Tiểu luận Các kỹ thuật sắc ký

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: DH06SH Yo0oZ Bài tiểu luận mơn Chẩn đốn bệnh gia súc, gia cầm bằng sinh học phân tử Đề tài: CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: ĐINH CÁT ĐIỀM MSSV: 06126027 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2009 2 I) ĐẶT VẤN ĐỀ Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hĩa học khác nhau. Các hợp chất này bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất cĩ trọng lượng phân tử nhỏ. Những hợp chất trên cĩ thể hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Người ta muốn biết các thành phần hĩa học của tế bào, nhằm hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nĩ, qua đĩ giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt đẹp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hĩa học. Từ đĩ, kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký (chromatography). Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù cĩ màu hay khơng, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. Nhưng vì các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên khơng thể nào cĩ một kỹ thuật sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Vì lý do đĩ, tơi thực hiện đề tài: “Các kỹ thuật sắc ký” với sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải. II) TỔNG QUAN II.1) Lịch sử sắc ký ¾ Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ơng thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố cĩ một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vịng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đĩ là sắc đồ. Ơng đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” cĩ nghĩa là chất màu, graphein cĩ nghĩa là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này cịn được dùng tách các chất khơng màu. ¾ Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chĩng với nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,.. ¾ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel. ¾ Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960. ¾ Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp. II.2) Định nghĩa sắc ký Sắc ký là một nhĩm các phương pháp hố lý dừng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luơn tiếp xúc và khơng hồ lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (Trong thí nghiệm của Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hỗn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nĩ được tách ra do sự phân bố khác 3 nhau của các chất hịa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong mơi trường động khí hoặc lỏng và đối với mơi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate,... Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký là phương pháp nhanh, dễ dàng và khơng ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử. II.3) Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh. b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung mơi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và cĩ vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký. 9 Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất cĩ thể lần lượt bị kéo ra ngồi pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đĩ là quá trình rửa giải và dung mơi dùng được và dung mơi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate). 9 Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta cĩ thể lấy từng phần pha tĩnh cĩ mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất. 9 Nếu các chất được tách ra ngồi pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta cĩ thể hứng thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải cĩ các chất cần phân tích. c) Phát hiện các chất: Các chất màu cĩ thể phát hiện dễ dàng, các chất khơng màu cĩ thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải cĩ thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột. II.4) Phân loại các phương pháp sắc ký II.4.1) Theo bản chất vật lý các pha 9 Pha động cĩ thể là một chất lỏng hay chất khí 9 Pha tĩnh cĩ thể là một chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay một chất lỏng (được giữ trên một chất mang rắn). Ư Do đĩ, dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp (trong tên của phương pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh): 1. Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) 2. Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC) 3. Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) 4. Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC) 9 Hai phương pháp đầu gọi chung là sắc ký lỏng (LC). 4 9 Hai phương pháp cuối gọi chung là sắc ký khí (GC). II.4.2) Theo hiện tượng sắc ký 1. Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn cĩ khả năng hấp phụ, đĩ là các phương pháp sắc ký lỏng - rắn và khí - rắn. 2. Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng khơng hồ lẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá hay chất mang và phải là chất trơ, khơng tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký khí - lỏng. 3. Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử cĩ mang những ion cĩ khả năng trao đổi với các ion cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký). 4. Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): cịn gọi là sắc ký trên gel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích thước do các phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn. II.4.3) Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký II.4.3.1) Theo phương pháp giữ pha tĩnh: 1. Sắc ký trên cột (column chromatography: CC) pha tĩnh được chứa trong một cột bằng kim loại hay thuỷ tinh. 2. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh được tráng đều và giữ trên mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhơm. Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel, nhơm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn và cĩ chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm. 3. Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) được thấm trên một loại giấy lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký II.4.3.2) Theo cách cho pha động chạy ta cĩ: 1. Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chất chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh). 2. Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất lần lượt ra ngồi pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy). II.5) Tốc độ di chuyển của một chất, peak và hình dáng peak II.5.1) Tốc độ di chuyển của một chất Tốc độ di chuyên của một chất cĩ thể được đặc trưng bởi hệ số phân bố của nĩ giữa hai pha hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đĩ trên pha tĩnh (thời gian lưu, thể tích lưu) a. Thời gian lưu và thể tích lưu Thời gian lưu là thời gian cần để một chất di chuyển qua cột sắc ký, khi ra khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và xuất hiện rực trên sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến khi xuất hiện peak). 5 Tm là thời gian lưu của một chất khơng bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nĩ bằng tốc độ di chuyển trung bình của dung mơi, thời gian này được gọi là thời gian chết. tR càng lớn, chất càng bị lưu giữ mạnh và tốc độ di chuyển của nĩ càng nhỏ. Hình: Sắc ký đồ của một chất Thời gian lưu hiệu chỉnh tR được tính theo cơng thức: Nếu trên trục hồnh của sắc đồ, dùng đơn vị đo là thể tích dung mơi thì ta cĩ các đại lượng tương tự: thể tích lưu VR và thể tích lưu hiệu chỉnh VR' thể tích VM được gọi là thể tích chết của cột hay cịn gọi là thể tích rỗng Vo. b. Hệ số phân bố Trong đĩ: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động khi cân bằng được thiết lập. Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ K càng lớn thì chất đĩ phân bố càng nhiều trong pha tĩnh và di chuyển càng chậm. c. Hệ số dung lượng K' (hệ số phân bố khối lượng) Trong đĩ: Qs và QM là lượng chất tan phân bố trong pha anh và pha động, K' phụ thuộc vào bản chất các pha, bản chất chất tan, nhiệt độ và đặc điểm của cột. Để tách một hỗn hợp chất, người ta thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích khác sao cho K' nằm trong khoảng từ 1 đến 8. II.5.2) Peak và hình dáng peak a. Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng của tức là lực đối xứng, nhưng thực tế lúc sắc ký chỉ gần đối xứng. Chiều rộng của tục được đo ở 1/10 chiều cao của peak. b. Sự kéo dài peak: là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử của cùng một chất khi đi qua cột sắc khí. Các lực ra chậm bao giờ cũng tù hơn. c. Hiệu lực của cột: Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thơng số: số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H. Ta cĩ thể coi như cột sắc khí được chia thành N lớp hay N tầng mỏng, ở mỗi một lớp sự phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân bằng. Những tầng mỏng giả định này được gọi là địa lý thuyết. Nếu cột sắc khí cĩ chiều dài là L thì: H = N/L. Cột cĩ N lớn là cột cĩ hiệu lực cao. 6 d. Độ phân giải: Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộng trung bình của peak. 9 Rs = 0,75 hai pic tách khơng tốt, cịn xen phủ nhau nhiều; 9 Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, cịn xen phủ nhau 4%; 9 Rs = l,5 hai pic tách hồn tồn (chi xen phủ 0,3%). 9 II.6) Các kỹ thuật sắc ký II.6.1) Sắc ký giấy Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thí dụ như tờ giấy thấm, giấy lọc trong phịng thí nghiệm). Các lọai giấy này cĩ tính ái nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy là lọai sắc ký phân chia. Pha động là chất lỏng( cĩ thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung mơi). Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino acid, đường,.. Trong giấy, cellulose cĩ dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽ tạo thành mạng lưới với các lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung mơi di chuyển dọc theo bề mặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ đầy dung mơi. Như thế, các chất tan bị phân tán nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn. Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế phân chia. Hình: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung mơi lên giấy với các điểm khác nhau. (a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một gĩc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy nằm trong dung mơi. (b) Dung mơi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố theo các tỷ lệ khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước của phân tử của nĩ và hịa tan của nĩ trong dung mơi. (c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạo thành một sắc ký đồ. 7 Ư Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng. Do phần lớn các chất hữu cơ khơng cĩ màu, nên sắc ký giấy sẽ khơng cho thấy được vị trí của mẫu chất trong quá trình dung mơi di chuyển đi lên giấy. Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm song song kề nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn cĩ các lỗ hỗng. Khi dung mơi giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bề mặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ được dịp phủ đầy dung mơi, và các chất tan cĩ dịp khuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các chất tan càng lúc càng to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầu. Cịn nếu sợi cellulose được nén chặt quá dịng chảy sẽ rất khĩ di chuyển. II.6.2) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng là hay cịn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đĩ pha động là dung mơi hoặc hỗn hợp các dung mơi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhơm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. ¾ Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, cĩ nắp đậy. ¾ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhơm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai polymer hữu cơ. ¾ Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một chút so với mặ thống của chất lỏng chứa trong bình. Hình: Bình sắc ký lớp mỏng ¾ Pha động: dung mơi hay hỗn hợp 2 dung mơi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lơi kéo mẫu chất đi theo nĩ. Dung mơi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung mơi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hịa tan của mẫu chất trong dung mơi. ¾ Ưu điểm: -Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích -Cĩ thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích. -Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích cĩ thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. ¾ Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng: -Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh cĩ đường kính trong ống nhỏ, khỏang 1-2mm, một đầu được vĩt nhọn, dài 10-20cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dung mơi hữu cơ như aceton. 8 -Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt bản với kiách thước cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyến dung mơi. -Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, cĩ thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, cịn mẫu là dung dịch quá sễt, cĩ thể pha lỗng mẫu. Với mẫu là chất rắn phải hịa tan trong dung mơi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%. Nhờ một vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh khơng cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản khơng chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất. -Sấy nhẹ để dung mơi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly -Giải ly để dung mơi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hịa dung mơi, người ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng nậgp trong dung mơi giải ly khỏang 0.5-1cm. Các vết mẫu khơng được ngập trong dung mơi giải ly, vì như thế dung mơi sẽ khuếch tán vào trong dung mơi. -Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất cĩ màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ khơng cĩ màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất cĩ thể hấp thu tia UV, các hợp chất cĩ màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện nhữgn hợp chất cĩ phát hùynh quang, các vết sẫm của chất mẫu cĩ màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hĩa học (Bằng cách dung thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid,…) - Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung mơi: Trong đĩ: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm, b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung mơi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. Rf: Chỉ cĩ giá trị từ 0 đến l. 9 Hình: Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng II.6.3) Sắc ký cột: Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt cĩ kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (cĩ một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt khơng bị xáo trộn), bình chứa dung mơi giải ly được đặt phái trên cao. Dung mơi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặ ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng cĩ ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, cĩ thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn. ¾ Các bước thực hiện sắc ký cột: -Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất khơng phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Vơí 2 phân tử khơng phân cực, phân tử naị cĩ trọng luợng phân tử lớn sẽ cĩ tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nĩ bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng cĩ khi nĩở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy cĩ tính phân cực. - Lựa chọn dung mơi:Mẫu cần sắc ký đuợc hồ tan hồn tồn trong dung mơi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5ul dd(A). Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung mơi giải ly khác nhau, kế đĩ phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung mơi sẽ dễ dàng thấy được dung mơi nào phù hợp. Từ kết quả đĩ, cố gắng tìm một hỗn hợp dung mơi, trong đĩ một dung mơi phân cực và một dung mơi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate. -Nạp chất hấp thu dạng khơ vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung mơi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng khơ vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khố ở bên dưới để cột để cho dung mơi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung mơi này dẽ được rĩt lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung mơi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất. -Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạng rắn thì hồ tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung mơi, loại dung mơi cho khởi đầu sắc ký. Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau: 10 +Mở khố cho dung mơi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung mơi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặ thống của chất hấp thu trong cột. +Đĩng khố lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thống cảu chất hấp thu trong cột, vừa bĩp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu. +mở khố bên dưới cho dung mơi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng khơng cho chất hấp thu đầu cột bị khơ. +Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung mơi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung mơi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột. +Mở khố cho dung mơi chảy ra. Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung mơi trong suốt khơng lây màu của chất mẫu. +Sử dụng bơng thủy tinh, bơng gịn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thống chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. +Cho dung mơi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột. II.6.4) Sắc ký trao đổi ion Sự trao đổi ion là sự gắn kết cĩ tính chất thuận nghịch giữa các phân tử cĩ mang điện tích. Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R cĩ gắn thêm nhĩm chức G mang điện tích. Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu cĩ chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào cĩ mang điện tích ngược dấu với điện tích của nhĩm chức, thí dụ chất tan S, chất tan dẽ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đĩ những chất khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ khơng bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. kỹ thuật này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu. RG- + S+ ------Ỉ RG-S+ + C+ Hoặc RG+ +S- ---Ỉ RG+S- + C- Trong đĩ: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhĩm chức mang điện tích được cố định trên pha tĩnh hay cịn gọi là nhĩm chức họat động của nhựa. C là đối ion của G. S là chất hữu cơ cĩ mang điện tích trái dấu với G. ¾ Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate. ¾ Các bước trong sắc ký trao đổi ion: -Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng trên giá, khĩa vịi bên dưới cột. Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung mơi sao cho cĩ thể rĩt nhựa dễ dàng vào cột, khơng tạo ra những bọt khí nằm giữ các hạt nhực. Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rĩt đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khĩa để cho hạt nhựa lắng xuống. Khi nhồi cột hồn tất, cần cân bằng cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột. -Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cỗt, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa. Đầiu quan trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu. Để nạp mẫu lên cột: mở khĩa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khĩa lại. dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khĩa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột. Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa. 11 -Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly. -Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắn vào nhựa trao đổi ion trong dung dịch đệm cĩ nồng độ thấp. Để cĩ thể tách mẫu chất ra khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách cho thêm NaCl. Khi cĩ thêm NaCl trong dung dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽ cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhĩm chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dịng chảy đi ra khỏi cột. ¾ Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phĩng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein cĩ điện tích dương, do đĩ, những protein mang điện tích dương được phĩng thích ra ngồi cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. II.6.5) Sắc ký gel Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer cĩ lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy dung mơi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất cĩ trọng lượng phân tử khác nhau cị thể tách riêng được hay khơng là tuỳ vào kích thước lỗ rỗng. Các phân tử cĩ kích thước lớn hơn lỗ rỗng, khơng thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chĩng theo dịng chảy của pha động đi ra khỏi cột. các phân tử cĩ trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ tồn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dịng chảy đi ra khỏi cột nhưng sẽ chậm trễ hơn. Dịng chảy pha động khiến các phân tử lớn khơng thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chĩng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì cịn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau. 12 Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm các bước sau: -Nhồi gel vào cột: các hạt gel trương nở hiện diện ở dạng huyền phù trong dung mơi phù hợp cho vào cột. Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt nhưng khi rĩt vẫn chảy vào cột thành dịng dễ dàng. Cân bằng cột bằng cách cho dung mơi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung mơi cĩ thể tích bằng 2-3 lần thể tích cột. Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào đầu cột. mẫu thử thường được chọn là dextran blue 2000, cĩ màu xanh dương để cĩ thể được quan sát bằng mắt thường sự di chuyển của mẫu trong cột. -Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải được lọc bỏ những hợp chất cịn ở dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu hồ tan vào dung dịch đệm, đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột. -Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dung mơi đơn nồng độ (nghĩa là sử dụng một loại dung mơi hay hỗn hợp hai dung mơi, khi bắt đầu cho tới khi kết thúc quá trình giải ly chỉ sứ dụng một loại dung mơi đĩ). giải lycĩ thể bằng trọng lực nhưng rất tốt khi sử dụng bơm đẩy từ đầu cột. hứng dung mơi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ cĩ một thể tích nhất định. Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần. ¾ Ứng dụng: kỹ thuật này dùng để tách các đại phân tử cĩ nguồn gốc sinh học như: protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme,.. Người ta ứng dụng vào việc đĩan TLPT của một hợp chất chưa biết. II.6.6) Sắc ký ái lực Sắc ký ái lực hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một phân tử sinh học cĩ với một phân tử khác được cố định trên một pha ổn định. Cĩ nhiều phương pháp để rửa giải các phân tử ái lực vì cĩ nhiều loại sắc ký ái lực khác nhau, các bước theo gradient vẫn thường được sử dụng. Thường sử dụng trên các hệ thống cĩ áp suất thấp. Các giá thể (thường là agarose) thường chịu được áp suất dưới 50psi. Nhược điểm: đắt tiền, khĩ tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt hĩa thường gặp nhiều khĩ khăn. Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A là antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủy cịn họat tính với dạng biến tính. 13 ™ Sử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể: ta cĩ thể tinh sạch một kháng nguyên bằng chách cho mẫu đi qua cột cĩ chứa giá thể liên kết với kháng thể để thu nhận protein. Ngược lại, một giá thể cĩ liên kết với một kháng nguyên chuyên biệt sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đĩ. Ứng dụng nhiều nhất là gắn kết protein A vào gel để gắn kết với các globulin miễn dịch. - II.6.7) Sắc ký tương tác kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuật phân tách khác. Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thơng dụng như là bước đầu tiên trong quá trình sắc ký. Loại hạt Macro-Prep cĩ dẫn xuất là nhĩm kỵ nước, cĩ thể là gốc methyl hay t-butyl. Các gốc này hấp dẫn các gốc kỵ nước khác cĩ trên bề mặt protein. Khi cho mẫu protein vào trong điều kiện nồng độ muối cao ép các phần kỵ nước lại gần nhau và đính với nhau. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách giảm dần nồng độ muối cho đến khi các phần kỵ nước đi lại vào trong dung dịch. Đặc điểm: Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử Các nhĩm kỵ nước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể. Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước trên phân tử tương tác các nhĩm cố định. Các phân tử gắn kết được rứa giải bằng cách giảm áp lực ion và vì vậy hịa tan các phân tử ra khỏi giá thể. Ưu điểm: Là bước cho phép cơ mẫu, cơng suất cao, nhanh, mẫu được thu nhận trong nồng độ muối thấp. Nhược điểm: một số protein cĩ thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khĩ nâng cấp quy mơ lớn. 14 II.6.8) Sắc ký khí Sắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, với pha động là chất khí, gọi là khí mang (carrier gas). Sắc ký khí cịn áp dụng cho các chất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền nhiệt độ cao, cĩ TLPT M<500. Sắc ký khí rắn (GSC - gas solid chromatography): pha tĩnh rắn là một chất hấp phụ, đây là sắc ký khí hấp phụ và sắc ký khí lỏng (GLC - gas liquid chromatography): pha tĩnh lỏng được bao hay gắn trên một chất mang rắn (solid support) đây là sắc ký khí phân bố. Sử dụng phương pháp sắc ký khí cĩ khả năng tách được hồn tồn những chất hữu cơ tương tự, ví dụ như o-; m-; p-xilen khơng thể tách được bằng phương pháp chưng cất phân đoạn nhưng tách được khá đơn giản bằng sắc ký khí, cũng như sử dụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp như khí thải ơ tơ chứa trên 300 hợp chất. Với việc ra đời của nhiều loại detector nhiều phương pháp mới xuất hiện như: sắc ký khí - khối phổ (GS - MS), sắc ký khí - hồng ngoại (GC - IR)... đã làm tăng khả năng phân tích của sắc ký khí. ¾ Máy sắc ký khí Hình: Sơ đồ của một máy sắc ký khí 1. Khí mang Khí mang là một khí trơ như nhờ, hen, ngon, hidro... trong đĩ hai là khí mang phổ biến nhất. Khí được chứa trong bom khí cĩ gắn van giảm áp và điều chỉnh. Khí mang cần cĩ độ tinh khiết cao và phải khơng tương tác với mẫu, chỉ mang mẫu đi qua cột: Tín hiệu đetectơ cĩ phụ thuộc vào sự khác nhau về tính chất giữa khí mang vàchất cần phân tích. 2. Bộ bơm mẫu Thường dùng bơm tiêm đề bơm trực tiếp mẫu qua một vách polime silicon chịu nhiệt cao vào cột hoặc vào phịng đun nĩng mẫu để mẫu lỏng cĩ thể bay hơi nhanh chĩng. Yêu cầu cần 15 thiết là mẫu phải cĩ đủ áp suất hơi để cĩ thể được làm bay hơi trong phịng mẫu. Nhiệt độ phịng mẫu cĩ thể cao hơn nhiệt độ trong cột một chút để quá trình bay hơi được thực hiện dễ dàng. 3. Cột sắc ký Cột được đặt trong lị cĩ thể điều chỉnh nhiệt độ trong quá trình thực hiện. Cột thơng dụng nhất trong phân tích là những ống bằng thép khơng rỉ (đồng, thép) hoặc bằng thuỷ tinh dài từ 1 đến 10 m và cĩ đường kính từ 2 đến 4 mm. Chúng được uốn cuộn trịn cho khớp với phịng lị. Cột được nhồi bằng những phần tử rắn hoạt động như một pha tĩnh (GSC): đĩ là những hạt nhỏ xếp gắn trên mặt trong cột hoặc pha tĩnh được tẩm trên các hạt nhỏ đĩ. Trong sắc ký khí lỏng (GLC), pha tĩnh được giữ trên chất mang, đĩ là những hạt chất rắn nhỏ, bền nhiệt, trơ về mặt hố học, cĩ lỗ cỡ 1 - 5 μm, bề mặt riêng lớn từ 1 - 10 m2/g. Pha tĩnh phải chịu nhiệt, hố lỏng ở nhiệt độ phân tích, trơ về hố học. Thường hay sử dụng các polyme xốp hoặc gel aluminosilicat khử nước. 4. Detector Yêu cầu về detector rất nghiêm ngặt: Mọi hợp phần cĩ trong 0,1 μl mẫu phải được phát hiện ở mức 1% cho nên phải nhanh chĩng phát hiện được 0,002 μl (cĩ khối lượng cỡ 10-6g) mẫu. Các detector hiện nay đo được những lượng nhỏ hơn đến mấy bậc. Hiện nay trong phương pháp GC người ta sử dụng những loại detector sau: 9 Detector dẫn nhiệt (TCD): Việc vận hành của detector dựa trên sự cân bằng nhiệt cửa một dây dẫn nung nĩng. Khi cĩ chất cần phân tích đi qua thì độ dẫn điện của hỗn hợp khí sẽ thấp đi, dây sẽ nĩng lên, xuất hiện một tín hiệu điện. Detector dẫn nhiệt thích hợp với