Tiến hành tổng hợp một số dẫn xuất của N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-galactopyranosyl)thiosemicarbazid bằng cách ngưng tụ hợp chất này với benzaldehyd thế khác nhau

trong ethanol. Sản phẩm thu được dạng bột màu ngà; hiệu suất 75%; Đnc: 172-173oC. 2.4.20. Tổng hợp 2-clo benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon Cho 0,22ml (2mmol) 2-clobenzaldehyd vào bình cầu dung tích 100ml trong đó đã có sẵn 2ml ethanol, thêm vào đó 1 đến 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác. Sau đó thêm tiếp 0,84 gam (2mmol) N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazid vào hỗn hợp này. Chiếu xạ hỗn hợp phản ứng đã chuẩn bị trên trong lò vi sóng trong khoảng thời gian 5 phút. Dịch phản ứng thu được sau khi chiếu xạ được đổ ra cốc, cho bay hơi bớt dung môi thu được những sản phẩm kết tinh dưới dạng bông xốp theo từng lớp màu trắng. Lọc hút sản phẩm trên phễu buchne và kết tinh lại trong ethanol. Sản phẩm thu được dạng tinh thể hình kim, trắng, xốp; hiệu suất 79%; Đnc: 216-217oC. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TỔNG HỢP 2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTOPYRANO-SYLBROMUA Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình tổng hợp mà chúng tôi thực hiện trong bản báo cáo này, phản ứng tiến hành chuyển hoá α-D-galactopyranozo thành 2,3,4,6-tetra-O- acetyl-β-D-galactopyranosyl bromua. Đây cũng là một phản ứng rất quan trọng cho cả quy trình phản ứng với việc thay thế nhóm –OH bằng nhóm -OAc. Nhóm -OAc có vai trò là nhóm bảo vệ các nhóm OH ở các vị trí 2, 3, 4, 6 của hợp phần đường galactopyranozo. Trong quá trình thực hiện phản ứng này, nhiệt độ phản ứng chủ yếu được giữ ở 200C để tránh sản phẩm bị nhựa hoá. Vì thế, trong khi rửa bằng dung dịch natri bicacbonat bão hoà nên cho một ít đá vào hỗn hợp để giữ cho nhiệt độ phản ứng dưới 200C. Nếu cần thiết cho thêm dung dịch natri bicacbonat đến khi kết tủa hạt. Ngoài ra, phản ứng cần phải tránh nước hoàn toàn nên các dụng cụ và hoá chất cần phải sấy thật khô. 3.2. TỔNG HỢP 2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTOPYRA-NOSYL ISOTHIOCYANAT Đây là giai đoạn thứ hai của quy trình tổng hợp. Với phản ứng này cũng cần phải được thực hiện trong điều kiện hoàn toàn khô. Do đó, trước khi tiến hành phản ứng, chì isothixianat đã được xử lý cẩn thận với toluen khan. Phổ hồng ngoại của sản phẩm chuyển hoá trong phản ứng này đã chứng minh phản ứng đã xảy ra. Trong phổ IR đã xuất hiện băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm C=O của nhóm este là 1746 cm–1, còn dao động hoá trị của nhóm C–O–C là 1237 cm–1 và 1041 cm–1. Ngoài ra, băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm –NCS đã xuất hiện với tần số bước sóng là 2092 cm–1 (xem Hình 3.1). Hình 3.1. Phổ IR của dẫn xuất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl isothiocyanat. 3.3. TỔNG HỢP N-(2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTO-PYRANOSYL)THIOSEMICARBAZID Đây là giai đoạn thứ ba của quá trình tổng hợp, là giai đoạn tạo ra hợp chất dẫn xuất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl thiosemicarbazid - hợp chất chính của quy trình phản ứng, được dùng để tiến hành hàng loạt các phản ứng ngưng tụ với các benzaldehyd ở giai đoạn thứ tư. Dung môi được sử dụng trong phản ứng này là dung dịch dioxan khan hoặc diclometan khan. Điều chú ý khi thực hiện phản ứng này là nhiệt độ của phản ứng phải được giữ trong khoảng 10- 15°C. Nếu nhiệt độ của phản ứng dưới 10°C thì hỗn hợp phản ứng bị đông đặc làm cho hỗn hợp phản ứng không đồng nhất. Còn nếu nhiệt độ của phản ứng trên 15°C trong môi trường dư hydrazin hiđrat thì xảy ra sự đeacetyl hoá một phần sản phẩm. Do đó, dung dịch gồm dung môi khan và hợp chất isothioxianat phải được làm lạnh bằng nước đá trước khi nhỏ giọt hỗn hợp hydrazin và dung môi khan, vừa nhỏ giọt vừa khuấy mạnh. Mặt khác, khi cô cạn dung môi sau khi kết thúc phản ứng để thu sản phẩm, tiến hành cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50°C vì nếu nhiệt độ trên 50°C sẽ dẫn đến sự thuỷ phân nhóm acetyl. So sánh hai phương pháp chúng tôi nhận thấy như sau: phương pháp 2 cho hiệu suất cao hơn hẳn so với phương pháp 1; khi thu sản phẩm theo phương pháp 2, sản phẩm thu dễ dàng hơn do sản phẩm không ở dạng siro như khi tiến hành theo phương pháp 1; tuy nhiên phương pháp 1 cũng có ưu điểm đó là lợi thế về thời gian hơn phương pháp 2. Phổ hồng ngoại của sản phẩm thấy xuất hiện băng sóng hấp thụ của dao động hoá trị của nhóm N-H là 3315 cm–1 và 3193 cm–1, với độ biến dạng là δ= 1627 cm–1. Dao động hoá trị của nhóm C=O của nhóm este là 1746 cm–1. Nhóm C–O–C hấp thụ ở các tần số là 1041 cm–1. Dao động hoá trị đặc trưng cho nhóm C=S cũng đã xuất hiện với tần số là 1237 cm–1. Các kết quả thu được từ phổ IR chứng tỏ rằng phản ứng đã xảy ra. Hình 3.2. Phổ IR của dẫn xuất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl thiosemicarbazid. 3.4. TỔNG HỢP N-(2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTO-PYRANOSYL)THIOCARBAZON CỦA BENZALDEHYD THẾ Đây là giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp. Trong luận văn này, chúng tôi đã thực hiện sự ngưng tụ (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazid với 20 benzaldehyd thế khác nhau để tạo thành các hợp chất thiosemicarbazon. Phản ứng được thực hiện theo hai phương pháp khác nhau. Phương pháp tổng hợp truyền thống (đun hồi lưu) và phương pháp tổng hợp sử dụng lò vi sóng, trong dung môi ethanol 96% hoặc methanol khan với sự có mặt của acid acetic băng làm xúc tác. Bản chất của phản ứng này là sự cộng hợp nucleophin vào liên kết đôi C=O của nhóm andehyd sau đó là sự loại đi phân tử nước. Các nghiên cứu sâu về cơ chế của phản ứng cho thấy, tốc độ của phản ứng phụ thuộc cả vào hai quá trình: quá trình tấn công của tác nhân nucleophin vào liên kết C=O cacbonyl, và quá trình tách nước tạo thành sản phẩm. Vì vây, tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến 2 giai đoạn này đều ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng. Chẳng hạn, với các andehyd mang nhóm thế hút điện tử mạnh sẽ làm tăng độ dương điện trên nguyên tử C cacbonyl làm thuận