Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

chứa một chất điều hòa sinh trưởng có khả năng dẫn truyền và kích thích sự tượng rễ. IAA cũng đã được biết là chất có khả năng kích thích sự tượng rễ của cành giâm và cũng đã cho thấy khả năng ứng dụng trong thực tiễn. Những auxin tổng hợp thường được dùng thay vì IAA tự nhiên vì chúng không bị phân hủy bởi enzyme IAA oxidase hay những enzyme khác và sẽ tồn tại trong mô trong một thời gian dài. Áp dụng auxin ngoại sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói chung bị ức chế trừ khi áp dụng với nồng độ đủ nhỏ. Sự ức chế sinh trưởng của auxin thường có liên quan đến sự kích thích sinh tổng hợp ethylene.  Sự sản sinh ethylene: Sự kích thích sản sinh ethylene gây ra do auxin được ghi nhận đầu tiên trên cà chua bởi Zimmerman và Wilcoxon (1935). Ngày nay, auxin đã được biết là chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự sinh tổng hợp ethylene trên nhiều loài thực vật như đậu xanh, lúa, cỏ lồng vực…  Sự phát triển trái: Sự gia tăng kích thước trái chủ yếu do sự nở rộng của tế bào gây ra. Auxin có liên quan đến sự nở rộng của tế bào và đóng vai trò cơ bản trong việc quyết định sự phát triển của trái. Vai trò mạnh mẽ của auxin trong sự phát triển của trái gồm hai yếu tố. Thứ nhất là mối quan hệ giữa sự phát triển hột với kích thước cuối cùng và hình dạng trái. Thứ hai là việc áp dụng auxin lên trái nào đó ở những giai đoạn đặc thù của sự phát Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 7 triển sẽ gây ra sự đáp ứng. Ví dụ ở dâu tây, nội phôi nhủ và phôi trong bế quả sản xuất auxin, nó di chuyển ra ngoài và kích thích sự sinh trưởng. Vị trí của bế quả trên trái có một ảnh hưởng lớn đến hình dạng trái. Bế quả dâu tây nằm bên ngoài đế hoa thịt quả và dễ dàng tác động. Khi tách tất cả bế quả thì trái không phát triển. Tuy nhiên, nếu tách tất cả bế quả và áp dụng auxin lên đế hoa thì trái phát triển bình thường.  Sự rụng: Nếu cắt bỏ phiến lá non thì lá sẽ dễ rụng. Tuy nhiên cuống lá sẽ không rụng nếu được xử lý auxin như IAA. Sự rụng lá là do sự thành lập tầng rời và hiện tượng này bị chi phối bởi auxin. Sự rụng sẽ gia tăng khi lượng auxin nội biên bằng hoặc lớn hơn auxin ngoại biên. Xử lý auxin về phía lá của tầng rụng làm giảm sự lão hóa, về phía thân của tầng rụng kích thích sự lão hóa và gây ra sự rụng. Sự giảm auxin nội sinh trong lá hoặc các cơ quan khác của cây sẽ gây ra sự rụng. Việc xử lý NAA hay 2,4 D cũng làm giảm sự rụng trái.  Sự thể hiện giới tính: Việc xử lý auxin có thể làm thay đổi giới tính của hoa trên một số loài cây và sự thay đổi giới tính này được ghi nhận có liên quan đến sự kích thích sinh tổng hợp ethylene. Khi xử lý auxin ngoại sinh đã làm tăng số lượng hoa cái trên họ bầu bí. II. Gibberellin (GA) 2.1. Sinh tổng hợp gibberellin Nói chung người ta chấp nhận rằng gibberellin được tổng hợp từ mevalonic acid trong những chồi non đang sinh trưởng tích cực và hột đang phát triển. Chu trình mevalonic acid không chỉ có liên quan đến sinh tổng hợp gibberellin mà còn liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, abscisic acid và brassinosteroid (hình 3.6). Sau khi mevalonic acid biến đổi thành mevalonicacid pyrophosphate rồi thành isopentenyl pyrophosphate sẽ tách ra theo hướng tổng hợp cytokinin, abscisic acid và con đường khác theo các bước tiếp theo để tạo thành ent-kaurene sẽ dẫn đến sự thành lập các phân tử gibberellin. Quá trình tổng hợp gibberellin có thể bị ức chế bởi các chất làm chậm sinh trưởng trong bước chuyển hóa từ geranylgeranyl pyrophosphate thành copyl pyrophosphate. Các chất làm chậmsinh trưởng gốc pyrimidine, triazole, tetcyclacis và inabenfide cũng ức chế sự biến đổi từ ent- kaurene thành ent-kaurenol, từ ent-kaurenol thành ent-kaurenal, từ ent-kaurenal thành ent- kaurenoic acid. Quá trình sinh tổng hợp gibberellin của nấm G.fujikuroi và thực vật bậc cao có thể chia thành 3 giai đoạn chính: - Chuyển hóa mevalonic acid thành ent-kaurene. - Chuyển hóa ent-kaurene thành gibberellin prototype, GA12-aldehyde. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 8 - Chuyển hóa GA12 - aldehyde thành C20-, rồi thành C19 - GA với con đường không 13-hydroxyl hóa và con đường 13-hydroxyl hóa sớm ở các vị trí khác nhau và sau cùng thành các dạng GA khác nhau. 2.2. Những ảnh hưởng sinh lý của gibberellin Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa. - Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: Các gibberellin đã biết đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự sinh trưởng của nhiều loài cây đặc biệt là những cây lùn. Khác với auxin, ảnh hưởng vươn dài của GA lên thực vật sống thì rõ hơn trên các đoạn mẫu được cắt. Thực vật đáp ứng với các loại gibberellin khác nhau cũng khác nhau. Đối với trục hạ diệp rau diếp, ảnh hưởng kích thích sự vươn dài của GA8 không rõ nét, ảnh hưởng kích thích sự vươn dài của GA4, GA1 và GA3 mạnh dần và GA9 lại có ảnh hưởng mạnh hơn cả. Trong một vài trường hợp thì ảnh hưởng kích thích sự vươn dài trục hạ diệp dưa leo của gibberellin cũng kém hiệu quả. - Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA đã được phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng một phần năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại. Các dạng đột biến lùn như đột biến bắp lùn (Zea mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza sativa L.) Tan-ginbozu và Waito- C. GA nội sinh kiểm soát hoạt động của bắp và lúa là GA1. Việc xử lý GA ngoại sinh làm cho các cây này cao trở lại bình thường. Cũng có những dạng đột biến lùn không đáp ứng với việc áp dụng gibberellin ngoại sinh và cây vẫn lùn sau khi xử lý. - Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng: Hiện nay GA được biết là những chất có khả năng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng trên nhiều loại cây trồng. GA có thể kích thích hoạt động của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc. GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone của hột ngũ cốc và kích thích sự sản sinh enzyme α-amylase để tác động lên sự phân hủy tinh bột thành đường đơn. Tác động này có tác dụng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng. Khoai tây có thể nảy mầm sớm khi xử lý với GA3. GA cũng có thể kích thích sự nảy mầm của hột rau diếp mà không cần xử lý ánh sáng đỏ. GA cũng có thể thay thế điều kiện nhiệt độ thấp hoặc ngày dài để phá vỡ miên trạng. