Thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 BÀI GIẢNG THỰC HÀNH PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM Biên soạn: KS. PHẠM MINH NHỰT ThS. BÙI ĐỨC CHÍ THIỆN - 2009 - 2 GIỚI THIỆU Trong xã hội ngày nay, đời sống của con người ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện. Tuy nhiên, cuộc sống của con người càng được nâng cao thì thời gian dành cho việc ăn uống càng giảm xuống. Chính vì thế, những bữa ăn nhanh, những quán cơm vỉa hè là những lựa chọn thích hợp đối với những con người bận rộn. Do đó, việc đánh giá và quản lý nguồn thực phẩm là điều hết sức cần thiết để có thể hạn chế tối đa khả năng ngộ độc thực phẩm. Đây chính là tiền đề để ra đời môn học Phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm, góp phần giúp cho sinh viên có cái nhìn khái quát về những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đồng thời biết được các phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng của nguồn thực phẩm. Và nội dung thực hành của môn học này giúp cho sinh viên có thể tự tay mình có thể phân tích và đánh giá mức độ vệ sinh an toàn của thực phẩm đối với một số các chỉ tiêu vi sinh vật và một số các chỉ tiêu hóa lý thực phẩm. Trong nội dung của môn thực hành này, sinh viên sẽ được làm quen với quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh như quy trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, coliform tổng số, Staphylococcus aureus, quy trình định tính E. Coli, Salmonella. Các quy trình phân tích này dựa trên tiêu chuẩn ngành và tiêu chuẩn Việt Nam và các quy trình này cũng được áp dụng rộng rãi ở khá nhiều phòng thí nghiệm vi sinh tại các cơ quan, công ty. Thông thường, các quy định về vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực phẩm thông thường cho phép có sự hiện diện của TPC, coliform tổng số và S. aureus với số lượng nhất định do đó phải tiến hành định lượng còn đối với hai chỉ tiêu E. Coli và Salmonella tuyệt đối không được phép hiện diện trong thực phẩm nên chỉ cần phân tích định tính. Tôi hy vọng sau môn học thực hành này, sinh viên sẽ tích lũy được ít nhiều kiến thức thực tế về phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm và hy vong nó sẽ trở thành một phần trong hành trang để các bạn bước vào đời. 3 MỤC LỤC PHẦN 1: KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM Bài số 1: Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) trong thực phẩm Bài số 2: Định lượng tổng số Coliform trong thực phẩm Bài số 3: Định tính E. Coli trong thực phẩm Bài số 4: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm Bài số 5: Định tính Salmonella trong thực phẩm PHẦN II: KIỂM NGHIỆM HÓA LÝ THỰC PHẨM Bài số 6: Phương pháp phát hiện nhanh màu độc và không độc Bài số 7: Xác định hàm lượng chất béo trong sữa theo phương pháp Adam – Rose – Gottlieb Bài số 8: Xác định hàm lượng protein trong sữa theo phương pháp kết tủa Bài số 9: Xác định độ ẩm nguyên liệu Bài số 10: Phương pháp phát hiện nhanh hàn the 4 PHẦN I KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM 5 CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. Khi làm việc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml). Nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh nên cần luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác.Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những hóa chất có độc tính. Do vậy, cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm như sau: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật. - Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm. Mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật. - Mặc áo blouse trong thời gian làm việc. - Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 700 hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô. Thực hiện tương tự cho hai tay. Chú ý chưa đốt đèn cồn hoặc đèn Bunsen khi tay chưa khô cồn. Lặp lại việc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc. - Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy. - Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc. - Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa. Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài. - Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút bằng miệng. - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ vào một túi rác riêng. - Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng. - Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng. 6 - Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau. - Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp. - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí. - Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm. 7 Bài số 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC) ----------------------------------- 1.1. Định nghĩa Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. 