nhiều chất cần phân tích. 9 Detector ion hố ngọn lửa (FID): Khi đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong ngọn lửa, chúng sẽ tạo ra các ion. Các điện cực ở gần ngọn lửa sẽ phát hiện ra sự cĩ mặt của các ion bằng sự xuất hiện một dịng điện nhỏ chạy qua mạch điện. Cĩ thể đo được những dịng ngay cả khi chứng chỉ xấp xi bằng 10-12A. Đây là detector được dùng nhiều nhất, phát hiện được đến 10-9g. 9 Detector hấp thụ electron (Detector bắt electron - ECD): Nhờ cĩ nguồn phĩng xạ như 3H hoặc 63Ni, khí mang bị ion hố tạo nên một "dịng nhất định" trong mạch detector. Khi một chất phân tích hấp thụ electron được giải hấp nĩ sẽ làm giảm dịng này, đặc biệt khi hợp chất cĩ chứa nguyên tố cĩ độ âm điện cao. Dịng sẽ giảm đi, tạo ra tín hiệu ghi để. Detector đặc biệt nhạy cảm với những hợp chất chứa halogen. Detector hấp thụ electron rất thuận lợi cho việc phân tích mơi trường. Độ nhạy cao, đạt tới 10-12g. 5. Thơng tin GC Sắc ký đồ thơng thường biểu thị trên hai trục x và y, trong đĩ tín hiệu detector ghi trên trục y và thời gian ghi trên trục x. Khi một hợp phần của mẫu được giải hấp và phát hiện nhờ detector thì tín hiệu đĩ sẽ được ghi lại. Thời gian ghi được ở lúc tín hiệu là hàm của KD và vì thế nĩ cung cấp thơng tin định tính về mẫu giống như thế bán sĩng trong cực phổ, và sẽ nhận biết được một hợp phần trong mẫu. Thơng tin định lượng từ sắc đồ được rút ra từ chỗ tín hiệu detector là hàm của thời gian. Diện tích dưới lúc tỷ lệ với lượng chất phân tích. Lượng này cĩ thể biểu thị bằng đơn vị mol hoặc đơn vị khối lượng, tuy nhiên hằng số tỷ lệ sẽ khác nhau: SA = diện tích dưới pic - R A Trong đĩ R là diện tích trên một một khí A được biểu thị bằng một hoặc là diện tích trên một gam khí A biểu thị bằng gam. ™ Sắc ký khí ghép khối phổ (GC_MS: gas chromatography mass spectrometry): Một trong những phương tiện hữu ích cho các nhà hĩa học xác định cấu trúc hĩa học của hợp chất cần khảo sát là máy sắc ký khí ghép khối phổ. Dịng khí thốt ra khỏi máy sắc ký khí được 16 cho đi qua một khĩa đễ vào ống, nơi mà cĩ một lỗ phân tử và dẫn đến buồng ion hĩa của máy khối phổ. Hệ máy GC_MS cĩ thể khảo sát một đơn chất hay một hỗn hợp, trước tiên máy tách mẫu, phân tích mẫu, kế đĩ bộ phân máy tính của máy khối phổ so sánh các dữ kiện thu được với các số liệu phổ chuẩn đang chứasẵn trong thư viện máy, đễ đề nghị cấu trúc hĩa học của hợp chất (đơn chất hay hỗn hợp) khảo sát. Máy in ra một bảng danh sách những hợp chất cĩ khả năng giống với các chất khảo sát, mỗi hợp chất đề nghị này đầu cĩ ghi kèm thao độ tương hợp. Độ tương hợp càng lớn (trên 90%) cấu trúc của hợp chất khảo sát càng cĩ khả năng là chất mà máy đề nghị. II.6.9) Sắc ký lỏng cao áp: - Áp dụng cho phân tích mẫu dạng lỏng, rắn cĩ TLPT M>2000. - Các thành phần chính của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 1) Bình chứa dung mơi Thường làm bằng thuỷ tinh, đơi khi làm bằng thép khơng rỉ, trong phương pháp rửa giải thơng thường chỉ cần một bình chứa dung mơi, trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung mơi khác nhau và hệ dung mơi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung mơi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xác định. Cần loại các hạt và các khí hồ tan trong dung mơi. 2) Hệ thống bơm Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 - 500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với các dung mơi. Hệ thống bơm này phải cĩ khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao mà khơng bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sĩng cĩ thể làm sai lệch các lực thu được. Cĩ nhiều kiểu bơm đã dùng trong các máy HPLC; nhưng kiểu phơng xoay chiều hiện nay được dùng phổ biến nhất. 3) Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu) 17 Mẫu được bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu. Người ta bơm mẫu vào vịng mẫu với thể tích thường là từ 10 đến 20 μl. 4) Cột sắc ký Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, nhưng thường là những cột bằng thép khơng gỉ, cĩ cỡ lỗ chính xác đường kính từ 3 đến 4 túm và dài từ 10 đến 30cm (những cột dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến 100cm). Loại cột này cĩ hiệu lực rất cao, cĩ số (ra lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1m chiều dài cột) 5) Detector Là bộ phận phát hiện các chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ. Hiện đang sử dụng các loại detector sau: Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước sĩng này. Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sĩng từ 195 đến 750 nm. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất. Detector điện hố và detector huỳnh quang cĩ độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân tích vết. Dùng detector điện hố cĩ thể phát hiện được những lượng picrogam (10-12g) ™ Các phương pháp sắc ký hiệu năng cao a) Sắc ký phân bố hiệu năng cao Gồm hai loại: Sắc khí lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết. - Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): Pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất mang, tức là được hấp phụ trên chất mang. - Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh được gắn hố học với chất mang tạo ra liên kết siloxan nối nhĩm cơ - silic với silicagen. b. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng - rắn LSC) Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt cĩ chứa các nhĩm hiđroxil phân cực, pha động là một dung mơi khơng phân cực. c) Sắc ký trao đối ion hiệu năng cao (IEC) Pha tĩnh rắn chứa các nhựa trao đổi lớn dưới dạng bột mịn, pha động thường là dung dịch nước. d. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel (sốc ký loại cỡ SEC) Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu cho các chất cĩ phân tử lượng lớn. Chất nhồi cho SEC là những hạt xốp của silicagent hay các polyme cĩ kích thước nhỏ ( 10 μm). Pha tĩnh là dung mơi nằm trong các lỗ xốp của hạt, pha động là dung mơi chảy giữa các hạt. Chỉ những phân từ nhỏ mới khuếch tán vào lớp xốp, khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ. 18 So Sánh Giữa 2 Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) và Sắc Ký Khí (GC) - Độ bay hơi + HPLC: Khơng yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan được trong pha động + GC: Mẫu phải bay hơi được - Độ phân cực + HPLC: Tách được cả 2 loại hợp chất phân cực và khơng phân cực + GC: Mẫu phân cực và khơng phân cực - Độ bền nhiệt + HPLC: Phép phân tích được thực hiện tại nhiệt độ thấp (nhiệt độ phịng hay thấp hơn) + GC: Mẫu buộc phải tồn tại ở nhiệt độ cao (nhiệt độ tách của cột và buồng tiêm mẫu) - Khối lượng phân tử + HPLC: Khơng cĩ giới hạn trên về mặt lý thuyết, trên thực tế độ hồ tan là giới hạn + GC: Đặc trưng < 500 amu - Chuẩn bị mẫu + HPLC: Mẫu buộc phải lọc, mẫu nên cĩ dung mơi hồ tan như pha động + GC: Dung mơi phải bay hơi và cĩ nhiệt độ sơi thấp hơn các chất phân tích - Lượng mẫu + HPLC: Lượng mẫu phụ thuộc vào đường kính (trong) của cột + GC: Thường từ 1 –5 μl - Cơ chế tách + HPLC: Thực hiện ở cả 2 pha động và tĩnh + GC: Chỉ cĩ pha động là mang mẫu - Detecter – Đầu dị + HPLC: Thơng dụng nhất là UV-VIS + GC: Thơng dụng là FID, dùng cho phân tích các chất hữu cơ 19 III. KẾT LUẬN: Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện cuộc sống ngày càng cao, nên địi hỏi phải cĩ những cơng nghệ kỹ thuật hiện đại để đáp ứng nhu cầu. Bên cạnh đĩ cũng cĩ một số ít người, vì lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm sốt kiểm tra tình hình chất lượng hàng hố để đáp ứng nhu cầu cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hố chất… Vì thế kỹ thuật sắc ký càng cĩ vai trị lớn trong cơng tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật này hồn tồn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm cĩ trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan cĩ trong trứng gia cầm và trong son mơi, 3 MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) cĩ trong nước tương, formone cĩ trong bánh phở, xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc gây độc (cĩ độc tố Aflatoxin) trong các lơ hàng nơng sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc …Trong cơng nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng chất cĩ thể gây độc hại… Ngồi ra cịn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, mơi trường… Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta cĩ thể chọn một phương pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng. IV) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cơ lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007, Trang 151-451. 2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Cơng Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008, 12trang. 3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích mơi trường, ĐH Nơng Lâm Thái Nguyên, trang 49-59. 4) Sắc ký giấy: 20Chromatography.ppt 5) Sắc ký lớp mỏng: Piia Salo, Thin-Layer Chromatography with Ultravioletand Mass Spectrometric Detection: From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique ,Division of Pharmaceutical Chemistry Faculty of Pharmacy University of Helsinki, Finland. 6) Sắc ký cột: 7) Sắc ký trao đổi ion: inciplesofChromatography/IonExchange/ 8) Sắc ký gel: inciplesofChromatography/SizeExclusion/ 9) Sắc ký tương tác kỵ nước: 20 inciplesofChromatography/HydrophobicInteraction/ 10) Sắc ký ái lực: inciplesofChromatography/Affinity/ 11) Sắc ký khí: 12) Sắc ký lỏng cao áp: