- Môi trường decarboxylase (xem công thức pha chế trên nhãn) + 0,5% yeast
extract.
- Thêm 1% amino acid (arginine, lysinevà ornithine) cho các phản ứng.
- Môi trường làm đối chứng không có amino acid.
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 1200C trong 15 phút.
- Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm sau đó phủ lên mỗi ống 0.5ml
parafin tiệt trùng, để trong tủ ấm ở 280C.
49 trang |
Chia sẻ: lylyngoc | Lượt xem: 3864 | Lượt tải: 3
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn aeromonashydrophilatại khoa thủy sản, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ydrophila. Bên cạnh đó tác giả còn sử dụng phương thức
khác để định danh vi khuẩn (bộ kít API 20E, ELISA,…) đồng thời sử dụng các
hóa chất trong nghiên cứu đa số đều ghi hãng cung cấp (Difco, Oxoid,..). Một tài
liệu khác có liên quan đến loài vi khuẩn A. hydrophila là “Bacterial diseases of
fish” (Inglis et al, 1993), các nhà khoa học cũng đưa ra những kết quả định danh
bằng phương pháp truyền thống tương tự của Austin và Austin (1993), nhưng
phần miễn dịch học (về huyết thanh, kháng thể,…) được nghiên cứu sâu hơn.
Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) là đã dùng phương pháp định danh
truyền thống với 41 chỉ tiêu và bộ kít API 20E cho các chủng chuẩn A.
hydrophila để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa. Cùng với việc định danh
này thì theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) cũng đã dùng phương pháp truyền
thống kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý với 41 chỉ tiêu. Nghiên cứu này
có sự kết hợp định danh giữa các chủng vi khuẩn chuẩn và các chủng phân lập thể
hiện mối quan hệ qua sơ đồ gia phả.
Cùng sử dụng phương pháp truyền thống để định danh vi khuẩn A. hydrophila,
các nghiên cứu ở Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ cũng được thực
hiện. Chẳng hạn như, Báo cáo khoa học của Nguyễn Thị Thu Hằng (2005), đề tài
“Khảo sát bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên tôm càng xanh nuôi trong ao và
ruộng lúa mật độ thấp” của Nguyễn Tấn Đạt (2002), luận văn về thử nghiệm
vaccin phòng bệnh xuất huyết trên cá chép của Đoàn Nhật Phương (2001),… Gần
đây, trong Báo cáo khoa học Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) đã sưu tầm và thiết
lập hệ thống lưu trữ các loài vi khuẩn phân lập trên tôm, cá bệnh thu được từ các
đề tài và dư án thực hiện trước tại Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ. Từ
kết quả nghiên cứu trên thu được đa số là hai giống vi khuẩn Vibro và
Aeromonas. Trong đó, các chủng vi khuẩn được định danh trước và sau khi sưu
tập gồm có 11 chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập trên cá chép bị xuất huyết
và 20 chủng Aeromonas sp. phân lập từ tôm càng xanh bị cụt râu và mòn phụ bộ.
Ngoài ra, còn có rất nhiều tác giả nghiên cứu loài vi khuẩn này như: Đỗ Thị Hòa
và ctv (2004), Bùi Quang Tề (2006), Từ Thanh Dung và ctv (2005),…
Bên cạnh phương pháp định danh truyền thống vi khuẩn như của Baumann et al
(1984), phương pháp này đã được dùng phổ biến nhưng tốn nhiều công và môi
trường để chuẩn bị ngoài ra thời gian kiểm tra cũng kéo dài, nên người ta đã sử
dụng nhiều phương pháp kiểm tra nhanh khác (API-zym, API-NFT, API-RE, API
20E,…). Trong đó, hệ thống kiểm tra nhanh API 20E do phương pháp sử dụng
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 10
đơn giản và tiết kiệm được thời gian nên hiện nay đang được sử dụng phổ biến
trong các phòng thí nghiệm (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005).
Kozinska et al (2002) dùng bộ kít API 20E để định danh các chủng vi khuẩn
Aeromonas như A. hydrophila, A. caviae và A. sobria, các chủng này được phân
lập từ cá chép. Ngoài ra, Kara et al (2000) cũng định danh vi khuẩn A.
hydrophila, A. caviae và A. sobria trên cá hồi. Ông cũng đã so sánh với kết quả
định danh sinh hóa trên ống nghiệm và cho rằng hệ thống này có thể dùng để
phân lập Aeromonas đối với các chủng A. hydrophila, A. caviae và A. sobria
(trích dẫn của Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005). Tuy nhiên, theo Buler (2004)
phương pháp này chưa được tối ưu trong việc định danh vi khuẩn Aeromonas.
Theo ông với loài vi khuẩn Aeromonas thì cần thêm một số chỉ tiêu như:
aesculin, MR và salicin thì kết quả sẽ tương đối chính xác hơn.
Ngoài hai phương pháp định danh vi khuẩn nêu trên, hiện nay có khá nhiều kỹ
thuật phân tử được cải tiến và ứng dụng trong định danh nhóm Aeromonas.
Phương pháp thường được sử dụng nhất là xác định kiểu ARN ribosom
(ribotyning) hay xác định độ dài đa hình các đoạn giới hạn (Restriction Fragment
Length Polymorphism-RFLP), phản ứng trùng hợp (PCR) 16S DNA ribosom,
tính đa hình chiều dài những đoạn khuếch đại (Amplified Fragment Length
Polymorphism- AFLP) và thể đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphic DNA-RAPD) (Laganowska et al, 2004, trích dẫn của Đặng Thị
Hoàng Oanh, 2006).
Gần đây nghiên cứu kỹ thuật multiplex-PCR (m-PCR) đang được phát triển và
ứng dụng do đặc điểm phát hiện đồng thời nhiều loại mầm bệnh vi khuẩn khác
nhau và tiết kiệm thời gian lẫn chi phí. Từ nghiên cứu của Wang et al (2003)
phát hiện đặc tính của hai gen hemolysin (aerolysin và hemolysin) có khả năng
gây bệnh của hai loài A. hydrophila và A. sorbia bằng phương pháp m-PCR. Năm
2007, Panangala et al đã công bố phương pháp m-PCR có thể xác định cùng lúc
cả ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đó là Flavobacterium columnare (504bp),
Edwardsiella ictaluri (407bp), và Aeromonas hydrophila (209bp). Điều này sẽ
góp phần tăng khả năng phát hiện bệnh trên đối tượng thuỷ sản nhằm giảm thiệt
hại tối thiểu cho người nuôi, đặc biệt là khi tốc độ tăng diện tích và mật độ nuôi
ngày càng tăng nhanh thì sự gia tăng mầm bệnh cũng tăng nhanh theo tỉ lệ thuận.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 11
PHẦN 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh
Thủy sản - Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: từ tháng 01 đến tháng 05 năm 2008.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,
Đĩa petri, ống nghiệm,
Ống đong, lame, lamella,
Chai nấu môi trường, bình tam giác,
Cá từ, pipet, đầu cole, ống hút, găng tay,
Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v….