1.2. Nguyên tắc Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C/72h + 6h hoặc 370C/48h + 6h 1.3. Môi trường sử dụng - Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW) - Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA) 1.4. Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Tủ ấm 300C 1.5. Quy trình phân tích 25g mẫu + 225ml SPW  đồng nhất trong 30 giây  độ pha loãng 10-1 Pha loãng trong nước muối sinh lý  độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội  úp ngược  đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 72h 8 1.6. Thuyết minh quy trình 1.6.1. Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90 ml (hoặc 225 ml) dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1. Dich pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng  đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. 1.6.2. Đổ đĩa Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 – 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45 – 500C. Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3 – 5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc 1.6.3. Ủ Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủ ở 300C trong 72 giờ 1.6.4. Đọc kết quả Tính toán kết quả: N A =------------------------------------ n1V1f1 + …+ niVifi Đọc kết quả các kết quả từ 25 – 250 khuẩn lạc 9 Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau: N A (CFU/g) = n1Vf1 + … + niVfi Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng 10 Bài số 2: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS -------------------------- 2.1. Định nghĩa Coliforms Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Nhóm coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. 2.2. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ 370C + 10C trong 24 – 48 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhận chỉ thị như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL. 2.3. Môi trường sử dụng - Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) - Violet Red Bile Agar (VRB) - Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) 2.4. Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Ống Durnham - Chai thủy tinh 250 ml - Tủ ấm 370C 2.5. Quy trình phân tích 25g mẫu + 225ml SPW  đồng nhất trong 30 giây  độ pha loãng 10-1 11 Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30’ Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5 mm Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL Ủ 370C + 0,5 trong 24 giờ Tỷ lệ xác nhận R: Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL R = --------------------------------------------------- Số khuẩn lạc đã cấy Tổng số Coliforms (cfu/g) N A = --------- x R nVf Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h 12 2.6. Thuyết minh quy trình 2.6.1. Chuẩn bị mẫu Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng mẫu chứa khoảng <100 khuẩn lạc 2.6.2. Cấy mẫu Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc. Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để phục hồi khả năng của Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 10C trong 24 giờ. 2.6.3. Đọc kết quả Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính >0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật Hình 2: Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB 2.6.4. Khẳng định Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ ở 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khẩn lạc khẳng định 13 Hình 3: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL 2.6.5. Tính toán kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms theo công thức: N A (CFU/g hay CFU/ml) = x R n1vf1 + … + nivfi Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng v: thể tích cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ xác nhận Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ số thập phân. 14 Bài số 3: ĐỊNH TÍNH E.COLI ---------------- 3.1. Định nghĩa Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms chịu nhiệt là coliforms có khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh hơi ở nhiệt độ 440C trong 24 – 48 giờ. Coliforms phân (feacal Coliform) là coliform nhiệt có thử nghiệm indol trong môi trường tryptom dương tính. E.Coli là coliforms phân có nghiệm pháp IMViC lần lượt là + + - -. 