ch vµ ®Þnh l­îng trªn hÖ thèng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao víi detector UV ë b­íc sãng 392nm. 4. ThiÕt bÞ, dông cô 4.1. M¸y nghiÒn mÉu phßng thÝ nghiÖm. 4.2. Sµng phßng thÝ nghiÖm, cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm vµ 3,00 mm. 4.3. C©n ph©n tÝch cã ®é chÝnh x¸c 0,0001 g. 4.4. C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c 0,01 g. 4.5. M¸y ly t©m l¹nh cã tèc ®é 3000 vßng/phót, sö dông èng ly t©m dung tÝch 30 ml. 4.6. èng ly t©m, dung tÝch 30 ml b»ng polypropylen hoÆc b»ng thuû tinh, cã n¾p ®Ëy. 4.7. Tñ Êm, cã kh¶ n¨ng duy tr× nhiÖt ®é æn ®Þnh ë 55oC ± 1oC. 4.8. M¸y l¾c trßn hoÆc m¸y l¾c ngang cã thÓ ®¹t tèc ®é 250 vßng/phót. 4.9. èng nghiÖm dung tÝch 10ml cã nót xo¸y. 4.10. B×nh ®Þnh møc dung tÝch 10, 100, 1000 ml. 4.11. Pipet tù ®éng ®iÒu chØnh ®­îc tõ 1ml ®Õn 30 ml. 4.12. Micropipet dung tÝch tõ 10ml ®Õn 100 ml vµ tõ 200ml ®Õn 1000 ml. 4.13. Hót dung m«i tù ®éng 2 ml, 10 ml, 20 ml. 4.14. M¸y l¾c èng nghiÖm (Vortex mixer). 4.15. èng ®ong 1000ml. 4.16. BÓ siªu ©m. 4.17. B¬m hót ch©n kh«ng. 4.18. Mµng läc syranh cã kÝch th­íc 0,45 mm. 4.19. B×nh nãn dung tÝch 125ml. 4.20. Lä nhá ®ùng dÞch mÉu chuyªn dông cho HPLC, cã n¾p vÆn PTFE . 4.21. ThiÕt bÞ trén mÉu phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart Model C 100 T hoÆc t­¬ng ®­¬ng. 4.22. ThiÕt bÞ chia mÉu: ThiÕt bÞ chia ®«i hoÆc chia t­ mÉu: vÝ dô nh­ thiÕt bÞ chia t­ h×nh nãn, thiÕt bÞ chia nhiÒu ng¨n cã hÖ thèng ph©n h¹t hoÆc c¸c thiÕt bÞ chia kh¸c ®¶m b¶o ph©n chia mÉu thÝ nghiÖm thµnh mÉu thö ®ång nhÊt. 4.23. Hép ®ùng mÉu cã n¾p kÝn. 4.24. HÖ thèng HPLC gåm cã: 4.24.1. M¸y s¾c kÝ láng hiÖu n¨ng cao, b×nh chøa dung m«i, hÖ thèng b¬m mÉu, detector UV ®Æt ®­îc ë b­íc sãng 392nm, m¸y ghi hoÆc bé tÝch ph©n. 4.24.2. Cét ph©n tÝch HPLC pha ®¶o cã kÌm cét b¶o vÖ ChiÒu dµi 150mm §­êng kÝnh trong 4,6mm H¹t nhåi C 18; 5mm hoÆc t­¬ng ®­¬ng 5. Hãa chÊt vµ thuèc thö 5.1. Ho¸ chÊt ChØ sö dông ho¸ chÊt ®­îc c«ng nhËn ®¹t chÊt l­îng tinh khiÕt ph©n tÝch vµ n­íc cÊt cÊp h¹ng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). C¸c dung m«i ph¶i ®¹t chÊt l­îng ®Ó dïng cho ph©n tÝch HPLC. 5.1.1. Metanol. 5.1.2. Axit acetic (100%). 5.1.3. Acetonitrile 5.1.4. ChÊt chuÈn monensin, d¹ng muèi natri monensin, lo¹i tinh khiÕt, cã kÌm theo giÊy chøng nhËn hµm l­îng. 5.2. Thuèc thö 5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dÞch 500mg/ml. C©n 50g TCA chÝnh x¸c ®Õn 0,01g cho vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc b»ng n­íc cÊt. L¾c kü dung dÞch. 5.2.2. Thuèc thö DNP, dung dÞch 1mg/ml trong metanol. C©n 100mg DNP chÝnh x¸c ®Õn 1mg vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch b»ng metanol. L¾c kü dung dÞch. 5.2.3. Pha ®éng cho HPLC. Hçn hîp metanol: dung dÞch axit acetic 1,5% tØ lÖ 90:10 theo thÓ tÝch (v/v). 