Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo biển quang tự dưỡng thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

ên cứu thử nghiệm sử dụng sinh khối I. galbana HP1, N.oculata HP2, S. mangrovei PQ6 để nuôi một số loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ. 2.4. Xử lý số liệu Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố (oneway – ANOVA) để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P< 0,05). CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài VTB thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis 3.1.1. Phân lập các loài VTB thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis dựa trên các đặc điểm hình thái 6 Từ các mẫu nước thu được ở các vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Nha Trang- Khánh Hòa, chúng tôi đã phân lập được 3 mẫu Isochrysis spp. và 3 mẫu Nannochloropsis spp. Hình thái tế bào của các mẫu Isochrysis spp. có dạng đơn bào, hình cầu hoặc elip, màu nâu vàng, có 2 roi bằng nhau, dài 7 µm, có khả năng chuyển động hoặc đứng yên, có kích thước chiều dài 4,4 - 5,3 μm; chiều rộng 2,7 – 3,5 μm; chiều dầy 2,1 – 3,0 μm. Tế bào của các mẫu Nannochloropsis spp. có dạng đơn bào, dạng hình trứng, không có roi, màu xanh, kích thước dao động khoảng 2,6 - 3,6 μm (Hình 3.1 và Hình 3.2). Hình 3.1. Hình thái tế bào của 6 mẫu Isochrysis spp. và Nannochloropsis spp. phân lập ở vùng biển Việt Nam dƣới kính hiển vi quang học Dựa trên các đặc điểm hình thái (quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét), chúng tôi đã phân lập được 3 chủng Isochrysis spp. và 3 chủng Nannochloropsis spp. ở các vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh và Nha Trang - Khánh Hòa trong năm 2008-2009. x 10000 x 10000 Isochrysis sp. HP1 Isochrysis sp. NĐ1 Isochrysis sp. NT1 x 10000 Nannochloropsis sp. HP2 Nannochloropsis sp. QN1 Nannochloropsis sp. NT2 Hình 3.2. Hình thái tế bào của 6 mẫu Isochrysis spp. và Nannochloropsis spp. dƣới kính hiển vi điện tử quét x 15000 x 15000 x 15000 x 1500 Nannochloropsis sp. HP2 Nannochloropsis sp. QN1 Nannochloropsis sp. NT2 x 2000 x 2000 x 2000 Isochrysis sp. HP1 Isochrysis sp. NT1 Isochrysis sp. NĐ1 x 1500 x 1500 4 µm 4 µm 4 µm 3 µm 3 µm 3 µm 7 3.1.2. Lƣu giữ các chủng VTB thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis 3.1.2.1. Lưu giữ giống ở nhiệt độ phòng Việc lưu giữ được các chủng giống Isochrysis spp. và Nannochloropsis spp. sau khi phân lập được trong điều kiện phòng thí nghiệm có ý nghĩa quan trọng, góp phần bổ sung cho bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo. Ở nhiệt độ phòng, chúng tôi đã lưu giữ được các chủng này trên môi trường lỏng. Mẫu được cấy chuyển với chu kỳ 1-2 tháng/lần tùy thuộc vào đặc điểm sinh học của từng chủng và lưu giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ). Giữ giống VTB trong môi trường lỏng có ưu điểm dễ tiến hành và có khả năng hoạt hóa mẫu nhanh. Tuy nhiên, do phải cấy chuyển thường xuyên nên khả năng mẫu bị nhiễm khuẩn, nhiễm chéo là rất lớn, ngoài ra tốn diện tích lưu giữ, môi trường nuôi, thời gian và công sức khi cấy chuyển. Vì vậy, để khắc phục và đảm bảo cung cấp nguồn giống ổn định lâu dài, chúng tôi tiến hành lưu giữ các chủng giống phân lập được trên môi trường thạch có bổ sung 1,2% agar (Hình 3.3). 