3.2. Nguyên tắc Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC) 3.3. Môi trường sử dụng - Môi trường TSA - Canh BGBL - Môi trường EMB - Canh Trypton - Canh MR - VP - Thạch Simmon Citrate - Thuốc thử Kovac’s - Thuốc thử Methyl Red - Thuốc thử α-naphtol 5% - KOH 40% 3.4. Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - ống Durnham - Bể điều nhiệt 440C - Tủ ấm 370C 15 3.5. Quy trình phân tích 25 g mẫu + 225 ml SPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây  độ pha loãng 10-1 Lấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào 10 ml môi trường BGBL Ủ ở 440C + 0,5 trong 24 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB. Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E. Coli Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của E. Coli trên EMB: tròn lồi, đường kính <0,5mm, có ánh kim tím Cấy chuyển sang TSA  Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ Cấy vào môi trường 1 trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC Kết luận 16 3.6. Thuyết minh quy trình 3.6.1. Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu tương tự như bài 1 3.6.2. Tăng sinh Cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml canh BGBL, ủ 440C trong 24 giờ. 3.6.3. Phân lập Sau 24 giờ, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và có sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB. Ủ ở 370C trong 24 giờ Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli: khuẩn lạc tròn, màu tím, có bờ đều, đường kính 0,5 mm, có ánh kim tím. Hình 4: Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên môi trường EMB 3.6.4. Khẳng định Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh hóa (thực hiện nghiệm pháp IMViC). Chọn ít nhất 2 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 370C trong 24 giờ. Các thử nghiệm sinh hóa được dùng để khẳng định E.Coli như sau: Hình 5: Các thử nghiệm sinh hóa (1): Thử nghiệm Indole (2): Thử nghiệm Methyl red 1 2 3 4 17 (3): Thử nghiệm Voges – Proskauer (4): Thử nghiệm Citrate STT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả 1 2 3 4 Indol Methyl Red Voges Proskauer Khả năng sử dụng citrate + + - - 3.6.5. Báo cáo kết quả Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10 g (25 g) mẫu 18 Bài số 4: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ---------------------- 4.1. Nguyên tắc Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ và đếm những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng và không đặc trưng của S. aureus. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các đặc trưng khác. Kết quả được xác định bằng số khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, nồng độ pha loãng và hệ số xác nhận. 4.2. Môi trường sử dụng - Môi trường BP - Môi trường TSA - Huyết tương thỏ 4.3. Quy trình thực hiện Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2 ml huyết tương thỏ 25g mẫu + 225ml SPW  đồng nhất trong 30 giây  độ pha loãng 10-1 Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48h Lấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào đĩa môi trường BP có bổ sung egg yolk  cấy trang KL đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, có tâm đen và có quầng sáng bao quanh Chọn 5 KL đặc trưng cấy chuyển trên môi trường TSA 19 4.4. Thuyết minh quy trình 4.4.1. Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu như tương tự bài 1 4.4.2. Cấy mẫu Dùng micropipette chuyển 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng vào môi trường BP. Dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô. Thực hiện lặp lai 3 đĩa BP ở mỗi nồng độ pha loãng. Ủ ở 370C trong 48 giờ đối với môi trường BP. 4.4.3. Đọc kết quả Sau 48 giờ, trên môi trường Baird Parker khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 0,5 – 1 mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa có các khuẩn lạc có các đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ, các khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5 mm, vòng sáng rộng khoảng 2 – 4 mm. Có một số dòng S. aureus không tạo các khuẩn lạc có các đặc điểm trên. Cần đếm và đánh dấu cả 2 dạng khuẩn lạc. Hình 6: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP 4.4.4. Khẳng định Ủ ở 370C và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có biểu hiện ngưng kết sẽ ủ tiếp tục đến 24 giờ. Xác định tỷ lệ ngưng kết R Tổng số S. aureus (cfu/g) N S = --------------- nVf 20 Trên môi trường BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường BP cấy vào môi trường TSA. Ủ ở 370C trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường huyết tương thỏ. Ủ ở 370C. Theo dõi phản ứng đông tụ huyết tương trong 2, 4, 6, 8, 24 giờ. Tính tỷ lệ khẳng định trên các khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. 