3.2.2 Thiết bị
Kính hiển vi,
Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy,
Bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng,
Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, máy ủ nhiệt, máy so màu quang phổ,…
Cân điện tử, lò viba, bộ điện di….
Các thiết bị khác, v.v….
3.2.3 Hóa chất, thuốc thử và môi trường để kiểm tra các chỉ tiêu hình thái,
sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn
Cồn 700, cồn 960.
Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: tryptone soya agar (TSA;
Merck), nutrient broth (NB; Merck) và Aeromonas agar (500ml agar + 1lọ
ampicilin) (Oxoid).
Bộ kít API 20E (bộ test + thuốc thử: TDA, IND, VP) (BIO MÉRIEUX).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 12
3.2.3.1 Môi trường và thuốc thử dùng thực hiện các phản ứng sinh hóa theo
phương pháp truyền thống
Môi trường
Các môi trường đường (glucose, arabinose, cellobilose, galactose,
glycerol, lactose, manitol, salicin, sucrose, xylose, trehalose) (Merck) dùng
để kiểm tra khả năng lên men của vi khuẩn.
Môi trường OF (Merck) dùng để kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men của
vi khuẩn.
Môi trường thạch muller hinton agar (MHA; Merck) dùng cho phản ứng
O/129 để phân biệt 2 giống vi khuẩn Vibrio và Aeromonas.
Môi trường thạch simon citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử
dùng nguồn cacbon của vi khuẩn.
Môi trường thạch dưỡng (NA-nutrient agar; Merck) + 0,5% starch (Merck)
dùng để kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột.
Môi trường MR-VP (voges proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP.
Môi trường nutrient broth (NB; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh
indole.
Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid
amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử
amino acid.
Môi trường 0,1% pepton (Himedia) + 0,2% KH2PO4 (Merck) + 0,0012%
phenol red (Merck) + 0,1% glucose + 2% ure (Merck) dùng kiểm tra khả
năng sử dụng urea của vi khuẩn.
Môi trường triple sugar iron (TSI; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh khí
H2S của vi khuẩn.
Môi trường trypton broth (Merck) + 1% hay 3%,...NaCl (Merck) dùng
kiểm tra khả năng chịu đựng ở các nồng độ muối.
Thuốc thử
Dung dịch H2O2 3% cho phản ứng catalase.
Que thử Oxidase (Merck).
Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck).
Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole.
Thuốc thử Lugol’s Iodine (cách pha được trình bày ở phần Phụ lục) cho
khả năng thủy phân tinh bột (starch).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 13
Thuốc thử cho phản ứng VP.
Các dung dịch nhuộm Gram.
3.2.4 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR
LB (10g tryptone, 5g yeast extract và 5g sodium chloride, trong 1L nước
cất ).
TE (pH 8.0) gồm 10mM Tris HCl và 1mM EDTA.
Hóa chất dùng trong khuếch đại DNA: Bufer 10X, MgCl2, dNTPs
(10mM), Taq polymerase (5u), mồi, nước cất 2 lần.
Dung dịch nạp mẫu 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy diện
di TAE (Tris HCl:acetate:EDTA).
3.2.5 Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Chủng chuẩn : 1chủng (LMG 2844- ngân hàng gen của Bỉ).
Chủng tham khảo: 7 chủng từ bộ sưu tập vi khuẩn của Khoa Thủy sản, Đại
học Cần Thơ.
Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn
Mã mới Mã cũ Nguồn gốc
CAF 2
CAF23
CAF25
CAF131
CAF132
CAF133
CAF134
CAF135
A.hydrophila LMG 2844
V402
V425
60
Lei.1.10.99
BSL3172000
69 (Tam 2L)
BSK
Ngân hàng gen Bỉ
CAF
CAF
CAF
CAF
CAF
CAF
CAF
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Phục hồi vi khuẩn: dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy lên môi trường TSA. Đem ủ ở
28oC trong 18-24 giờ kiểm tra kết quả.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống
nghiệm chứa 5 ml NB đặt lên máy lắc 200 vòng/phút sau 18- 24 giờ. Kiểm tra kết
quả.
Mỗi chỉ tiêu kiểm tra sinh hóa được lặp lại 3 lần.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 14
3.3.1 Định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp truyền
thống
Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa: được chọn để định danh dựa theo hệ
thống phân loại của Baumann et al (1984). Các đặc điểm sinh lý sinh hóa được
xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và
phương pháp của West và Colwell (1984).
Các chỉ tiêu về hình thái
- Hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc.
- Khả năng di động của vi khuẩn.
- Nhuộm gram để kiểm tra tính ròng của vi khuẩn.
Các chỉ tiêu về sinh lý
- Phản ứng oxidase.
- Phản ứng catalase.
- Khả năng phát triển của vi khuẩn ở 0%, 3%, 6%, 7% và 10% NaCl.
Các chỉ tiêu về sinh hóa
- Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose.
- Khả năng tạo acid từ các loại đường: glucose, arabinose, cellobilose,
galactose, glycerol, lactose, manitol, salicin, sucrose, xylose, trehalose.
- Khả năng sinh khí từ glucose và tạo H2S.
- Khả năng thủy phân tinh bột.
- Khả năng lên men β-galactosidase (ONPG).
- Khả năng sử dụng citrate.
- Khả năng sinh indole.
- Phản ứng VP (voges- proskauer).
- Khả năng sử dụng amino acid: arginine, lysine và ornithine.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 15
3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E
Kiểm tra các các phản ứng sinh lý và sinh hóa của A. hydrophila sử dụng bộ kít
API 20E của hãng BIO MÉRIEUX.
Các chỉ tiêu cơ bản (hình dạng, khả năng di động, osidase, catalase và phản ứng
O/F) được thực hiện trước khi sử dụng bộ kít API 20E.
Phương pháp thực hiện
Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm trong quá trình ủ
trong tủ ấm.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh
lý tiệt trùng, lắc đều.
Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô
của bộ test.
Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT, VP và
GEL thì nhỏ đầy và 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho paraffin tiệt
trùng vào.
Ủ trong tủ ấm ở 280C và đọc kết quả sau 24 giờ.
Đọc kết quả
TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện cho phản ứng dương
(+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện cho
phản ứng dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
VP: Thêm một giọt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 phút,
màu hồng hoặc màu đỏ xuất hiện cho phản ứng dương (+). Nếu màu hồng nhạt
xuất hiện trong vòng 10-12 phút, được coi là phản ứng âm (-).
