Thực tập môn hóa sinh

Trường ĐHKH-Huế Khoa Sinh Học Báo cáo THỰC TẬP MÔN HÓA SINH Huế, 11/2010 Bài 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ I. Theo phương pháp Bertrand Tất cả các nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự do trong những điều kiện xác định có khả nămg khử Cu2+ thành kết tủa Cu2O. Vì vậy, phương pháp này dùng để định lượng các loại aldose, cetose, các disaccharide có tính khử. Khi dùng phương pháp này, muốn có kết quả tốt, cần phải đảm bảo các điều kiện sau: Loại Protein và các chất khác ra khỏi dung dịch cần nghiên cứu bằng cách dùng dung môi thủy ngân, base acetate, hỗn hợp CuSO4 và NaOH (1VCuSO4 8% 1V NaOH 1.25% ) THời gian đun 3 phút kể từ khi có bọt khí đầu tiên xuất hiện. Hàm lượng đường trọng dịch nghiên cứu lấy ước tính khoảng không quá 160mg tốt nhất 10-90mg. pha loãng mẫu nếu quá đặc. Phải bảo vệ kết tủa Cu2O không bị oxyl hóa bởi lớp không khí bề mặt. - Nguyên tắc: Khi đun sôi dịch kiềm của Cu2+ với dung dịch đường sẽ tạo thành kết tủa Cu2O, sau khi rửa bằng nước, hòa tan kết tủa Cu2O bằng Fe2(SO4)3, Cu2+ sẽ chuyển thành Cu+ và Fe3+ sẽ chuyển thành Fe2+ . Chuẩn độ Fe2+ bằng dd KMnO4 0.1N biết lượng KMnO4 đã dùng để tích ra lượng đồng. Tử lượng đồng ấy, đối chiếu bảng cho sẵn sẽ tính được lượng đường trong mẫu. Các phản ứng như sau: Cu2+ Cu+ Phản ứng Fehling Phản ứng kết tủa Cu2O: Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Phản ứng chuẩn độ bằng dd KMnO4 0.1N 10 FeSO4 + 2KMnO4 + H2SO4 5Fe2(SO4)3 2. Đối tượng, hóa chất, thiết bị 2.1 Đối tượng Quả Hồng 2.2 Hóa chất Dung dịch Fehling Fe2(SO4)3: 5g Fe2(SO4)3 + 20ml H2SO4 đậm đặc cho nước cất đến 90ml kiểm tra bằng dd KMnO4 0.1N khi có màu hòng nhạt bền 30 giây. Thêm nước cất đủ 100ml. 2.3 Thiết bị Hệ thống hút lọc chân không Bình tam giác, phễu, chày và cối sứ. Giấy lọc, cân (chính xác 0.001g). II. Tiến hành thí nghiệm 1. Chuẩn bị mẫu Cân 2gram cho vào cối sứ, thêm ít nước cất ngiền thành dạng chất đồn thể. Cho 20ml nước cất vào, tiếp tục ngiền rồi để lắng, lấy phần nước và rửa sạch cối khoảng 3 lần. Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng. Sau đó định mức lên 100ml 2. Phản ứng Fehling: Cho vào bình tam giác 5ml dịch lọc và 20ml fehling, đậy bình bằng phễu nhỏ và đun sôi. Khi thấy bọt khí đầu tiên xuất hiện và có kết tủa đỏ gạch tính thời gian 3 phút, để nguội cho kết tủa lắng. 3. Rửa kết tủa Cu2O Tiến hành rửa trên phễu lọc Bunce Dồn tủa về một phia. Chiết từ từ dịch Fehling qua phễu lọc. Quá trình rửa cần cho nước cất ấm vào dần dần, để ngẵn tủa tiếp xúc với không khí. Mở máy cho dịch Fehling hút nhanh xuống bình, thử pH của tủa trong bình tam giác khi không còn tính kiềm là kết thúc quá trình rửa. 4. Hòa tan kết tủa Cu2O: Đặt phễu lọc lên bình nón, cho vào bình kết tủa 15ml Fe2(SO4)3 chảy từ từ rồi lắc đều để tủa tan hoàn toàn. nếu kết tủa vẫn chưa tan hết thì cho thêm. Dùng nước cất nóng rửa bình chứa tủa và phễu lọc cho đến khi không còn phản ứng acid là kết thúc gian đoạn này. 5. Chuẩn độ bằng dd KMnO4 0.1N Cho dd KMnO4 0.1N lên buret rồi chuẩn độ dịch đã hoàn thành xong, đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây, kết thúc quá trình chuẩn độ. Ghi lại số ml dd KMnO4 0.1N đã dùng. 6. Tính kết