MỤC LỤC
Phần I: Tổng quan về enzym amylase
I. Phân loại enzyme amylase
II. Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym amylase
I.1. α-amylase
I.2. β-amylase
I.3. γ-amylase
I.4. oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn
I.5. Pullulanase
I.6. α-glucosidase hay maltase
Phần II: Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
I. Giới thiệu chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
II. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae
Phần III: Công nghệ sản xuất enzym α-amylase
I.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
I.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt
I.2. Qui trình sản xuất
II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
II.1. Nguyên liệu
II.2. Qui trình công nghệ
II.3. Các yếu tố ảnh hưởng khi thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae
II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm
II.3.2. Các yếu tố dinh dưỡng
II.3.3. Các yếu tố khác
Phần IV : Ứng dụng
Phần V: Phụ lục và tài liệu tham khảo
GIỚI THIỆU :
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con
người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì
sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng
nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta
sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino
acid, .
Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và giai đoạn đường hoá.
Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân
tinh bột bằng acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và
H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không
mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để
thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực
phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV.
Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất
có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách
chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra,
amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không
yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường.
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,
Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì, đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm
thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác
phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải,
CHÚ THÍCH : TÀI LIỆU TRÊN GỒM FILE PDF + WORD
27 trang |
Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 9575 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tìm hiểu và thu nhận enzyme amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
enzyme này thuộc nhóm enzyme
thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
Exoamylase
R.R’ + H-OH
Amylase
RH + R’OH
Endoamylase
β-amylase
γ-amylase
Khử trực tiếp
α-dextrin 6 – glucosidase
(Pullulanase)
Enzyme khử nhánh
α-amylase
Khử gián tiếp
Oligo-1,6 glucosidase
(transglucosidase)
Và amilo 1,6-glucosidase
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen
II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym amylase
II.1. α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ
hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic.
Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:
-
-
-
α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ).
Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
4
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
-
-
-
Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).
α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam
Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định
cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Thành phần amino
acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ):
Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide.
Polysaccharide này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên mỗi mol enzyme ( Akabori
et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành
phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng
của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 )
α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó
sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân
cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh.
5alamine6,8glycine6,6valine6,9leucine8,3Isoleucine5,2prolin4,2phenylalanine4,2tyrosine9,5trytophan4,0xetin6,5trionin10,7cystein + cystine1,6glutamic acid6,9amide1,5
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose,
thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột
thành đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể
lên tới 84-87%.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích
cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ). Theo số
liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae
trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-
7,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với
acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt
hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của
nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi
bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8.Ở 0oC và
pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất,
α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở
70OC( Kozmina, 1991 ).
Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm
chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C
trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ).
α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách
các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh
bột nguyên song với tốc đột rất chậm.
6
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một
lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin
đều bị dịch hóa nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo
ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới
disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng
đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1).
+ Sau đó, các mạch glucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch glucose colagen cứ ngắn dần
và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm
thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy
ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và
19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và
dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân
tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc
trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
II.2. β-amylase
Còn có tên gọi khác là α-1,4-glucan-mantohydrolase 3.2.1.2
β-amylase xác tác sự thuỷ phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide
đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch.Maltose tạo thành có cấu hình β,
vì thế amylase này được gọi là β-amylase.
β-amylase không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên lành mà thuỷ phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase
phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thuỷ phân
amylapectin tạo thành được 10-12 phân tử maltose,phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất
nhiều liên kết α-1,6 glucoside.
β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa các nhóm-SH và nhóm –COOH cùng với vòng
imidazol của các gốc histidin.
pH tối tích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4,6 và nhiệt độ tối thích trong dung
dịch tinh bột thuần khiết là 40-500C, β-amylase bị vô hoạt ở 700C. β-amylase chỉ phố biến trong thế giới thực
vật đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase.