3.1.2.2. Lưu giữ giống ở nhiệt độ thấp Chúng tôi đã lưu giữ được chủng Nannochloropsis sp. HP2 ở - 80°C có bổ sung 10%DMSO. Kết quả sau 24 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phòng, các chủng này có tỉ lệ sống sót cao nhất, đạt 62,45% (ngày thứ 18 sau khi hoạt hóa) trong khi đó tỷ lệ sống sót tự nhiên của chúng chỉ đạt có 35,44% (Hình 3.4). Isochrysis sp. HP1 Isochrysis sp. NĐ1 Isochrysis sp. NT1 Hình 3.3. Khuẩn lạc của các chủng Isochrysis spp. và Nannochloropsis spp. phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch Nannochloropsis sp. HP2 Nannochloropsis sp. QN1 Nannochloropsis sp. NT2 Hình 3.4. Tỷ lệ sống sót của chủng Nannochloropsis sp. HP2 ở nhiệt độ - 80°C có sử dụng 10% DMSO 8 Kết quả bảo quản chủng Isochrysis sp. HP1 ở -80°C có bổ sung 10% DMSO đã cho thấy sau 7 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ sống sót của chúng chỉ đạt 7,3%; tế bào bị vỡ và hầu như không có khả năng phục hồi trở lại ở nhiệt độ phòng. Vì vậy, chúng tôi chỉ tiến hành lưu giữ chủng Isochrysis sp. HP1 phân lập được trong môi trường lỏng và ở nhiệt độ phòng. 3.1.2.3. Sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản Các chủng VTB phân lập ở vùng biển Việt Nam được sử dụng làm thức ăn sống cho NTTS cần phải hội tụ được một số đặc điểm như: sinh trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng và có khả năng nuôi trồng trên qui mô lớn. Dựa trên khả năng sinh trưởng của các chủng đã phân lập được trong môi trường lỏng (đánh giá qua MĐTB, thời gian đạt mật độ cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc trưng), thành phần dinh dưỡng (hàm lượng protein, lipit và hydratcacbon), chúng tôi đã chọn được 2 chủng tiềm năng Isochrysis sp. HP1 và Nannochloropsis sp. HP2 phân lập từ vùng biển Hải Phòng làm đối tượng nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.3. Định tên khoa học các chủng thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis bằng kỹ thuật đọc và so sánh trình tự nuleotit của đoạn gen 18S rRNA * Kết quả tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng tiềm năng Isochrysis sp. HP1 và Nannochloropsis sp. HP2 được trình bày ở Hình 3.5. * Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của chủng Isochrysis sp. HP1 Độ phần trăm tương đồng của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Isochrysis khá cao từ 81,5% đến 99,5%. Hai loài Crypthecodinium cohnii (Seligo) Chatto và Fucus distichus Linnaeus được sử dụng làm nhóm ngoại của chi Isochrysis. Trên cây phát sinh chủng loại của chi Isochrysis được chia thành 2 nhánh, nhánh