quả. cứ 1ml KMnO4 0.1N tương đương 1mg Cu. như vậy mCu có trong dịch là: 36.61 xVg c= Vc là số ml KMnO4 0.1N dùng chuẩn độ. Tra bảng ta sẽ có kết quả: BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET 1.1. Mục đích yêu cầu - Mục đích: giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hàm lượng lipid thô bằng phương pháp dùng máy so màu. - Yêu cầu: phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác định hàm lượng lipid thô, các thao tác tiến hành thí nghiệm phải hết sức cẩn thận. 1.2. Nguyên tắc Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết. Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật). Chính vì vậy để xác định hàm lượng lipid, ta chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ. Ở đây ta dùng petrol ether để trích lipid ra khỏi một lượng mẫu biết trước (mẫu đã được sấy khô) trên máy soxhlet. Khi đã trích li hết lipid ra khỏi mẫu, ta tiến hành sấy mẫu khô lại đến khôi lượng không đổi. Từ đó xác định hàm lượng lipid thô có trong 100g mẫu theo công thức: 100% 21 x m mmX −= Trong đó: X là hàm lượng lipid tính theo % m: là trọng lượng mẫu đem chiết rút lipid m1: trọng lượng gói mẫu trước khi chiết rút lipid (kể cả khối lượng giấy lọc) m2: trọng lượng gói mẫu đã được sấy khô tuyết đối sau khi chiết rút lipid 1.3. Hóa chất dụng cụ - Hóa chất: ethylic - Dụng cụ: cối chày sứ, giấy lọc, bếp điện, tủ sấy, bộ soxlet... 1.4. Tiến hành thí nghiệm - Bước 1: chuẩn bị mẫu Đối tượng thí nghiệm: đậu lạc + Đem mẫu cho vào cối chầy sứ nghiền mịn. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 1050C đến khi khối lượng không đổi. + Mẫu sau khi được sấy khô ta cân 5g cho vào giấy lọc (đã được sấy khô tuyệt đối) gói lại ba gói, đây chính là trọng lượng m1 - Bước 2: chiết rút lipid + Rửa sạch và làm khô bộ soxlet sau đó cho mẫu vào ống hình trụ sao cho mẫu chiếm khoảng 1/3 thể tích của ống. + Đổ ethylic vào ngập mẫu ở phía trên ống hình trụ còn ở dưới bình cầu ta đổ ethylic khoảng 2/3 bình. Lắp kính bình cầu với ống hình trụ. + Cho nước chảy vào ở vòi dưới và chảy ra ở vòi trên của ống sinh hàn đồng thời bật bếp điện đun bình cầu chứa ethylic, khi đó hơi ethylic bốc lên gặp lạnh ở ống sinh hàn sẽ ngưng tụ lại và rơi vào ống hình trụ để hòa tan lipid tự do có trong mẫu. Ta điều chỉnh nhiệt độ của bếp điện khoảng 40 – 500C sao cho cứ sao khoảng 10 phút thì dung môi ethylic chảy qua eo của ống hình trụ và tràn xuống bình hình cầu. Ta đun trong vòng 10 -12 giờ cho đến khi tách chiết hết lipid ra khỏi mẫu. Cần chú ý trong quá trình đun nếu nghĩ giữa chừng thì phải cho dung môi ngập mẫu mới tắt bếp. + Để thử lipid đã được chiết hết hay chưa, ta lấy vài giọt dung môi từ ống hình trụ nhỏ vào miếng giấy lọc, để khô mà nếu thấy vết loang của dung môi không phân biệt được với nền giấy trắng thì xem như đã chiết hết lipid và ta kết thúc quá trình chiết rút. + Sau khi chiết rút xong ta lấy các gói mẫu ra và cho bay hết dung môi, đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 1050C trong vòng 1 – 1,5h, sau đó tiếp tục sấy khô ở nhiệt độ thấp hơn cho đến khối lượng không đổi. Đem mẫu đã được sấy khô đến khối lượng không đổi ra cân ta thu được trong lượng m2 1.5. Kết quả và nhận xét: - Kết quả: Qua quá trình chiết rút lipid