4.4.5. Tính toán kết quả Số lượng S. aureus trong mẫu được tính như sau: 10 Số S. aureus (CFU/g) = (Nt x Ht + Na x Ha) F1 + F2 Trong đó: F: độ pha loãng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng ĐHT dương tính Ht = Số khuẩn lạc đặc trưng Số khuẩn lạc không đặc trưng cho phản ứng dương tính Ha = Số khuẩn lạc không đặc trung 21 Bài số 5: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA --------------- 5.1. Nguyên tắc Phát hiện có hay không có Salmonella trong khối lượng mẫu xác định. Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm được thực hiện qua 4 bước: - Tiền tăng sinh - Tăng sinh chọn lọc - Phân lập - Khẳng định 5.2. Môi trường sử dụng - Môi trường canh RV - Môi trường XLD - Môi trường TSA - Môi trường TSI - Môi trường Mannitol Phenol Red both - Môi trường Urea broth - Môi trường LDC 5.3. Quy trình thực hiện 25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây  độ pha loãng 10-1 Lấy 0,1 ml canh trường cho vào 10 ml môi trường RV Ủ ở 420C + 0,5 trong 24 giờ Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h 22 5.4. Thuyết minh quy trình 5.4.1. Tiền tăng sinh Ủ ở 370C trong 24 giờ Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC both Ủ ở 370C trong 24 giờ Biểu hiện đặc trưng của Salmonella: Trên TSI: đỏ/vàng/ H2S (+)/ gas (+); Mannitol (+); Urea (-), LDC (+) Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25 g mẫu Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C, 24h Cấy chuyển sang môi trường TSA KL đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm của khuẩn lạc, môi trường quanh chuyển sang màu đỏ 23 Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng. Thêm 225ml dung dịch pepton đệm và đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15 hoặc 30 giây tùy theo từng loại mẫu. Ủ 370C trong 24 giờ. 5.4.2. Tăng sinh chọn lọc Trộn môi trường canh sau khi đã ủ 24 giờ trước khi cấy chuyển 0,1ml sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian 24 giờ 5.4.3. Phân lập Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như: XLD, BPLS, BSA, HE … Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trương khác nhau. Để nhận dạng và chọn lọc được tất cả các dòng Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau: - Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường XLD chuyển sang màu hồng. Hình 7: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD - Môi trường BPLS: các khuẩn lạc Salmonella có màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển thành đỏ. 24 Hình 8: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường BPLS Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 370C trong 22 – 26 giờ. Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm các đặc tính kháng nguyên. 5.4.4. Khẳng định Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ mỗi môi trường phân lập, cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 370C trong 24 giờ, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. a. Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa Các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella là lên men glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, mannitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau: - Thử nghiệm trên môi trường KIA hoặc TSI: Salmonella chỉ lên men được glucose trong các môi trường nói trên vì thế phần nghiêng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen trên môi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi qua làm vỡ thạch môi trường này hoặc môi trường bị đẩy lên trên rạo ra một khoảng trống bên dưới ống nghiệm. Hình 9: Kết quả trên môi trường TSI - Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển sang màu ban đầu 25 Hình 10: Thử nghiệm LDC (+) - Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam. Hình 11: Thử nghiệm Urea (-) - Lên men mannitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng. Hình 12: Thử nghiệm Mannitol (+) - Thử nghiệm Indol, VP (-) b. Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh Thử nghiệm kháng huyết thanh phải được thực hiện song song với mẫu trắng (dung dịch nước muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H. Phản ứng dương tính khi 26 vi sinh vật thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có hiện tượng ngưng kết với nước muối sinh lý. 5.4.5. Báo cáo kết quả Với quy trình kiểm nghiệm này, cho phép kết luận có hoặc không có Salmonella được phát hiện trong 25 g mẫu tuy nhiên không cho phép phân biệt các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được dòng Salmonella nào nhiễm vào trong thực phẩm thì phải thực hiện thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau, đồng thời có thể gởi chủng đến các PTN chuyên định danh vi sinh vật. 27 PHẦN II KIỂM NGHIỆM HÓA LÝ THỰC PHẨM 28 Bài số 6: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH PHẨM MÀU ĐỘC VÀ KHÔNG ĐỘC 6.1. Nguyên lý - Phẩm màu kiềm tính (chromobase) dẫn xuất từ than đá có tính chất độc hại, không được phép sử dụng trong thực phẩm. Phẩm màu axit dẫn xuất từ than đá được phép sử dụng. - Phẩm màu dẫn xuất than đá có tính kiềm tan được trong nước hay trong cồn. Dung dịch phẩm màu này nếu cho tác dụng với một chất kiềm mạnh (NH3), sẽ làm giải phóng chất màu của kiềm phẩm. - Có hai loại phẩm màu kiềm tính: + Chromobase: sản phẩm chiết có màu sẽ hòa tan được trong ether và nhuộm màu ether + Leucobase: sản phẩm chiết không màu, hòa tan được trong ether và không nhuộm màu ether. - Dung dịch ether có chứa chất màu kiềm tính nếu cho tác dụng với acid loãng (acid acetic), chất màu ban đầu lại chuyển sang dung dịch acid và nhuộm màu dung dịch acid (cả laucobase và chromobase). 6.2. Hoá chất – dụng cụ a- Hoá chất - Acid acetic 5% - Ether ethylic - Dung dịch hỗn hợp: cồn 750 + NH4OH đặc (1:1) hoặc nước cất + NH4OH đặc (1:1) b- Dụng cụ - Ống nghiệm có nắp: 3 cái - Đũa thủy tinh hoặc đũa inox có đầu bẹt 6.3. Tiến hành - Đánh số thứ tự 3 ống nghiệm: 1, 2, 3 - Cho vào ống 1: 5ml dung dịch hỗn hợp cồn 750 + NH4OH đặc (1:1) - Ống thứ 2: 5ml ether ethylic - Ống thứ 3: 5ml acid acetic 5% 29 - Cân 3g mẫu, cắt hoặc nghiền nhỏ mẫu cho vào ống 1. Đậy nút, lắc kỹ để yên. - Gạn nước ống 1 vào ống 2. Lắc nhẹ, đậy nút, để yên phân lớp. - Gạn lớp ether ở trên (ống 2) sang ống 3. Lắc đều, để yên và quan sát 1.4. Kết quả - Dung dịch acid acetic (dưới) có màu: Phẩm màu kiềm không được phép dùng - Dung dịch acid acetic (dưới) không màu: phẩm màu acid được phép dùng 1.5. Yêu cầu sinh viên thực hiện: - Thực hiện thí nghiệm với hai mẫu thực phẩm (thịt nguội hoặc xôi gấc và kẹo hoặc bánh có màu thực phẩm) - Sinh viên tự mang mẫu đến PTN để phân tích 30 BÀI SỐ 7: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT BÉO TRONG SỮA THEO PHƯƠNG PHÁP ADAM – ROSE – GOTTLIEB 7.1. LÝ THUYẾT Trong môi trường ammoniac và cồn, lipid được chiết xuất dưới tác động của ether và ether dầu hỏa. - Ammoniac có nhiệm vụ hòa tan protein, làm thay đổi sức căng bề mặt của chất béo, cắt liên kết giữa lipid và protein, giúp lipid hòa tan dễ dàng. - Cồn có khả năng hút nước khiến cho lipid dễ hòa tan trong ether hơn; giúp cho việc cắt liên kết giữa lipid và protein. - Ether ngoài khả năng hòa tan lipid còn có khả năng hòa tan một số tạp chất khác, do đó phải sử dụng thêm ether dầu hỏa. - Ether dầu hỏa mang tính đẩy nước cao nên có khả năng đẩy các tạp chất hòa tan trong nước bị lẫn trong ether thường. Tuy nhiên, ether dầu hỏa không có khả năng hòa tan lipid có chứa trong nước, do vậy phải sử dụng kết hợp ether và ether dầu hỏa. 7.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ - 1 bình lắng có nắp - 1 ống đong 100 ml - 1 becher 250 ml - 1 pipet 10 ml - Ống nhỏ giọt - Cân phân tích - Bình hút ẩm - Tủ sấy - Tủ hút 7.3. HÓA CHẤT - Dung dịch cồn – ammoniac Cồn 900: 208,5 ml Ammoniac: 7,5 ml Nước cất vừa đủ: 250 ml - Ether thường 31 - Ether dầu hỏa - DD phenolptalein 1 % 7.4 THỰC HÀNH 7.4.1. Chuẩn bị mẫu - Cho vào bình lắng: 10 ml thực phẩm nếu là thực phẩm lỏng. Trong trường hợp là thực phẩm đặc: cân 1,4 g mẫu sau đó thêm 10 ml nước hòa tan mẫu rồi cho vào bình lắng. Dung dịch cồn ammoniac: 10ml Ether: 11 ml DD phenolptalein: 1 giọt - Lúc đầu lắc nhẹ, sau đó lắc mạnh dần và cuối cùng lắc mạnh (chú ý định kỳ phải dốc ngược, mở khóa bình lắng cho thoát hơi) trong 5 phút. - Để yên 30 phút, trong bình lắng sẽ chia thành 2 lớp: Lớp dưới là ammoniac hòa tan protein, nước và các thành phần khác của thực phẩm. Lớp trên là ether hòa tan trong chất béo, nước và một số chất khác - Tách bỏ lớp dưới (Phần này được chuyển sang bài sau), lấy lớp trên. 7.4.2. Phương pháp xác định - Cho thêm vào 10 ml ether dầu hỏa, lắc mạnh trong 5 phút, để yên 5 phút. - Các chất không phải là chất béo sẽ lắng xuống dưới. Các chất béo cùng ether ở bên trên. - Chuyển ether chứa chất béo vào becher đã sấy khô đến khối lượng không đổi và cân trước. Tráng lại bình lắng 2 lần bằng ether, mỗi lần 5 ml. Dồn hết ether vào becher. - Để bốc hơi ở nhiệt độ thường, sau đó cho vào tủ sấy 100 – 1050C trong 30 phút. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và tiến hành cân. 7.4.3. Tính toán kết quả Hàm lượng chất béo có trong 100 g hoặc 100 ml thực phẩm là: 1 2( ) 100m m xX m − = 32 Trong đó: m: khối lượng thực phẩm cân ban đầu (g), hoặc thể tích của thực phẩm đo ban đầu m1: trọng lượng của becher chứa lipid (g) m2: trọng lượng của becher 33 BÀI SỐ 8: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG SỮA THEO PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA 8.1. LÝ THUYẾT - Các phương pháp xác định protein - Tính chất của protein trong sữa 8.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ - Máy ly tâm - 4 ống ly tâm chịu nhiệt - 1 nồi cách thủy - Đũa thủy tinh - Ống nhỏ giọt - Cân phân tích - Bình hút ẩm - Tủ sấy 8.3. HÓA CHẤT - Acid trichlor acetic 50 % - Acid trichlor acetic 1% 8.4. THỰC HÀNH 8.4.1. Chuẩn bị mẫu - Tương tự như bài xác định chất béo theo phương pháp Adam – Rose – Gottlieb. - Lấy phần chiết lắng xuống dưới đáy bình lắng. 8.4.2. Phương pháp xác định - Cho phần lắng vào ống ly tâm đã sấy khô, cân sẵn. - Đặt ống ly tâm lên nồi cách thủy cho bay hết hơi ether, cồn và ammoniac (khoảng 30 – 35 phút). - Cho từng giọt acid trichlor acetic 50 % vào ống ly tâm cho đến khi kết tủa. Chú ý, nhỏ từng giọt theo thành ống và quan sát chỗ tiếp xúc giữa 2 dung dịch. - Dùng đũa thủy tinh khuấy đều. - Đặt lên nồi cách thủy đun sôi khoảng 30 phút để protein kết tủa hết. - Quay ly tâm, protein sẽ lắng xuống dưới đáy ống. Bỏ kết tủa phía trên. - Rửa tủa như trên thêm 2 lần nữa, cuối cùng chắt kiệt nước. 34 - Cho tủa và ống ly tâm vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C đến khối lượng không đổi (khoảng 4 h). - Lấy ra cho vào bình hút ẩm, để nguội và cân. 8.4.3. Tính toán kết quả Hàm lượng chất béo có trong 100 g hoặc 100 ml thực phẩm là: 1 2( ) 100m m xX m − = Trong đó: m: khối lượng thực phẩm cân ban đầu (g), hoặc thể tích của thực phẩm đo ban đầu m1: trọng lượng của ống ly tâm chứa đạm (g) m2: trọng lượng của ống ly tâm 35 Bài số 9: XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM NGUYÊN LIỆU 9.1. Khái niệm độ ẩm nguyên liệu Nguyên liệu ẩm, có thể coi như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = mo + w (1) Trong đó: m - Khối lượng chung của nguyên liệu ẩm mo - Khối lượng chất khô tuyệt đối (không có ẩm) w - Khối lượng nước chứa trong nguyên liệu. + Độ ẩm tương đối (ω) của nguyên liệu ẩm: Là tỷ số giữa khối lượng nước trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm: o o o o o wm w m w 100100 × + =×=ω (2) + Độ ẩm tuyệt đối (ωo) của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa nước (w) và khối lượng chất khô tuyệt đối (mo) của nguyên liệu ẩm, %: o o o o m w 100×=ω Muốn quan sát quá trình sấy bằng đường cong lấy một cách rõ ràng (tạo thành các điểm uốn ở các giai đoạn sấy) người ta thường sử dụng độ ẩm tuyệt đối, còn độ ẩm tương đối biểu thị trạng thái ẩm của nguyên liệu. Vì vậy trong sản xuất, xác định thành phần ẩm hay độ ẩm của nguyên liệu người ta thường xác định và tính toán độ ẩm tương đối (ω) bằng % theo biểu thức (2) ở trên. 9.2. Xác định độ ẩm tương đối 9.2.1. Phương pháp sấy khối lượng không đổi 9.2.1.1. Đối với các loại nguyên liệu có độ ẩm không quá 18%: quả, củ, hạt, vật liệu rời và bột (vật liệu rắn) Dụng cụ thí nghiệm - Cốc thủy tinh hay hộp kim loại đựng mẫu - Máy nghiền hoặc cối nghiền, đũa thủy tinh - Tủ sấy, bình hút ẩm - Cân phân tích 36 Cách tiến hành  Xử lý nguyên liệu - Đối với quả, củ tươi có thể tháo hoặc băm nhỏ, nghiền nhỏ đối với quả, củ khô - Đối với các loại hạt, các loại bánh quy, vật liệu dòn có kích thước lớn … đem nghiền nhỏ - Đối với vật liệu rời như đường cát, bột ngọt, các loại bột kích thước nhỏ không cần xử lý - Xử lý nguyên liệu thực hiện nhanh, xử lý xong cho vào hộp kín Dùng cân phân tích cân chính xác 5 g mẫu đã được xử lý cho vào cốc sạch, khô đã biết trước khối lượng Dùng đũa thủy tinh san đều lượng mẫu trong hộp đựng mẫu để ẩm bốc hơi nhanh và đều Đưa mẫu vào tủ sấy để ở nhiệt độ 1050C đến khi khối lượng không đổi. Sau khi sấy cho mẫu vào bình hút ẩm để làm nguội và cân. Khi kết quả giữa 2 lần cân cuối cùng có sai số + 0,5% coi như khối lượng không đổi. Tính kết quả: Nếu gọi - G1: Khối lượng hộp và nguyên liệu trước khi sấy (g) - G0: Khối lượng hộp không (g) - G2: Khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy (g) - G: Khối lượng mẫu cần xác định (g) G = G1 – G0 Độ ẩm tương đối ω hay độ ẩm tương đối được xác định theo biểu thức sau: 10021 x G GG − =ω 9.2.1.2. Đối với các loại nguyên liệu có độ ẩm lớn hơn 18 %: bột nhão, bột sệt, đường non, dầu thực vật … Đối với nguyên liệu này nên trộn đều với mẫu ban đầu trên 0,5kg, sau đó lấy mẫu thí nghiệm trên 20g. Dùng các hộp đựng mẫu có thể tích lớn