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 9 - Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: Gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong nhiều loài thực vật. Đối với những cây cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh trước trổ hoa thì khi xử lý GA trong những điều kiện không cảm ứng chúng sẽ tượng hoa và trổ hoa. Ảnh hưởng này có liên quan đến sự kích thích quá trình phân chia tế bào và vươn dài tế bào. - Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, đậu trái và lão hóa: GA có thể làm thay đổi giới tính của hoa tương tự như auxin, cytokinin và ethylene. Tuy nhiên, GA có hiệu quả ngược với auxin và ethylene. GA làm tăng số hoa đực trên dưa leo. GA cũng gây nên hiện tượng trình quả sinh và tạo nên trái không hột. GA cũng giúp cho trái to và trì hoãn sự lão hóa. Các loại trái nho không hột ở Nhật, Úc, Mỹ và châu Âu thường có xử lý GA3. Bằng cách giảm lão hóa, GA giữ cho vỏ trái cam quít tươi lâu hơn, chậm mềm khi chín và kéo dài thời gian bảo quản hơn. GA cũng làm cho vỏ táo đẹp hơn, cây kiểng trổ hoa sớm và tập trung. GA3 cũng có thể giúp quá trình sản xuất malt trong công nghiệp sản xuất bia hiệu quả hơn và ngắn hơn 2-3 ngày. 2.3. Ứng dụng của GA - Kích thích tăng chiều cao, tăng sinh khối. - Tăng năng suất và tạo quả không hạt. - Phá bỏ sự ngủ nghỉ của hạt, củ. - Điều chỉnh giới tính III. Cytokinin. 3.1. Nguồn gốc Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin(6-furfurylaminopurine). Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá trích được thanh trùng và được gọi là kinetin bởi vì nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào (cytokinensis) trong mô lõi thuốc lá. Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên được phân lập đầu tiên từ hột bắp non và được gọi làzeatin(6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino)purine). Ngày nay, hầu hết cytokinin được tìm thấy trong cây là zeatin (hình 3). Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 10 Hình 3. Cấu trúc của Zeatin Hiện nay, có nhiều cytokinin tổng hợp được biết. Có 3 chất thông dụng là kinetin (6- furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine), và BPA (6-benzylamino)-9-(2- tetrahydropyranyl)-9H-purine) (hình 4). Cytokinin đã được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký sinh, vi khuẩn, và cũng có trong phần lớn tRNA của vi sinh vật và tế bào động vật. Hiện tại có hơn 200 cytokinin tự nhiên và tổng hợp đã được phát hiện. Hình 4. Cấu trúc của 6-(furfurylamino)purine (Kinetin), benzylaminopurine và BPA (6- benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine) 3.2. Sinh tổng hợp cytokinin Cytokinin có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng phát triển có hiệu quả liên tục bao gồm rễ, lá non,trái đang phát triển và hột. Chúng được xem là được tổng hợp ở rễ và vận chuyển đến chồi bởi vì có nhiều báo cáo cho thấy rằng cytokinin được tìm thấy ở nhựa gỗ. Tuy nhiên, cytokinin đã được tìm thấy nhiều trong mô của trái và hột cho thấy rằng chúng có thể được tổng hợp ở đó. Sự sinh tổng hợp cytokinin liên quan đến các bước khởi đầu của chu trình mevalonic acid đến isopentenyl phosphate (hình 3.6). Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 11 Bước tiếp theo, isopentenyl sẽ kết hợp với AMP để tạo thành isopentenyl AMP. Chất này sau đó được biến đổi thành isopentenyl adenosine theo sau bởi một loạt phản ứng khác để tạo thành cytokinin. 3.3. Những ảnh hưởng sinh lý của cytokinin - Phân chia tế bào và tạo thành cơ quan: Vai trò chính của cytokinin trong cây là kích thích sự phân chia tế bào. Callus có thể được tạo thành ban đầu chỉ cần auxin hoặc cytokinin riêng lẽ. Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của callus, sự kết hợp của auxin và cytokinin tỏ ra cần thiết. Tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ ảnh hưởng lên sự tạo callus, rễ hay chồi . Khả năng tái sinhcây từ callus là một công cụ kỹ thuật sinh học thông thường dùng để chọn lọc những cây kháng với điều kiện khô hạn, stress do mặn, bệnh, thuốc cỏ hay những yếu tố khác. - Sự nảy mầm, sự mở rộng của tế bào và cơ quan: Kinetin có thể giúp hột rau diếp nảy mầm vượt qua ảnh hưởng ức chế của ánh sáng đỏ xa. Cytokinin được biết là chất kích thích sự phân chia tế bào, tuy nhiên vẫn có những trường hợp thấy được ảnh hưởng của cytokinin lên sự mở rộng của tế bào. Cytokinin kích thích sự mở rộng tế bào trục hạ diệp được cắt từ cây củ cải, bí rợ, cây lanh và nhiều cây song tử diệp khác. Sự mở rộng của tế bào là do sự hấp thu nước gây ra do sự giảm thế năng thẩm thấu của tế bào được kích thích bởi sự biến đổi trở lại của lipid dự trữ trong trục hạ diệp thành đường khử (glucose và fructose). - Sự tượng rễ và sự phát triển rễ: Cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý. Kinetin có thể kích thích sự gia tăng trọng lượng khô và sự vươn dài của rễ cây đậu lupin con, trái lại hai yếu tố trên bị ức chế ở nồng độ kinetin cao. Khi kinetin được xử lý lên rễ ở nồng độ thấp, nó kích thích quang hợp và sinh trưởng. Tuy nhiên nếu rễ tiếp xúc với 0,47 µM kinetin hơn hai ngày thì sinh trưởng của rễ và toàn cây sẽ bị giảm rõ rệt. - Sự phát triển nụ và chồi: Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn. Bằng công nghệ di truyền người ta đã làm gia tăng được sự sinh tổng hợp cytokinin trong cây thuốc lá và Arabidopsis. Một gene của vi khuẩn giải mã enzyme