từ mẫu ta thu được kết quả như sau: Mẫu (m=5g) m1 (g) m2 (g) 100% 21 x m mmX −= Đậu lạc 6.185 3.960 44.5% Nhận xét: Qua bảng kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid trong đậu lạc khá cao. Hàm lượng lipid chiếm gần một nữa lượng chất có trong củ. Qua bài thí nghiệm này giúp cho sinh viên nắm được các bước cơ bản của phương pháp chiết rút lipid bằng máy soxlet, và rèn luyện được kỹ năng làm thí nghiệm. BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 4.1.Mục đích yêu cầu - Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp xây dưng đồ thị chuẩn protein và phương pháp xác định hàm lượng potein trong mẫu. - Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, trong quá trình tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận. 4.2. Nguyên tắc Dựa vào phản ứng màu giữa protein với thuốc thử Folin. Do trong môi trường kiềm với sự có mặt của một lượng nhỏ Cu2+ protein sẽ tạo thành phức chất màu xanh. Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu (có nghĩa là hàm lượng protein trong mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm). Sau đó dùng máy so màu để xây dựng đồ thị chuẩn, và thông qua đồ thị chuẩn ta tính được hàm lượng protein có trong mẫu. 4.3. Dụng cụ hóa chất - Dụng cụ: Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức... - Hóa chất: Albumin + Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = 7 + Dung dịch Na2CO3 2% tan trong NaOH 0.1N (dung dịch A) + Dung dịch CuSO4 1% (dung dịch B1) + Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B2) + Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B1, 0.5ml dung dịch B2 và 50ml dung dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước khi dùng 30 phút) + Thuốc thử Folin 0.5N. Chú ý thuốc thử Folin được đựng trong chai màu và bảo quản lạnh, thuốc thử này có màu vàng, khi dùng nếu thấy có màu xanh thì cho vài giọt brom đun trong 15 phút thì sẽ có màu vàng trở lại và dùng được. 4.4. Tiến hành thí nghiệm 4.4.1. Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein - Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân chính xác 1g albumin hòa tan trong nước cất và định mức đến 100ml. - Chuẩn bị dãy gồm 6 ống nghiệm khô sạch, sau đó cho vào các ống nghiệm những chất như bảng sau: TT Hóa chất MT 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 1 0.995 0.99 0.98 0.97 0.96 Albumin (ml) 0 0.005 0.01 0.02 0.03 0.04 Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4 Folin (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Hàm lượng albumin (µg/ml) 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Khi cho dung dịch C vào các ống nghiệm ta lắc đều và để trong 10 phút, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên trong 30 phút. Sau đó đem so màu ở bước sóng 620nm ta thu được kết quả như sau: Hàm lượng Albumin(µg/ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 OD 0.175 0.29 0.40 0.515 0.623 Sử dụng phần mềm oringin 7.5 xây dựng đồ thị chuẩn protein: Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A 0.0643 0.00219 B 1.121 0.00661 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99995 0.00209 5 <0.0001 ------------------------------------------------------------ Đồ thị chuẩn protein 