II.3. γ-amylase ( α-1,4-glucan-glucohydrolase,3.2.1.3 hay Glucoamylase )
7
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
γ-amylase có khả năng xúc tác thuỷ phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Vì thế các nhà nghiên cứu
Nhật Bản ( 1964-1984) đã đề nghị đặt cho nó một tên phân loại khác là α-1,4-glucan-glucohydrolase. γ-
amylase được các nhà khoa học Nhật Bản tách ra lần đầu tiên từ Asp.awamori. Sau đó nó được tìm thấy trên
Rhizopus delemar, Asp.niger, Asp. oryzae rồi ở các nhóm VSV khác và ở mô động vật.
γ-amylase là enzyme ngoại phân, nó thuỷ phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Khi
thuỷ phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. γ-amylase có khả năng thuỷ
phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose. Các
cơ chất có cấu tạo phân nhánh bị γ-amylase tấn công với tốc độ khá lớn. Đa số γ-amylase đã biết đều thuộc
loại enzyme “acid”. Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5-5,5. So với α-amylase, γ-amylase bền hơn đối với
acid nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo bảo vệ bằng Ca2+ .
Điểm đẳng điện của γ-amylase từ các nguồn khác nhau không đồng nhất: γ-amylase từ Asp.niger là
6,5, γ-amylase từ Asp.amamori là 7,5, γ-amylase từ Rh.delamar là 7,4.
Hiện nay chỉ mới biết được phân tử lượng của một số chế phẩm γ-amylase tinh thể. Chẳng hạn như
phân tử lượng của γ-amylase tách từ Asp.niger là 97000Dal.
II.4. Oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn
Enzyme này thuỷ phân các loại liên kết α-1,6 glucosid trong izomaltose, pantose và các dextrin tới hạn
và có thể chuyển hoá các chất này đến các loại đường lên man được.Các loại nấm sợi Asp.awamori,
Asp.oryzae, Asp.usamii sinh tổng hợp enzyme này mạnh hơn cả. Chúng thuỷ phân dextrin sâu sắc hơn là α,β-
amylase, do đó mà maltose được tích tụ nhiều trong dung dịch thuỷ phân. Các dextrinnase hoạt động tối thích
ở nhiệt độ 400C và pH 5,1.
II.5. Pullulanase
Ở vi khuẩn Aerobacter aerogenes người ta tìm thấy các enzyme có khả năng thuỷ phân liên kết α-1,6
glucoside trong các polyose và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen. Cơ chất đặc thù cho enzyme này là
pullulan- một polyose được tách từ giả nấm men Aureobasidium punllana sym.Pullulasia pullulans.
Phân tử lượng của Pullulanase là 145 000 Dal, chế phẩm enzyme thu được khi kết tủa bằng aceton có
pH hoạt động tối thích là 5,0 và nhiệt độ tối thích là 47,50C. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside
bị bao quanh bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thuỷ phân cả những dextrin phân tử thấp.
II.6. α-glucosidase hay maltase
Nấm sợi sản sinh enzyme này. Nó thuỷ phân maltose thành glucose nhưng không thuỷ phân tinh
bột.Một số tác giả cho rằng nó có hoạt tính glucosyltransferase, tức là có khả năng chuyển các gốc glucosyl
sang đường và rượu.
Phần II: Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae
8
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình này xảy ra ở điều
kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về
mặt hình thức và phương diện thì khác nhau hoàn toàn.
Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự tham gia tổng hợp
nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự
nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không
được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do
dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất.
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt
độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát
hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến
cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện .
I. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Condium of Aspergillus oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể
sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và
có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành
những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của
Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên
gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các
tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của
Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…
9
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Đặc điểm của giống Asp.oryzae: giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease,
pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng
không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp
mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và
phát tán khắp nơi, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.
II.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ
chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất,
thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ nơi cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời
gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống
này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí
nghiệm.
Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.
Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây.
Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn
mẫu.
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước
cất vô trùng.
Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.
Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi
trường PDA (Potato Dextro Agar).
Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3
ngày.
10
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung
quanh khuẩn lạc.