Các chỉ tiêu còn lại không cần sử dụng thuốc thử thì đọc kết quả dựa vào bảng
bên dưới (Bảng 3.2).
Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 16
Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kit API 20E
Chỉ tiêu Âm tính Dương tính
ONPG Không màu Vàng
ADH Vàng Đỏ/cam
LDC Vàng Đỏ/Cam
ODC Vàng Đỏ/Cam
CIT Vàng Xanh/xanh lá
H2S Không màu Đen
URE Vàng Đỏ/cam
TDA Vàng Nâu sậm
IND Vàng Đỏ (2 phút)
VP Không màu Hồng/đỏ (10 phút)
GEL Không màu (còn kết tủa đen) Đen
GLU Xanh/xanh lá Vàng
MAN Xanh/xanh lá Vàng
INO Xanh/xanh lá Vàng
SOR Xanh/xanh lá Vàng
RHA Xanh/xanh lá Vàng
SAC Xanh/xanh lá Vàng
MEL Xanh/xan lá Vàng
AMY Xanh/xanh lá Vàng
ARA Xanh/xanh lá Vàng
Ghi chú: ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: arginine dihydrolase; LDC:
lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: sinh H2S; Urea:
ure; TDA: tryptophane deaminase; IND: indole; VP: phản ứng Voges- Proskauer; GEL:
gelatin; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose;
SAC: sucrose; MEL: melibiose; AMY: amygdaline; ARA: arabinnose.
Mỗi chủng vi khuẩn được lặp lại ba lần.
3.3.3 Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp PCR
Chiết tách acid nucleic (Bartie et al, 2006)
Nuôi tăng sinh vi khuẩn (16-18 giờ) trong 5ml LB.
Rút 1,5ml dung dịch vi khuẩn và 100µl TE (10mM Tris HCl và 1mM
EDTA) vào ống eppendorf.
Đun ở 950C trong vòng 15 phút.
Làm lạnh trong nước đá.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 17
Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. Rút phần dung dịch cho vào ống
eppendorf mới (trữ ở -20 ºC nếu chưa sử dụng). Đo hàm lượng DNA
(OD=260nm).
Khuyếch đại DNA (theo Panangala et al (2007) có chỉnh sửa)
Thành phần cho phản ứng
Mồi sử dụng cho phản ứng gen Aerolysin
AeroFd CCAAGGGGTCTGTGGCGACA
AeroRs TTTCACCGGTAACAGGATTG
Bảng 3.3: Thành phần 25µl tham gia 1 phản ứng PCR
STT Thành phần tham gia phản ứng Hàm lượng
1 PCR Buffer 10 X
2 MgCl2 1.5 mM
3 dNTPs 200 µM
4 Taq DNA polymerase 5 U
5 Đoạn mồi (AeroFd) 0.5 µM
6 Đoạn mồi (AeroRs) 0.5 µM
7 Mạch khuôn 20 ng
8 Nước cất -
Chu kỳ nhiệt (Hình 3.1)
Làm biến tính DNA ở 95oC trong 4 phút.
Lặp lại chu kỳ 30 lần: Giai đoạn biến tính ở 950C trong 30 giây, giai đoạn gắn
mồi 520C trong 45 giây, giai đoạn kéo dài chuỗi 720C trong 30 giây.
Tổng hợp cuối ở 72oC trong 7 phút.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 18
30 chu kỳ
95 0C 95 0C
4’:00 0’:30 72 0C 72 0C
0’:30 7’:00
52 0C (0’:45)
Hình 3.1. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR theo quy trình
Panangala et al (2007) có chỉnh sửa.
Kỹ thuật điện di
Dùng dòng điện một chiều, quá trình điện di được thực hiện với dung dịch
TAE 0,5X và bản thạch (gel) chứa 1,5% agarose.
Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn. Sau đó để du g dịch nguội
khoảng 50-600C cho ethium bromide vào và đổ agarose vào khay. Thể tích
gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Độ dày của gel chỉ cần cao
hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá 0,8cm.
Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel.
Dùng pipette hút 10µl lần lượt cho thang DNA, đối chứng âm (nước cất)
và mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X dung dịch nạp mẫu vào từng
giếng một. Sử dụng thang DNA để xác định khối lượng phân tử của sản
phẩm PCR. Sử dụng dòng điện từ 80-120V. Ngừng điện di khi màu xanh
đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel (trong khoảng từ 40-50 phút)
Đọc kết quả
Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả.
Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat.
Căn cứ vào thang DNA 1kb plus (Invitrogen) để xác định trọng lượng
phân tử.
Mẫu hiện vạch 209bp là mẫu dương tính với Aeromonas hydrophila
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 19
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả
Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila trong đề tài (1 chủng chuẩn và 7
chủng tham khảo) sau khi phục hồi từ tủ âm 800C của Khoa Thuỷ sản – Trường
Đại học Cần Thơ, kiểm tra tính ròng qua kết quả nhuộm gram, các chỉ tiêu cơ bản
gồm hình dạng, khả năng di động, oxidase, catalase và và phản ứng O/F cho cả
hai phương pháp định danh (truyền thống và API 20E).
4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn A.
hydrophila xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
Kiểm tra các đặc điểm sinh lý sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan
và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp của West và Colwell (1984).
Mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần
lặp lại. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn A.
hydrophila trong đề tài được trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của chủng vi khuẩn chuẩn và 7
chủng tham khảo
VI KHUẨN
CHỈ TIÊU
CAF2
Chủng
chuẩn
CAF
23
CAF
25
CAF
131
CAF
132
CAF
133
CAF
134
CAF
135
Gram - - - - - - - -
Hình dạng
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Sinh sắc tố - - - - - - - -
Di động + + + + + + + +
Catalase + + + + + + + +
Oxidase - - - - - - - -
Phản ứng lên men yếm khí + + + + + + + +
Phản ứng lên men hiếu khí + + + + + + + +
Arginine + - - + + + + +
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 20
Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính
Theo bảng kết quả test các chỉ tiêu sinh hoá (Bảng 4.1), các dòng vi khuẩn A.