isopentenyl AMP synthase, một enzyme đáp ứng với quá trình sản sinh cytokinin, cùng với kích thích gây sốc nóng đã đưa được gene này vào cây thuốc lá và Arabidopsis. Gene mới này được hoạt hóa bằng cách cho cây chuyển gene vào điều kiện nhiệt độ 40-450C trong một thời gian ngắn và kết quả là làm gia tăng hàm lượng zeatin riboside monophosphate, zeatin riboside và zeatin lần lượt là 23, 46 và 80 lần. Một ví dụ khác là việc đưa một gene giải mã enzyme biến đổi IAA tự do thành một amino acid liên hợp bất hoạt. Dưới ảnh hưởng của gene này, IAA tự do bị giảm, do đó kích thích chồi bên phát triển. Ưu thế chồi ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ cytokinin và auxin nội sinh. Có hai giả thiết về mối quan hệ của cytokinin lên Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 12 ưu thế chồi ngọn. Giả thiết thứ nhất cho rằng cytokinin có thể ức chế enzyme IAA oxidase trong chồi bên và do đó cho phép tích lũy auxin và gây ra sự vươn dài của chồi bên. Giả thiết thứ hai là cytokinin có thể khởi đầu cơ chế liên quan đến sức chứa ở chồi bên bằng cách kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng, vitamin, khoáng và những chất sinh trưởng khác để tác động lên sự sinh trưởng. - Trì hoãn sự lão hóa và kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và những hợp chất hữu cơ: Cytokinin có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra khỏi thân cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để giảm lão hóa. Cytokinin cũng có khả năng thay thế ảnh hưởng của ánh sáng và làm giảm sự lão hóa bằng cách duy trì nguyên vẹn màng tonoplast (màng bán thấm bao quanh không bào). Khi cytokinin được xử lý lên lá cây úa vàng hoặc tử diệp vài giờ trước khi đưa ra ánh sáng, tiền lạp thể sẽ được chuyển hóa thành lục lạp và kết quả là có sự gia tăng sự sản sinh diệp lục tố. Cytokinin cũng làm giảm sự lão hóa của hoa cắt cành và rau tươi. Kinetin có khả năng kích thích sự vận chuyển của những hợp chất hữu cơ trong lá đã cắt và giữ trong tối. Khả năng của cytokinin kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng và tạo ra sức chứa đã được biết trên nhiều loài. II. GIỚI THIỆU VI KHUẨN AZOTOBACTER VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH. 2.1. Đặc tính của vi khuẩn Azotobacter Azotobacter thuộc nhóm vi khuẩn di động (motile), có dạng hình cầu hoặc ovan, thường hình thành các nang có vỏ rất dầy và tiết ra một lượng lớn chất nhờn bao quanh. Chúng là vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, có đóng góp quan trọng vào chu trình N2 trong tự nhiên bằng cách cố định N2 không khí_ dạng mà cây không hấp thụ được, rồi chuyển hóa thành muối amoni trong đất. Con người đã lợi dụng các đặc điểm có lợi của Azotobacter để sản xuất phân bón vi sinh, các chất phụ gia thực phẩm và một vài loại polymer sinh học. Đại diện đầu tiên của loài VK này là chủng Azotobacter chroococum, được phát hiện và miêu tả lần đầu vào năm 1901 bời nhà vi sinh vật học người Hà Lan Martinus Beijerinck. Azotobacter là vi khuẩn Gram âm, ta có thể dễ dàng phân lập chúng từ các nguồn đất trung tính hoặc kiềm, nước và một số loài thực vật. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 13 Tên chủng: Azotobacter agilis Azotobacter armeniacus Azotobacter sp. AR Azotobacter beijerinckii Azotobacter chroococcum * Azotobacter sp. DCU26 Azotobacter sp. FA8 Azotobacter nigricans Azotobacter paspali Azotobacter salinestris Azotobacter tropicalis Azotobacter vinelandii * * : Chủng có khả năng sinh tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (auxin, cytokinin, giberellin ) được công bố trong các tài liệu kèm theo. Domain: Bacteria Kingdom: Bacteria Phylum: Proteobacteria Class: Gammaproteobacteria Order: Pseudomonadales Family: Pseudomonadaceae/Azotobacterace-ae Genus: Azotobacter Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 14 2.1.1. Hình thái học Tế bào Azotobacter tương đối lớn hơn so với vi khuẩn nói chung (đường kính khoảng 1-2 micromet). Thường thì chúng có dạng hình oval, nhưng cũng có thể có nhiều hình dạng khác, từ hình que đến hình cầu. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi, ta có thể thấy chúng phân tán hay co cụm thành đám, đôi khi lại hình thành các chuỗi dài ngắn khác nhau. Trong canh trường non, các tế bào trở nên di động nhờ vào đuôi flagella. Khi tế bào già đi, chúng mất dần khả năng di động, trở nên dạng hình cầu và sản sinh ra lớp dịch nhầy, sau tạo thành vỏ tế bào. Hình dạng của tế bào được quyết định bởi a.a Glycine có mặt trong canh trường peptone. Ngoài ra, khi quan sát canh trường còn nhìn thấy nhiều thể vùi, một số có màu sắc. Vào khoảng những năm 1900, những thể vùi có màu được cho là các hạt tái sinh “ reproductive grains”. Tuy nhiên, sau này người ta nhận ra rằng những hạt đó không tham gia vào quá trình phân chia tế bào , mà đó là volutin, còn những thể vùi không màu là giọt chất béo, giúp vi khuẩn dự trữ năng lượng. 2.1.2. Nang vi khuẩn Các nang của vi khuẩn Azotobacter giúp chống chịu một số yếu tố môi trường có hại, độ khô, sóng siêu âm và đặc biệt là tia UV, nhưng lại không chịu được nhiệt độ cao. Sự tạo nang xảy ra khi có sự thay đổi nồng độ một số chất dinh dưỡng trong môi trường và việc thêm vào các chất hữu cơ như etanol, n-butanol hay beta-hydroxybutyrate. Dạng nang hiếm khi hình thành trong môi trường lỏng, khi tạo nang thì kèm theo nhiều thay đổi trong đường hướng trao đổi chất, hô hấp… Bản chất của nang chính là dạng tế bảo sinh dưỡng ở trạng thái ngủ; tuy nhiên, trong khi những tế bào sinh dưỡng bình thường nhân lên thì nang Azotobacter không có khả năng này, tựa như việc hình thành bào tử của nhiều loài VSV khác nhằm chống chọi khi điều kiện môi trường không thuận lợi (pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng…). Khi nang nẩy chồi, những tế bào sinh dưỡng mới này tăng sinh bằng hình thức phân chia giản đơn. Quá trình này diễn ra khá chậm, mất khoảng 4-6 giờ, sau đó tốc độ tăng dần, các tế bào bắt đầu hấp thu O2 và thải CO2. 