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị
cho tinh bột.
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho
phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông.
-Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng
của nấm:
PH = 6,5
Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong
15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200
vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu
quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.
11KH2PO41,4mlMgSO4.7H2O0,1mlNH4NO310mlFeSO4.7H2O0,01mlKCl0,5mlhồ tinh bột20ml
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase
I. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
Thiết kế công nghệ:
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt.
Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là
phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống.
I.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi
trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
-
-
-
-
-
Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp.
Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm.
Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện
nay phát triển mạnh trở lại.
Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau
khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng
như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh,
không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối
nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn.
Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy.
Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn)
nên rất cần nhiều diện tích.
Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng
( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2
từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan
vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến
hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước
phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác.
Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá
lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao
môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao.
Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ
5-7 cm là hợp lý.
12
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng
môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử
dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.
Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi
trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các
hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV.
VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí (
không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường
nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại ,
không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho
VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý.
Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm
20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho lên men ở nấm mốc Asp.oryzae.
I.2. Qui trình sản xuất
Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng
Ống mốc giống
Cấy chuyển
Nuôi cấy 30-32oC trong 5-6 ngày
Chuẩn bị môi trường
trong bình tam giác
Ngô mảnh hấp
thanh trùng
Nước vô trùng
Giống trong ống
thạch nghiêng
Trộn đều bào tử
Nuôi cấy 30-32 oC
trong 5-6 ngày
Mốc giống trong
bình tam giác
Mốc giống cho
Làm tơi
Trộn giống 0,5 – 10%
Nuôi mốc 60 h
sàn xuất
Sấy khô
Bao gói
13
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
II.1. Nguyên liệu
Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ
tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô
công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan
tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả
người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ
tìm:
Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo
(Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999)
- Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và
prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản.
- Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin,
có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và
carotenoid.
+Thành phần dinh dưỡng của ngô:
(Cortez và Wild-Altamirano,1972)
Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như
cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám
gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát
14Thành phần dinh dưỡng /100gBắp nếpBắp ngọtProtein9,112,9Tinh bột72,869,3Lipid(tổng số)2,23,9Cellulose1,82,9Nước11,29,5Khoáng2,91,5
Thành phần
dinh dưỡngĐơn vị
tínhHàm lượng/100gProteing6Tinh bộtg82Lipid (tổng số)g0,8Cellulseg0,6Nướcg10,2Năng lượngkcal361
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
triển. Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết
dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu.
Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ
thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường,
tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta thấy rằng
nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt
môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha
khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn
hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt.
.
15
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
II.2. Qui trình công nghệ
Nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu
Hấp thanh trùng
Làm nguội
Trộn giống VSV
Nuôi cấy
Thu nhận phế phẩm
enzyme thô
Nghiền mịn
Trích ly
Lọc
Kết tủa enzyme
Sấy
Lọc
Giống VSV
Nhân giống
Giống cho sản xuất
Bã
Cồn hoặc Sulfat amon
Thu nhận kết tủa
Hoà tan trong dịch
đệm
Sấy kết tủa
Sắc ký trao đổi ion
chế phẩm ezyme bán
tinh khiết
Tách rửa
chế phẩm enzyme tinh
khiết
Sấy khô
Siêu lọc
Thu enzyme
16
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Thuyết minh qui trình:
Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì, cám gạo. Hai loại này là
nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm
chất khác nữa. Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt tiền. Hơn nữa
trong quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn
thêm một số cấu tử rẻ tiền hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp cho
hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực enzyme cao nhất. Đặc biệt chú
ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không
hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%.
Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để
đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai, cần thanh
trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Để thuận lợi cho việc thanh
trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng
HCl hay H2SO4 để điều chỉnh pH môi trường.
Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận enzyme.
Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã
thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay tại các phân xưởng
nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu
bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại
enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của
môi trường.
Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm,
rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không
khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không
khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng
không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường
tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
17
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng
nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải
qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có
những thay đổi sau:
-Nhiệt độ tăng rất chậm.
-Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
-Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
-Khối môi trường còn rời rạc.
-Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ
cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:
Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra
những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường.
-Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường.
-Môi trường được kết lại khá chặt
-Độ ẩm môi trường giảm dần
-Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C.
-Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
-Enzyme amylase được tổng hợp mạnh.
-Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh
và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất.
18
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:
-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại.
-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không
khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành
nhiều do đó luợng enzym amylase tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu
nhận enzym rất cần thiết.
Thu nhận chế phẩm enzyme thô :Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym
amylase, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh
khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy
khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không. Độ ẩm cần
đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi
người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ
lên đến 60-70 độ C.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch.
Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết
người ta phả tiến hành như sau:
Nghiền: Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền.Mục đích của quá trình nghiền là
vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô.Khi thành tế bào được phá vỡ ,các
enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.Phần lớn enzym amylase ngoại bào
khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường.Khi ta nghiền nhỏ,
enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.
Trích ly:Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α-amylase. Các loại enzyme
thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một
phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng
dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho
gia súc ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác
từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này.
Quá trình kết tủa enzym α-amylase: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những
tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sulfat amon. Hai tác nhân kết
tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết
tủa xuống từ 4-70C để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym
thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
19
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung
dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều
kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7OC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người
ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).
Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa
enzyn α-amylase ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun
sương – có thể xem ở phần phụ lục).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt
hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzym ngoài enzym amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzym α- amylase
này còn chứa hoạt tính protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzym có độ tinh khiết
cao hơn ta phải tinh tiếp tục tinh sạch enzyme.
Hoà tan trong dung dịch đệm Tris-HCI 0,05M ( pH 8) nhằm giúp trạng thái pH trong dung được ổn
định.
Thực hiện sắc kí trao đổi ion đối với dung dịch enzyme vừa hoà tan bằng cột DEAE-cellulose với
mục đích loại các protein tạp kể cả các acid Nucleic khỏi enzyme. Có thể tiếp tục thực hiện tiếp lần lọc thứ hai
sau lần lọc thứ nhất nhưng thay chất giá cellulose bằng chất giá Sephadex.Sau đó enzyme được tách rửa bằng
NaCl nồng độ 0-0,5M.
Dịch enzyme sau thu sẽ được đưa đi siêu lọc nhằm cô đặc enzyme lại. Đem enzyme đi sấy khô để
được enzyme dạng bột tinh khiết..
Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩm enzyme gọi là enzyme không
tan (hay enzym cố định).Một số phương pháp chủ yếu tạo enzyme không tan: Phương pháp hấp phụ vật lí;
Phương pháp đưa enzyme vào khuôn gel; Phương pháp cộng hóa trị của enzyme và chất mang đây là phương
pháp được dùng phổ biến nhất
II.3. Các yếu tố ảnh hưởng khi thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae
II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm
Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối
VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường.
Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa
là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme
amylase kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định
tiếp theo sau.
20
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể
tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự
tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp
enzyme cực lớn.
II.3.2..Các yếu tố dinh dưỡng
Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc
Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi
nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu
qủa hơn so với các loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….).
Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp
amylase khác .Ví dụ:Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụng các nguồn Nitơ từ
những muối khác nhau.
(bảng : Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase)
( Sách Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng chủ biên, 2004)
Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn carbon và Nitơ trong môi trường phù hợp cho mốc
Asp.oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và Nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự
sinh tổng hợp sinh khối của nấm Asp.oryzae và sự tạo thành amylase.
Ảnh hưởng của Amino acid
Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số các amino acid không đồng
nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới.
Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như việc sinh tổng hợp enzym amylase do những
nguyên nhân sau:
-Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon , nguồn Nitơ vừa là nguồn năng lượng.
-Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid ,Aspatic acid….) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong
trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong qúa trình chuyển amine hóa. Nhờ một
số amino acid trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng CO2 (Araiet al,1968).