5.2.3.1. Dung dÞch axit acetic 1,5% trong n­íc, theo tØ lÖ thÓ tÝch (v/v). Cho 15ml axit acetic (5.1.2) vµo b×nh ®Þnh møc 1000ml. Thªm n­íc cÊt ®Õn v¹ch ®Þnh møc. L¾c ®Òu dung dÞch. 5.2.3.2. Hçn hîp pha ®éng. Cho 900ml metanol vµo èng ®ong dung tÝch 1000ml. Thªm tiÕp 100ml dung dÞch axit acetic 1,5% (5.2.3.1). Sau ®ã läc hçn hîp dung m«i thu ®­îc qua phÔu hót ch©n kh«ng víi mµng läc cã kÝch th­íc lç 0,45 mm, siªu ©m ®uæi khÝ ë nhiÖt ®é th­êng trong 30 phót. 5.2.4. Dung dÞch chuÈn 5.2.4.1. Dung dÞch chuÈn gèc 1000mg/ml Tïy theo hµm l­îng monensin ghi trong giÊy chøng nhËn (5.1.4), c©n mét l­îng nhÊt ®Þnh chÊt chuÈn natri monensin chÝnh x¸c ®Õn 0,1mg cho vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 100ml, pha lo·ng vµ ®Þnh møc b»ng metanol ®Ó sao cho thu ®­îc dung dÞch gèc cã nång ®é 1000mg/ml. Dung dÞch chuÈn gèc ®­îc b¶o qu¶n trong lä n©u ë 40C, cã thÓ sö dông ®­îc trong vßng 2 tuÇn. 5.2.4.2. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc 100mg/ml. Hót chÝnh x¸c 10ml dung dÞch chuÈn gèc(5.2.4.1) vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, pha lo·ng vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch b»ng metanol. L¾c ®Òu. 6. LÊy mÉu vµ chuÈn bÞ mÉu 6.1. LÊy mÉu Ph­¬ng ph¸p lÊy mÉu kh«ng quy ®Þnh trong tiªu chuÈn nµy, nªn lÊy mÉu theo ISO 6497:2002. §iÒu quan träng lµ mÉu göi ®Õn phßng thÝ nghiÖm ph¶i lµ mÉu trung thùc vµ cã tÝnh ®¹i diÖn, kh«ng bÞ h­ h¹i hoÆc bÞ biÕn ®æi thµnh phÇn trong qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n. Khèi l­îng mÉu ph©n tÝch ph¶i kh«ng ®­îc Ýt h¬n 500 gam. 6.2. ChuÈn bÞ mÉu 6.2.1. MÉu ë d¹ng bét mÞn NÕu mÉu thÝ nghiÖm ë d¹ng bét lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm th× trén thËt ®Òu mÉu (500 gam) b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart (hoÆc t­¬ng ®­¬ng) trong vßng 10 phót. Sau ®ã chia hçn hîp b»ng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t­ cho ®Õn khi thu ®­îc l­îng mÉu thö kh«ng d­íi 100 gam. 6.2.2. MÉu cã kÝch th­íc h¹t võa 6.2.2.1. NÕu mÉu thÝ nghiÖm kh«ng lät hÕt qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm nh­ng lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç 3,00 mm th× trén thËt ®Òu mÉu (kh«ng Ýt h¬n 500 gam) b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart (hoÆc t­¬ng ®­¬ng) trong vßng 10 phót. 6.2.2.2. Dïng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t­ mÉu ®· trén ®Òu (6.2.2.1) cho ®Õn khi thu ®­îc l­îng mÉu thö kh«ng d­íi 100 gam. NghiÒn l­îng mÉu nµy cÈn thËn trong m¸y nghiÒn (4.1) cho dÕn khi mÉu lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm. 6.2.3. MÉu cã kÝch th­íc h¹t to. 6.2.3.1. NÕu mÉu kh«ng lät qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 3,00 mm th× cÇn nghiÒn mÉu (kh«ng Ýt h¬n 500 gam) trªn m¸y nghiÒn (4.1) cho ®Õn khi mÉu lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 3,00 mm, sau ®ã trén thËt ®Òu mÉu b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart (hoÆc t­¬ng ®­¬ng) trong vßng 10 phót. 6.2.3.2. Dïng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t­ mÉu ®· trén ®Òu (6.2.3.1) cho ®Õn khi thu ®­îc l­îng mÉu thö kh«ng d­íi 100 gam. NghiÒn l­îng mÉu nµy cÈn thËn trong m¸y nghiÒn (4.1) cho ®Õn khi mÉu lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm. C¸c mÉu thö ®­îc b¶o qu¶n trong c¸c lä ®ùng mÉu (4.20) ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 2 – 250C, n¬i kh« r¸o. Chó ý: Nªn nghiÒn, trén mÉu trong c¸c phßng cã th«ng giã, nªn ®eo kÝnh, khÈu trang vµ g¨ng tay b¶o vÖ. 7. C¸ch tiÕn hµnh 7.1. §­êng chuÈn Hót chÝnh x¸c lÇn l­ît 10, 20, 50, 100, 200 vµ 400ml tõ dung dÞch chuÈn lµm viÖc (100mg/ml) cho vµo èng nghiÖm (4.9), pha lo·ng ®Õn 700ml b»ng metanol vµ t¹o dÉn xuÊt nh­ c¸c b­íc tiÕn hµnh ë môc 7.2. C¸c dung dÞch trªn sÏ cã nång ®é tõ 1mg/ml ®Õn 40mg/ml t­¬ng øng trªn ®å thÞ chuÈn. 7.2. ChiÕt mÉu vµ t¹o dÉn xuÊt C©n chÝnh x¸c ®Õn 0,1mg tõ 5,0g-10,0g mÉu thö ®· ®­îc nghiÒn mÞn theo môc 6 (tuú theo hµm l­îng kh¸ng sinh cã trong mÉu) cho vµo b×nh nãn 125ml, thªm tiÕp 50ml metanol. TiÕn hµnh chiÕt monensin b»ng c¸ch l¾c trªn m¸y l¾c ngang (4.8) trong thêi gian 1 giê víi tèc ®é 250vßng /phót. LÊy 10ml phÇn dÞch trong ë phÝa trªn cho vµo èng ly t©m (4.6) vµ ly t©m trong 10 phót ë tèc ®é 3000 vßng/phót. Hót 700ml dÞch ë phÝa trªn èng ly t©m cho vµo èng nghiÖm (4.9). Thªm tiÕp 100ml dung dÞch TCA (500mg/ml). L¾c èng nghiÖm trong 20 gi©y trªn m¸y l¾c (4.8), sau ®ã ®Ó èng nghiÖm ë nhiÖt ®é phßng trong 10 phót. Thªm tiÕp 200ml thuèc thö DNP (1mg/ml) vµo èng nghiÖm, vµ l¾c 20 gi©y trªn m¸y l¾c (4.8). §Æt èng nghiÖm vµo tñ Êm cã nhiÖt ®é æn ®Þnh 55oC (4.7) trong 20 phót. Lµm nguéi èng nghiÖm vµ dïng 10ml dung dÞch nµy ®Ó b¬m vµo hÖ thèng HPLC. 7.3. ChuÈn bÞ mÉu tr¾ng MÉu tr¾ng lµ mÉu thøc ¨n ch¨n nu«i ®­îc x¸c ®Þnh lµ kh«ng cã monensin. MÉu tr¾ng ®­îc chuÈn bÞ t­¬ng tù nh­ mÉu thö theo môc 7.2. 7.4. ChuÈn bÞ mÉu ®Ó x¸c ®Þnh ®é thu håi ViÖc x¸c ®Þnh ®é thu håi ®­îc chuÈn bÞ b»ng c¸ch cho mét l­îng dung dÞch chuÈn cã nång ®é thÝch hîp ®­îc pha tõ dung dÞch gèc vµo 5g mÉu tr¾ng (7.3) ®Ó ®¶m b¶o mÉu cã hµm l­îng monensin n»m trong d·y ®å thÞ chuÈn, mÉu ®­îc ®Ó yªn trong 30 phót tr­íc khi tiÕn hµnh chiÕt xuÊt. Sau ®ã tiÕp tôc qu¸ tr×nh chiÕt mÉu vµ t¹o dÉn xuÊt t­¬ng tù nh­ ®èi víi mÉu thö theo môc 7.2. 