thứ nhất là loài C. cohnii có độ tương đồng so với các loài thuộc chi Isochrysis đạt 81,5%; nhánh thứ 2 được chia thành 2 nhánh phụ, nhánh phụ thứ nhất là loài F. distichus (độ tương đồng đạt 84%) và nhánh phụ thứ 2 là các loài thuộc chi Isochrysis. Trong đó, chủng Isochrysis sp. HP1 phân lập được từ vùng biển Hải Phòng có tỷ lệ phần trăm tương đồng cao nhất là 99,5% với loài I. galbana Parke (AJ246266), tiếp theo đến loài Isochrysis sp. CCAP 927/14 (DQ79859) đạt 99,4% và thấp nhất là loài Isochrysis sp. MIBC 10557 (AB183617) đạt 98,0%. Do vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái, tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi Isochrysis, chúng tôi có thể kết luận chủng Isochrysis sp. HP1 phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể là loài Isochrysis galbana Parke 1949 (hình 3.6). Hình 3.5. Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng Isochrysis sp. HP1 và Nannochloropsis sp. HP2 A: DNA tổng số của chủng HP1 và HP2 (lane 1 và 2); B: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA của chủng HP1 và HP2 (lane 3 và 4); C: Sản phẩm PCR tinh sạch của chủng HP1 và HP2 (lane 5 và 6); D: PCR checking của chủng HP1 (lane 7, 8 và 9) và chủng HP2 (lane 10, 11, 12). M: Thang DNA chuẩn 1 Kb Plus Ladder. A B C D 9 * Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp. HP2 Độ tương đồng của các loài thuộc chi Nannochloropsis dao động từ 84,0% đến 99,0%. Trong đó, chúng tôi sử dụng các chi Aphanochaete, Bulbochaete, Chaetophora, Oedogonium là nhóm ngoại - đây là các chi có quan hệ gần gũi với chi Nannochloropsis. Chủng Nannochloropsis sp. HP2 phân lập ở Hải Phòng có độ tương đồng cao nhất với loài N. oculata (AF045045) đạt 99,0%, tiếp theo là N. granulate (AF045043) đạt 98,7% và thấp nhất là loài N. gaditana (AF133819) đạt 97,5%. Kết hợp tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh chủng loại (Hình 3.6), chúng tôi có thể kết luận chủng Nannochloropsis sp. HP2 phân lập được từ vùng biển Hải Phòng thuộc về loài N. oculata vì chúng có độ tương đồng đạt 99,0% với loài N. oculata (Droop) Hibberd 1981 có mã số (AF045045). 3.1.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học chính của chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 3.1.4.1. Đặc điểm sinh học chính của chủng I. galbana HP1 Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng I. galbana HP1 là môi trường dinh dưỡng F/2, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH 7. Thành phần axít béo trong sinh khối của chủng HP1 ở các pha khác nhau trên đường cong sinh trưởng đã được xác định (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Thành phần và hàm lƣợng các axít béo của chủng I. galbana HP1 ở các pha sinh trƣởng khác nhau (% so với TFA) Axít béo Tên khoa học Pha sinh trƣởng theo hàm số mũ (log) Pha sinh trƣởng tuyến tính Pha cân bằng sớm Pha cân bằng muộn Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của