21Nguồn NitơLiệu lượng muối, %
theo NHoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với
100mlNguồn NitơLiệu lượng muối, %
theo Nα-amylaseGlucomylaseNaNO30,301458000NaNO30,15263300(NH4)2SO20,15--NH4NO30,15984100NH4NO30,30454900NH4H2PO40,305,58000
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
-Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: Pantotenic acid,
biotin, folic acid, …các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự
tổng hợp ARN trong tế bào một số VSV phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi
(Kurland, Marloe, 1962 ).
-Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid
kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược lại và
một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Các yếu tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzym, α-amylsae ở nấm
mốc Asp.oryzae.
-Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bên nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp
mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967).
Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α-amylase là 0,05%.
-Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và
nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng
trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzym. Các muối phosphate thường được
dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0,1% KH2PO4.
-Canxi(Ca) cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của
enzym này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease ( Hsiu et amiloza, 1964). Muốn
tích lũy nhiều α-amylase cấn có lượng Ca trong môi trường là 0,01-0,05%.
-Lưu huỳnh(S) kích thích sự tạo amylase ( S có trong thành phần của các amino acid quan trọng :
methionine, cystein, cystine). Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môi trường là thích hợp nhất cho
Asp.oryzae tạo amylase.
Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng. Chẳnng hạn như: Coban,
kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, …
II.3.3. Các yếu tố khác
22
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Độ ẩm(w) môi trường: Tốt nhất cho sự hình thành enzym của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm
môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị
giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase
của
Asp. Oryzae
nuôi bằng phương pháp bề
mặt:
BẢNG: Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp.oryzae nuôi
bằng phương pháp bề mặt
Điều này thật sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong
suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi.
-Ảnh hưởng của không khí: Asp.oryzae là VSV hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi
đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải xốp, rải thành lớp dày không quá 2,5-3cm, phòng
nuôi phải thoáng. Theo thực nghiệm, để thoả mãn cho sự hô hấp của nấm mốc Asp.oryzae trong toàn bộ chu
kỳ phát triển cứ cách 1giờ, môi trường cần khoảng 1,7m3 không khí. Asp. oryzae phát triển bình thường khi
nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%.
-Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng
của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzym amylase. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình
thành enzym là 28-320C. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn. Do vậy
cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 270C và không cao hơn 360C. Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng
của nấm mốc cám có thể chia làm hai thời kỳ:
+Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ đầu. Trong thời kỳ này cần phải cung cấp nhiệt
cho phòng nuôi không hơn 23-300C . Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%.
+Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (có thể đạt từ 4-18 giờ).
-Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng nấm mốc Asp. oryzae có hoạt động cực đại của amylase
ở khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42. Một số chủng cho hai cực đại của
enzym, ví dụ: cực đại của enzym amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ 60. Do đó, thời gian nuôi mốc có thể kéo dài
từ 60-72 giờ. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo
bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzym. Đối với Asp. Oryzae, sự tạo
hoạt lực tối đa thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử.
-Ảnh hưởng của pH: pH thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid yếu khoảng 5,5-6.5. Các môi
trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh
23Phương án
thí nghiệm20 giờ34 giờ42 giờPhương án
thí nghiệmĐộ ẩm
%Hoạt độ
amylase đối
với canh
trường khôĐộ ẩm
%Hoạt độ
amylase
đ/v g canh
trường
khôĐộ ẩm
%Hoạt độ
amylase đối
với canh
trường khôKhay để hở27,815,023,818,022,020,5Khay đậy nắp46,420,442,432,942,436,7
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng
khuếch tán trong một vài thế hệ.
Phần IV: Ứng dụng
Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đa và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công
nghiệp. Thực tế đa có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đa được
khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không
chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong
nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so
với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử".
Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó
những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,… và một số enzym đặc biêt khác đã
thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này.
I.Ứng dụng amylase trong sản xuất bia
Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzym amylase của
malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp. Cơ sở
khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy
mầm (malt), enzym amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra
năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzym của
chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzym amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong hạt.
Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản
phẩm. Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không sử dụng hoàn tòan 100%
nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung
nguồn tinh bột cho quá trịnh lên men. Lý do là một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp
cho người tiêu dùng và một phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho
bia. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzym amylase cung cấp
cho quá trình thủy phân tinh bột .Enzym này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô
công nghiệp.
Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzym cellulose có tác dụng phá vỡ
thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần có trong tế bào hạt thóat ra phía ngoài nhờ đó chất lượng bia
được nâng cao hơn. Một loại enzym khác cũng được sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzym này
được sử dụng để loại trừ O2 có trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều.
II.Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn:
Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau.Ví
dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các
nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Qúa trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và
giai đọan rượu hóa.
24
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase ( không thể sử dụng phương
pháp thủy phân tinh bột bằng acid ). Người Nhật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình đường
hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc
để đường hóa rượu trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo
cách đây hàng ngàn năm.
Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết
sử dụng enzym này thay amylase của malt để sản xuất cồn. Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt (
mầm mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ sự du nhập kỹ thuật này từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một
khối lượng malt khổng lồ trong sản xuất rượu.
Giai đọan rượu hóa, nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem đây là một quá trình áp
dụng enzym. Qúa trình rượu hóa là quá trình hết sức phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ
đường thành cồn nhờ sự tham gia của nhiều enzym khác nhau. Điểm khác với enzym amylase là ở chổ các
enzym tham gia quá trình rượu hóa nằm trong tế bào nấm men. Việc điều khiển các quá trình chuyển hóa bởi
enzym trong tế bào thực chất là quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường.
III.Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc.
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng
này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, ng ười ta thường cho
thêm enzym amylase vào. Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình
chuyển hóa tinh bột tốt hơn.
IV.Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt
Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho vải
mềm.Trong vải thô thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, khi sử dụng chế phẩm
enzym amylase của vi khuẩn vải sẽ tốt hơn. Người ta thường sử dụng l ượng chế phẩm amylase khỏang 0,3-
0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90oC.
Tuy nhiên ngoài chế phẩm enzym amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm
đến việc sử dụng amylase từ nấm sợi.Cho đến nay có rất
nhiều nước đã sử dụng enzym trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi.
Các nước sử dụng lượng enzym amylase nhiều nhất trong lĩnh vực này là Mỹ, Nhật, Pháp, Đan Mạch.
Ngoài ra, enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột,
sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy
mô công nghiệp.
25
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Một số chế phẩm enzyme amylase thương mại
26Chế phẩm enzymeTên thương mạiHãng sản xuấtα-amylase vi khuẩnTenase
Optiamyl
BAN
RapidaseMils lab
Miles Kali-chemie
Novo-nordisk
Gist-brocadesα-amylase vi khuẩn chịu nhiệtTermamyl
Taka-them II
Taka-lita
Opti-therm
MaxamylNovo-nordisk
Miles lab
Miles lab
Mile Kali-chemie
Gist-brocadesAmyloglucosidaseDiazym
Optidex
AMG
Spezym
AmygaseMiles lab
Miles Kali-chemie
Novo-nordisk
Fiun Biochemical
Gist brocadesβ-amylaseDextrozym (chứa AMG)
PromozymNovo-nordisk
Novo-nordiskAmylase nấm sợiBiozym
MKC,Fugal amylase
Fungamyl claraseAmano
Novo-nordisk
Miles labGlucose isomeraseSweetzym
Ketomax 100Novo-nordisk
UOP
Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Thị Hiền ( chủ biên), Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền,
NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2006
2. Nguyễn Đức Lượng và một số tác giả, Công nghệ enzym, NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2004
3. Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật công nghiệp ( Công nghệ vi sinh Tập 2), NXB Đại học quốc gia
Tp.HCM, 2006
4. Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2006
5. Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình công nghệ enzym, Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Tp.HCM,
2008
6. www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf
7. www.en.wikipedia.org
8.
9.
27
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- DA cong nghe protein va enzyml.docx
- DA cong nghe protein va enzyml.pdf