Thuyết minh Đề tài Phương pháp PCR
Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp .
Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90 oC lặp lại nhiều lần mà không mất khả năng tổng hợp DNA
29 trang |
Chia sẻ: tueminh09 | Ngày: 26/01/2022 | Lượt xem: 546 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Thuyết minh Đề tài Phương pháp PCR, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Đề tài :
PHƯƠNG PHÁP PCR
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA THỦY SẢN
GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG
1
1
Thành viên nhóm
Nguyễn Thị Huỳnh Nga 08141029
Phan Thị Bích Tuyền 08141063
Nguyễn Minh Quân 08141123
Mai Thị Nga 08141105
2
Mục lục
I. Giới thiệu
II. Nguyên tắc PCR
III. Điều kiện phản ứng PCR
IV. Quy trình phản ứng PCR
1.Giai đoạn biến tính
2.Giai đoạn bắt mồi
3.Giai đoạn kéo dài
V. Ý nghĩa và các ứng dụng PCR
VII. Các hạn chế
Tài liệu tham khảo
3
GIỚI THIỆU
PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là " phản ứng khuếch đại gen “.
Trong ngành thủy sản việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện ra các mầm bệnh do virus gây ra như bệnh đốm trắng,bệnh đầu vàng , hội chứng Taura trên tôm .
4
II. Nguyên tắc PCR
PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.
Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh .
5
II. Nguyên tắc PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau , mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn :
1 chu kỳ
GĐ
Biến tính
GĐ
Bắt mồi
GĐ
Kéo dài
6
III. Điều kiện phản ứng PCR
Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được , cần phải có đầy đủ các thành phần sau :
Hình : Thực nghiệm PCR
7
1. Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết , không chứa ion nào , không chứa DNAase , RNAase , enzyme cắt giới hạn .
8
2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:
Thành phần dung dịch đệm thường phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR, dung dịch đệm thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM , KCl 50 mM và MgCl 2 1.5 mM
Nồng độ MgCl 2 có thể dao động từ 0.5-5 mM . Chính ion Mg 2+ gắn kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi .
9
3. Deoxynucleotide triphosphat ( dNTPs ):
Deoxyadenosine 5’ triphosphate
10
3. Deoxynucleotide triphosphat ( dNTPs ):
Nồng độ khoảng chừng 100 mM cho mỗi nucleotide: dATP , dCTP , dGTP , dTTP .
Nồng độ thấp khoảng 10 – 100 mM thì Taq polymerase có độ chính xác cao hơn .
11
4. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA.
Các mồi này có chiều ngược nhau , bao gồm :
Mồi xuôi (forward primer)
Mồi ngược (reverse primer).
12
5.Enzyme DNA polymerase ( Taq )
Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp .
Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90 o C lặp lại nhiều lần mà không mất khả năng tổng hợp DNA
13
6. DNA mẫu (DNA template)
Có thể là DNA kép , đơn , hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu . DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất .
Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm ( từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả cao .
14
III. Quy trình phản ứng PCR.
Trong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng và kèm theo là yếu tố thời gian .
Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong một chu kỳ :
15
1. Giai đoạn biến tính :
Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 94 0 C trong vòng 30 giây đến 1 phút .
Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn mồi và các dNTP .
16
2.Giai đoạn bắt cặp :
Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 65 0 C tốt nhất là 55 o C trong khoảng thời gian 1 – 2 phút .
Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase và chiều dài sản phẩm .
17
3. Giai đoạn kéo dài :
Nhiệt độ lúc này được nâng lên 72 0 C trong vòng 30 giây đến 1 phút .
Nhờ tác dụng của men Taq polymerase các Nu có sẵn trong ống nghiệm gắn vào các mồi theo nguyên tắc bổ sung
=> Một bản sao DNA mới đã được hình thành .
18
3. Giai đoạn kéo dài :
19
Sơ đồ phản ứng PCR qua nhiều chu kỳ
20
Hình : Nhiệt độ của các chu kỳ phản ứng PCR
21
V. Ý nghĩa và các ứng dụng
22
a. Phương pháp này có ý nghĩa lớn vì nhiều lý do:
Độ tinh sach của mẫu không cần cao
Dễ thực hiện
Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn
Độ chính xác cao đáng tin cậy
23
b. Các ứng dụng chủ yếu của PCR gồm :
Phát hiện đột biến
Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
Chọn giống vật nuôi , cây trồng
Xác định huyết thống , truy tìm dấu vết tội phạm
Xác định mầm bệnh từ động vật thủy sản như bệnh tôm : MBV, WSSV, YHV, TSV và bệnh trên cá : VNN
24
25
VI. Các hạn chế
Do phương pháp có độ nhạy cao và khuếch đại nucleic acid nên dễ bị ảnh hưởng dẫn đến lỗi trong thao tác và đòi hỏi sự thận trọng trong quá trình thực hiện .
Ba vấn đề lớn khi dùng PCR:
Kích thước và trình tự cần giới hạn
Sự ngoại nhiễm
Các sai sót gây ra do Taq polymerase
26
VII. Kết luận
Ngày nay kĩ thuật PCR đang được áp dụng rộng rãi góp phần không nhỏ cho sự phát triển của y học nói chung,cho ngành thủy sản nói riêng .
Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm của kỹ thuật này thì cần phải khắc phục những hạn chế để giảm giá thành , mang lại kết quả cao hơn trong việc chuẩn đoán các mầm bệnh mới gây hại cho động – thực vật và con người .
27
Tài liệu tham khảo
Bù i Trang Vi ệ t – Lê Thị Phương H ồ ng . 2006. Sinh họ c di truy ề n và phân t ử , ph ầ n II. Sinh họ c phân t ử .
Đỗ Hiếu Liêm , 2007 . Sinh hóa đại cương .
Các wed:
www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html
vi.wikipedia.org/wiki/PCR
www.sinhhocvietnam.com
www.tailieu.com
28
Cảm ơn cô và các bạn đã theo dõi
bài thuyết trình của nhóm
BÀI THUYẾT TRÌNH CỦA NHÓM
CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI
29
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- thuyet_minh_de_tai_phuong_phap_pcr.ppt