lợi hơn cho quá trình tấn công của tác nhân nucleophin. Do đó, sự có mặt của các nhóm thế hút điện tử sẽ làm tăng khả năng phản ứng của hợp phần andehyd và ngược lại sự có mặt của các nhóm thể đẩy điện tử sẽ có xu hướng làm giảm khả năng phản ứng. Vì phản ứng trải qua hai giai đoạn chính nên môi trường pH (bản chất của chất xúc tác) cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng. Trong môi trường acid, sẽ thận lợi cho quá trình proton hóa của nguyên tử C cacbonyl, làm tăng điện tích dương của nguyên tử cacbon này và hơn nữa trong môi trường acid giai đoạn tách nước cũng xảy ra dễ dàng. Tuy nhiên trong môi trường acid nguyên tử nitơ của nhóm thiosemicarbazid cũng dễ dàng bị proton hóa do đó sẽ cạnh tranh với phản ứng cộng hợp dẫn đến làm giảm tốc độ phản ứng. Ngược lại trong môi trường kiềm, tính nucleophin của các nguyên tử N được tăng cường, làm tăng tốc độ quá trình cộng hợp tuy nhiên quá trình tách nước lại không thuận lợi. Do đó, với mỗi cặp chất khác nhau sẽ có một giá trị pH mà tại đó có sự cân bằng giữa cả hai quá trình và khi đó tốc độ phản ứng sẽ đạt giá trị cao nhất [1]. Điều này cũng cho thấy việc lựa chọn chất xúc tác là khá quan trọng cho phản ứng này. Trong phương pháp tổng hợp truyền thống, phản ứng được tiến hành trong điều kiện đun hồi lưu mạnh trên bếp cách thuỷ trong thời gian từ 60-90 phút ở nhiệt độ sôi của dung môi. Với phương pháp này, phản ứng được thực hiện trong điều kiện có dung môi (ethanol hoặc methanol) và xúc tác acid. Với các andehyd có khả năng phản ứng cao (chứa nhóm thế hút điện tử mạnh như NO2, Cl, Br) chúng tôi tiến hành phản ứng trong dung môi ethanol. Các andehyd mang nhóm thế đẩy điện tử mạnh (có khả năng phản ứng kém hơn) chúng tôi thực hiện trong dung môi methanol khan với hy vọng hiệu suất phản ứng tách nước tạo thiosemicarbazon cao hơn và phản ứng xảy ra dễ dàng hơn. Xúc tác của phản ứng là acid acetic băng, tạo môi trường acid yếu. Phản ứng ngưng tụ xảy ra tương đối dễ dàng với hiệu suất khá từ 32%-81% (Bảng 3.1). Trong quá trình tổng hợp, các hợp chất mang nhóm thế NO2 mặc dù có độ tan kém trong dung môi nhưng do khả năng phản ứng cao nên phản ứng vẫn xảy ra với hiệu suất tương đối tốt (49% với trường hợp nhóm thế p-NO2 và 66% với trường hợp nhóm thế o-NO2). Trên cơ sở kết quả các phản ứng nhận được theo phương pháp tổng hợp truyền thống chúng tôi mở rộng nghiên cứu tổng hợp các galactosyl thiosemicarbazon theo phương pháp sử dụng lò vi sóng [ 13, 35-38]. Với các hợp chất bền nhiệt, có nhiệt độ nóng chảy cao việc sử dụng lò vi sóng nâng cao nhiệt độ phản ứng sẽ làm tăng nhanh tốc độ phản ứng. Ngoài ra, việc phản ứng được thực hiện trong điều kiện không dung môi giúp tăng tối đa nồng độ của các chất phản ứng cũng làm tăng tốc độ của phản ứng. Ở đây, chúng tôi thực hiện phản ứng dưới điều kiện chiếu xạ khoảng 2-5 phút trong lò vi sóng với công suất 750W. Trong phương pháp này, đại đa số được thực hiện theo cách các chất phản ứng, xúc tác và dung môi được cho đồng thời vào bình cầu chịu nhiệt, tiến hành chiếu xạ trong lò vi sóng có lắp sinh hàn hồi lưu. Riêng trường hợp tổng hợp của nhóm thế 3-OCH3 – là nhóm thế khảo sát đầu tiên theo phương pháp sử dụng lò vi sóng, ban đầu được chúng tôi tiến hành trong điều kiện không có dung môi, các chất phản ứng được nghiền mịn trong chén sứ chịu nhiệt để thực hiện phản ứng. Tuy nhiên khi thực hiện lại phản ứng này trong điều kiện có một lượng nhỏ dung môi, hồi lưu trong lò vi sóng thì chúng tôi nhận thấy hiệu suất có tăng lên do đó các chất sau chúng tôi lựa chọn cách làm sau, tiến hành trong điều kiện có một lượng nhỏ dung môi và hồi lưu trong lò vi sóng. Kết quả, bằng cả 2 phương pháp chúng tôi tổng hợp thành công 20 hợp chất thiosemicarbazon khác nhau (Bảng 3.1). Bằng những nhận định ban đầu, và các kết quả hiệu suất tính toán được chúng tôi nhận thấy rằng các galactothiosemicarbazon hoàn toàn có thể được tổng hợp bằng phương pháp sử dụng lò vi sóng, và cho hiệu suất cao (60%-98%) hơn hẳn so với phương pháp đun hồi lưu truyền thống (32%-81%). Nhiều phản ứng xảy ra mạnh với hiệu suất trên 90% (trường hợp andehyd mang nhóm thế p-Cl, p-NO2, p-Br). Đại đa số hiệu suất phản ứng nằm trong khoảng 75-90%. Một lợi thế khác của phương pháp thực hiện trong lò vi sóng đó là thời gian của phản ứng được rút ngắn đáng kể. Từ 60-90 phút trong phương pháp đun hồi lưu xuống chỉ còn 2-5 phút trong phương pháp sử dụng lò vi sóng. Đây là một trong những ưu điểm lớn nhất của phương pháp này. Ngoài ra sự có mặt chỉ một lượng rất nhỏ của dung môi là một trong những điều kiện giúp phương pháp này có thể thực hiện được với lượng nhỏ chất phản ứng. Trong quá trình thực hiện phản ứng theo phương pháp sử dụng lò vi sóng, sản phẩm nhận được có nhiều trường hợp bị dầu, rất khó kết tinh trong ethanol hay hệ dung môi trong khi một số trường hợp đó khi chúng tôi thực hiện theo phương pháp 1 sản phẩm lại có thể kết tinh được ngay khi đổ dung dịch phản ứng thu được ra cốc. Sự dầu hóa này gây khó khăn trong quá trình kết tinh sản phẩm và tinh chế sản phẩm để được chất tinh khiết. Trong luận văn này, chúng tôi đã dùng cách xử lý sản phẩm dầu với nước để thu sản phẩm. Do kết tinh theo cách này nên sản phẩm trong một số trường hợp có độ tinh khiết không cao, thường bị lẫn các chất đầu (các benzaldehyd dùng để phản ứng) như trường hợp với nhóm thế 4-CH3, 4-CH(CH3); còn lại phần lớn các sản phẩm thu được có độ tinh khiết tương đối tốt như trường hợp của nhóm thế 4-OH, 4-N(CH3)2… Bảng 3.1 Các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon được tổng hợp Stt Nhóm thế Đn/c (oC) Hiệu suất (%) Phương pháp 1 Phương pháp 2 1 3’-OCH3, 4’-OCH3 212-213 - 70 2 3’-NO2 169-170 60 70 3 2’-NO2 196-197 66 77 4 4’-NO2 157-158 49 97 5 4’-(CH3)2N 217-218 40 74 6 3’,4’-CH2O2 156-157 78 - 7 2’-OH,5’-Br 218-219 81 - 8 3’-OCH3 223-224 - 85 9 2’-OCH3 190-191 - 60 10 4’-Cl 173-174 32 98 11 3’-OCH3, 4’-OH 246-247 - 70 12 3’-OC2H5, 4’-OH 204-205 - 80 13 4’-CH3 180-181 - 60 14 4’-F 113-114 - 73 15 4’-Br 159-160 - 98 16 3’-OH, 4’-OCH3 181-182 - 75 17 2’-OH 190-191 - 75 18 4’-OH 234-235 - 75 19 4’-(CH3)2CH 172-173 - 75 20 2’-Cl 216-217 - 79 Tuy