hơn hộp dùng để đựng vật liệu rắn, đũa thủy tinh ngắn dùng để trộn mẫu, có thể để yên mẫu trong hộp sau khi sấy. Trước khi 37 cho mẫu vao hộp, hộp và đũa thủy tinh cùng được rửa sạch, sấy khô, làm nguộ và cân để biết trước khối lượng. Sấy ở nhiệt độ 1050C cho đến khi độ ẩm mẫu đạt 18%, nghiền nhỏ, cân 5g, sấy ở 1300C trong 40 phút rồi làm tiếp tục như phần 4.1. Công thức tính: W = 100 – G.g (%) Trong đó: G: Khối lượng 20g nguyên liệu sau khi sấy sơ bộ ở nhiệt độ 1050C đến độ ẩm dưới 18% (khoảng 30 phút) g: Khối lượng 5 g nguyên liệu (lấy từ G) sau khi sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi 9.2.1.3. Xác đinh độ ẩm nguyên liệu dung dịch đặc - Nguyên tắc: Cho nước bốc hơi hết, ta thu được lượng ẩm trong dung dịch - Dụng cụ:  Cốc đựng mẫu  Đũa thủy tinh, muỗng  Nồi đun cách thủy  Tủ sấy  Bình hút ẩm  Cân phân tích - Tiến hành: Dùng dụng cụ thích hợp lấy 10 gam mẫu cho vào cốc cùng đũa thủy tinh đã biết trước khối lượng. Đặt cốc có mẫu và đũa thủy tinh vào nồi nước cách thủy để cô cạn nước trong cốc. Tiếp theo lấy cốc ra cùng đũa thủy tinh cho vào tủ sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Chú ý trong quá trình cô cạn ở nồi đun cách thủy cũng như trong quá trình sấy dùng đũa thủy tinh khuấy để rút ngắn thời gian. - Tính kết quả: 10021 x G GG − =ω Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + hộp + đũa thủy tinh trước khi sấy G2: Khối lượng mẫu còn lại + hộp + đũa thủy tinh sau khi đã sấy khô đến khối lượng không đổi. G: Khối lượng mẫu (ban đầu) 9.2.1.4. Xác định độ ẩm nguyên liệu dạng dung dịch hòa tan 38 Đối với loại dung dịch này thường hàm lượng ẩm lớn hơn rất nhiều so với lượng chất khô trong dung dịch. Vì vậy, người ta thường xác định hàm lượng chất khô suy ra hàm lượng ẩm của dung dịch. Các phương pháp xác định độ khô hay xác định thành phần các chất hòa tan hiện nay thường dùng các phương pháp sau: - Phương pháp sấy khô - Phương pháp tỷ trọng - Phương pháp quang học - Phương pháp hóa học 9.2.2. Xác định độ ẩm bằng phương pháp đo độ dẫn điện - Nguyên tắc + Chất khô tuyệt đối của mỗi loại nguyên liệu có một giá trị độ dẫn điện nhất định. + Độ dẫn điện tăng theo tỷ lệ thuận với độ ẩm của nguyên vật liệu. + Dựa trên các nguyên tắc trên người ta có thể đo độ dẫn điện của nguyên vật liệu rồi tính ra độ ẩm của vật liệu. - Dụng cụ: + Máy nghiền hoặc cối nghiền + Máy xác định độ ẩm "Freuchtron" + Máy xác định độ ẩm Gralner II PM - 300 - Cách tiến hành + Đối với loại máy Freuchtron có thể xác định độ ẩm của nhiều vật liệu khác nhau: các loại ngũ cốc, ca cao, chè, cà phê, thuốc lá sợi, bông, len, sợi v.v. Để sử dụng loại máy này, nguyên vật liệu phải được nghiền nhỏ, kích thước bột nghiền lớn nhất bằng 1mm. Còn bông, len, sợi phải được cắt ngắn từ 2 - 3mm. Cho nguyên vật liệu vào đầy ổ đo (khoảng 2 - 3gam), bật công tắc, máy đo làm việc sẽ chỉ trên thang đo độ dẫn điện của mẫu bằng "ohm", từ giá trị này tra theo bảng đã lập sẵn, ta sẽ tính được độ ẩm của nguyên vật liệu theo %. Loại máy này có độ chính xác cao, sai số ±0,5%. + Đối với loại máy Grainer II PM - 300 thường dùng cho các loại ngũ cốc: lúa mì, thóc, gạo v.v. Nguyên vật liệu dùng cho loại máy này có thể để nguyên hạt, nhưng tốt nhất là nghiền nhỏ. Cho nguyên vật liệu cần đo độ ẩm vào đầy ổ đo, bật 39 công tắc, máy đo làm việc sẽ cho ngay giá trị độ ẩm của nguyên vật liệu tính bằng %, và khi chuyển từ "ohm" ra %, người ta đã nhân hệ số chuyển (hệ số này phụ thuộc vào chất khô tuyệt đối của mỗi loại vật liệu). Do đó máy này chỉ đo với một số nguyên vật liệu có thành phần hóa học gần giống nhau, đặc biệt là hàm lượng tinh bột. * Ưu điểm: của loại máy này dùng pin, gọn, nhẹ, tiện lợi cho việc sử dụng trên các cánh đồng trồng ngũ cốc, kho tàng bảo quản, sân phơi, trạm sấy... để xác định độ ẩm của nguyên vật liệu kịp thời phục vụ cho công nghệ thu hoạch. * Nhược điểm: Chỉ xác định độ ẩm được đối với một số ngũ cốc có tính chất gần giống nhau. Độ chính xác thấp, sai số ± 2 - 3%. 9.2.3. Phương pháp kết hợp - Nguyên tắc: Đối với một số nguyên vật liệu như rau, quả thường có độ ẩm ban đầu rất cao từ 60 - 90%. Nếu chỉ dùng phương pháp nhiệt (sấy đến khối lượng không đổi) thì thời gian sấy dài, nên người ta có thể sử dụng phương pháp nhiệt kết hợp phương pháp đo điện trở bằng cách: ở giai đoạn đầu dùng phương pháp nhiệt sấy đến độ ẩm còn lại trong vật liệu < 30%, sau đó tiếp tục dùng phương pháp đo điện trở, tốt nhất nên dùng loại máy đo Freuchtron vì nó cho độ chính xác khá cao. - Cách tiến hành: xem cách tiến hành của phương pháp nhiệt và phương pháp đo điện trở để rút ra quá trình tiến hành thích hợp. 40 Bài số 10: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH HÀN THE 10.1. Nguyên lý Hàn the có phản ứng kiềm với phenoltalein cho dung dịch màu hồng. Nếu cho dung dịch này tác dụng với glycerin trung tính, dung dịch sẽ chuyển thánh acid, sẽ mất màu hồng (không màu) do tạo thành acid glycero boric. 