hydrophila đều là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn (Hình 4.1), di động, catalase
dương tính, oxidase âm tính và có khuẩn lạc dạng tròn, nhẵn (Hình 4.2). Vi khuẩn
A. hydrophila có khuẩn lạc dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và màu vàng nhạt khi phát
Lysine + + + + + + + +
Ornithine + + + + + + + +
H2S - - - - - - - -
Urease - - - + + - + -
VP + + + + + + + +
Citrate + + + + + + + +
Indole + + + + + + + +
Starch + + + + + + + +
O/129 - - - - - - - -
ONPG + + + + + + + +
0% NaCl + + + + + + + +
3% NaCl + + + + + + + +
6% NaCl + + + + + + + +
7% NaCl - - - - - - - -
10% NaCl - - - - - - - -
Gas glucose + + + + + + + +
Glucose + + + + + + + +
Arabinose + + + + + + + +
Cellobiose + + + + + + + +
Galactose + + + + + + + +
Mannitol + + + + + + + +
Salicin + + - + + + + +
Sucrose + + + + + + + +
Xylose + + + + + + + +
Glycerol + + + + + + + +
Trehalose + + + + + + + +
Lactose + + + + + + + +
Aeromonas agar
Klạc
vàng
Klạc
vàng
Klạc
xanh
Klạc
vàng
Klạc
vàng
Klạc
vàng
Klạc
vàng
Klạc
vàng
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 21
triển trên môi trường Aeromonas agar (Hình 4.3). Đồng thời, vi khuẩn A.
hydrophila cũng vừa có khả năng lên men yếm khí vừa có khả năng lên men hiếu
khí. Ngoài ra, đặc tính phân bố rộng muối của loài vi khuẩn này được thể hiện ở
khả năng phát triển được ở các nồng độ muối 0-6%.
Hình 4.1 Hình dạng A. hydrophila (100X)
Hình 4.2 A. hydrophila trên môi trường TSA
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 22
Hình 4.3 A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar
Aeromonas hydrophila trong đề tài hầu như đều sử dụng citrate (Hình 4.4), có
khả năng lên men β-galactosidase và dịch hóa được amylase. Tuy nhiên, chúng
không có khả năng sử dụng ure. Ngoài ra, chúng còn có khả năng lên men nhiều
loại đường (glucose, mannitol, sucrose, lactose,….), sinh gas từ glucose nhưng lại
không sinh khí H2S. Bên cạnh đó, chúng có khả năng sinh indole (Hình 4.6) và
cho phản ứng dương tính với VP (Hình 4.5), arginine, lysin và cả ornithin.
Hình 4.4 Phản ứng citrate (+)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 23
Hình 4.5 Phản ứng VP (+)
Hình 4.6 Phản ứng indole (+)
So với chủng chuẩn, chủng CAF23 và CAF25 sai khác ở chỉ tiêu arginine (-),
chủng CAF25 là chủng duy nhất sai khác là đường salicin (-) và biểu hiện màu
khuẩn lạc cũng như làm thay đổi môi trường Aeromonas agar (xanh). Còn 3
chủng CAF131, CAF132 và CAF134 có sự dao động là chỉ tiêu ure (+). Các dòng
còn lại đều có kết quả định danh giống với dòng chuẩn.
4.1.2 Kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn A. hydrophila theo bộ kít API 20E
Cùng với việc kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa bằng phương pháp truyền
thống của A. hydrophila phương pháp sử dụng bộ kít API 20E cũng được áp dụng
đồng thời nhằm so sánh kết quả giữa 2 phương pháp này. Kết quả kiểm tra các
chỉ tiêu cơ bản giống với kết quả ở phương pháp truyền thống (Bảng 4.1) và kết
quả API 20E được thể hiện ở Bảng 4.2.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 24
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra bằng bộ kít API 20E chủng chuẩn và 7 chủng tham
khảo
VI KHUẨN
CHỈ TIÊU
CAF2
Chủng
chuẩn
CAF
23
CAF
25
CAF
131
CAF
132
CAF
133
CAF
134
CAF
135
Gram - - - - - - - -
Hình dạng
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Que
ngắn
Sinh sắc tố - - - - - - - -
Di động + + + + + + + +
Catalase + + + + + + + +
Oxidase - - - - - - - -
Phản ứng lên men yếm khí + + + + + + + +
Phản ứng lên men hiếu khí + + + + + + + +
ONPG + + + + + + + +
ADH - - + - - - - -
LCD + + - + + + + +
OCD - - + - - - - -
CIT + + + + + + + +
H2S - - - - - - - -
URE - - - + + - + -
TDA - - - - - - - -
IND + + + + + + + +
VP + + + + + + + +
GEL - - - - - - - -
GLU + + + + + + + +
MAN + + + + + + + +
INO + + - + + + + +
SOR + + + + + + + +
RHA + + + + + + + +
SAC + + + + + + + +
MEL + + + + + + + +
AMY + + + + + + + +
ARA + + + + + + + +
Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính
ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: arginine dihydrolase; LDC: lysine
decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: sinh H2S; Urea: ure;
TDA: tryptophane deaminase; IND: indole; VP: phản ứng Voges- Proskauer; GEL:
gelatin; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose;
SAC: sucrose; MEL: melibiose; AMY: amygdaline; ARA: arabinnose.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 25
Dựa trên kết quả định danh API 20E (Bảng 4.2), tất cả các chủng kiểm tra đều
không có khả năng thủy phân gelatin nhưng lại có khả năng tạo men β-
galactosidase (ONPG). Chúng còn cho phản ứng dương tính với citrate và VP.
Ngoài ra, chúng cũng có khả năng sinh indole nhưng lại không sinh H2S và cho
phản ứng âm tính với tryptophane. Đặc biệt, tất cả các kết quả lên men các loại
đường (glucose, manitol, sorbitol, rhamnose,…) đều cho kết quả dương tính.
Các chủng vi khuẩn trên hầu như có đặc điểm sinh hóa trong kết quả kiểm tra API
20E là giống nhau. Ngoại trừ, có chủng CAF 25 biến động nhiều nhất 4 chỉ tiêu
so với chủng chuẩn (ADH, LCD, OCD và INO). Bên cạnh đó, có 3 chủng
(CAF131, CAF 132 và CAF 134) cho phản ứng dương với chỉ tiêu URE ngược
với chủng chuẩn là âm tính. Các chủng còn lại (CAF 23, CAF 133 và CAF 135)
cho kết quả kiểm tra ở tất cả các chỉ tiêu đều trùng với chủng chuẩn (Hình 4.7 ).
(a)
(b)
Hình 4.7 Kết quả định danh API 20E của dòng CAF2 (a) và dòng CAF25 (b)
Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính
1: Ortho-nitrophenyl galactosidase (+); 2: Arginine dihydrolase((a): (-); (b): (+)); 3:
Lysine decarboxylase ((a): (+); (b): (-)); 4: Ornithine decarboxylase ((a): (-); (b): (+));
5: Citrate (+); 6: Sinh H2S (-); 7: Ure (-); 8: Tryptophane deaminase (-); 9: Indole (+);
10: Phản ứng Voges- Proskauer (+); 11: Gelatin (-); 12: Glucose (+); 13: Mannitol (+);
14: Inositol ((a): (+); (b): (-)); 15: Sorbitol (+); 16: Rhamnose (+); 17: Sucrose (+); 18:
Melibiose (+); 19: Amygdaline (+); 20: Arabinnose (+).