nhiên, một trong những bất lợi của phương pháp tổng hợp trong lò vi sóng có thể được nhận thấy là độ bền nhiệt của các chất tham gia hay sản phẩm phản ứng. Với các chất kém bền nhiệt, chúng có thể bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ cao của lò vi sóng. Mặt khác, các chất có nhiệt độ sôi thấp cũng như các chất có khả năng thăng hoa đều khó có thể thực hiện trong lò vi sóng. Các thiosemicarbazon tạo thành được kết tủa sơ bộ một từ ethanol 96° và được kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi toluen:ethanol tỉ lệ được thay đổi phù hợp với mỗi trường hợp chất cụ thể. Độ tinh khiết của sản phẩm thiosemicarbazon đã tinh chế được kiểm tra bằng độ sắc nét của điểm chảy (Bảng 3.1) và bằng sắc kí bản mỏng. Hệ dung môi được lựa chọn là toluen:aceton với tỷ lệ 3:1 hoặc 2:1 về thể tích; hiện màu bằng hơi iot. Kết quả chạy sắc kí bản mỏng nhận được các vệt tròn và rõ nét cho thấy các sản phẩm tổng hợp có độ tinh khiết cao. Cấu trúc của các thiosemicarbazon được xác nhận bằng phương pháp ghi phổ IR, phổ 1H NMR, 13C NMR kết hợp kĩ thuật phổ 2D NMR (HSQC, HMBC) và phổ khối lượng ESI-MS [26-27]. Trên phổ IR của các hợp chất tổng hợp (Bảng 3.2) nhận thấy các băng sóng hấp thụ có bước sóng 3350–3320 cm–1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết N-H thiosemicarbazon. Băng sóng hấp thụ có cường độ mạnh, sắc tại bước sóng 1755–1740 cm–1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O este. Mặt khác, liên kết CH=N của thiosemicarbazon cũng được nhận thấy với các băng sóng hấp thụ yếu cho dao dộng hóa trị tại bước sóng 1620–1590 cm–1. Sự có mặt của liên kết C=S được đặc trưng bởi các băng sóng hấp thụ có cường độ mạnh của dao dộng hóa trị trong vùng 1250–1200 cm–1. Ngoài ra còn thấy các băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C–O–C ete ở vùng 1060–1020 cm–1. Sự có mặt của các nhóm thế cũng nhận thấy như các băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH tại 3407 và 3502 cm–1, hay nhóm NO2 tại 1523, 1345 cm–1. Bảng 3.2 Dữ kiện phổ IR đặc trưng của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon Stt R Phổ hồng ngoại (cm–1) νN-H νCH=N νC=O νC=S νC–O–C νR 1 3’-OCH3, 4’-OCH3 3355 1603 1749 1222 1061 2965 2 3’-NO2 3338 1625 1745 1228 1054 - 3 2’-NO2 3283 1600 1750 1227 1049 - 4 4’-NO2 3337 1587 1744 1226 1048 1523; 1345 5 4’-(CH3)2N 3343 1600 1744 1223 1055 2958 6 3’,4’-CH2O2 3354 1595 1744 1217 1040 - 7 2’-OH,5’-Br 3348 1597 1746 1219 1059 - 8 3’-OCH3 3348 1582 1745 1220 1055 2965 9 2’-OCH3 3319 1599 1740 1254 1053 2960 10 4’-Cl 3325 1600 1754 1245 1054 - 11 3’-OCH3, 4’-OH 3352 1601 1744 1223 1055 3502; 3252 12 3’-OC2H5, 4’-OH 3345 1600 1747 1223 1051 2988 13 4’-CH3 3334 1609 1747 1233 1054 2934 14 4’-F 3341 1606 1750 1261 1045 - 15 4’-Br 3331 1595 1748 1227 1052 - 16 3’-OH, 4’-OCH3 3313 1600 1744 1243 1040 3491 17 2’-OH 3257 1619 1752 1221 1040 3407 18 4’-OH 3354 1608 1752 1216 1039 3261 19 4’-(CH3)2CH 3355 1608 1748 1223 1054 2980 20 2’-Cl 3334 1593 1744 1224 1059 - Trên phổ 1H NMR (Bảng 3.3) của các thiosemicarbazon tổng hợp được chia làm bốn vùng tín hiệu cộng hưởng đặc trưng: Proton N-H xuất hiện hai tín hiệu cộng hưởng ở trường thấp. Một tín hiệu singlet với δH 11,70–12,17 ppm đặc trưng cho proton Hb của thiosemicarbazon. Tín hiệu cộng hưởng còn lại xuất hiện ở trường cao hơn với độ chuyển dịch hóa học δH 8,50–8,80 ppm, douplet, J ~ 9–10 Hz đặc trưng cho proton Ha có tương tác với proton anome của hợp phần monosaccarid. Vùng tín hiệu cộng hưởng của proton thơm xuất hiện với các pic cộng hưởng có độ chuyển dịch hóa học δH 6,90-8,20 ppm. Các tương tác spin-spin của các proton thơm tính được trong mỗi trường hợp cũng phù hợp với các trường hợp nhân phenyl có chứa nhóm thế với proton tương tác octho J ~ 7,5-8,0 Hz, tương tác meta J ~ 1,5-2,0 Hz. Điều đặc biệt trong vùng proton thơm xuất hiện tín hiệu cộng hưởng singlet δH 8,0-8,3 ppm đặc trưng cho proton CH=N của liên kết cacbazon. Khi xem xét kĩ lưỡng về mối tương quan giữa hằng số nhóm thế và độ chuyển dịch hóa học của proton này chúng tôi nhận thấy mối tương quan tuyến tính giữa chúng. Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hằng số nhóm thế và độ chuyển dịch hóa học của H trong nhóm CH=N Bảng 3.3 Dữ kiện phổ 1H NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon R Proton δH, tương tác, J (Hz) 3’-OCH3,4’-OCH3 3’-NO2 2’-NO2 4’-NO2 H-a 8,55; d; 8,5 8,96; d; 9,0 8,92; d; 9,0 9,00; d; 9,0 H-b 11,90; s 12,13; s 12,21; s 12,17; s H-c 8,03; s 8,22; s 8,54; s 8,20; s H-1 5,75; t; 9,0 5,91; t; 9.0 5,92; t; 9,0 5,93; t; 9,0 H-2 5,26; t; 9,5 5,34; m 5,33; m 5,35; m H-3 5,42; dd; 9,5; 4,0 5,41; dd; 9,5; 3,5 5,40; dd; 10; 3,5 5,40; dd; 10,0; 3,5 H-4 5,33; d; 3,5 5,34; m 5,33; m 5,35; m H-5 4,30; t; 6,5 4,34; t; 6,5 4,34; t; 6,5 4,33; t; 6,5 H-6 4,04; m 4,06; m 4,06; d; 6,0 4,07; d; 6,5 H-2’ 7,53; d; 1,5 8,22; s - 8,14; d; 9,0 H-3’ - - 8,46; d; 8,0 8,27; d; 9,0 H-4’ - 8,36; d; 8,0 8,06; d; 8,5 - H-5’ 6,99; d; 8,0 7,74; t; 8,0 7,77; dt; 8,0; 1,5 8,27; d; 9,0 H-6’ 7,21; dd; 8,0; 1,5 8,26; dd; 8,0; 1;0 7,81; t; 7,5 8,14; d; 9,0 CH3CO 1,96-2,13; s 1,96-2,00; s 1,95-2,15; s 1,96-2,16; s H - khác 3,88; s (3’-OCH3) 3,81; s (4’-OCH3) - - - Bảng 3.3 Dữ kiện phổ 1H NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R Proton δH, tương tác, J (Hz) 4’-N(CH3)2 3’,4’-CH2O2 2’-OH,5’-Br 3’-OCH3 H-a 8,43; d; 9,0 8,79; d; 9,0 8,81; d; 9,0 8,67; d; 8,5 H-b 11,71; s 11,86; s 11,97; s 11,97; s H-c 7,99; s 8,04; s 8,40; s 8,08; s H-1 5,85; t; 9,5 5,92; t; 9,0 5,90; t; 9,0 5,82; t; 9,0 H-2 5,26; t; 10,0 5,35, m 5,34; m 5,29; t; 10 H-3 5,40; dd; 10; 3,5 5,41; dd; 10; 3,5 5,43; dd; 10; 4,0 5,40; dd; 10; 4,0 H-4 5,34; d; 3,5 5,35; m 5,34; m 5,33; d; 3,5 H-5 4,31; t; 6,5 4,34; t; 6,5 4,35; t; 6,5 4,31; t; 6,5 H-6 4,05; d; 6,5 4,08; d; 6,0 4,08; m 4,05; m H-2’ 6,73; d; 9,0 7,73; d; 1,0 - 7,46; d; 1,0 H-3’ 7,61; d; 9,0 - 6,88; d; 9,0 - H-4’ - - 7,42; dd; 9,0; 2,5 7,34; m H-5’ 7,61; d; 9,0 7,00; d; 8,0 - 7,34; m H-6’ 6,73; d; 9,0 7,16; dd; 8,0; 1,5 8,19; s 7,01; ddd; 8,0; 1,4; 1,0 CH3CO 1,95-2,15; s 1,98-2,18; s 1,97-2,18; s 1,95-2,14; s H - khác 2,98; s 6,13; s (CH2O2) - 3,84; s (3’-OCH3) Bảng 3.3 