chủng Isochrysis sp. HP1 (A) và Nannochloropsis sp. HP2 (B) phân lập từ vùng biển Hải Phòng A B 10 C10:0 0,2±0,0 0,4±0,0 0,6±0,0 0,2±0,0 C12:0 Vết Vết Vết Vết C14:0 Axít myristic 7,9±0,9 15,5±1,1 12,0±0,7 17,5±1,3 C14:1n-5 0,1±0,0 0,2±0,0 0,3±0,0 0,3±0,0 C15: 0 0,2±0,0 0,1±0,0 0,5±0,0 0,4±0,0 C15:1n-5 0,4±0,0 0,6±0,0 0,8±0,1 0,7±0,1 C16:0 Axít palmitic 6,7±0,6 13,1±1,3 11,6±0,8 13,4±1,1 C16:1n-7 Axít palmitoleic 1,9±0,1 2,2±0,1 3,2±0,2 3,1±0,2 C17:0 Vết Vết Vết Vết C17:1n-7 0,4±0,0 0,4±0,0 0,6±0,0 0,3±0,0 C18:0 Axít stearic 0,1±0,0 0,1±0,0 0,2±0,0 0,2±0,0 C18:1n-9 Axít oleic 5,5±0,2 16,0±1,3 18,0±1,1 9,6±0,9 C18:1n-7 0,7±0,0 0,9±0,1 1,2±0,1 1,0±0,1 C18:2 n-6 1,9±0,1 1,9±0,1 2,5±0,1 2,4±0,1 C18:3n-6 Axít γ-Linolenic (GLA) 1,7±0,1 2,1±0,1 2,4±0,1 2,0±0,1 C18:3n-3 Axít -Linolenic (ALA) 12,9±1,1 24,3±1,4 21,0±1,7 18,6±1,5 C20:0 1,0±0,1 1,2±0,1 1,5±0,1 1,1±0,1 C20:1n-9 0,1±0,0 0,1±0,0 0,2±0,0 0,1±0,0 C20:1n-7 0,9±0,1 1,0±0,1 1,3±0,1 0,9±0,1 C20:3n-6 0,2±0,0 0,6±0,0 0,4±0,0 0,5±0,0 C20:4n-6 AA (Axít Arachidonic ) 1,6±0,4 1,9±0,4 2,1±0,9 1,9±0,4 C20:5n-3 Axít eicosapentaenoic (EPA) 1,0±0,1 1,2±0,1 1,7±0,2 1,5±0,1 C22:0 Vết Vết Vết Vết C22:3n-3 - - - - C22:4n-6 0,2±0,0 0,5±0,0 0,4±0,0 0,5±0,0 C22:5n-3 Axít docosapentaeoic (DPA) 2,9±0,3 3,0±0,3 2,7±0,2 3,2±0,4 C22:6n-3 Axít docosahexaenoic (DHA) 8,3±1,2 11,3±1,4 14,7±0,8 13,6±1,4 SFAs 16,1 30,4 26,4 34,8 MUFAs 10,0 21,8 25,6 16,0 (PUFAs) 30,7 46,8 48,2 44,2 SFA + MUFA 26,1 52,2 52,0 50,8 (SFA+MUFA) 0,85 1,12 1,10 1,15 11 /PUFA n-3 PUFA 25,1 39,8 40,1 36,9 n-6 PUFA 5,6 7,0 7,8 7,3 n-3/n-6 4,5 5,69 5,14 5,06 Ghi chú: - Không phát hiện Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy hàm lượng DHA và các axít béo chiếm ưu thế như myristic (14:0), palmictic (16:0), oleic (18:1n-9) , α-Linolenic (ALA, 18:3n-3) và docosapentaenoic (DPA, 22:5n-3) của chủng HP1 đều tăng dần từ pha log đến pha cân bằng sớm và giảm dần ở pha cân bằng muộn. Hàm lượng PUFAs chiếm tỉ lệ cao từ 30,7 - 48,2% so với TFA. Chủng HP1 có giá trị dinh dưỡng cao nhất ở pha cân bằng sớm. Khi đó hàm lượng SFA (saturated fatty acid – axít béo bão hòa) và MUFA (Mono unsaturated fatty acid – axít béo không bão hòa 1 nối đôi) đạt 52,0% so với TFA, PUFAs đạt 48,2% so với TFA. Ngoài ra, hàm lượng DHA, EPA và DPA cũng đạt giá trị cao nhất là 14,7 ± 0,8%; 1,7 ± 0,2% và 2,7 ± 0,2% so với TFA, tương ứng. Tỷ lệ axít béo n-3/n-6 đạt giá trị 5,14 - đây được xem là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau. Hàm lượng protein tổng số, lipit và hydratcacbon của chủng HP1 đạt 27,98 ± 0,89%, 9,78 ± 0,12%, 25,26 ± 0,79% sinh khối khô (SKK), tương ứng, và rất giàu các khoáng đa và vi lượng. Hàm lượng các kim loại nặng như As, Cd, Hg và Pb có trong sinh khối chủng HP1 đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản theo quy chuẩn Việt Nam (2011). 