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Hµm l- î ng protein (mg) OD B Data1B 4.4.2. Tiến hành xác định hàm protein trong mẫu Trước hết ta phải chiết mẫu bằng cách cân 3g mẫu đậu xanh rồi nghiền trong các cối sứ được làm lạnh với dung dịch đệm phosphat 0.1N. Sau đó dùng đệm phosphat định mức đến 200ml, như vậy mẫu đã được pha loãng 200 lần. Sau đó chia mẫu vào các ống ly tâm và đem ly tâm trên máy li tâm ở 10000 vòng trong thời gian 15 phút. Sau khi ly tâm ta thu phần dịch trong cho vào lọ và bảo quản lạnh để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Còn với mẫu sữa đậu nành thì ta lấy 2ml + 6ml nước cất (fa loãng 4 lần) để thí nghiệm - Sau khi chuẩn bị xong dịch chiết ta chuẩn bị dãy nhiều ống nghiệm khô sạch. Một ống nghiệm chứa mẫu trắng đối chứng, còn ba ống chứa mẫu. - Ta cho vào ống mẫu trắng 1ml nước cất và 5ml dung dịch C, tương tự các ống khác ta cho vào mỗi ống 1ml mẫu và 5ml dung dịch C, để yên trong 10 phút sau đó cho vào mỗi ống 0.5ml dung dịch Folin lắc đều để yên trong 30 phút. Sau đó đem so màu ở bước sóng 650nm, mẫu trắng dùng để chuẩn máy so màu. Kết quả: Đối tượng: Độ fa loãng Không pha loãng 2 lần 3 lần 4 lần 8 lần Đậu xanh 0.048 0.020 0.02 0.047 0.019 0.02 0.047 0.021 0.018 TB:0.0473 0.02 0.0193 Sữa Lần 1 0.835 0.489 Lần 2 0.834 0.488 Lần 3 0.837 0.488 TB: 0.8353 0.4883 Dựa vào phương trình đồ thị chuẩn: Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X. Ta tính được hàm lượng protein trong mẫu như sau: Y đxanh: 0.0643+1.121x0.0473 = 0.117323 Y sữa: 0.0643+1.121x0.8353x4=3.809785 4.5. Nhận xét kết luận Qua kết quả trên ta thấy hàm lượng protein trong các đối tượng khác nhau, ở trên ba đối tượng thí nghiệm thì đậu xanh có hàm lượng protein cao nhất, tiếp đến là sữa. Và qua kết quả này cho ta thấy được hàm lượng protein trong sữa là tương đối cao, chính vì vậy những loại sữa này có tác dụng rất lớn trong việc cung cấp nguồn protein cho con người. Đặc biệt thông qua bài học này giúp cho sinh viên nắm được phương pháp xây dựng đồ thị chuẩn proetin và biết cách xác định hàm lượng protein trong mẫu, qua đó giúp sinh viên rèn luyện được kỷ năng làm thí nghiệm. BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRÊN GIẤY 6.1. Mục đích yêu cầu - Mục đích: nhằm giúp sinh viên nắm vững nguyên tắc và làm quen với phương pháp định lượng acid amin bằng sắc ký trên giấy. - Yêu cầu: phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ thí nghiệm, các thao tác thí nghiệm phải cẩn thận chính xác để không làm ảnh hưởng đền kết quả thí nghiệm. 6.2. Nguyên tắc Trong quá trình chạy trên giấy sắc ký, do giấy sắc ký được cấu tạo từ các sợi cellulose, do đó các acid amin tan trong dung môi sắc ký sẽ chạy theo các mạch với lực mao dẫn khác nhau tùy vào trọng lượng phân tử của các acid amin. Vì vậy kết thúc quá trình chạy sắc ký thì mỗi loại acid amin sẽ nằm ở những vị trí khác nhau cách nhau khoảng nhất định trên giấy sắc ký. Bằng việc sử dụng các thuốc thử hiện màu, thôi màu ta có thể định lượng được các acid amin trong mẫu thông qua việc so màu của dung dịch thôi màu khi ngâm các vết sắc ký trong dung dịch sắc ký, ta so màu ở bước sóng 530nm. 6.3. Hóa chất dụng cụ - Hóa chất: + Các acid amin chuẩn: Prolin, Valin, Lysin, Isoleusin + Butanol, acid acetic, nước cất + Ninhydrin, aceton, CuSO4.5H2O + Cồn methylic hoặc ethylic - Dụng cụ: + Giấy sắc ký + Bình sắc ký + Máy so mày + Pipet, ông nghiệm.... 