2.1.3. Đặc tính vật lý: Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí, pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng khoảng 7.0 – 7.5, tuy nhiên chúng vẫn tồn tại ở dải pH từ 4.8 tới 8.5. Nhiệt độ phù hợp khoảng 20 – 30oC. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 15 Trạng thái khuẩn lạc: dẹt, nhầy, đường kính khoảng 5-10 mm, có thể tạo thành màng trong canh trường lỏng. Màu sắc khuẩn lạc có thể là nâu đen, xanh lá cây hoặc đôi khi không có màu, tùy thuộc vào từng chủng cụ thể. 2.2. Khả năng sản xuất các chất kích thích sinh trưởng và những tác động của chúng tới cây trồng Chất kích thích sinh trưởng, hay hormone thực vật là những hợp chất tự nhiên được tạo ra bởi các vi sinh vật và cây cối, có tác dụng kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh hóa trong cây và bản thân VSV. Brakel và Higer (1965) đã chỉ ra rằng loài vi khuẩn Azotobacter có thể sản sinh ra indo -3-acetic acid (IAA) khi thêm trytophan vào canh trường nuôi cấy. Vancura và Macura (1960), Burlingham (1964) và Hennequin (1966) mặt khác chỉ tìm thấy một lượng nhỏ IAA trong canh trường khi không có mặt tryptophan. Ba hợp chất giống với Gibberelin cũng đã được kiểm tra bởi 2 nhà khoa học Brown và Burlingham (1968) trên chủng Azotobacter Chroococum. Sau 14 ngày, lượng chất tăng tương ứng từ 0.01 đến 0.1 g GA3/ml. Các chủng vi khuẩn Azotobacter tự tổng hợp auxin, cytokinin và những chất tương tự GA, có vai trò điều khiển sự phát triển của cây cà chua (Jackson et al.,1964; Barea và Brown, 1974; Azcorn và Barea , 1975). Những hormone này có khả năng kích thích sự sinh trưởng của rễ cây, chúng được hình thành không chỉ trong cây mà còn từ vùng đẩt rễ _ nơi có vi khuẩn Azotobacter sinh sống. Rất nhiều đề tài đã chứng minh sự hiện diện của các phytohormone này trong canh trường nuôi cấy và các nhà khoa học đã đo đạc được sự ảnh hưởng của nó lên cây trồng: Reliv et al. (1987), Martinez Toledo et al. (1989), Salmeron et al. (1990) và Gonzales Lopez et al. (1991). Một nghiên cứu được thực hiện bởi Govedarica và cộng sự (1993) trên 9 chủng Azotobacter Chrocoocum phân lập từ đất bùn đen đã cho thấy khả năng sinh tổng hợp auxin, gibberelin và phenol, làm tăng chiều cao cây cà chua, khối lượng và hàm lượng N trong cây. Các chủng được phân lập từ vùng rễ củ cải đường lại cho một lượng Gibberelin vào khoảng 0.003- 0.1 g/cm3 canh trường (Miliv và Markova-ki, 1995). Nhưng tiến bộ trong sinh học phân tử gần đây giúp cải tiến nhiều kỹ thuật phân tích, gia tăng độ nhạy, cho phép đo đạc chính xác hơn sự có mặt và lượng phytohormone mà VSV tạo ra. Thêm vào đó, rất nhiều quá trình sinh trưởng của thực vật không chỉ bị điều hòa bởi 1 hormone mà do tác động của nhiều chất điều hòa khác. (Barendse và Peter, 1995; Voasenek và Blom, 1996). Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 16 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG Chất mang Xử lý Nghiền mịn Đóng bao Thanh trùng Phân lập, tuyển chọn VSV Lên men sinh khối Thu sinh khối hỗn hợp, kiểm tra sinh khối và mật độ tế bào Tiêm dịch Hỗn hợp Ủ sinh trưởng Bảo quản, sử dụng Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 17 III. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CÁC PHYTOHORMONE. 3.1. Phân lập Từ nhiều mẫu đất khác nhau (trồng lúa, trồng màu, đất bỏ hoang). Hong khô,nghiền mịn ta tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau.Trang trên hộp peptri chứa môi trường Burk đặc pH=7.2-8.2, 28-30 o C để 2-3 ngày đem quan sát khuẩn lạc. Các môi trường phân lập: (1) Môi trường Burk (2) Fe - Mo mixture K2HPO4 0.08 g (3) Môi trường Thompson – Sherman K2HPO4 1 g MgSO4 0,2 g CaCl 0,1 g Na2MoO4 0,001 g Glucose 10 g Nước máy 1000 ml FeCl3.6H2O 1,45 g Na2MoO4.2H2O 0,253 g Nước cất 100 ml KH2PO4 0.02 g MgSO4.7H2O 0.02 g NaCl 0.02 g CaSO4 0.01 g Fe – Mo mixture 0.1 ml Sucrose 2.0 g H3BO3 10.0 µg ZnSO4.7H2O 10.0 µg MnSO4.4H2O 1.0 µg CuSO4.5H2O 0.30 µg KI 0.10 µg Nước cất 100 ml Agar 2.0 g Kết quả phân lập được một số chủng VK, cấy chuyển các chủng VK vào ống thạch nghiêng môi trường Burk Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 18 Kiểm tra các chủng VK phân lập thuộc chi Azotobacter bằng cách quan sát hình thái hoặc dùng sinh học phân tử. Qua một nghiên cứu cụ thể của ĐH Đà Nẵng người ta nhận thấy có 4 loài: A.chroococcum; A.beijerinckii; A.vinelandii; A. agilis . Khi nuôi trong môi trường thạch,vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan,lúc đầu không màu, sau biền thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc.Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhãn nheo,khuẩn lạc có màu vàng lục,màu hồng. 3.2. Tuyển chọn các chủng VK Azotobacter sinh tổng hợp IAA Từ các chủng VK phân lập được, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA, dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Salkowski (2 ml of 0.5 M FeCl3+ 98 ml 35% HClO4). Cường độ máu tỉ lệ thuận với nồng độ IAA. Tiến hành: Phản ứng màu giữa thuốc thử Salkowski và IAA .3. Tuyển chọn chủng sinh Gibberelin Qua quá trình thử trên ta lựa chọn được chủng A.chroococcum sinh tổng hợp IAA mạnh nhất. Ngoài kiểm tra khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng ta con kiểm tra khả năng tổng hợp Gibberellins vi một số chủng Azotobacter có khả năng tổng hợp Gibberellins. Phương pháp tiến hành như sau: Lấy 2ml dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ tế bào 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, lắc đều Hàm lượng IAA thô được xác định theo phương pháp so màu ở 530nm với đồ thị chuẩn IAA Quan sát màu của các ống nghiệm phản ứng Nuôi cấy Azotobacter trên môi trường lỏng, bổ sung 0,1% tryptophan nuôi lắc 220v/p, 5 ngày, t o = 28- 30 o C Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 19 . Qua kiểm tra thấy chủng A.chroococcum tổng