3.1.4.2. Đặc điểm sinh học chính của chủng N. oculata HP2 Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng N. oculata HP2 là môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25 - 30C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH 7. Thành phần axít béo trong sinh khối chủng HP2 đã được xác định ở các pha khác nhau trên đường cong sinh. Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy các axít béo của chủng HP2 gồm 14:0 (chiếm 0,54 - 2,42%), 16:0 (14,65–27,68%), 18:1n-9 (7,99 – 10,12%); 18:2n-6 (7,15 - 8,30%), 18:3n-3 (15,92 – 22,65%), 20:4n-6 (0,28 – 1,78%), 20:5n-3 (20,5 – 24,7%). Các PUFAs chiếm ưu thế là ALA và EPA. Hàm lượng PUFAs chiếm tỉ lệ cao từ 44,10 -53,48% so với TFA .Giá trị dinh dưỡng của chủng HP2 đạt cao nhất ở pha cân bằng sớm. Cụ thể hàm lượng EPA, SFA+MUFA và PUFAs đạt 24,70±1,42%; 45,50% và 52,8% so với TFA, tương ứng. Tỷ lệ axít béo n-3/n-6 đạt giá trị 4,42 – được coi là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho các đối tượng NTTS trong đó có các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Bảng 3.2. Thành phần và hàm lƣợng các axít béo của chủng N. oculata HP2 ở các pha sinh trƣởng khác nhau (% so với TFA) Axít béo Tên khoa học Pha sinh trƣởng theo hàm số mũ (log) Pha sinh trƣởng tuyến tính Pha cân bằng sớm Pha cân bằng muộn C10:0 0,45±0,05 0,48±0,05 0,50±0,07 0,46±0,05 12 C12:0 Vết Vết Vết Vết C14:0 Axít myristic 2,42±0,48 1,05±0,20 0,60±0,12 0,54±0,14 C14:1n-5 0,13±0,03 0,18±0,04 0,21±0,04 0,17±0,03 C15:0 0,61±0,12 0,51±0,10 0,10±0,02 0,05±0,00 C 15:1n-5 0,50±0,10 0,75±0,15 0,80±0,16 0,63±0,13 C16:0 Axít palmitic 14,65±2,93 18,34±2,59 20,10±1,02 27,68±2,22 C16:1n-7 Axít palmitoleic 5,67±1,13 4,91±0,98 4,30±0,65 2,94±0,44 C17:0 Vết Vết Vết Vết C17:1n-7 4,02±0,60 3,79±0,57 0,50±0,08 0,45±0,07 C18:0 Axít stearic 1,83±0,37 2,47±0,37 1,10±2,20 0,98±0,20 C18:1n-9 Axít oleic 10,12±2,02 9,75±1,95 8,90±1,87 7,99±1,84 C18:1n-7 0,24±0,05 0,35±0,05 0,40±0,05 0,36±0,05 C18:2n-6 7,50±0,90 8,00±1,43 8,30±1,99 7,15±1,00 C18:3n-6 GLA Vết Vết Vết Vết C18:3n-3 ALA 22,65±0,13 21,27±1,32 17,70±1,66 15,92±1,18 C20:0 1,96±0,39 2,09±0,44 6,90±1,73 4,56±0,78 C20:1n-7 0,53±0,09 0,82±0,19 1,20±0,24 0,74±0,19 C20:3n-6 0,53±0,13 0,65±0,16 0,70±0,18 0,25±0,03 C20:4n-6 AA 1,78±0,45 1,02±0,23 0,60±0,13 0,28±0,06 C20:5n-3 EPA 21,48±5,16 22,54±3,83 24,70±1,42 20,5±1,10 C22:0 Vết Vết Vết Vết C22:6n-3 DHA Vết Vết Vết Vết Khác 2,93 1,03 1,70 8,35 SFAs 21,92 24,94 29,30 34,27 MUFAs 21,21 20,55 16,20 13,28 PUFAs 50,05 53,48 52,80 44,10 SFA + MUFA 43,13 45,49 45,50 47,55 (SFA + MUFA)/PUFA 0,86 0,85 0,86 1,08 n-3/n-6 4,5 4,53 4,42 4,74 Ghi chú: - Không phát hiện Hàm lượng protein, lipít và hydratcacbon đạt 8,20 ± 1,64%; 18,72 ± 1,74% và 34,77 ± 2,30% SKK, tương ứng và rất giàu các khoáng đa và vi lượng. Hàm lượng các kim loại nặng có trong sinh khối chủng HP2 đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu và sản phẩm thủy sản theo quy chuẩn Việt Nam (2011). 