Dữ kiện phổ 1H NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R Proton δH, tương tác, J (Hz) 2’-OCH3 4’-Cl 3’-OCH3,4’-OH 3’-OC2H5,4’-OH H-a 8,64; d; 9,0 8,78; d; 9,0 8,51; d; 8,5 8,49; d; 9,0 H-b 11,92; s 11,95; s 11,85; s 11,84; s H-c 8,48; s 8,08; s 8,01; s 8,01; s H-1 5,88; t; 9,0 5,88; t; 9,0 5,77; t; 9,0 5,79; t; 9,5 H-2 5,29; t; 10 5,30; t; 9,5 5,26; t; 9,5 5,26; t; 10 H-3 5,39; dd; 10; 4,0 5,37; dd; 10; 3,5 5,42; dd; 10; 3,5 5,42; dd; 10; 4,0 H-4 5,33; d; 3,5 5,32; d; 4,0 5,33; d; 3,5 5,35; d; 3,5 H-5 4,32; t; 6,5 4,30; t; 6,5 4,31; t; 6,5 4,32; t; 6,5 H-6 4,05; d; 6,5 4,04; d; 6,5 4,05; m 4,04; m H-2’ - 7,48; d; 8,5 7,48; d; 1,5 7,43; d; 1,5 H-3’ 8,10; dd; 8,0; 1,5 7,86; d; 8,5 - - H-4’ 7,43; dt; 8,0; 1,5 - - - H-5’ 7,02; t; 8,0 7,86; d; 8,5 6,83; d; 8,0 6,85; d; 8,0 H-6’ 7,09; d; 8,5 7,48; d; 8,5 7,12; dd; 8,0; 4,0 7,15; dd; 8,0; 1,5 CH3CO 1,95-2,15 1,93-2,13;s 1,96-2,14; s 1,97-2,15; s H - khác 3,85; s (2’-OCH3) - 9,54; s (4’-OH) 3,89; s; (3’-OCH3) 9,45; s (3’-OH) 1,37; t; 6,5 4,19; q; 6,5 (4’-OC2H5) Bảng 3.3 Dữ kiện phổ 1H NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R Proton δH, tương tác, J (Hz) 4’-CH3 4’-F 4’-Br 3’-OH,4’-OCH3 H-a 8,62; d; 9,0 8,75; d; 9,0 8,77; d; 9,0 8,51; d; 9,0 H-b 11,85; s 11,93; s 11,95; s 11,78; s H-c 8,06; s 8,11; s 8,06; s 7,98; s H-1 5,85; t; 9,5 5,90; t; 9,0 5,88; t; 9,0 5,89; t; 9,0 H-2 5,27; t; 10 5,32; m 5,30; t; 10 5,26; t; 9,5 H-3 5,36; dd; 9,5; 4,0 5,40; dd; 10; 3,5 5,37; dd; 10; 4,0 5,39; dd; 10; 4,0 H-4 5,31; d; 3,5 5,32; m 5,31; d; 4,5 5,32; d; 3,5 H-5 4,29; t; 6,5 4,33; t; 6,0 4,30; t; 6,5 4,31; t; 6,5 H-6 4,03; d; 6,5 4,06; m 4,03; d; 6,5 4,04; d; 6,5 H-2’ 7,69; d; 8,0 7,28; t; 9,0 7,79; d; 8,5 7,31; d; 2,0 H-3’ 7,23; d; 8,0 7,92; dd; 9,0; 6,0 7,61; d; 8,5 - H-4’ - - - - H-5’ 7,23; d; 8,0 7,92; dd; 9,0; 6,0 7,61; d; 8,5 6,96; d; 8,5 H-6’ 7,69; d; 8,0 7,28; t; 9,0 7,79; d; 8,5 7,14; dd; 8,5; 2,0 CH3CO 1,93-2,13; s 2,02-2,15; s 1,93-2,13 1,93-2,15; s H - khác 2,33; s (4’-CH3) - - 9,13; s (3’-OH) 3,82; s (4’-OCH3) Bảng 3.3 Dữ kiện phổ 1H NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R Proton δH, tương tác, J (Hz) 2’-OH 4’-OH 4’-CH(CH3)2 2’-Cl H-a 8,61; d; 9,5 8,53; d; 9,0 8,63; d; 9,5 8,84; d; 9,0 H-b 11,86; s 11,76; s 11,92; s 12,10; s H-c 8,44; s 8,01; s 8,10; s 8,55; s H-1 5,87; t; 9,0 5,86; t; 9,0 5,87; t; 9,5 5,92; t; 9,5 H-2 5,27; t; 9,0 5,23; t; 9,5 5,30; t; 10,0 5,34; m H-3 5,38; dd; 10; 4,0 5,38; dd; 10; 4,0 5,41; dd; 10; 3,5 5,41; dd; 10; 3,5 H-4 5,32; d; 3,5 5,33; d; 3,5 5,35; d; 3,5 5,34; m H-5 4,30; t; 6,0 4,30; t; 6,0 4,33; t; 6,5 4,34; t; 6,5 H-6 4,04; d; 6,5 4,04; d; 7,0 4,06; d; 6,5 4,07; d; 6,5 H-2’ - 6,82; d; 8,5 7,32; d; 8,0 - H-3’ 7,94; d; 7,0 7,65; d; 8,5 7,50; d; 8,0 8,33; dd; 7,5; 1,5 H-4’ 7,26; dt; 8,0; 1,5 - - 7,45; m H-5’ 6,87; m 7,65; d; 8,5 7,50; d; 8,0 7,45; m H-6’ 6,87; m 6,82; d; 8,5 7,32; d; 8,0 7,51; dd; 7,5; 1,5 CH3CO 1,94-2,14; s 1,94-2,14; s 1,96-2,16; s 1,96-2,16; s H - khác 9,97; s (2’-OH) 9,97; s (4’-OH) 2,94; m 1,23; d; 6,5 (4-CH(CH3)2) - Qua đồ thị hình 3.3 chúng tôi nhận thấy rằng khi nhân thơm mang nhóm thế với giá trị hằng số Hammett dương (nhóm thế hút electron) sẽ làm dịch chuyển tín hiệu cộng hưởng của proton CH=N lên vùng trường cao và ngược lại khi nhân thơm mang nhóm thế có giá trị hằng số Hammett âm (nhóm thế đẩy electron) sẽ làm dịch chuyển tín hiệu cộng hưởng của proton này về vùng trường thấp. Vùng tín hiệu cộng hưởng của proton galactose xuất hiện ở vùng trường cao với độ chuyển dịch hóa học nằm trong vùng δH 4,0-6,0 ppm. Một tín hiệu cộng hưởng xuất hiện ở δH 5,7-6,2 ppm, triplet có cường độ tích phân bằng 1H đặc trưng cho proton anome của hợp phần monosaccarid. Proton này tương tác với proton H-2 và một proton N-H với cùng hằng số tương tác spin-spin J 9,5-10,0 Hz tạo nên tín hiệu cộng hưởng dạng triplet. Giá trị lớn của hằng số tương tác spin-spin nhận được của proton anome và proton H-2 của vòng monosaccarid cho thấy hai proton này nằm ở vị trí trans-axial với nhau, và do đó phần monosaccarid galactose tồn tại ở đồng phân β. Các tương tác còn lại tính toán được phù hợp với cấu trúc của monosaccarid galactopyranozơ. Một vùng tín hiệu cộng hưởng nữa quan sát được trên phổ 1H NMR của các thiosemicarbazon nằm ở trường cao δH 1,7-2,2 ppm, singlet, với giá trị cường độ tích phân tương ứng với 12 proton cho thấy sự xuất hiện của bốn nhóm acetyl trong phân tử hợp chất thiosemicarbazon. Ngoài ra, với mỗi chất mang nhóm thế khác nhau cũng xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng cho thấy sự xuất hiện của các proton trong nhóm thế như: OMe với tín hiệu cộng hưởng singlet có cường độ tích phân bằng 3, độ chuyển dịch hóa học δH 3,84-3,85 ppm. Hay với trường hợp nhóm thế isopropyl, trên phổ 1H cũng xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng δH 2,94, heptet, 1H, J = 6,5 Hz, và δH 1,23, douplet, 6H, J = 6,5 Hz. Phổ 13C NMR của các thiosemicarbazon cũng cho thấy xuất hiện các vùng pic cộng hưởng đặc trưng như: tín hiệu của C=S, acetyl, vòng benzen và của hợp phần monosaccarid. Tín hiệu cộng hưởng xuất hiện ở vùng trường thấp có δC 177,7-178,5 ppm đặc trưng cho nguyên tử C của thiosemicarbazone, tiếp đó là bốn tín hiệu cộng hưởng ở δC 169,0-170,0 ppm cùng với bốn tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển dịch hóa học δC 20,0-20,5 ppm cho thấy sự xuất hiện của bốn nhóm acetyl trong phân tử các hợp chất thiosemicarbazon đã tổng hợp. Sáu tín hiệu cộng hưởng tại δC 61, 67, 68, 70, 71, và 81 ppm đặc trưng cho sáu nguyên tử cacbon của hợp phần galactose. Các tín hiệu cộng hưởng có δC 111-150 ppm đặc trưng cho các nguyên tử cacbon trong nhân thơm. Tiếp đó, để tiến hành xác định chính xác cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp chúng tôi tiến hành ghi phổ 2D NMR HMBC, HSQC. Chẳng hạn với hợp chất 3’,4’-dimetoxi benzandehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon, trên phổ HMBC nhận thấy tín hiệu tương tác giữa nguyên tử cacbon (C=S) δC 178,07 và proton δH 5,76, t, J = 9,0 Hz cho phép gán đó là giá trị độ chuyển dịch hóa học của proton H-1, và qua HSQC nhận được tín hiệu cộng hưởng C-1 (δC 81,54). Trên