4.1.3 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR
Sử dụng phương pháp PCR cho 5 chủng nghiên cứu (CAF2, CAF 25, CAF 131,
CAF 133 và CAF 134) nhưng sản phẩm không đặc hiệu cho A. hydrophila (không
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 26
hiện vạch ở 209bp) hoặc không có sản phẩm (Hình 4.8). Hai chủng CAF 2 (chủng
chuẩn; giếng 5) và chủng CAF 25 (giếng 6) cho sản phẩm không đặc hiệu. Các
chủng còn lại không có sản phẩm (giếng 1, 2 và 3).
Ghi chú:
Giếng M: thang đo DNA 1kb plus (Invitrogen)
Giếng 1: Đối chứng âm (nước cất)
Giếng 2: CAF 131
Giếng 3: CAF 133
Giếng 4: CAF 134
Giếng 5: CAF 2
Giếng 6: CAF 25
Hình 4.8 Kết quả điện di 5 chủng A. hydrophila
4.2 Thảo luận
Qua quá trình kiểm tra vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp định danh
truyền thống (36 chỉ tiêu) và API 20E (28 chỉ tiêu), các chỉ tiêu dùng kiểm tra A.
hydrophila ở 2 phương pháp giống nhau. Tuy nhiên, một số chỉ tiêu (GEL, MEL,
SOR, RHA và AMY) có trên bộ kit API 20E do điều kiện không cho phép nên
không thực hiện trong phương pháp truyền thống.
Bên cạnh kết quả các chỉ tiêu giống hay khác với các nghiên cứu trước đây thì chỉ
tiêu khác quan trọng nhất là chỉ tiêu cơ bản oxidase cho kết quả âm tính. Kết quả
này có thể là do vi khuẩn trữ quá lâu trong tủ -800C làm vi khuẩn trở nên biến
200 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 27
tính hoặc quá yếu để cho phản ứng dương tính với oxidase.
Kết quả ở hầu hết các chủng vi khuẩn đều thể hiện giống nhau chỉ sai khác một
vài chỉ tiêu so với chủng chuẩn ở một số chủng. Chẳng hạn như dòng CAF 23 và
CAF 25 có kết quả kiểm tra theo phương pháp truyền thống là arginine âm tính,
trong khi đó dòng chuẩn CAF 2 (LMG 2844) lại cho kết quả dương tính. Theo
ghi nhận của Abbott et al (2003), A. hydrophila có 25/25 dòng kiểm tra có khả
năng phân giải arginine. Cùng với phương pháp định danh truyền thống trong
nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2006), Nguyễn Thị Thu Hằng (2005) và
Nguyễn Tấn Đạt (2002) cũng cho phản ứng dương tính với chỉ tiêu arginine.
Ngoài ra, trong quá trình kiểm tra cũng có 3 chủng (CAF 131, CAF 132 và CAF
134) khác biệt khả năng sử dụng urea khác với dòng chuẩn cũng như với các
dòng khác là cho kết quả dương tính ở cả hai phương pháp. Theo các tài liệu
nghiên cứu trước đây của Đặng Thị Hoàng Oanh (2006), Nielsen et al (2001),
Autin và Autin (1993), thì A. hydrophila không có khả năng sử dụng urea.
Mặt khác, đối với phương pháp truyền thống ở chỉ tiêu lactose, xylose và
ornithine đều dương tính ở tất cả các chủng nghiên cứu, điều này khác với các
nghiên cứu trước đây của Đặng Thị Hoàng Oanh (2006), Buller (2004) và nhiều
tác giả khác. Trong khi đó, các chủng sử dụng trong đề tài của Đoàn Nhật Phương
(2001) lại cho rằng A. hydrophila có khả năng lên men đường lactose và xylose.
Ngoài ra, trong ghi nhận của Nguyễn Tấn Đạt (2002) thì loài vi khuẩn này có
phản ứng dương tính với chỉ tiêu ornithine.
Sự khác biệt được nêu trên có thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Có thể là do mỗi
tác giả sử dụng cách lưu trữ các chủng chuẩn cũng như các chủng tham khảo khác
nhau. Ngoài ra, loài vi khuẩn ở những vùng địa lí khác nhau và nguồn cung cấp,
sử dụng hóa chất cho các chỉ tiêu phản ứng khác nhau hoặc tùy thuộc vào người
thực hiện nên từ đó thể hiện kết quả khác nhau. Các hóa chất sử dụng trong đề tài
này đa số đều là từ hãng Merck cung cấp, còn một số đề tài trước đây (Nguyễn
Tấn Đạt (2002), Đoàn Nhật Phương (2001),…) không ghi nhận được nguồn gốc
hóa chất nên đây có thể là trong những nguyên nhân kết quả khác biệt. Thật vậy,
khi sử dụng hóa chất không đảm bảo (về chất lượng, về hạn sử dụng,…) cũng sẽ
ảnh hưởng ít nhiều đến kết quả định danh vi khuẩn.
Các chỉ tiêu khi sử dụng các phương pháp khác nhau để định danh đã được Buler
(2004) cho rằng sai khác kết quả là do áp dụng phương pháp khác nhau hoặc do
sai sót trong quá trình định danh. Các kết quả giữa các dòng A. hydrophila ghi
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 28
nhận ở 2 phương pháp chỉ khác nhau ở một số chỉ tiêu của phản ứng
decarboxylase. Chỉ tiêu khác biệt giữa hầu hết các dòng vi khuẩn là ornithin và
arginine, trong phương pháp truyền thống cho kết quả dương tính (+), còn ở
phương pháp API 20E lại cho kết quả âm tính (-) (Hình 4.2a). Tuy nhiên, kết quả
của ornithin từ API 20E và kết quả của arginine từ phương pháp truyền thống lại
giống với kết quả của Abbott et al (2003). Điều này có thể giải thích, các chỉ tiêu
cho phản ứng trong phương pháp truyền thống là do tự pha chế, còn API 20E là
bộ kít có sẵn và được nghiên cứu điều kiện thích hợp cho phản ứng mà nhà sản
xuất yêu cầu là 30-370C còn thực hiện trong phòng thí nghiệm là 280C, vì thế sự
khác nhau có thể chấp nhận được (Popovic et al, 2007).
Như vậy khi sử dụng hai phương pháp truyền thống và API 20E trong cùng điều
kiện phòng thí nghiệm ở nghiên cứu này so sánh các chỉ tiêu giống nhau thì thể
hiện kết quả gần như là giống nhau. Chỉ có sự khác nhau là hai chỉ tiêu arginine
và ornithine của phản ứng decarboxylase. Mặc dù ở một vài chỉ tiêu chưa đúng
với đặc tính của A. hydrophila cũng như khác hẳn với rất nhiều nghiên cứu trước
nhưng kết quả của hai phương pháp này đều thể hiện kết quả như nhau. Điều đó
cho thấy ít có sự sai khác giữa hai phương pháp trên.