3.1.5. So sánh khả năng chống chịu với điều kiện môi trƣờng nuôi bất lợi của các loài VTB phân lập từ vùng biển Việt Nam và Singapore 3.1.5.1. Khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của chủng N. oculata HP2 và N. oculata LB2164 13 Chủng N. oculata HP2 có tính chống chịu với điều kiện nuôi trồng bất lợi cao hơn chủng LB2164 (khi được xử lý ở điều kiện cực đoan nhiệt độ 11 và 55C; CĐAS – 500 mol/m2.s; nồng độ muối 2 và 70‰; pH 3 và 11). Điều này khẳng định ưu thế của chủng N. oculata HP2 bản địa về khả năng thích nghi với biến động rộng của môi trường hơn so với các chủng có nguồn gốc ngoại nhập. 3.1.5.2. Khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của 2 chủng VTB I. galbana HP1 và I. galbana LB2307 Chủng I. galbana HP1 chưa chứng tỏ được khả năng chống chịu với điều kiện nuôi bất lợi so với chủng LB2307 (khi được xử lý ở điều kiện cực đoan như: nhiệt độ 11 và 45C; CĐAS – 400 mol/m2/s; nồng độ muối 5 và 70‰; pH 3 và 11). Điều này có thể giải thích do bản chất di truyền loài I. galbana - không phải là loài có khả năng thích nghi tốt với biến động rộng của môi trường như nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ muối 3.2. Nghiên cứu công nghệ nuôi chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot 3.2.1. Công nghệ nuôi hai chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot Chúng tôi đã xây dựng được quy trình nuôi chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 ở quy mô phòng thí nghiệm và pilốt với điều kiện nuôi cấy thích hợp: môi trường (Erd, F/2, Walne), nồng độ muối 30‰, nhiệt độ 30C, CĐAS (100 – 300 µmol/m2.s) và pH 7. Ở mỗi cấp độ nuôi cấy khác nhau, chúng tôi đã chọn được môi trường dinh dưỡng và MĐTB ban đầu phù hợp để sinh trưởng của tảo giống luôn ở pha log, rút ngắn được thời gian thích nghi của tảo khi chuyển sang nuôi ở các cấp độ thể tích lớn hơn. 3.2.2. Nuôi sinh khối chủng N.oculata HP2 trong hệ thống nuôi kín dạng ống 20 Lít tự thiết kế * Đặc điểm của hệ thống nuôi kín dạng ống tự thiết kế Hệ thống nuôi kín (HTNK) dạng ống tự thiết kế có dung tích 20 L với một số đặc điểm cấu tạo khác biệt so với các HTNK đã được biết trước đó. Theo thiết kế, hệ thống bể chứa tảo được nâng cao kết hợp với dòng khí đẩy sinh ra bởi máy nén khí vừa có tác dụng tạo lực đẩy giúp dịch tảo luân chuyển tuần hoàn trong hệ thống theo dòng chảy rối với hệ số Renol > 4000, vừa có tác dụng phân tán oxy trong dịch nuôi mà không gây tổn thương đến tế bào tảo so với việc sử dụng bơm cơ học cũng như hạn chế tối đa tế bào tảo lắng xuống đáy ống và bám dính. Đồng thời, do không sử dụng bơm để đẩy khí nên hầu như không gây nên sự chênh lệch nhiệt độ ở trong hệ thống nuôi và ngoài môi trường, điều này rất thuận lợi cho việc nâng cấp hệ thống nuôi lên quy mô lớn hơn, không cần hệ thống làm mát đi kèm, giúp làm giảm giá thành sản phẩm (Hình 3.7). Kết quả nghiên cứu đã được đăng ký giải pháp hữu ích với tên gọi “Hệ thống bể phản ứng quang