7.5. Ph©n tÝch trªn HPLC 7.5.1. §iÒu kiÖn s¾c ký: NhiÖt ®é cét 30oC Detector detector UV b­íc sãng 392 nm Tèc ®é dßng 1 ml/phót ThÓ tÝch b¬m mÉu 10 ml 7.5.2. TiÕn hµnh 7.5.2.1. Nªn sö dông b¶o vÖ cét, viÖc sö dông b¶o vÖ cét kh«ng cã bÊt cø ¶nh h­ëng nµo ®Õn kÕt qu¶ ph©n tÝch. 7.5.2.2. C©n b»ng hÖ thèng s¾c ký b»ng pha ®éng (5.2.3) 30 phót tr­íc khi b¬m mÉu. 7.5.2.3. Quy tr×nh b¬m mÉu theo thø tù nh­ sau: dÞch mÉu tr¾ng, c¸c dung dÞch chuÈn, dÞch mÉu thu håi, dÞch mÉu thö, c¸c dung dÞch chuÈn. Chó ý: CÇn b¬m c¸c dÞch chuÈn tr­íc vµ sau mçi ®ît ph©n tÝch, kh«ng nªn ®Ó qu¸ 20 lÇn b¬m mÉu cho mçi ®ît ph©n tÝch. NÕu qu¸ 20 lÇn th× ph¶i b¬m c¸c dung dÞch chuÈn thªm lÇn n÷a vµo kho¶ng gi÷a ®ît b¬m mÉu. 7.5.2.4. X¸c ®Þnh diÖn tÝch pic ®èi víi c¸c dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch mÉu thö t­¬ng øng 7.5.2.5. Sau khi ch¹y m¸y ph¶i lµm s¹ch hÖ thèng HPLC b»ng hçn hîp gåm n­íc cÊt : acetonitrile theo tû lÖ thÓ tÝch 40:60 trong 30 phót ®Õn 1 giê ®Ó lo¹i hÕt ®Öm trong hÖ thèng tr­íc khi t¾t m¸y. 8. TÝnh to¸n kÕt qu¶ 8.1. §­êng chuÈn 8.1.1. Ph¶i ®¶m b¶o r»ng c¸c diÖn tÝch pic cña mÉu thö ®Òu n»m trong ph¹m vi cña ®­êng chuÈn. NÕu mÉu thö nµo cã diÖn tÝch pic v­ît qu¸ chiÒu cao cña ®­êng chuÈn ë nång ®é cao nhÊt th× sÏ bÞ lo¹i vµ ph¶i tiÕn hµnh thö l¹i víi sù pha lo·ng. 8.1.2. X©y dùng ®­êng chuÈn biÓu thÞ mèi quan hÖ gi÷a diÖn tÝch pic thu ®­îc cña dung dÞch chuÈn víi nång ®é cña monensin theo quan hÖ tuyÕn tÝnh bËc1: y= ax + b Trong ®ã: y lµ diÖn tÝch pic x lµ nång ®é cña kh¸ng sinh a lµ hÖ sè gãc b lµ h»ng sè 8.2. TÝnh to¸n 8.2.1. Hµm l­îng monensin cã trong mÉu thö ®­îc tÝnh to¸n dùa vµo ®­êng chuÈn håi qui tuyÕn tÝnh (8.1.2) theo c«ng thøc sau: Trong ®ã: X lµ hµm l­îng monensin cã trong mÉu thö, tÝnh b»ng mg/kg Y lµ hiÖu sè gi÷a diÖn tÝch pic cña dÞch chiÕt mÉu thö vµ diÖn tÝch pic cña mÉu tr¾ng a, b lµ c¸c th«ng sè cña ®­êng chuÈn y = ax + b V lµ thÓ tÝch dÞch chiÕt mÉu (7.2), tÝnh b»ng ml m lµ khèi l­îng mÉu thö, tÝnh b»ng gam 8.2.2. KÕt qu¶ cuèi cïng lµ gi¸ trung b×nh cña hai lÇn ph©n tÝch nh¾c l¹i. Trong qu¸ tr×nh tÝnh to¸n lu«n ph¶i lÊy hai sè sau dÊu phÈy. Gi¸ trÞ trung b×nh ®­îc lµm trßn ®Õn mét ch÷ sè thËp ph©n. 8.2.3. X¸c ®Þnh ®é thu håi (R) tÝnh theo phÇn tr¨m theo c«ng thøc sau: Trong ®ã: C1 lµ hµm l­îng monensin x¸c ®Þnh ®­îc theo quy tr×nh ph©n tÝch (tÝnh b»ng mg/kg) C lµ hµm l­îng monensin ®­îc n¹p thªm vµo mÉu (tÝnh b»ng mg/kg). §é thu håi ®­îc x¸c ®Þnh cho mçi lÇn ch¹y mÉu Ýt nhÊt ph¶i ®¹t 80%. 9. B¸o c¸o thö nghiÖm B¸o c¸o kÕt qu¶ ph¶i bao gåm Ýt nhÊt c¸c th«ng tin d­íi ®©y: - Mäi th«ng tin cÇn thiÕt ®Ó nhËn biÕt mÉu thö. - ViÖn dÉn cña tiªu chuÈn nµy hoÆc ph­¬ng ph¸p thö. - KÕt qu¶ vµ ®¬n vÞ biÓu thÞ kÕt qu¶. - Ngµy th¸ng lÊy mÉu vµ kiÓu lo¹i lÊy mÉu (nÕu cã). - Ngµy th¸ng thö nghiÖm. - C¸c ®iÓm ®Æc biÖt quan s¸t ®­îc trong qu¸ tr×nh thö nghiÖm. - Mäi thao t¸c kh«ng qui ®Þnh trong tiªu chuÈn nµy, hoÆc ®­îc coi lµ tuú chän, cïng víi c¸c chi tiÕt cña sù cè bÊt kú mµ cã thÓ ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶. KT. BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docThức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng monensin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.doc