Sau khi kiểm tra kết quả định danh bằng PCR, kết quả không có sản phẩm đặc
hiệu hiện ở vạch 209bp. Mặc dù kết quả chưa rõ ràng nhưng cũng không thể nói
rằng các chủng nghiên cứu không phải là A. hydrophila. Có thể là do điều kiện
cho phản ứng PCR chưa phù hợp trong việc phát hiện A. hydrophila ở điều kiện
phòng thí nghiệm hiện tại hoặc do các yếu tố khác như nhiệt độ gắn mồi, thành
phần phản ứng PCR chưa phù hợp,…. Ngoài ra, trong nghiên cứu Nielsen et al
(2001) về xác định loài A. hydrophila phân lập trên cá chình bệnh ở Trung Quốc
cũng có xảy ra hiện tượng một số dòng vi khuẩn có chỉ tiêu cellobiose dương tính
lại không cho kết quả PCR dương tính.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 29
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết luận
- Đã kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hoá 8 chủng A. hydrophila
bằng phương pháp truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E. Hai phương pháp
thể hiện kết quả giống nhau ở hầu hết các chỉ tiêu trừ chỉ tiêu arginine và
ornithine.
- Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra bằng phương pháp PCR chưa cho sản
phẩm đặc hiệu.
- Các chủng tham khảo tuy có một số chỉ tiêu khác với chủng chuẩn (CAF 2)
nhưng có thể sử dụng làm chủng tham khảo, bao gồm các chủng CAF 23,
CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 và CAF 135.
5.2 Đề xuất
- Cần so sánh thêm nhiều chủng chuẩn và chủng tham khảo A. hydrophila để có
kết quả chính xác hơn.
- Tối ưu phương pháp PCR để có sản phẩm PCR đặc hiệu với mồi.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abbott, S.L., W.K.W. Cheung and J.M. Janda. 2003. The Genus
Aeromonas: Biochemical Characteristics, Atypical Reactions, and
Phenotypic Identification Schemes. Journal of Clinical Microbiology, p.
2348-2357, Vol. 41, No. 6.
2. Austin, B. and D.A. Austin. 1993. Bacterial fish pathogens: Disease in
farmed and wild fish, 2nd edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester. 384 pp.
3. Bartie, K., Đ. T. H. Oanh, G. Huy, C. Dickson, M. Cnockaert, J. Swings,
N. T. Phương, A. Teale. 2006. Ứng dụng REP-PCR và PFGE để định dạng
vi khuẩn kháng chloramphenicol. Tạp chí Công nghệ sinh học 4 (1): p31-
40.
4. Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản - Khoa Thủy sản, Trường Đại học
Cần Thơ, 2007. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh
học thủy sản. 63 trang.
5. Bùi Quang Tề và Phạm Thị Yên. 2002. Báo cáo về bệnh cá sông nuôi lồng
ở Vịnh Hạ Long.
6. Bùi Quang Tề. 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. Nhà xuất
bản Nông nghiệp Hà Nội. 112 trang
7. Barrow, G. I. and R. K. A. Feltham. 1993. Cowan and Steel ‘s manual for
the indentification of medical bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity
Press, Cambridge. 262 pp.
8. Baumann, P. A. L. Furnss and J. V. Lee. 1984. Genus 1 Vibrio pacini
1854, 411 al. 518-538 pp. In: Krieig, N. R. and J. G. Holt (eds). Bergeyf’s
manual of systematic bacteriology, Volume1. William and Wilkin
Baltimore.
9. Buller, N. B. .2004. Bacteria from fish and other aquatic animal: A
practical indentification manual. CABI publishing. 353 pp.
10. Chowdhury, Md.B.R, 1998. Bacteria in fish disease in Bangladesh.
department of aquaculture, Facculy of Fisheries. Bangladesh Agriculture
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 31
University, Mymensingh, 2002, Bangladesh. 247 pp.
11. Chu, W. H. and C-P Lu. 2005. Multiplex PCR assay for the detection of
pathogenic Aeromonas hydrophila. Journal of Fish Diseases. Volume 28
Issue 7: 437-441.
12. Cipriano, R. C., G. L. Bullock and S. W. Pyle. 2001. Aeromonas
hydrophila and motile Aeromonad septicemias of fish. Revision of Fish
Disease Leaflet 68 (1984).
13. Đặng Thị Hoàng Oanh. 2006. Đặc điểm sinh hóa và kiểu ARN ribosom
của vi khuẩn Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm thủy sản nuôi ở Đồng
bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học 2006: 85-94.
14. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và
Nguyễn Thanh Phương. 2006. Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng
thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng
tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chí khoa học 4/2006: 42-52. 300 trang.
15. Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương.
2006. Sưu tập và phân lập vi khuẩn từ mẫu thủy sản nuôi ở Đồng bằng
sông Cửu Long. Tạp chí khoa học 4/2006 (2): 53-61. 300 trang.
16. Đoàn Nhật Phương. 2001. Xác định LD50 và thử nghiệm vaccine phòng
bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio)
(LVTN). Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ. 29 trang
17. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội.
2004. Bệnh học thủy sản Nha Trang. 423 trang.
18. Ferguson, H.W, J. F. Turnbull, A Shinn, K.Thomson, T. T. Dung and
M.Crumlish. 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus
(Sauvage) from the Mekong delta, VietNam. Journal of fish disease 2001,
24: 509-513pp.
19. Frerichs, G. N. and S. D. Millar. 1993. Mannual for the isolate and
indentification of fish bacterial pathogens. Institute of aquaculture,
University of Stirling, Scotland. 107pp.
20. Inglis, V., R. J. Roberts and N. R. Bromage. 1993. Bacterial diseases of
fish. Institute of aquaculture, Univesity Press, Cambridge. 312 pp.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 32
21. Kozinska, A., M. J. Figueras, M. R. Chacon and L. Soler. 2002.
Phenotypic characteristics and pathogenicity of Aeromonas genomospecies
isolate from common carp. In: Journal of applied microbiology 2002, 93:
1034-1041 pp.
22. Nielsen, M. E., L. Høi, A. S. Schmidt, D. Qian, T. Shimada, J. Y. Shen, J.
L. Larsen. 2001. Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas
species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the
Zhejiang Province of China? Diseases of aquatic oraganism. Vol.46: 23-
29.
23. Ngô Minh Dung. 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra (LVTN). Khoa
Thuỷ Sản-Trường Đại học Cần Thơ. 47 trang.
24. Nguyễn Chính. 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản
trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) thâm canh ở
An Giang và Cần Thơ (LVCH). Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần
Thơ. 80 trang.