hợp IAA mạnh nhất lại có khả năng tổng hợp cả Gibberellins. Như vậy ta sẽ chọn A.chroococcum làm đối tượng để sản xuất. 3.4 Kiểm tra hoạt lực tổng hợp IAA của chủng vừa tuyển trọn trong thực tế Sau 24h, hạt đậu đen được xử lý bằng dịch nuôi cấy của chủng A.chroococcum ở nồng độ pha loãng 10 -2 và 10 -3 . Sau 72h, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 10 -2 vượt 23% so với đối chứng. Như vậy dịch nuôi cấy của chủng A.chroococcum đã kích thích và rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt giống. Vì vậy, có thể ứng dụng chủng này để xử lý hạt giống trước khi gieo. Dịch nuôi cấy ở 280C trong 3 ngày Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vào flask 250 ml Cho 15 ml axit phosphomolybdic Đun sôi 1 h và làm nguội về nhiệt độ phòng Tính nồng độ Gibberelins (tỷ lệ với cường độ màu) Đo cường độ màu ở 780 nm Bổ sung nước cất đến 25 ml Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 20 3.5 Lên men thu sinh khối. - Từ chủng VSV tuyển chọn ta tiến hành nhân sinh khối VSV theo phương pháp lên men chìm trong môi trường Burk lỏng có sục khí và bổ sung N (cao nấm men, pepton hay axit amin). - Chuẩn bị môi trường. Pha môi trường, điều chỉnh pH thích hợp với chủng rồi thanh trung môi trường. Sinh khối VSV được nhân qua cấp 1,2 trong các điều kiện phù hợp với từng chủng VSV và mục đích sản xuất. Nhiệt độ 20 – 30oC pH 7.0 – 8.0 Sục khí, khuấy Khuấy Áp suất Áp suất thường Đối chứng Xử lý bằng dịch ở nồng độ 10 -2 Giống trong ống thạch Hoạt hóa giống Lên men thu nhận giống Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 21 Dinh dưỡng Bổ sung N trong môi trường - Trong quá trình sản xuất việc kiểm tra và điều chỉnh các yếu tố môi trường (pH, liều lượng ,tốc độ khí ,áp suất, nhiệt độ…) là hết sức cần thiết. Các hệ thống lên men hiện nay đã được trang bị hiện đại có công suất từ hàng chục đến hàng trăm ngàn lít. - Trên cơ sở nghiên cứu, khảo sát tình hình thực tế ở một số quốc gia gần đây, ở Hoa Kỳ, Úc đã nghiên cứu và chế tạo thành công nồi lên men đơn giản để tạo ra sinh khối vi khuẩn có thể sử dụng trong điều kiện bán công nghiệp ở các nước phát triển. Nồi lên men đơn giản kiểu này đang được sử dụng tại Thái Lan, Ấn Độ và một số quốc gia khác trong đó có Việt Nam. Thời gian nuôi 5-7 ngày 3.6 Kiểm tra sinh khối Sau khi lên men thu sinh khối phải tiến hành kiểm tra xem mật độ tế bào trong dịch lên men là bao nhiêu để chúng ta kiểm soát qua trình tiêm dịch vào chat mang cho đúng tỉ lệ. Ta lam tương tự như phần phân lập với quy trình như sau: 1ml dịch lên men Pha loãng với nhiều tỉ lệ Lấy 0.05ml từ các mẫu pha loãng trang đều lên các hộp peptri MT Burk Tính mật độ tế bào trong dịch lên men Quan sát và đếm khuẩn lạc Để 2-3 ngày Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 22 IV. CHUẨN BỊ CHẤT MANG 4.1 Giới thiệu chung về chất mang. Chất mang là chất để vi sinh vật mong muốn tồn tại và phát triển, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình vận chuyển, bảo quản và sử dụng phân vi sinh. Chất mang không được chứa chất có hại cho người , động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. - Khi lựa chọn một chất mang để sử dụng cho phân bón vi sinh cần căn cứ vào các yếu tố sau: + Bảo đảm cho vi sinh vật mong muốn sinh trưởng và phát triển tốt. + Dễ tìm, giá thành rẻ. + Không ảnh hưởng đến khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây trồng. + Khả năng đệm pH tốt. + Không chứa chất độc hại cho người, động vật, môi trường sinh thái + Dễ sử dụng trong nông nghiệp - Nguồn gốc chất mang + Nguyên liệu hóa thạch: than bùn, than đá, than non... Chất thải từ thực vật: phân, bột đậu, cám mì... + Chất trơ: đất sét, đá trân châu, CaSO4... 4.2 Lựa chọn chất mang cho Azotobacter Loại chất mang thường được sử dụng để nuôi Azotobacter trong sản xuất phân vi sinh là Than bùn - Than bùn hoàn toàn thỏa mãn các yêu cầu lựa chọn chất mang. Than bùn và than non không độc, giá thành rẻ, than chứa các thành phần dinh dưỡng giúp Azotobacter có thể sống được, và không ảnh hưởng đến cây trồng… - Than bùn được tạo thành từ xác các loài thực vật khác nhau. Xác thực vật được tích tụ lại, được đất vùi lấp và chịu tác động của điều kiện ngập nước trong nhiều năm. Với điều kiện phân huỷ yếm khí các xác thực vật được chuyển thành than bùn. Trong than bùn có hàm lượng chất vô cơ là 18 – 24%, phần còn lại là các chất hữu cơ. Theo số liệu điều tra của các nhà khoa học, trên thế giới trữ lượng than bùn có khoảng 300 tỷ tấn, chiếm 1.5% diện tích bề mặt quả đất. Than bùn được sử dụng trong nhiều ngành kinh tế khác nhau. Trong nông nghiệp than bùn được sử dụng để làm phân bón và tăng chất hữu cơ cho đất. Than bùn cho phản ứng chua. Hàm Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 23 lượng các chất dinh dưỡng trong than bùn thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần các loài thực vật và quá trình phân huỷ các chất hữu cơ. Hàm lượng hữu cơ 40% Hàm lượng N 2.0% - 2.2% Acid humic 16% - 18% Mùn hữu cơ 30% - 40% Đạm tổng số 1.4% - 1.7% Lân tổng số 0.1% - 1.0% Độ giữ nước 1.77 Chất khoáng K, P... Tuy nhiên, than bùn có hợp chất bitumic rất khó phân giải. Nếu bón trực tiếp cho cây không những không có tác dụng tốt mà còn làm giảm năng suất cây trồng. Vì vậy, than bùn muốn dùng làm phân bón phải khử hết bitumic. Trong than bùn có axit humic, có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây. Hàm lượng đạm tổng số trong than bùn cao hơn trong phân chuồng gấp 2 – 7 lần, nhưng chủ yếu ở dưới dạng hữu cơ. Để có thể dùng than bùn làm chất mang, cần phải khử hết bitumic và đưa pH về pH tối thích cho cả vi sinh vật mong muốn và đất cần bón. 4.3. Xử lí chất mang - Dùng tác động của nhiệt để khử bitumic trong than bùn. Có thể phơi nắng một thời gian để ôxy hoá bitumic. Có thể hun nóng than bùn ở nhiệt độ 70 o C. - Sấy đến độ ẩm 25 %-30%, rây để loại bỏ đất đá, rễ cây. - Xay bằng kỹ thuật nghiền búa. Và được qua rây: 1mm, 355μm, 150 μm và 75 μm. hoặc là nhỏ hơn. - Điều chỉnh pH = 7.0 – 8.0 bằng CaO. - Trộn nước thịt : than bùn với tỉ lệ 1 : 2. - Có thể thay nước thịt bằng nước đậu (cung cấp dinh dưỡng). - Trộn đều, rồi cho vào bao plastic (250g - 500g). - Tiến hành thanh trùng trong nồi hấp với áp suất là 1.2 – 1.5 at, trong 30 phút. - Bao plastic phải được giữ kín. Bao đủ dầy để không bị rách,đủ mỏng để VSV có thể hô hấp. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 24 - Trên bao phải ghi đầy đủ những thông tin: tên loại phân VS, hạn sử dụng… 4.4 Cấy chủng - Chuẩn bị các túi đựng than bùn đã khử trùng (hoặc là nguồn chất mang khác). - Từ đường cong tiềm năng ẩm độ của chất mang, xác định số lượng sinh khối sẽ trộn vào than bùn để đạt được ẩm độ thích hợp cho sự tồn tại của azobacter trong chất mang đó. - Làm sạch bề mặt của túi ở ngay vùng sẽ tiêm bằng cồn. - Sử dụng xy lanh và kim tiêm khử trùng, cẩn thận lấy lượng dịch sinh khối đã xác định cho vào trong túi chất mang, tránh dịch này tràn ra ngoài theo đường tiêm. Khử trùng vùng tiêm này bằng cồn và sau đó thì dán với nhãn dính với tên chủng và ngày tiêm. - Xoa bóp nhẹ nhàng túi chế phẩm cho đến khi dịch sinh khối phân phối đều trong chất mang, kiểm tra xem dịch sinh khối có phân bố đều ở 4 góc túi không. - Ủ các túi chế phẩm ở nhiệt độ phòng từ 1– 4 tuần. 4.5 Bảo quản - Trong 1g phân bón vi sinh là 109 tế bào. - Sau khi sản xuất mà không sử dụng ngay thì ta phải bảo quản 15 – 200C thì hiệu quả kéo dài trong 6 tháng; 40C thì bảo quản trong 2 năm. - Thời gian bảo hành được quyết định sau khi đã kiểm tra chặt chẽ các thông số: thành phần, độ ẩm, nhiệt độ. 4.6 Sử dụng Muốn nâng cao sản lượng cây trồng, một trong những biện pháp cần thiết là đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của cây. Bón phân hợp lý nghĩa là phải xác định lượng phân bón hợp lý cho cây trồng, tỷ lệ các loại phân bón thích hợp, xác định thời kỳ và phương pháp bón phân, biết độ phì của đất (khả năng cung cấp của đất) và mức độ sử dụng phân bón của cây. Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh kích thích sinh trưởng thực vật có thể sử dụng 1 chủng Azotobacter hoặc kết hợp với nhiều chủng vi khuẩn khác, nhằm tạo chế phẩm có khả năng cung cấp nhiều loại phytohormone khác nhau cho cây trồng. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 25 PHẦN II. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG TỔNG HỢP RA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG I. Phân lập, tuyển chọn chủng Pseudomonas tổng hợp ra chất kích thích sinh trưởng Auxin 1.1. Đặc điểm của chủng Pseudomonas sp Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh họat về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và pháttriển thực vật: Tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật; kích thích bộ rễcủa cây chủ; gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất 1.2. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas từ các mẫu khác nhau. a. Pseudomonas từ đồng bằng Sông Cửu Long. (Do viện sinh học công nghệ-Đại Học Cần Thơ nghiên cứu) pseudomonas Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 26 Mẫu đất của các cây họ đậu ở đồng bằng sông cửu long. Đất được thu và phơi trong bong mát, đập nhỏ và rây qua rây 2mm; cân 1g đất cho vào bình tam giác chứa 99ml nước cất tiệt trùng, lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 200 vòng/phút trong 2h. Sau đó, chuyển 1ml dung dịch đất sang bình tam giác chứ 99ml nước cất tiệt trùng trong ống nghiệm, khuấy mạnh trên máy lắc rung trong 30 giây và tiếp tục pha loãng như trên đến tần suất 10-7. Hút 0,1ml dung dịch từ ống nghiệm lên môi trường pseudomonas bị cách ly bởi thạch trắng (difco) bổ xung 10ml glyxerin và 50mg/lit cycloheximit, dung que thủy tinh trải đều và đợi khô trong buồng cấy vô trùng và đặt đĩa petri trong tủ ủ ở 30oc. sau 2 hay 3 ngày, cách khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trường, chuyển 1 khuẩn lạc rời sang môi trường mới bằng cách ria cấy để nhận những khuẩn lạc rời ở cuối đường cấy và chuyển một khuẩn lac rời sang ống nghiệp nắp đen chứa môi trường trên để trữ và được xem là một chủng. Các chủng này được xác địh khả năng tổng hợp IAA trong môi trường king B có và không bổ xung 2,5mM tryptophan và các chủng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường xác định ở nhiệt độ 30o trong vòng 7 ngày, sau đó đem ly tâm ở môi trường 14000 vòng/phút trong 8 phút, dịch ly tâm được trộn với thuốc thử salkowski R2(4,5 g/l FeCl3 trong 10,8 M H2SO4 trong vòng 30 phút và đo trên máy quang phổ ở bước song 530 nm, sau đó xác định lượng IAA dựa trên đường chuẩn tinh khiết IAA. Chủng nào tạo ra nhiều IAA sẽ được chọn làm chủng giống. ([1] cac-chng-vi-khun-pseudomonas-co-kh-nng-hoa-tan-lan-va-sinh-tng-hp-auxin-cao) Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 27 Thành phần môi trường king B Thành phần 1L 500mL Nước 1L 500mL proteose peptone 20g 10g K2HPO4 1,5g 0,75g MgSO4•7H2O 1,5g 0,75g glycerol 10mL 5mL Agar 15g 7,5 mL Trộn môi trường: đầu tiên nước và peptone được trộn với nhau sau đó đun sôi cho tới khi hòa tan, thêm các chất khác vào và đung nóng cho tới khi tất cả chúng hòa tan ( b. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas (Murnberg, Đức) [2] [2] &ved=0CCoQFjABOAo&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissue s%2Fbiy-08-32-1%2Fbiy-32-1-2-0703- 5.pdf&ei=IHuoULHRPIijiAfdjYGoCg&usg=AFQjCNGBU8AVhSniRQ1Ei3AoehXxm6mT WA&sig2=lYxclDRKbnAJY_c_Brq8Yg c. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas ( Hokkaido, Nhật Bản) [3]  1 ml dầu thô+ 50ml môi trường MSM có bổ xung cao nấm men 0,1% Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 28  Nuôi cấy ở 30 o c trong máy lắc đến khi xuất hiện vẩn đục  Pha loãng canh trường cấy lên môi trường thạch agar + kerosene ( nguồn C) đĩa thạch được bịt kín bằng hợp chất vinel tape  Tách khuẩn lạc đem đi nuôi cấy trên môi trường MSM Định lượng IAA bằng phương pháp salkowski d. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas (Aligrarh, Ấn Độ) [4]  Mẫu đất của cây súp lơ, lúa mỳ ở vùng phụ cận thành phố Aligrarh, Ấn Dộ  Môi trường dinh dưỡng thạch agar hay king B để tách chủng pseudomonas  Sau đó chúng được nuôi cấy trên môi trường jensen có bổ xung và không bổ xung trytophan, nuôi trong1 tuần đối với pseudomonas,  2ml dịch ly tâm+ 2 giọt orthophosphoric acid+ 4ml solawaski đo OD ở 530 nm [4] ad=rja&ved=0CFoQFjAG&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology %2Fissues%2Fbiy-05-29-1%2Fbiy-29-1-5-0410- 1.pdf&ei=xlWoUOSpAoqhiAe8_IDoCw&usg=AFQjCNGdepVDJ- zpSRulhrOxdh5AMWDGiA&sig2=q9VLw4FUjswdvndc3qjO9g Bảng so sánh IAA đối với chủng pseudonoma Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 29 Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 30 Mẫu đất ở đồng bằng Sông Cửu Long Mẫu đất ở Ấn Độ II. Phân lập và tuyển chọn chủng Azospirillum tổng hợp Auxin và Giberelin 2.1. Đặc điểm của Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum sp. thuộc chi Rhodosprillales, được biết là những vi khuẩn gram âm, có hình dạng thể xoắn, hơi cong như hình dấu phẩy hoặc dạng xoắn khuẩn, chiều dài khoảng 2,0–3,8 µm và chiều rộng khoảng 1,0–1,5 µm, sinh trưởng tốt ở 300C. Azospirillum có khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như Auxin và Gibberelin giúp bộ rế cây trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếpxúc của rễ với đất. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 31 2.2. Phân lập và tuyển chọn Azospirillum từ cây mía ở tỉnh Cần Thơ(ĐH Cần Thơ nghiên cứu ) Dòng vi khuẩn Azospirillum sp được phân lập từ cây mía, được nuôi cấy trong môi trường NFb lỏng, Pha 15 ml môi trường NFb cho vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ướt 121o C trong 20 phút. Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong vi khuẩn sau khi ly tâm cho vào các ống duharm. Cho 2 ml thuốc thử Salkowski R2 đã pha ở trên vào các ống duharm trên. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm. Kết quả đo OD của các dòng phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn , từ đó suy ra được nồng độ IAA của các dòng. Chủng nào tạo ra nhiều IAA sẽ được chọn làm chủng giống sản xuất phân bón vi sinh. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 32 [5]( &ved=0CB4QFjAA&url=http%3A%2F%2Fpublication.ctu.edu.vn%2Findex.php%2Ftapchi %2Fdoc_download%2F1467-kho-sat-kh-nng-sinh-tng-hp-iaa-va-c-nh-m-ca-vi-khun- gluconacetobacter-sp-va-azospirillum-sp-c-phan-lp-t-cay-mia&ei=zqiSUMPCC- iViAfM9oGQBQ&usg=AFQjCNFbCgUrd0Y4p-CjO3T116TEuJBxtA&sig2=E- xjIv6xqGLSM08YIiVt-g) 2.3. Phân lập và tuyển chọn Azospirillum từ mẫu đất rừng của quận Thanjavur, Tamil Nadu, Ấn Độ[6]  Phân lập từ mẫu đất rừng của quận Thanjavur, , Tamil Nadu, Ấn Độ.  1 g mẫu đất hòa tàn vào nước vô trùng và pha loãng đến 10 8  0,1 ml dịch pha loãng cho vào ống nghiệp chứa môi trường NfB (nitrogen free bromothymol) bán rắn, nuôi cấy ở 32 o C trong vòng 48 h và hình thành một lớp màng mỏng, lớp màng mỏng này được cấy lên môi trường Nfb rắn bằng đường ziczac ở 32 o C trong 24h  Hình thành những khuẩn lạc riêng rẽ có màu trắng, vàng và hồng được cấy lên môi trường thạch muối nhỏ cơ bản nuôi ở 32 o C trong vòng 24h. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 33 [6] d=rja&sqi=2&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pelagiaresearchlibrary.c om%2Fder-chemica-sinica%2Fvol1-iss3%2FDCS-2010-1-3-138-145.pdf&ei=kd-oUP- BJYyjigf1pYHQDg&usg=AFQjCNG_LO9nIBar_G3_dc_7GFd- 6VnEDw&sig2=jrMZ0GUl35lqs0GLlqQuMg Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 34 BẢNG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ĐÃ SỬ DỤNG ĐỂ PHÂN LẬP CHỦNG 1.Thành phần môi trường king B Thành phần 1L 500mL Nước 1L 500mL proteose peptone 20g 10g K2HPO4 1,5g 0,75g MgSO4•7H2O 1,5g 0,75g glycerol 10mL 5mL agar 15g 7,5 mL 2. Môi trường NFb: axit malic- 0,5g; MgSO4.7H2O- 0,2g; NaCl-0,1g; CaCl2-0,02; Na2MoO4-0,002g; MnSO4.H2O-0,01g; EDTA 1,64%-4 mL; Bromothymol xanh 0,5% (W/W trong cồn) -2mL; KOH-4,5g; Biotin-0,1g; nước cất 1L, pH-6,8. 3. Môi trường MSM: 0.4% NH4NO3,0.47% KH2PO4, 0.0119% Na2HPO4, 0.001% CaCl2. 2H2O, 0.1%MgSO4 .7H2O, 0.001% MnSO4 . 4H2O, and 0.0015% FeSO4 . 4H2O,pH 7.0. 4. Môi trường Jensen: sucrose 20g, dipotassium hydrogen phosphate 1g, magnesium sulfate 0,5g, sodium chloride0,5g ferrous sulfate 0,1g, sodium molybdate 0,005g, agar 20g, trong 1 lít nước ph=6,9 5. Môi trường dinh dưỡng thạch agar: 0.5 % peptone , 0.3 % beef extract/yeast extract, 1.5 % agar, 0.5% NaCl, distilled water, pH adjusted to neutral (6.8) at 25 °C. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 35 PHẦN III. GIỚI THIỆU VỀ AZOTOBACTER Azotobacter thường được tìm thấy trong đất và rất hiệu quả cho việc cải thiện độ phì nhiêu của đất và tăng năng suất cây trồng. Nó có thể chuyển hóa nitơ trực tiếp từ không khí giúp cho việc sản xuất ngũ cốc tốt hơn. Azotobacter có xu hướng nhạy cảm với môi trường axit, nồng độ phosphate cao và nhiệt độ trên 35 º C. Azotobacter được tìm thấy trong các rhiosphares của một số nhà máy và có thể sản xuất hormone như chất kích thích tăng trưởng. Azotobacter tự nhiên cố định nitơ trong rhizosphare. Có nhiều chủng khác nhau của Azotobacter, mỗi chủng có tính chất hóa học, sinh học khác nhau đối chút Tuy nhiên, một số chủng có khả năng cố định nitơ cao hơn hơn những chủng khác Bên cạnhviệc cố định nitơ, Azotobacter cũng sản xuất Thiamine, Riboflavin, Indole, Nicotine axit acetic và gibberellins. Khi Azotobacter được áp dụng cho hạt giống, hạt giống nảy mầm được cải thiện đến một mức độ đáng kể 1. Phân lập chủng Azotobacter spp từ đất a. Lấy mẫu Mẫu đất được thu thập từ bảy địa điểm khác nhau, như sau: 1. đất trồng cây họ đậu 2. đất trồng cây thực vật 3. đất trồng lúa 4. đất trồng cỏ 5. đất lâm nghiệp 6. Đất chưa sử dụng 7. Nước sông trầm tích. Lấy mẫu đất được thu thập từ bảy địa điểm khác nhau,mẫu đất thu thập một số nhựa túi xách, bút đánh dấu, thìa, rượu và dao đã được thực hiện. Lúc đầu người ta chọn một khu vực để lấy mẫu, sau đó họ lựa chọn bốn hoặc năm điểm trong khu vực đó và thu thập đất và trộn bốn hay năm điểm mẫu đất với nhau. Đủ lượng đất được thu thập từ mỗi trang web, giữ trong một túi nilon và được gắn thẻ. Mẫu đất được thu thập từ trên 4 cm đất, vì đây là nơi mà hầu hết các hoạt động của vi sinh vật diễn ra, và do đó nơi mà hầu hết vi khuẩn tập trung. Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 36 b. Xác định độ ẩm 50 mẫu gm được cân bằn một cốc thủy tinh 150ml sạch, trọng lượng của cốc thủy tinh đã được cân trước khi đổmẫu đất. Sau đó nó được lưu giữ trong hơn 105 º C ± 3 º C trong 24 giờ, và sau đó một lần nữa trọng lượng của mẫu đất và cốc thủy tinh đã được đưa combinedly. Sự khác biệt về độ ẩm của đất đã được ghi lại và được tính trên độ ẩm của mẫu. c. Xác định PH của mẫu 25 gm (lĩnh vực ẩm) đã được cân trong một cốc thủy tinh sạch và khô ml 150 và 50 ml nước cất đã được bổ sung. Khuấy bằng máy votex. pH của mẫu được đo bằng máy đo PH d. Chuẩn bị môi trường phân lập Người ta chuẩn bị mơ trường cho một lít như sau: Theo phương tiện truyền thông thành phần, các thuốc thử được cân bằng cân bằng điện tử - 1000 ml nước cất đã được đo bằng bình định mức và thực hiện trong một bình nón. - Các thuốc thử (trừ agar) được trộn với nước cất. - Sau khi trộn thuốc thử, pH được điều chỉnh bằng cách thêm HCl hoặc dung dịch NaOH nếu có cần thiết. - Sau khi điều chỉnh pH, agar được trộn vào dung dịch. - Sau khi trộn thạch, môi trường được đem di hấp khử trùng - Cuối cùng môi trường được đổ trong hộp Petri vô trùng. Môi trường dùng cho phân lập Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 37 e. Phân lập 10 gm mẫu thu thập được thêm vào 90 ml nước cất vô trùng trong một bình nón vô trùng (250 ml), lắc kĩ bằng máy votex sau đó để yên trong 30 phút. 1 ml dung dịch mẫu sau đó được chuyển sang ống nghiệm chứa 9 ml nước cất và lắc bằng tay và một lần nữa để yên trong 30 phút. Tiếp tục pha loãng đến 10 5 . Một ml mẫu (từ 101 đến 105 phần nhỏ) được rót trong một tấm Petri vô trùng có chứa khoảng 15 ml môi trưpwngf sau khi hấp khử trùng (45 º C),môi trường Ashby, và sau đó ủ ở nhiệt độ 28 ± 2 º C trong khoảng 2 - 3 ngày. Sau khi ủ,các khuẩn lac lạc xuất hiện trên môi trường . Sau đó người ta tính toán số lượng Azotobacter mỗi gram đất f. Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng trong một số môi trường  Người ta tiến hành nghiên cứu trên mơi trường có nồng độ muối khác nhau thay đổi từ 0-1% sau đó ủ trong vòng 48h ở nhiệt độ 28oC.  Người ta cũng tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của chủng trong điều kiện nhiệt độ thay đổi từ 10oC-50oC để dánh giá khả năng chịu nhiệt của chủng từ đó lựa chọn ra chủng tối ưu phục vụ cho việc sử dụng trong sản xuất phân sau này  g. Kết quả Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy rằng những chủng được lấy từ vùng đất trồng đậu tương có mật độ tế bào nhiều nhất Từ bảng số liệu trên ta thấy rằng không có chủng ở mẫu nào sống sót được ở nồng độ NaCl 1,0%. Các chủng ở các mẫu 1,2,3,4,5 và 6 cho thấy sự tăng trưởng tối đa ở 0% NaCl trong khi các mẫu 1,3,4 đã cho thấy sự tăng trưởng cả ở mức 0% và 0,2% nhưng không như Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 38 nhau,các mẫu 1 và 4 tăng trưởng 0,4% và 0,6% nồng độ NaCl.. 1 và 4 cũng tăng nồng độ NaCl 0,8%. Từ đây có thể thấy rằng các mẫu 1 và 4 có thể được dùng để sản xuất phân bón ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng Ta thấy rằng Tất cả các mẫu phân lập đều tăng trưởng tối đa ở 30 º C. các mẫu 1, 3 và 4 cho thấy tốc độ tăng trưởng tối đa ở 30 º C và 40 º C. Không có mẫu phân lập nào sống sót ở 50 º C. mẫu 4 cho thấy tốc độ tăng trưởng ở mức 10 º C. từ đó ta thấy rằng nhiệt độ ủ của mẫu nên là 30 o C Kết luận nghiên cứu cho thấy rằng mẫu đất được lấy từ những vùng trồng đậu tương là phù hợp nhất với điều kiên canh tac cua cây trồng và nó có thể được dùng để sản xuất phân bón vi sinh giảm giá thành sản phẩm Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN 1 (SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà) 1. 2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ HOẠT TÍNH NITROGENAZA VÀ SINH TỔNG HỢP IAA, Đỗ Thu Hà, ĐH Đà Nẵng, 2008 3. Evidence for a Non- trytophan dependent pathway, E. Prinsen et al,1993. 5. Antifungal and Phytohormone Production Potential of Azotobacter chroococum Isolates from Groundnut Rhizophere, 2009. 6. Biosynthesis of cytokinins, Tatsuo Kakimoto, 2003. PHẦN 2 (SVTH: Đặng Thị Thuý) [1] chn-cac-chng-vi-khun-pseudomonas-co-kh-nng-hoa-tan-lan-va-sinh-tng-hp-auxin-cao [2] &ved=0CCoQFjABOAo&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissue s%2Fbiy-08-32-1%2Fbiy-32-1-2-0703- 5.pdf&ei=IHuoULHRPIijiAfdjYGoCg&usg=AFQjCNGBU8AVhSniRQ1Ei3AoehXxm6mT WA&sig2=lYxclDRKbnAJY_c_Brq8Yg [4] &ved=0CFoQFjAG&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissues%2 Fbiy-05-29-1%2Fbiy-29-1-5-0410- 1.pdf&ei=xlWoUOSpAoqhiAe8_IDoCw&usg=AFQjCNGdepVDJ- zpSRulhrOxdh5AMWDGiA&sig2=q9VLw4FUjswdvndc3qjO9g [5] &ved=0CB4QFjAA&url=http%3A%2F%2Fpublication.ctu.edu.vn%2Findex.php%2Ftapchi %2Fdoc_download%2F1467-kho-sat-kh-nng-sinh-tng-hp-iaa-va-c-nh-m-ca-vi-khun- gluconacetobacter-sp-va-azospirillum-sp-c-phan-lp-t-cay-mia&ei=zqiSUMPCC- iViAfM9oGQBQ&usg=AFQjCNFbCgUrd0Y4p-CjO3T116TEuJBxtA&sig2=E- xjIv6xqGLSM08YIiVt-g [6] &sqi=2&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pelagiaresearchlibrary.com%2Fder -chemica-sinica%2Fvol1-iss3%2FDCS-2010-1-3-138-145.pdf&ei=kd-oUP- BJYyjigf1pYHQDg&usg=AFQjCNG_LO9nIBar_G3_dc_7GFd- 6VnEDw&sig2=jrMZ0GUl35lqs0GLlqQuMg PHẦN 3 (SVTH: Nguyễn Văn Hùng) Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 40