6.4. Tiến hành thí nghiệm - Pha dung môi sắc ký (dung môi 1): butanol : aceton : nước cất = 4 : 1 : 5 - Thuốc thử hiện màu: Ninhydrin 0,5g + aceton vừa đủ 100ml. - Thuốc thử thôi màu: CuSO4.5H2O 5mg + 22ml nước cất + cồn metylic hoặc cồn etylic vừa đủ 100ml. - Tiến hành định lượng acid amin: ta dùng bút chì kẻ một đường cách mép giấy sắc ký khoảng 9-12cm, chia đường thẳng đó thành những đoạn bằng nhau cách nhau 3-4 cm, cách hai đầu mép giấy sắc ký 5cm. + Dùng micropipet chấm dung dịch acid amin lên đường thẳng đã vạch sẵn, chú ý chấm những chầm nhỏ để khô rồi mới chấm tiếp. + Cho giấy sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn dung môi ở trên và bắt đầu cho chạy sắc ký. + Kết quả: ta thu được các vết acid amin khác nhau: bao gồm các vết riêng lẽ và các vết hỗn hợp. Ta đối chiếu các vết acid amin hỗn hợp với các vết acid amin riêng lẽ ta có thể thấy rằng vết trên của hỗn hợp là hỗn hợp của Lysin và Prolin còn vết dưới là Isoeusin và Valin chập vào nhau. Kết quả này có thể chỉ mang tính tương đối do trong quá trình làm thí nghiệm có thể có nhiều sai sót. 6.5. Nhận xét kết luận Qua kết quả trên ta thấy hàm lượng acid amin trung bình của mỗi loại trong các hỗn hợp khác nhau là khác nhau. Trong quá trình chạy sắc ký ta thấy các acid amin chạy tương đối đều. Tuy nhiên kết quả này chỉ mang tính chất tương đối do các vệt acid amin không nằm rời nhau trên giấy sắc ký. Qua bài thí nghiệm này giúp sinh viên nắm được những kiến thức cơ bản cách định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký trên giấy. Bài 5. Định lượng Cellulose 1. Nguyên tắc. Phương pháp định lượng Cellulose dựa vào tính chất của nó trong một hợp chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin...ít bền với tác dụng của acid và base nên bị oxyl hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch base hoặc hỗn hợp acid nitric với acid acetic. 2. Hóa chất Dung dịch acid nitric đặc(d=1.4) Dung dịch acid acetic đặc Rượu ethylic 96% 3. Tiến hành 3.1 Đối tượng là quả hồng Cân 1g mẫu đã nghiền nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ không đổi, cho vào bình tam giác 250ml Thêm vào bình 16.5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 1.5ml acid acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình, đun sôi trong 30 phút. Để nguội pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã sấy khô tuyệt đối và biết trước khối lượng. Rửa kết tử cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng Rửa bằng rượu ethylic 96% một đến hai lần. Rửa bằng ete ethylic. Sấy giấy lọc chứa mẫu ở nhiệt độ 100-105oC đến khối lượng không đổi. Vì có thể dư lại một lượng nhỏ hemicellulose, lignin... nên cellulose gọi là cellulose thô 4. Tính kết quả Hàm lượng cellulose được tính như sau: W AxX 100= Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính % A: khối lượng cellulose gram W: Khối lượng mẫu thí nghiệm %7.0 1 100007.0 == xX 5. Nhận xét, kết luận Nhận xét: hàm lượng phần trăm cellulose trong quả hồng rất thấp (0.7%). Bởi vì, đối tượng thí nghiệm đã chín và lượng cellulose cũn không còn nhiều. Kết luận: Qua bài này, em đã biết cách xác định hàm lượng cellulose thô, nó sẽ giúp ích cho em sau này khi ra trường và đi làm. Em chân thành cảm ơn Thầy. Bài 6. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS 1.Yêu cầu ,mục đích : 1.1 Mục đích : - Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết - Biết được phương pháp xác định protein bằng phương pháp điện di SDS. 1.2 Yêu cầu : - Chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ trước khi tiến hành thí nghiệm. Đọc kỹ lý thuyết -Thao tác nhanh nhẹn, cẩn thận. 2.Nguyên tắc : -Điện SDS là phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau . SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tích cấu trúc bặc hai và bặc ba của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy , số lượng SDS tương tác với protein tỉ lệ với khối lượng kích thước phân tử protein và điện tích SDS bám vào và có thể làm bất cứ phân tử pprotein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm sang cực dương.Do đó, bằng phương pháp điện di có thể tách biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau. 3. Hóa chất và dụng cụ 3.1 Hóa chất: 1. Acrylamide 30% Acrylamide 29 g Bisacrylamide 1 g Định mức 100 mL bằng nước cất 2 lần Bảo quản 4oC 2. Tris 2 M (pH 8,8) Tris base 121 g Nước cất 2 lần 300 mL Chỉnh pH = 8,8 bằng HCl đậm đặc Định mức 500 ml bằng nước cất 2 lần 3. SDS 10% SDS 10 g Định mức 100 mL với nước cất 2 lần 4. APS 10% APS 1g Định mức 10 mL với nước cất 2 lần 5. TEMED Bảo quản ở 4oC 6. 4X separating gel pH 8,8 Tris 2M pH 8,8 75 mL SDS 10% 4 mL Định mức 100 mL với nước cất 2 lần 7. 4X stacking gel pH 6,8 Tris 2M pH 8,8 25 mL Nước cất 2 lần 25 mL Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc SDS 10% 4 mL Định mức 100ml với nước cất 2 lần 8. 2X SDS sample buffer Tris 2M pH 8,8 6,25 mL Nước cất 2 lần 30 mL Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc SDS 4 g Glycerol 20 mL β- mercaptoethanol 10 mL Bromophenol blue 0,2 g Định mức với nước cất 2 lần tới 100 mL Bảo quản ở -20oC 9. 10X Electrophresis buffer pH 8,3 Tris base 30 g Glycine 144 g SDS 10 g Nước cất 2 lần 1000 mL Chỉnh pH = 8,3 bằng HCl đậm đặc 10. Gel staining Coomassie brilliant blue R250 2,5 g Methanol 450 mL Glacial acid acetic 100 mL Nước cất 2 lần 450 mL 11. Gel destaining Methanol 300 mL Glacial acetic acid 100 mL Nước cất 2 lần 600 mL 12.Dung dịch gel destaining 13. Nước cất 14.(NH4)2SO4 3.2 Dụng cụ : -Micro pipet,máy chạy điện di, máy ly tâm,giấy thấm,hộp nhựa. 3.3 Đối tượng : -Thơm. 4. Các bước tiến hành: 4.1. Đổ gel Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất đầy đủ. Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm lại. Bước 3: Pha dung dịch separating gel 12%. DW 1,68 mL Acrylamide 1,92 mL Separating buffer 1,2 mL TEMED 6 μL APS 30 μL Vortex khoảng 1 - 2 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính đã chuẩn bị sẵn lên đến hơn 3/4 độ cao tấm kính. Cho nhanh nước cất vô trùng vào bên trên gel. Sau khi đông (kiểm tra bằng dung dịch thừa ở ngoài hoặc thấy vạch phân cắt ở 2 pha trên gel), nghiêng gel lại cho nước chảy ra hết và làm khô bề mặt gel bằng giấy thấm. Bước 4: Pha dung dịch stacking gel 5% DW 0,88 mL Acrylamide 260 μL Stacking buffer 380 μL TEMED 2 μL APS 12 μL Vortex khoảng 1 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính, bên trên separating gel cho hết độ cao tấm kính. Cẩn thận đặt lược vào giữa 2 tấm kính sao cho không có bọt khí. Theo dõi gel đông, cứ khoảng 2 phút dùng pipette thêm stacking gel vào phía trên lược để bổ sung lương gel bị chảy ra ngoài (nếu có). 