25. Nguyễn Tấn Đạt. 2002. Khảo sát bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên tôm
càng xanh nuôi trong ao và ruộng lúa mật độ thấp (LVTN). Khoa Thuỷ sản
– Trường Đại học Cần Thơ. 24 trang
26. Nguyễn Thành Tâm. 2006. Khảo sát các mầm bệnh trên cá rô đồng
(Anabas rtestudineus) bị bệnh xù vảy (LVTN). Khoa Thuỷ sản – Trường
Đại học Cần Thơ. 39 trang.
27. Nguyễn Thị Như Ngọc. 1997. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh tuột
nhớt trên cá bống tượng (LVTN). Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần
Thơ. 54 trang.
28. Nguyễn Thị Thu Hằng. 2005. Sưu tầm và thiết lập hệ thống lưu trữ các
loài vi khuẩn phân lập trên tôm cá tại Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học
Cần Thơ. Báo cáo khoa học (đề tài cấp trường). Trường Đại học Cần Thơ.
24 trang.
29. Panangala, V.S., C.A Shoemaker, V.L. Van Santan, K. Dybvig., P. H.
Klesius. 2007. Multiplex-PCR for simultaneous detection of three fish-
pathogenic bacteria, Edwardsiella ictaluri, Flavobacterium columnare and
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 33
Aeromonas hydrophila. Diseases of aquatic organisms 74: 199-208.
30. Popovic, N. T., R.Coz-Rakovac and I. Strunjak-Perovic. 2007.
Commercial phenotypic tests (API 20E) in diagnosis of fish bacteria: a
review. Veterinarni medicina, 52, 2007 (2): 49–53.
31. Sở Thủy sản An Giang. Báo cáo dịch bệnh 9 tháng đầu năm 2007.
32. Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh và
Nguyễn Thanh Phương. 2004. Thành phần loài và khả năng gây bệnh của
nhóm vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống ương tôm càng xanh
(Macrobranchium rosenbergii). Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, 2004:
p153-164. 373 trang.
33. Triệu Thanh Tuấn. 2006. Khảo sát mối quan hệ giữa kiểu gen của White
spots syndrome (WSSV) với bệnh đốm trắng trên tôm Sú (Penaeus
monodon) nuôi tại Bạc Liêu và Cà Mau (LVTN). Khoa Thuỷ sản – Trường
Đại học Cần Thơ. 45 trang.
34. Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc
Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng
gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học. Đại học Cần
Thơ, 2004: 137-142. 373 trang.
35. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. 2005.
Giáo trình Bệnh học thủy sản.151 trang.
36. Từ Thanh Dung. 2006. Bài giảng Bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản.
37 trang.
37. Vila, J, F. Marco, L. Soler, M. Chacon and M. J Figuera. 2002. In vitro
antimicrobial susceptibility of clinical isolate of Aeromonas caviae, A.
hydrophila and Aeromonas veronii biotype sorbia. Journal of
Antimicrobial Chemmotherapy 49: 697-702.
38. Wang, G., C. G. Clark, C. Liu, C. Pucknell, C. K. Munro, T. M. A. C.
Kruk, R. C. D. L. Woodward, and F. G. Rodgers. 2003. Detection and
characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila and
Aeromonas sobria by Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology,
Vol. 41, No. 3: 1048-1054pp.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 34
39. West, P. A. and R. R. Colwell. 1984. Indentification and classification of
Vibrionaceae- an overview. Pp 285-363 in: R. R. Colwell (edn). Vibrio in
environment. Jonh Wiley and Sons, New York.
40. Horneman, A. and J. G. Morris. 2007. Up to date Aeromonas infections.
Cập nhật trên ngày 28/12/2007.
41. Kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2007 đạt 3,75 tỉ USD. Trích báo cáo
của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.
Cập nhật: 02/01/2008.
42. Phan Anh. 75 tấn cá chết ở tỉnh Đồng Tháp. ngày
09/01/2006. Cập nhật ngày 22/01/2008.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 35
Phụ lục: Các chỉ tiêu test sinh lý và sinh hóa
Quan sát tính di động
Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt treo ở vật kính
40X. Các bước thực hiện như sau:
- Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lame trên bàn.
- Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle.
- Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lame hòa vào nước muối sinh
lý.
- Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước
muối sinh lý chứa vi khuẩn.
- Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle.
- Đặt lame lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X.
Nhuộm Gram
Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt một ít vi
khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lame
trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lame.
Các bước nhuộm Gram
- Nhỏ dung dịch crystal violet lên lame. Để 1 phút.
- Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lame (khoảng 2 giây), để khô ở nhiệt độ
phòng.
- Nhỏ dung dịch iodine lên lame, để khoảng 1 phút.
- Lật nghiêng lame kính cho hết dung dịch iodine trên lame.
- Dùng dung dịch 95% cồn: 5% aceton để tẩy màu bằng cách nghiêng lame rồi
nhỏ từ từ dung dịch cho đến khi giọt nước cuối lam không còn màu tím. Rửa
và để khô ở nhiệt độ phòng.
- Nhỏ dung dịch safranin lên lame, để khoảng 2 phút. Rửa và để khô ở nhiệt độ
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 36
phòng. Quan sát ở vật kính 100X.
Đọc kết quả
- Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh.
- Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ.
Phản ứng catalase
- Dùng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong 100ml nước cất).
- Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lame, sau đó nhỏ lên vi khuẩn một
giọt 3% H2O2 .
- Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch
3% H2O2 và ngược lại.
Phản ứng oxidase
- Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên que đã tẩm dung dịch oxidase.
- Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển sang màu xanh
trong vòng 60 giây và ngược lại.
Phản ứng decarboxylase
- Môi trường decarboxylase (xem công thức pha chế trên nhãn) + 0,5% yeast
extract.
- Thêm 1% amino acid (arginine, lysine và ornithine) cho các phản ứng.
- Môi trường làm đối chứng không có amino acid.
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 1200C trong 15 phút.
- Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm sau đó phủ lên mỗi ống 0.5ml
parafin tiệt trùng, để trong tủ ấm ở 280C.
- Đọc kết quả từ 1-4 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có amino acid
chuyển màu khác với màu của ống đối chứng và ngược lại.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 37
Khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau
- Môi trường 1% tryptone (1g tryptone trong 100ml nước cất). Thêm NaCl ứng
với các nồng độ 0, 3, 6, 7, 10% NaCl.
- Cho 3ml môi trường vào mỗi ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.
- Cấy một ít vi khuẩn vào các ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C.
- Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết quả (+) và ngược lại.
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (Fermentation/oxidation: O/F)
- Môi trường O/F (xem công thức pha chế trên nhãn)
- Đun và khấy cho tan hoàn toàn.
- Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C.
- Thêm 1% glucose tiệt trùng.
