Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật

TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRÊN VI SINH VẬT SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT MSSV : 60604096 GVHD : NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN MỤC ĐÍCH Cung cấp chính xác thông tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống của vi sinh vật. 1. Quy trình thực hiện Chuẩn bị mẫu và đầu dò. Trộn mẫu với đầu dò. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào. Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai. Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp). Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả. 1. Quy trình thực hiện Đầu dò - Đầu dò: Là những oligonucleotide dài từ 15 đến 30 bp, có trình tự bổ sung với các rRNA 16S của tế bào vi sinh vật. 1. Quy trình thực hiện Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dò Có 2 cách cơ bản: - Đánh dấu trực tiếp: không cần bước dò tìm sau quá trình lai. - Đánh dấu gián tiếp: đánh dấu bằng một số hợp chất chỉ thị trung gian, đồng thời phải tiến hành dò tìm sau quá trình lai. 1. Quy trình thực hiện 1. Quy trình thực hiện Thuốc nhuộm huỳnh quang Đặc điểm quan trọng: các chất huỳnh quang có các mức năng lượng kích thích và phát xạ khác nhau. Cho phép phát hiện đồng thời hai hay nhiều vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất. 1. Quy trình thực hiện Thuốc nhuộm huỳnh quang 1. Quy trình thực hiện Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ Mục đích: đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng. Hình thức: ngâm mẫu trong các dung dịch hoặc xử lý bằng enzym. 1. Quy trình thực hiện Lai Yêu cầu: Kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng với số lượng lớn nhất. 1. Quy trình thực hiện Lai Điều kiện: Môi trường tối ẩm. Nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC. Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ. 1. Quy trình thực hiện Quan sát và xử lý tín hiệu Kính hiển vi có trang bị dải lọc nhiều tần (hoặc kính hiển vi laze quét đồng tiêu). Máy ảnh CCD. Phần mềm xử lý ảnh kỹ thuật số. 1. Quy trình thực hiện Kính hiển vi laze quét đồng tiêu 2. Trở ngại của FISH Kết quả không chính xác Các chất tự phát huỳnh quang Đầu dò thiếu tính đặc hiệu 2. Trở ngại của FISH Không thu được kết quả Số lượng đầu dò quá ít Cấu trúc của đầu dò hay trình tự đích quá phức tạp Hàm lượng rRNA thấp Ảnh chụp bị mất màu 3. Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật FISH được sử dụng trên toàn thế giới để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong tự nhiên như môi trường dưới nước, trong đất hay trên bề mặt rễ thực vật. 3. Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật Một ví dụ điển hình khi sử dụng FISH để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan. Đây là một loại vi khuẩn hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA. 3. Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật Quá trình lai được thực hiện trong dung dịch bao gồm: Dung dịch đệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2) Formamide 20%. Đầu dò oligonucleotide REX72 (5’-TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’). Đầu dò LGC353b (5’-GCGGAAGATT CCCTACTGC-3’). 3. Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật Cuối cùng, mẫu được nhuộm với dung dịch chứa 1mg 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). 3. Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật DAPI nhận biết tất cả các vi sinh vật với tín hiệu màu xanh. Các đầu dò LGC252b sẽ được nhuộm với Cy3 để phát hiện các tế bào vi khuẩn Bacillus và bào tử với tín hiệu màu đỏ Đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang với các ribotype DA001 của Bacillus. 3. Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật Dò tìm vi khuẩn bacillus mang gen DA001 sử dụng ba chất nhuộm khác nhau trên cùng một mẫu đất 3. Ứng dụng của FISH Hệ vi sinh vật trong nước thải FISH sử dụng các đầu dò oligonucleotideđược tạo ra bằng những kỹ thuật phân tử như PCR để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong nước thải, bùn hoạt tính. 3. Ứng dụng của FISH Vi sinh vật cộng sinh Khi sử kỹ thuật FISH với các trình tự rRNA 16S, các vi khuẩn cộng sinh có thể được phát hiện, từ đó tiến hành định danh và phân cấp phát sinh loài. 3. Ứng dụng của FISH Ứng dụng vào y học Nghiên cứu các quần thể vi khuẩn phức tạp trong cơ thể người và động vật. Khoang miệng Dạ dày Phổi 3. Ứng dụng của FISH Ứng dụng vào y học Nghiên cứu và phát hiện các bệnh có nguồn gốc từ nấm Candida đối với các bệnh nhân suy giảm miễn dịch. 3. Ứng dụng của FISH Ứng dụng vào y học Xác định chính xác các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật và thực vật để từ đó kiểm soát và triệt tiêu mầm bệnh này. Khoai tây mục héo và hóa nâu do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Penaeus vannamei gây bệnh trên loài tôm trắng 4. Triển vọng của FISH Trên thế giới - Thực hiện hoàn toàn tự động, nhanh chóng chẩn đoán chính xác vi sinh vật. - Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn. 4. Triển vọng của FISH Trên thế giới - Kỹ thuật FISH với độ nhạy cao, sử dụng được đối với mRNA, một trình tự không ổn định và có số lượng bản sao thấp. - Sử dụng đầu dò acid nucleic peptide trung hòa điện thay cho oligonucleotide. 4. Triển vọng của FISH Tại Việt Nam FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền: Việc chẩn đoán trước sinh và sau sinh những bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể của thai nhi. Phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền. Xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc. Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư. 4. Triển vọng của FISH Tại Việt Nam Việc phát triển kỹ thuật FISH ở Việt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì đầu tư cho kỹ thuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kỹ thuật của nước ta. Cám ơn sự lắng nghe của quý thầy cô và tất cả các bạn!