4.2. Chuẩn bị mẫu: -Mẫu được chuẩn bị như ở bài định lượng prôtein bằng phương pháp Bradford. Bước 5: Tính toán lấy 5 mẫu chứa khoảng 30 μg protein và 5 μL sample buffer, 5 mẫu chứa 20 μg protein và 5 μL sample buffer.5 mẫu chứa 10 μg protein và 5 μL sample buffer.1 mẫu là dung dịch chuẩn. 4.3. Chạy điện di Bước 6: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dưới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V. Bước 7: Dùng Hamilton syringe load mẫu vào các giếng, cẩn thận để mẫu không bị tràn ra ngoài. Bước 8: Chạy điện di ở điện thế 60 V trong khoảng từ 3 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu). 4.4. Nhuộm và rửa gel Bước 9: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút. Bước 10: Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành. 5.Kết quả : - Hàm lượng protein của thơm tương đối thấp. 6.Kết luận: -Hàm lượng protein tương đối thấp. -Biết được nguyên tắc của việc xác định protein bằng phương pháp điện di SDS Bài 7. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.Mục đích,yêu cầu : 1.1.Mục đích: -Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết - Biết được phương pháp xác định protein tổng số 1.2.Yêu cầu: - Phải nắm vững kiến thức lý thuyết về phương pháp xác định protein tổng số, phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất dung cụ thí nghiệm. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm phải hết sức cẩn thận để tránh những sự cố đáng tiếc và ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. 2. Nguyên tắc : -Xác định hàm lượng protein tổng số trên 1g dựa vào phương pháp Bradford bằng cách đo hấp thụ quang của dịch chiết protein ở λ=595 nm và tính toán hàm lượng protein theo đường chuẩn albumin huyết thanh bò. 3.Dụng cụ và hóa chất: 3.1. Dung cụ: -Micro pipet,cối,chày,giấy lọc, -Máy lọc chân không,máy do OD,máy ly tâm. 3.2 Hóa chất : - Dung dịch Bardford 1X ,thuốc thử nihidrin (NH4)2SO4. 4. Tiến hành thí nghiệm: 4.1 Đối tượng: - Quả thơm 4.2 Cách chuẩn bị mẩu chiết: -Lấy 5g thịt quả thơm nghiền nát sau đó hòa tan 20ml với nước cất rồi lọc chân không.Tiếp tục dùng nước cất tráng bã sau khi lọc cho đến lúc hết protein trong bã bằng cách thử thuốc thử nihidrin -Kết tủa thuận nghịch dung dịch thu được bằng (NH4)2SO4 . 5 Tiến hành : -Mẫu sau khi lọc thì ly tâm với độ 15000 vòng/phút ở 4oc dùng micro pipet hút 4 μL dung dịch mẫu và 200 μL dung dịch bardford 1X vorter 30 giây sau đó đo OD ở bước sóng 595 nm và tiến hành do lặp lại 3 lẫn -Mẫu blank thay mẫu bằng nước cất. 6.Kết quả : -Đường chuẩn protein có phương trình là: Y = 0.0643 + 1.121* X - Trong đó: Y: Hàm lượng protein X: Chỉ số OD X1 = 0.916 X2 = 0.92 X3 = 0.917 X =( 0.916 + 0.92 + 0.917) /3 = 0.918 Thay vào phương trình ta được hàm lượng protein trong 1g Y =( 0.0643 + 1.121 * 0.918 ) /5= 0.2187 g 7.Kết luận: - Hàm lượng protein tương đối thấp