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm có chứa môi trường OF. Sau đó phủ 0.5-1ml
dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống
nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C.
- Đọc kết quả sau 24h- 7 ngày.
- Lên men (F) khi ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng.
- Oxidation (O) khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng.
- Không đổi (N) cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ.
Khả năng sinh indole
- Môi trường nutrient broth.
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 38
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội.
- Thuốc thử Kovac’s (bảo quản ở 40C).
- Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C.
- Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Vi khuẩn sinh
indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt
của môi trường và ngược lại.
Phản ứng Voges- Proskauer (VP)
- MR – VP broth (xem nhãn)
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội.
Thuốc thử:
A : Hòa tan 5g alpha naphthol (Merck) trong 100ml ethyl alcohol (Merck).
B: Hòa tan 40g KOH (Prolabor) trong 100ml nước cất.
- Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 28 0C.
- Sau 48 giờ nhỏ 0.6ml thuốc thử A và 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc
đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút.
- Sự chuyển màu hồng hoặc đỏ của môi trường cho phản ứng (+) và ngược lại.
Khả năng sử dụng citrate
- Môi trường Simmon’s Citrate agar (xem nhãn)
- Đun sôi và khuấy cho tan.
- Cho 5ml môi trường vào ống nghiệm
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.
- Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội.
- Cấy vi khuẩn mặt đứng (dùng que cấy thẳng cắm thẳng xuống mặt đứng) và
trên bề mặt nghiêng (dùng que cấy thường) của ống nghiệm. Ủ ở 280C
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 39
- Sau 2-7 ngày, vi khuẩn sử dụng citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường
Simmon’s Citrate agar cho kết quả (+) và ngược lại.
Starch hydrolysis (khả năng thủy phân starch)
- Nutrient agar (xem công thức pha chế trên nhãn) + 0,5% starch
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.
- Để nguội khoảng 450C, đổ môi trường ra đĩa petri.
- Thuốc thử Lugol’s Iodine:
5g Iodine (Merck),10g Potassium iodine (KI; Merck),100ml nước cất.
Hòa tan KI và Iodine trong 10ml nước cất rồi thêm tiếp cho đủ 100ml.
- Cấy vi khuẩn trên đĩa petri và ủ ở 280C.
- Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử Lugol’s Iodine trên bề mặt vi khuẩn.
- Trong vòng 30 phút, nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có
vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) và ngược lại.
Khả năng sử dụng urea
- 0,1% pepton + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% phenol red + 0,1 % glucose
- Thêm 2% urea cho phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có urea.
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.
- Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C.
- Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Phản ứng dương khi các ống nghiệm có urea
chuyển sang màu hồng.
Khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate
- Nutrient broth (xem công thức pha chế trên nhãn).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 40
- 0,4% Bromothymol blue (1,6%) (Merck)
- 1% đường (glucose, arabinose, cellobinose,…). Chỉnh pH 6.8
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội.
- Dùng môi trường đường tương ứng.
- Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C.
- Đọc kết quả trong vòng 2-7 ngày.
- Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại.
Khả năng sinh gas từ glucose
- Nutrient broth (xem công thức pha chế trên nhãn).
- 0,4% Bromothymol blue (1,6%).
- 1% đường glucose. Chỉnh pH 6.8
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm đã tiệt trùng có chứa sẵn chuông (tiệt
trùng).
- Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội.
- Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C.
- Đọc kết quả trong vòng 2-7 ngày.
- Nếu môi trường chuyển sang màu vàng và chuông nổi trên mặt môi trường
cho phản ứng (+) và ngược lại.
Khả năng sinh H2S
- Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất).
- Đun và khuấy cho tan hoàn toàn.
- Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội ở 450C.
- Cho 5ml môi trường vào ống nghiệm.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 41
- Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng và chừa lại khoảng 12cm
thạch đứng trong ống nghiệm và để nguội.
- Cấy vi khuẩn mặt đứng (dùng que cấy thẳng cắm thẳng xuống mặt đứng) và
trên bề mặt nghiêng (dùng que cấy thường) của ống nghiệm. Ủ ở 280C.
- Đọc kết quả sau 14-28 giờ.
- Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm.
- Vi khuẩn chỉ lên men đường glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và
màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)).
- Vi khuẩn lên men đường glucose và lactose hoặc sucrose cho màu vàng ở
phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A (acid)/ A (acid)).
- Vi khuẩn chỉ lên men đường lactose hoặc sucrose cho màu vàng ở phần thạch
nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K(alkaline)).
- Vi khuẩn không lên men đường glucose, không lên men đường lactose hoặc
sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K
(alkaline)/ K (alkaline)).
Tính mẫn với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129)
- Giúp phân biệt được nhóm vi khuẩn Aeromonas và Vibrio. Vi khuẩn
Aeromonas kháng với O/129 nhưng Vibrio thì mẫn cảm với hợp chất này.
- Phải thao tác các bước sau trong điều kiện vô trùng
- Sử dụng môi trường muller hinton agar (MHA), giấy tẩm O/129 và ống
nghiệm chứa 5ml 0,9% NaCl tiệt trùng.
- Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít vi khuẩn ròng cho vào ống nghiệm chứa
5ml 0,9% NaCl tiệt trùng và lắc đều.
- So sánh màu của dung dịch vi khuẩn tiêu chuẩn McFarland 0,5.
- Dùng pipet tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho lên đĩa MHA.
- Nghiêng nhẹ để trãi đều dung dịch khắp bề mặt agar rối rút bỏ lượng dung
dịch thừa.
- Dùng kẹp đặt giấy tẩm O/129 lên mặt đĩa agar. Để đĩa trong tủ ấm ở 280C.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trang 42
- Đọc kết quả sau 24 giờ. Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên 1 vòng tròn vô
trùng ≥15mm xung quanh đĩa tẩm O/129.
Khả năng lên men β-galactosidase (ONPG, Ortho-nitrophenyl galactosidase)
- Đĩa nuôi vi khuẩn đã kiểm tra tính ròng.
- Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít vi khuẩn ròng cho vào ống nghiệm chứa
0,2 ml 0,9% NaCl tiệt trùng và lắc đều.
- So sánh màu của dung dịch vi khuẩn tiêu chuẩn McFarland 0,5.
- Dùng kẹp đặt đĩa ONPG vào trong ống nghiệm đã chứa dung dịch vi khuẩn.
- Nếu dung dịch chuyển sang vàng sau 20 phút thì đọc kết quả là dương tính
(+).
- Nếu sau từ 20 phút đến 4 giờ dung dịch không chuyển màu thì đọc kết quả là
âm tính (-).
Các hóa chất và môi trường dùng cho test các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa phải
được chuẩn bị trước khi test 24 giờ.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- lv_nh_giang_196.pdf