HMBC lại nhận thấy nguyên tử C-1 có tương tác với 2 proton khác đó là proton H-2 (δH 5,26, t, J = 10,0 Hz) và H-5 (δH 4,30, t, J = 6,5 Hz), và qua HSQC tương ứng nhận được C-2 (δC 68,34) và C-5 (δC 71,4). Tương tự chúng tôi gán các giá trị độ chuyển dịch hóa học C-3 (δC 70,29; δH 5,42, dd, J = 4,0; 9,5 Hz), C-4 (δC 67,53; δH 5,34, d, J = 4,0 Hz), và C-6 (δC 61,09; δH 4,04, m) của hợp phần monosaccarid. Bảng 3.4 Dữ kiện phổ 13C NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon R C δC (ppm) 3’-OCH3,4’-OCH3 3’-NO2 2’-NO2 4’-NO2 C=S 178,07 178,69 178,74 178,84 C-1 81,54 81,89 81,84 81,94 C-2 68,34 68,62 68,62 68,67 C-3 70,29 70,50 70,56 70,61 C-4 67,53 67,50 67,46 67,53 C-5 71,51 71,64 71,60 71,71 C-6 61,07 61,23 61,24 61,28 C-1’ 126,40 130,15 133,44 140,21 C-2’ 108,69 135,71 139,00 123,77 C-3’ 149,19 141,58 130,75 128,53 C-4’ 151,01 133,44 128,47 141,23 C-5’ 111,35 124,40 124,58 128,53 C-6’ 122,50 122,06 128,14 123,77 C-c 143,87 148,33 148,44 147,90 CH3CO 20,30-20,48 20,32-20,52 20,32-20,51 20,32-20,51 CH3CO 169,29-170,53 169,33-169,99 169,33-169,99 169,36-170,01 C-khác 55,63 (3’-OCH3) 55,57 (4’-OCH3) Bảng 3.4 Dữ kiện phổ 13C NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R C δC (ppm) 4’-N(CH3)2 3,4-CH2O2 5-Br; 2-OH 3’-OCH3 C=S 177,25 178,02 178,22 178,42 C-1 81,50 81,79 81,85 81,64 C-2 68,50 68,57 68,58 68,45 C-3 70,42 70,63 70,41 70,41 C-4 67,48 67,51 67,53 67,51 C-5 71,38 71,53 71,58 71,48 C-6 61,16 61,25 61,24 61,16 C-1’ 120,77 128,25 128,32 135,11 C-2’ 111,62 105,48 139,04 129,78 C-3’ 128,86 143,60 111,07 159,58 C-4’ 151,65 148,06 122,43 120,77 C-5’ 128,86 108,22 133,81 111,38 C-6’ 111,62 124,45 118,29 116,57 C-c 144,80 149,26 155,94 143,65 CH3CO 20,26-20,45 20,34-20,53 20,35-20,55 20,32-20,50 CH3CO 169,24-170,05 169,35-170,03 169,37-170,11 169,31-170,25 C-khác 20,37; (4’-N(CH3)2 101,54 (3’,4’-CH2O2) 55,26 (3’-OCH3) Bảng 3.4 Dữ kiện phổ 13C NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R C δC (ppm) 2’-OCH3 4’-Cl 3’-OCH3; 4’-OH 3’-OC2H5,4’-OH C=S 178,11 178,53 177,90 177,86 C-1 81,62 81,92 81,54 81,56 C-2 68,55 68,73 68,38 68,39 C-3 70,47 70,68 70,31 70,34 C-4 67,47 67,62 67,55 67,56 C-5 71,47 71,72 71,41 71,44 C-6 61,20 61,37 61,10 61,11 C-1’ 131,79 134,86 125,07 125,03 C-2’ 158,01 128,88 109,58 122,45 C-3’ 126,23 129,36 148,13 147,16 C-4’ 120,56 132,81 149,23 149,56 C-5’ 111,72 129,36 119,26 115,48 C-6’ 121,72 128,88 122,63 111,11 C-c 139,49 142,70 144,28 144,44 CH3CO 20,27-20,46 20,41-20,61 20,32-20,49 20,32-20,48 CH3CO 169,27-170,00 169,51-170,17 169,30-170,53 169.30-170.48 C-khac 55,67 (2’-OCH3) 55,73 (3’-OCH3) 14,68; 63,93 (3’-OC2H5) Bảng 3.4 Dữ kiện phổ 13C NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R C δC (ppm) 4’-CH3 4’-F 4’-Br 3’-OH,4’-OCH3 C=S 178,22 178,35 178,41 177,79 C-1 81,75 81,76 81,77 81,65 C-2 68,63 68,61 68,59 68,63 C-3 70,57 70,55 70,54 70,53 C-4 67,57 67,51 67,48 67,54 C-5 71,59 71,56 71,56 71,55 C-6 61,29 61,24 61,21 61,29 C-1’ 131,03 130,37 133,05 126,51 C-2’ 129,40 129,87; 129,80 131,62 120,70 C-3’ 127,62 115,82; 115,65 129,43 146,74 C-4’ 140,32 164,24; 162,26 123,50 150,03 C-5’ 127,62 115,82; 115,65 129,43 113,31 C-6’ 129,40 129,87; 129,80 131,62 111,78 C-c 144,11 142,67 142,56 144,51 CH3CO 20,35-21,00 20,29-20,48 20,28-20,47 20,33-20,53 CH3CO 169,41-170,13 169.31-169.98 169,27-169,94 169,34-170,04 C-khac 18,53 (4’-CH3) 55,69 (4’-OCH3) Bảng 3.4 Dữ kiện phổ 13C NMR của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon (tiếp theo) R C δC (ppm) 2’-OH 4’-OH 4’-CH(CH3)2 2’-Cl C=S 178,00 177,78 178,17 178,58 C-1 81,70 81,64 81,61 81,82 C-2 68,58 68,61 68,53 68,62 C-3 70,53 70,53 70,46 70,56 C-4 67,53 67,53 67,48 67,50 C-5 71,51 71,51 71,48 71,61 C-6 61,25 61,25 61,18 61,24 C-1’ 131,61 144,31 131,37 133,46 C-2’ 140,96 129,41 126,64 131,57 C-3’ 126,69 115,66 127,62 131,09 C-4’ 116,14 124,68 150,95 127,64 C-5’ 119,33 115,66 127,62 127,34 C-6’ 120,04 129,41 126,64 129,78 C-c 156,74 159,70 143,87 139,80 CH3CO 20,31-20,51 20,31-20,51 20,26-20,45 20,29-20,48 CH3CO 169,34-170,05 169,35-170,09 169,25-170,02 169,29-169,96 C-khac 23,56; 33,34 (4’-CH(CH3)2) Mặt khác trên phổ HMBC chúng tôi nhận thấy proton của nhóm CH=N (δH 8,01; s; δC 143,87) có tương tác với ba nguyên tử cacbon ở δC 108,69; 122,50; 126,40 ppm. Qua HSQC nhận thấy giá trị δC 126,40 tương ứng với nguyên tử C-1’ (cacbon bậc 4). Giá trị δC 122,50 tương ứng với δH 7,21; dd; J = 1,5; 8,0 Hz cho phép gán tại vị trí 6’, và giá trị còn lại δC 108,69 tương ứng với δH 7,43; d; J = 1,5 Hz được quy kết cho nguyên tử cacbon và proton tại vị trí 2’ của nhân phenyl. Tín hiệu proton còn lại của nhân thơm có δH 6,99; d; J = 8,0 Hz tương ứng với δC 111,35 trên HSQC thuộc về nguyên tử hidro ở vị trí 5’ của nhân thơm. Tương tự, từ tương tác nhận được trên phổ HMBC của H-5’ cho phép gán độ chuyển dịch hóa học của C-3’ tại δC 149,19 và còn lại là C-4’ (δC 151,01). Hai nhóm metoxy 3’-OMe (δC 55,63; δH 3,88; s) và 4’-OMe (δC 55,57; δH 3,81; s) được xác định nhờ tương tác tương ứng với nguyên tử C-3’ và C-4’ trên phổ HMBC. Tương tự, chúng tôi có thể quy kết các giá trị độ chuyển dịch hóa học nhận được trên phổ 1H và 13C cho các hợp chất còn lại. Phổ khối lượng ESI-MS nhận thấy pic ion phân tử tại m/z 568 [M-H]-, tương ứng với công thức phân tử của N-(3’,4’-dimethoxyphenyliden)-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazon (C24H31O11N3S). Và từ các dữ kiện phổ IR, cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, và 2 chiều này cho phép khẳng định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp. 3.5. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DẪN XUẤT (2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTOPYRANOSYL)THIOCARBAZON CỦA BENZALDEHYD THẾ 3.5.1. Khả năng kháng trực khuẩn Gram âm Klebsiella pneumonia, cầu khuẩn Gram dương Staphylococcus epidermidis, và nấm men Candida abbicans a) Hoá chất và vi trùng + Hoá chất: 7 mẫu dẫn xuất (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon của benzaldehyd thế cân với một lượng như nhau (0,002gam) pha trong 5ml dung môi DMF. + Môi trường thử: Miieller-Hinton(MH), Sabourous(SBR), thạch tương (TT). + Vi trùng: trực khuẩn Gram-(-) K. pneumonia, cầu khuẩn Gram-(+) S. epidermidis, nấm men C. abbicans. b) Cách làm: Láng vi khuẩn và nấm đã nuôi cấy lên bề mặt của môi trường (MH, SBR, TT) trên đĩa canh thang nuôi cấy qua đêm ở tủ ấm 37oC, đục lỗ và nhỏ thể tích dung dịch tương ứng (25, 50 và 100 ml) dung dịch chất thử, để trong tủ ấm 37oC khoảng 18-24 giờ, sau đó đọc kết quả bằng việc đo đường kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm), phối hợp với các phương pháp tính toán để khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất này. Bảng 3.5. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất benzaldehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazon Kí hiệu mẫu Nhóm thế R Đường kính vòng vô khuẩn Trực khuẩn Gram-(–) Klebsiella pneumonia Cầu khuẩn Gram-(+) Staphylococcus epidermidis Nấm men Candida abbicans 25μl 50μl 100μl 25μl 50μl 100μl 25μl 50μl 100μl 1 o – NO2 0 0 20 0 ↑ 0 ↑ 22 0 ↑ 0 ↑ 26 2 m – NO2 0 15 25 0 ↑ 0 ↑ 20 0 ↑ 0 ↑ 22 3 p – NO2 0 15 20 0 ↑ 0 ↑ 20 0 ↑ 0 ↑ 15 4 p – N(CH3)2 0 16 26 0 ↑ 0 ↑ 15 0 ↑ 0 ↑ 0 ↑ 5 3,4(– O–CH2–O–) 0 16 18 0 ↑ 0 ↑ 20 0 ↑ 0 ↑ 15 6 p – Cl 0 10 20 0 ↑ 0 ↑ 22 0 ↑ 0 ↑ 26 7 2–OH–5–Br 0 12 22 0 ↑ 0 ↑ 20 0 ↑ 0 ↑ 15 Ghi chú: 0 ↑: Không có vòng vô khuẩn nhưng kích thích vi khuẩn phát triển c) Nhận xét chung: Tác dụng kháng trực khuẩn Gram âm K. pneumonia, cầu khuẩn Gram dương S. epidermidis, và nấm men C. abbicans của một số dẫn xuất galactopyranosylthiosemicarbazon được xác định bằng việc đo độ lớn bán kính vòng vô khuẩn theo phương pháp khuếch tán thạch tế bào [28-30]. Kết quả cho thấy, ở thể tích 25 μl (hay ở nồng độ 10 μg/ml) các dẫn xuất trên đều không thể hiện hoạt tính kháng trực khuẩn Gram-(-) K. pneumonia. Điều thú vị ở đây là ở nồng độ này thì các chất không kháng cầu khuẩn Gram-(+) S. epidermidis, nấm men C. abbicans mà kích thích các vi khuẩn này phát triển. Ở thể tích 50 ml (hay nồng độ 20 mg/ml) các dẫn xuất thể hiện hoạt tính sinh học đáng kể với vòng vô khuẩn từ 10 mm đến 16 mm khi thử với trực khuẩn Gram-(–) K. pneumonia trừ dẫn xuất với nhóm thế o-NO2 không có vòng vô khuẩn. Với cầu khuẩn Gram-(+) S. epidermidis và nấm men C. abbicans các dẫn xuất này cũng không có vòng vô khuẩn nhưng kích thích cầu khuẩn Gram-(+) và nấm men phát triển. Ở thể tích 100 ml (hay nồng độ 40 mg/ml) thì hầu hết các dẫn xuất này đều thể hiện hoạt tính sinh học rõ rệt với vòng vô khuẩn tương ứng như sau: kháng trực khuẩn Gram-(-) K. pneumonia với vòng vô khuẩn từ 18 mm đến 26 mm, tất cả các dẫn xuất đều có hoạt tính sinh học; kháng cầu khuẩn Gram-(+) S. epidermidis với vòng vô khuẩn từ 15 mm đến 22 mm; kháng nấm men C. abbicans với vòng vô khuẩn từ 15 mm đến 26 mm trừ dẫn xuất với nhóm thế p-N(CH3)2 ở nồng độ này không có vòng vô khuẩn nhưng kích thích kháng nấm men phát triển. 3.5.2 Tác dụng chống oxi hóa a) Chuẩn bị mẫu. Các dẫn xuất benzandehyd N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl) thiosemicarbazon, và chất chuẩn resveratrol được pha trong etanol thành các dung dịch có nồng độ 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; và 12,0 mM. DPPH được pha trong ethanol thành dung dịch có nồng độ 150 μM bằng cách hòa tan 5,9 mg DPPH trong 100 ml ethanol. b) Phương pháp tiến hành Trên đĩa ELISA 96 giếng, sử dụng micropipet thêm lần lượt 5 µL các dung dịch mẫu thử, chất chuẩn (positive control) đã pha sẵn vào các giếng thử có chứa 195 µL dung dịch DPPH 150 mM. Các giếng chứa mẫu DPPH đối chứng (negative control) được pha bằng cách thêm 5µL ethanol trong 195 µL dung dịch DPPH 150 μM. Mẫu trắng (blank sample) là các giếng chứa 200µL etanol. Lắc nhẹ đĩa cho các dung dịch trộn đều vào nhau và đưa vào buồng ủ ở 25oC trong vòng 30 phút. Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trong các giếng thu được tại bước sóng 518 nm. Thí nghiệm được lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình và tính toán giá trị hiệu quả ức chế của các mẫu thử. c) Kết quả và thảo luận Tác dụng chống oxi hóa của các galactopyranosylthiosemicarbazon được khảo sát dựa theo phương pháp bắt giữ gốc tự do DPPH [31-33]. Phương pháp này được phát triển bởi Blois dựa vào tính bền vững của gốc tự do DPPH. Ở trạng thái gốc tự do, cặp electron tự do trên nguyên tử N được giải tỏa bởi sự liên hợp toàn phân tử. Chính vì vậy, mà nó ít bị dime hóa như các gốc tự do bình thường và có thể tồn tại ở dạng đơn phân tử. Một đặc điểm nữa đó là ở trạng thái gốc tự do, DPPH có màu tím, hấp thụ tử ngoại với băng sóng cực đại trong dung dịch ethanol ở khoảng 518 nm. Khi có mặt chất có khả năng bắt gốc tự do, DPPH sẽ chuyển sang dạng khử và màu tím sẽ nhạt dần, chuyển sang màu vàng nhạt, độ hấp thụ thay đổi. Dựa trên sự khác biệt này người ta có thể tính lượng gốc tự do DPPH bị chuyển sang dạng khử (bị bắt giữ) từ đó cho phép đánh giá giá trị chống oxi hóa của chất thử. Các mẫu thử và chất chuẩn được pha sẵn và khảo sát ở sáu nồng độ khác nhau: 12,5; 25; 50; 100; 200; và 300 µM. Phép thử được tiến hành trên các đĩa ELISA 96 giếng và đo độ hấp thụ (hình 3.4). Giá trị hiệu quả bắt giữ gốc tự do (hiệu quả ức chế) được tính theo công thức: Hiệu quả ức chế (%) = ADPPH - Amẫu ADPPH - Aetanol x 100 Trong đó: ADPPH là giá trị độ hấp thụ của các giếng chỉ chứa dung dịch DPPH Amẫu là giá trị độ hấp thụ của các giếng chứa mẫu, chất chuẩn Aetanol là giá trị độ hấp thụ của các giếng chứa etanol (mẫu trắng) Hình 3.4 Các giếng thí nghiệm sau khi ủ ở 25oC trong 30 phút Từ giá trị hiệu quả ức chế nhận được, xây dựng đồ thị phụ thuộc giữa hiệu quả ức chế và nồng độ chất thử (hình 3.4), xử lý số liệu trên excel và phần mềm GraphPad Prism (version 5.0) để tính toán giá trị % gốc tự do bị bắt giữ 50% (IC50) của mỗi mẫu thử (bảng 3.6). Bảng 3.6 Giá trị hiệu quả bắt giữ 50% gốc tự do (IC50) của các dẫn xuất galactosylthiosemicacbazon R Hiệu quả bắt giữ gốc tự do DPPH (%) IC50 (µM) 12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM 200 µM 300 µM Comp.1 4’-N(CH3)2 14,32 30,86 48,94 68,17 74,54 78.47 56 Comp.2 2’-NO2 6,21 12,03 17,48 29,35 51,18 63.46 215 Comp.3 3’-NO2 7,05 13,74 19,63 26,29 38,31 51.24 283 Comp.4 4’-NO2 6,11 11,32 18,47 29,08 53,30 64.46 210 Comp.5 4’-Cl 7,15 