10.2. Hóa chất và dụng cụ a- Hóa chất - Chỉ thị màu phenoltalein 1% trong cồn - Glycerin trung tính b- Dụng cụ - Cốc 100 ml - Giấy lọc - Ống nghiệm - Phễu lọc - Đũa thủy tinh - Kéo 10.3. Tiến hành - Cân chính xác 1g thực phẩm cho vào bình kjedahl cổ dài, cho vào 10ml H2SO4 đậm đặc và 5g chất xúc tác. Cho vào thêm khoảng 50ml nước cất - Đặt bình Kjeldahl lên bếp điện trong tủ hút, nghiêng bình và đun từ từ cho đến khi bốc hơi và hình thành khói trắng SO2, khi bọt tan đun sôi cho đến khi dung dịch màu trong suốt hoặc có màu xanh lơ của CuSO4. Để nguội. - Định mức dung dịch được vô cơ hóa thành 250 ml với nước cất. Cho cả dung dịch trên vào bình cầu của máy cất đạm, tráng bình bằng nước cất và cho vào bình cầu. - Nhỏ vào vài giọt thuốc thử tashiro, trung hòa bằng NaOH 50% cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh lá cây thì dừng (khoảng 20ml). - Lắp bình cầu vào máy cất đạm. - Chuẩn bị bình hứng: cho vào bình tam giác 50 ml acid boric và 5 giọt thuốc thử Tashiro - Bật máy cất đạm, khoảng 15 phút. Khi dung dịch trong bình hứng chuyển sang màu xanh đun tiếp 15 phút thì dừng. 41 - Dùng H2SO4 0,1N để chuẩn độ (màu xanh lá cây chuyển trở lại màu tím nhạt). Ghi lại số ml H2SO4 0,1N đã dùng. 10.4. Kết quả - Nếu có màu hồng xuất hiện, nhỏ tiếp 2-3 giọt glycerin trung tính, màu hồng sẽ mất đi thành không màu: kết luận sản phẩm có hàn the. - Nếu không có màu hồng xuất hiện: kết luận sản phẩm không có hàn the. 10.5. Sinh viên tự chẩn bị mẫu thử: - Thực hiện thí nghiệm với hai mẫu thực phẩm khác nhau. - Sinh viên tự mang mẫu đến PTN để phân tích. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục, 230 trang 2. Bộ Môn Công nghệ Thực phẩm, 2004. Giáo trình thực hành Kiểm nghiệm thực phẩm 1, 2. Trường Đại Học Công Nghiệp Tp.HCM. 3. Quy trình kiểm nghiệm Salmonella ở thịt. Tiêu chuẩn Việt Nam, 1998. 43 PHỤ LỤC: THÀNH PHẦN MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH 4. Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB) - Cao nấm men 3 g - Peptone hoặc gelysate 7 g - NaCl 5 g - Muối mật 1,5 g - Lactose 10 g - Neutral red 0,03 g - Crystal violet 0,002 g - Agar 15 g - Nước cất 1000 ml 5. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) - Pepton 10 g - Lactose 10 g - Mật bò 20 g - Brilliant green 0,0133 g - Nước cất 1000 ml 6. Môi trường Baird Parker - Trypton 10 g - Cao thịt 5 g - Cao nấm men 1 g - Sodium pyruvate 10 g - Glycine 12 g - Lithium chloride.6H2O 5 g - Agar 20 g 7. Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) - Trypticase peptone 15 g - Phytone Peptone 5 g - NaCl 5 g - Agar 15 g 44 - Nước cất 1000 ml 8. Môi trường Eosine Methylene Blue Agar (EMB) 9. Môi trường MR – VP - Buffered Pepton Water Powder 7 g - Glucose 5 g - K2HPO4 5 g - Nước cất 1000 ml 10. Môi trường Simmons Citrate Agar (SCA) - Sodium citrate 2 g - NaCl 5 g - K2HPO4 1 g - NH4H2PO4 1 g - MgSO4 0,2 g - Bromothymol Blue 0,08 g - Agar 15 g - Nước cất 1000 ml 11. Môi trường Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD) - Cao nấm men 3 g - L – Lysine 5 g - Xylose 3,75 g - Lactose 7,5 g - Sucrose 7,5 g - Sodium deoxycholate 2,5 g - Ferric ammonium citrate 0,8 g - Sodium thiosulfate 6,8 g - NaCl 5 g - Agar 15 g - Phenol red 0,08 g - Nước cất 1000 ml 12. Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) - Cao thịt 3 g 45 - Cao nấm men 3 g - Peptone 15 g - Proteose peptone 5 g - Glucose 1 g - Lactose 10 g - Sucrose 10 g - FeSO4 0,2 g - NaCl 5 g - Na2S2O3 0,3 g - Phenol red 0,024 g - Agar 12 g - Nước cất 1000 ml 13. Môi trường Urea broth - Urea 20 g - Cao nấm men 0,1 g - Na2HPO4 9,5 g - K2HPO4 9,1 g - Phenol red 0,01 g - Nước cất 1000 ml 14. Môi trường Lysine DeCarboxylase (LDC) - Dextrose 1 g - KH2PO4 0,5 g - Nước cất 100 ml - L – Lysine HCl 0,5 g 15. Môi trường Trypton - L – tryptophan 1 g - NaCl 1 g - K2HPO4 3,13 g - KH2PO4 0,27 g - Nước cất 200 ml 16. Môi trường Rappaport Vassiliadis (RV) 46 Môi trường cơ bản - Tryptone 5 g - NaCl 8 g - KH2PO4 1,6 g - Nước cất 1000 ml Dung dịch MgCl2 - MgCl2.6H2O 400 g - Nước cất 100 ml Dung dịch Malachite green oxalate - Malachite green oxalate 0,4 g - Nước cất 1000 ml Môi trường hoàn chỉnh - Môi trường cơ bản 1000 ml - Dung dịch MgCl2 100 ml - Dung dịch Malachite green oxalate 10 ml - Tổng thể tích 1110 ml