10,09 17,61 19,82 38,37 55.42 270 Comp.6 2’-Cl 3,13 5,43 9,71 14,60 19,39 29.06 >300 Comp.7 4’-F 8,51 13,32 17,08 34,34 55,63 67.19 197 Comp.8 4’-Br 5,38 9,04 17,46 23,51 35,42 44.31 >300 Comp.9 4’-CH3 7,21 12,76 18,06 32,84 53,27 65.03 206 Comp.10 4’-CH(CH3)2 2,17 5,32 9,65 15,09 18,13 24.48 >300 Comp.11 2’-OH 7,18 18,48 29,41 48,37 65,29 72.84 124 Comp.12 4’-OH 11,45 22,61 33,27 49,18 68,74 75.08 108 Comp.13 2’-OCH3 6,84 12,01 18,36 24,23 37,04 57.13 264 Comp.14 3’-OCH3 7,34 11,46 15,63 27,17 34,02 55.07 276 Comp.15 3’,4’-O2CH2 7,03 12,27 19,19 26,38 39,22 59.64 248 Comp.16 3’-OCH3 -4’-OCH3 5,31 8,42 18,16 25,03 34,41 42.30 >300 Comp.17 3’-OCH3 -4’-OH 9,45 27,11 45,64 60,30 71,23 74.05 75 Comp.18 3’-OH -4’-OCH3 8,16 17,43 28,21 40,09 56,80 69.61 182 Comp.19 3’-C2H5 -4’-OH 14,16 30,24 45,38 59,42 68,34 69.16 71 Comp.20 2’-OH -5’-Br 7,84 15,24 18,37 30,17 40,32 58.13 249 Resveratrol 9,13 22,56 33,84 54,03 70,44 75,62 94 Kết quả nhận được cho thấy các hợp chất tổng hợp đều thể hiện khả năng bắt gốc tự do. Trong đó các hợp chất mang nhóm thế 4’-N(CH3)2, 2’-OH, 4’-OH, 3’-OCH3-4’-OH, và 3’-OC2H5-4’-OH có giá trị IC50 tính được thấp hơn, tương đương so với chất chuẩn resveratrol cho thấy các chất này có khả năng bắt giữ gốc tự do mạnh và do đó có khả năng là các chất chống oxi hóa tốt. Như vậy, ta có thể thấy rằng, mạch liên kết NHC(=S)NHN=C< có vai trò như nhóm bắt gốc tự do. Khi các nhóm thế kể trên có mặt thì chúng cũng thể hiên vai trò này, do các cặp electron không chia sẻ ở dị tố. Hiệu quả bắt giữ gốc tự do (%) Nồng độ (µM) Hình 3.5 Sự phụ thuộc của giá trị hiệu quả bắt giữ gốc tự do DPPH vào nồng độ của một số hợp chất thiosemicacbazon Các hợp chất còn lại có giá trị IC50 lớn (250-280 µM) cho thấy khả năng bắt giữ gốc tự do kém hơn, và là các chất có tính chống oxi hóa yếu. Hình 3.5 cho thấy sự phụ thuộc của hiệu quả bắt giữ gốc tự do vào nồng độ chất thử của một số các mẫu thể hiện hoạt tính cao. Đồ thị cho thấy khả năng bắt giữ gốc tự do của các chất này biến đổi mạnh ở nồng độ dưới 100 µM và ít bị biến đổi ở nồng độ 200-300 µM. Do đó các hợp chất này có ý nghĩa chống oxi hóa tốt ở khoảng nồng độ 50-100 µM. KẾT LUẬN 1. Đã tổng hợp được N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-thiosemicarbazid bằng phản ứng của 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl isothiocyanat với hydrazin hydrat. 2. Đã tổng hợp được 20 hợp chất N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazon benzaldehyd thế bằng phản ứng ngưng tụ của N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazid với các benzaldehyd thế trong sự có mặt của xúc tác acid acetic băng trong dung môi ethanol 96% hoặc methanol khan theo hai phương pháp: phương pháp đun hồi lưu truyền thống và hồi lưu trong lò vi sóng. 3. Cấu trúc phân tử được xác định bằng phổ IR, phổ 1H NMR, 13C NMR, kết hợp kĩ thuật phổ 2D NMR (HSQC, HMBC) và phổ khối lượng ESI-MS. 4. Đã thử hoạt tính sinh học của các N-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazon của benzaldehyd thế và nhận thấy rằng phần lớn các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram-(+), Gram-(-) và nấm men. Các chất tổng hợp đều thể hiện khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH, có ý nghĩa chống oxi hóa. Trong đó dẫn xuất thế N(CH3)2, 3-OMe-4-OH, và 3-OEt-4-OH thể hiện hoạt tính tốt hơn cả chất chuẩn resveratrol. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đặng Như Tại (1998), Cơ sở hoá học lập thể, NXB Giáo Dục, Hà Nội, tr.24. 2. Nguyễn Đình Triệu (2000), Các phương pháp phân tích vật lý và hoá lý, Tập 1, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. Tiếng Anh 3. Weng C. C., Micklewright R., Barrett D. A. (1995), “Porous graphitic carbon for the chromatographic separation of O-tetraacetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate-derivatised amino acid enantiomers”, Journal of Chromatography A, Vol. 697(1-2), pp.213-217. 4. Lobell M., Schneider M. P. (1993), “2’,3’,4’,6’-Tetra-O-benzoyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate: An efficient reagent for the determination of enantiomeric purities of amino acids, β-adrenergic blockers and alkyloxiranes by high-performance liquid chromatography using standard reversed-phase columns”, Journal of Chromatography A, Vol.633(1-2), pp.287-294. 5. Ahnoff M., Balmér K., Lindman Y. (1992), “By-products in the derivatization of amines with the chiral reagent 2’,3’,4’,6’-tetra-O-acertyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate and their elimination”, Journal of Chromatography A, Vol.592(1-2), pp.323-329. 6. Witczak Z.J. (1984), “Monosaccharide Isothiocyanates: Synthesis, Chemistry, and Preparative Applications” in “Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry”, Vol. 44, pp. 91 – 145. 7. Erve, J. C. L.; Amarnath, V.; Graham, D. G.; Sills, R. C.; Morgan, A. L.; Valentine, W. M. (1998), “Carbon Disulfide and N,N-Diethyldithiocarbamate Generate Thiourea Cross-Links on Erythrocyte Spectrin in Vivo”, Chem. Res. Toxicol.; 11(5), pp. 544-549. 8. Fuent J., Moreda W., Oriz C. (1992), “Partially Protected D-Gluco-pyranosyl Isothiocyanates, Synthesis and Transformations into Thiourea and Heterocyclic Derivatives”, Tetrahedron, Vol. 48 (31), pp. 6413-6424. 9. Gasteiger J. (Ed.), (2003), Handbook of Chemoinformatics, Vol. 4, Wiley-VCH Press, p.1230. 10. Fuentes J., Molina J. L., Pradera M. A. (1998), “Reactions of per-O-acetylglucosyl isothiocyanate with carbon bases. A new method for the stereocontrolled syntheses of nucleosides and glucosylaminothiophenes”, Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 9(14), pp.2517-2532. 11. Fuentes J., Molina J. L., Olano D., Pradera M. A. (1996), “Stereoselective synthesis of nucleoside analogues of chiral imidazolidines from sugar isothiocyanates”, Tetrahedron: Asymmetry, Vol.7(1), pp. 203-218. 12. Molina J. L., Fernández G., Mellet C. O., Pérez V. M. D., Blanco J. J., Fuentes J. (1996), “Conformational energetics of sugar thioureas and synthesis of glycosyl thioureido sugars”, Tetrahedron, Vol. 52(40), pp. 12947-12970. 13. Kabalka G.W., Mereddy A.R. (2006), “Microwave promoted synthesis of functionalized 2-aminothiazoles”, Tetrahedron Letters, Vol. 47(29), pp. 5171-5172. 14. Aoyama T., Murata S., Nagata Y., Takido T., Kodomari M. (2005), “One-pot synthesis of N-allylthioureas using supported reagents”, Tetrahedron Letters, Vol. 46(29), pp. 4875-4878. 15. Arguello, J. E.; Schmidt, L. C.; Penenory, A. B. (2003), “"One-Pot" Two-Step Synthesis of Aryl Sulfur Compounds by Photoinduced Reactions of Thiourea Anion with Aryl Halides”, Org. Lett. , Vol.5(22), pp. 4133-4136. 16. Dong Y.Y., Venkatachalam T.K., Narla R.K.R.K., Trieu V.N.V.N., Sudbeck E.A.E.A., Uckun F.M.F.M. (2000), “Antioxidant function of phenethyl-5-bromo-pyridyl thiourea compounds with potent anti-HIV activity”, Bioorg. Med. Chem. Lett., Vol. 10(1), pp. 87-90. 17. Dolman, S. J., Gosselin, F., O'Shea, P. D., Davies, I. W. (2006), “Superior Reactivity of Thiosemicarbazides in the Synthesis of 2-Amino-1,3,4-oxadiazoles”, J. Org. Chem, 71(25), pp. 9548-9551. 18. Güniz Küçükgüzel, Ayla Kocatepe, Erick De Clercq, Fikretin Şahin, Medine Güllüce (2006), “Synthesis and biological activity of 4-thiazolidinones, thiosemicarbazides derived from diflunisal hydrazide”, European Journal of Medicinal Chemistry, 41, pp. 353-359. 19. Mei-Hsiu Shih and Fang-Ying Ke (2004), “Syntheses and evaluation of antioxidant of sydnonyl substituted thiazolidinone and thiazoline derivatives”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12, pp. 4633-4643. 20. Samir Ghosh, Anup Kumar Misra, Gitika Bhatia, M. M. Khan, A.K. Khanna (2009), “Syntheses and evaluation of glucosyl aryl thiosemicarbazide and glucosyl thiosemicarbazone derivatives as antioxidant and anti-dyslipidemic agents”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, pp. 386-389. 21. Yu Xin Li, Su Hua Wang, Zheng Ming Li, Na Su and Wei Guang Zhao (2006), “Synthesis of novel 2-phenylsunfonylhydrazono-3-(2’,3’,4’,6’-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiazolidine-4-ones from thiosemicarbazide precursors”, Carbohydrate Research, 341, pp. 2867-2870. 22. Yu Xin LI, Zheng Ming LI, Wei Guang ZHAO, Wen Li DONG, Su Hua WANG (2006), “Synthesis of novel 1-Arylsunfonyl-4-(1’-N-2’,3’,4,6’-tetra-O-acetyl-b-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazides”, Chinese Chemistry Letter, 17(2), pp. 153-155. 23. Fathalla, W.; Pazdera, P. (2008), “Synthesis of new 1-substituted 4-(2-phenylquinazolin-4-yl)-and 4-(2-phenylquinazolin-4-ylidene) thiosemicarbazides”, Chemistry of Heterocyclic Compounds (New York, NY, United States), 44(11), pp. 1374-1378. 24. Gopalakrishnan, M.; Sureshkumar, P.; Thanusu, J.; Kanagarajan, V. (2008), “Unusual formation of N-hydroxy-3,3-dimethyl-2,6-diarylpiperidin-4-one and its thiosemicarbazide derivative-synthesis and antimicrobial activity”, Journal of the Korean Chemical Society, 52(5), pp. 503-510. 25. Tomchin, A. B.; Pastushenkov, L. V.; Pastushenkov, A. L.; Lin'kov, V. I.; Belicheva, E. G.; Ivanov, V. E. (2008), “Thiourea and Thiosemicarbazide Derivatives Structure, Reactions, and Pharmacological Activity. 10. Synthesis and Pharmacological and Pharmacokinetic Properties of the New Antihypoxic and Antisurditant Agent Tompasline”, Pharmaceutical Chemistry Journal, 42(5), pp. 245-254. 26. E. Pretsch, P. Buhlmann, C. Affolter (2000), Structure Determination of Organic Compounds, Tables of Spectral Data, Springer - Verlag, Berlin Heidelberg 27. Donald L. Pavia, Donald L. Pavia (Author) › Visit Amazon's Donald L. Pavia Page Find all the books, read about the author, and more. See search results for this author Are you an author? Learn about Author Central Gary M. Lampman, George S. Kriz, James A. Vyvyan (2008), Introduction to Spectroscopy, 4th edition, Brooks Cole, Thomson Learning. 28. Bal T.R., B. Anand, P. Yogeeswari, D. Sriram (2005), “Synthesis and evaluation of anti-HIV activity of isatin beta-thiosemicarbazone derivatives”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 15(20), pp. 4451-4455. 29. Genova P., T. Varadinova, A.I. Matesanz, D. Marinova, P. Souza (2004), “Toxic effects of bis(thiosemicarbazone) compounds and its palladium(II) complexes on herpes simplex virus growth”, Toxicol. App. Pharmacol., 197(2), pp. 107-112. 30. Kizicikli I., Y.D. Kurt, B. Akkurt, A.Y. Genel, S. Birteksoz, G. Otuk, B. Ulkuseven (2007), “Antimicrobial activity of a series of thiosemicarbazones and their Zn(II) and Pd(II) complexes”, Folia microbol., 52(1), pp. 15-25. 31. Molyneux, Philip. (2004), “The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl ( DPPH ) for estimating antioxidant activity”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 26(2), pp. 211-219. 32. Lee, Hyun Jung; Seo, Jai Woong; Lee, Bong Ho; Chung, Kyoo-Hyun; Chi, Dae Yoon (2004), “Syntheses and radical scavenging activities of resveratrol derivatives”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 14(2), pp. 463-466. 33. Z. Rehacova, V. Koleckar, F. Cervenka and l. Jahodar, L. Saso, L. Opletal, D. Jun and K. Kuca (2008), “DPPH Radical Scavenging Activity of Several Naturally Occurring Coumarins and Their Synthesized Analogs Measured by SIA Method”, Toxicology Mechanisms and Methods, 18, pp. 413-418. (27) 34. Vogel Arthur (1989), A Text-Book of Practical Organic Chemistry, 5th edition, London, 1545 pp. (21) 35. Kureshy, Rukhsana I.; Ahmad, Irshad; Pathak, Kavita; Khan, N. H.; Abdi, Sayed H. R.; Bajaj, H. C.; Suresh, Eringathodi (2009), “Solvent-Free microwave synthesis of aryloxypropanolamines by ring opening of aryloxy epoxides”, Research Letters in Organic Chemistry, Vol 2009. 36. Chichetti, Stephanie M.; Ahearn, Sean P.; Adams, Bruce; Rivkin, Alexey. (2007), “Solvent-free microwave synthesis of novel 6-hydroxypyrimidin-4(1H)-one derivatives using arylmalonates”, Tetrahedron Letters, 48(46), pp. 8250-8252. 37. W. Tan, B.-X. Zhao, L. Sha, et al. (2006), “Microwave-assisted ring opening of epoxides in solvent-free conditions,” Synthetic Communications, vol. 36, no. 10, pp. 1353–1359. 38. C. O. Kappe (2004), “Controlled microwave heating in modern organic synthesis,” Angewandte Chemie International Edition, vol. 43, no. 46, pp. 6250–6284.