sinh để nuôi vi tảo biển” và đã được Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học và Công nghệ chấp nhận đơn hợp lệ theo Quyết định số 609562/QĐ-SHTT ngày 29/10/2012. Nhờ sử dụng HTNK dạng ống tự thiết kế nêu trên, chúng tôi đã nuôi thành công chủng N. oculata HP2 với MĐTB cao nhất đạt 197,2 triệu tb/mL sau 23 ngày nuôi cấy, nhiệt độ dao động 25-30C. Sinh khối tảo nuôi trong HTNK, không bị tạp 14 nhiễm, thời gian vận hành được kéo dài làm giảm chi phí nuôi cấy, năng suất sinh khối luôn ổn định, tiết kiệm diện tích cũng như công lao động. Các kết quả nuôi trồng loài VTB này trong HTNK dạng ống đã khẳng định được công nghệ nuôi trồng VTB ở Việt Nam bước đầu tiếp cận được với các công nghệ nuôi trồng trong HTNK của thế giới để chủ động cung cấp nguồn giống ban đầu cho các trại sản xuất giống nhằm nâng cao chất lượng con giống và góp phần làm giảm giá thành của sản phẩm. 3.3. Nghiên cứu sử dụng sinh khối chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 để nuôi một số loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ 3.3.1. Sử dụng sinh khối vi tảo biển làm thức ăn sống cho sinh sản nhân tạo ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) 3.3.1.1. Sử dụng 2 chủng VTB I. galbana HP1 và N. oculata HP2 làm thức ăn sống cho nuôi vỗ ngao bố mẹ: Sử dụng sinh khối hỗn hợp 2 chủng HP1 và HP2 (với MĐTB đạt 200 x 104 tb/mL) làm thức ăn sống cho ngao bố mẹ đã góp phần tăng tỷ lệ sống của chúng lên khoảng 20% so với công thức đối chứng chỉ cho ăn men bánh mỳ (2 g/kg). 3.3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn thức ăn lên hệ tiêu hóa của ấu trùng ngao: ấu trùng ngao ở giai đoạn chữ D có hệ thống tiêu hóa chứa màu sắc đặc trưng của các loài VTB tương ứng đã được dùng làm thức ăn. Ngoài ra, ấu trùng ngao ở lô 3 (ăn hỗn hợp I. galbana HP1 và N. oculata HP2) - cung cấp đủ thành phần axít béo như AA, EPA, DHA, DPA và kích thước của hệ thống tiêu hoá ở lô này lớn hơn so với ở lô 1, 2 và ĐC (đối chứng) (Hình 3.8). Hình 3.7. Sơ đồ khối và hình ảnh của hệ thống nuôi kín dạng ống tự thiết kế (20 L) Hình 3.8. Hình thái hệ thống tiêu hoá của ấu trùng ngao (ấu trùng chữ D) khi cho ăn các chủng vi tảo khác nhau Lô ĐC (chỉ cho ăn tảo được bơm từ nước biển tự nhiên); Lô 1 (chỉ ăn tảo N. oculata HP2); Lô 2 (chỉ ăn tảo I. galbana HP1); Lô 3 (cho ăn hỗn hợp 2 chủng tảo I. galbana HP1, N. oculata HP2) Lô ĐC Lô 1 Lô 3 Lô 2 15 Tỉ lệ sống sót của ấu trùng ngao sử dụng nguồn thức ăn bơm từ nước biển tự nhiên là thấp (dưới 10%). Khi kết hợp sử dụng hỗn hợp sinh khối của 5 loài Chaetoceros gracilis, Chlorela vulgaris, I. galbana, N. oculata và Tetraselmis convolutae làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao Bến tre trong giai đoạn 0-40 ngày tuổi đã nâng được tỷ lệ sống sót của ấu trùng chân bò (giai đoạn 8-40 ngày tuổi) đạt trên 25% (Bảng 3.3). Kết quả trên đã cho thấy sử dụng một cách chủ động các loài VTB giàu dinh dưỡng làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao từ khi ấp trứng đến giai đoạn chân bò đã nâng tỷ lệ sống sót của ấu trùng từ dưới 10% lên trên 25%. Bảng 3.3. Mật độ và tỉ lệ sống của ấu trùng ngao Bến tre ở các giai đoạn khác nhau khi sử dụng các loài VTB với mật độ khác nhau làm thức ăn sống Ghi chú: (+): có sử dụng 3.3.1.3. Sử dụng bón phân gây màu nước trong ao: Năm 2008, trại NTTS Cửu Dung đã thay thế nguồn thức ăn là các VTB được nuôi trồng theo quy trình công nghệ của chúng tôi chuyển giao bằng cách bón phân để gây màu nước trong ao. Bón phân gây nước màu xanh trong ao là phương pháp bổ sung phân chuồng và nước biển tự nhiên vào bể nuôi trong thời gian 5-10 ngày để quần thể tảo tự nhiên có sẵn trong nước biển được phát triển. Sau đó, sử dụng hỗn hợp này cho ấu trùng ngao ăn trực tiếp. Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ sống sót của ấu trùng ngao đạt dưới 25%, thấp hơn so với sử dụng hỗn hợp sinh khối 5 loài VTB nói trên. 3.3.1.4. Sử dụng hỗn hợp sinh khối VTB I. galbana HP1, N. oculata HP2 và C. gracilis làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao Bến tre được thực hiện trong năm 2009 và 2010. Quy trình phối trộn các loài VTB phù hợp với giai đoạn phát triển của ấu trùng; cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho ấu trùng nuôi đã nâng được tỷ lệ sống Thời gian (ngày) Giai đoạn sinh trƣởng Mật độ Ấu trùng Thành phần các loài vi tảo biển Mật độ tảo tổng số (x10 4 tb /mL) Tỉ lệ sống (%) C. gracilis C. vulgaris I. galbana N. oculata T. convolutae 1 Phân cắt 15- 20ct/mL 0 0 0 0 0 0 95 2 - 4 Ấu trùng chữ D 10- 20ct/mL 0 0 + + 0 15 - 20 65 5 - 7 Ấu trùng chữ D 10- 15ct/mL + + + + 0 30 50 8-10 Ấu trùng đỉnh vỏ (Umbo) 3- 5 ct/cm 2 + + + + + 25 >30 11- 40 Ấu trùng chân bò (Spat) 1-2 ct/cm 2 + + + + + 30 >25 16 sót của ấu trùng ngao từ dưới 25% năm 2008 (tương ứng với 1 cá thể/cm2) lên trên 70% (2-8 cá thể/cm2) năm 2009, lên trên 75% (9-20 cá thể/cm2) và đặc biệt có thể lên tới 90% (57-86 cá thể/cm2) ở năm 2010 (Bảng 3.4). Bảng 3.4. Mật độ cá thể và tỉ lệ sống sót của ấu trùng ngao Bến tre thu đƣợc trong các năm 2008-2010 Đợt thí nghiệm Loại thức ăn Mật độ cá thể /cm 2 (ct/cm 2 ) Tỷ lệ sống sót (%) 2008 Bón phân gây màu nước trong ao 1 <25 2009 Kết hợp hỗn hợp sinh khối chủng I. galbana HP1, N. oculata HP2 và C. gracilis 1-8 >70 2010 Kết hợp hỗn hợp sinh khối chủng I. galbana HP1, N. oculata HP2 và C. gracilis 9 -20 >75 3.3.2. Sử dụng sinh khối VTB làm thức ăn sống trong nuôi vỗ hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau đến tăng trưởng chiều dài của hầu TBD: Trong suốt thời gian thí nghiệm, chiều dài của vỏ hầu không tăng lên và không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê sinh học (P>0,05) giữa các lô thí nghiệm (từ 8,5-8,8 cm). Điều này có thể là do ở giai đoạn này kích thước hầu tăng rất chậm và chúng chỉ tích lũy chất dinh dưỡng để chuẩn bị cho quá trình thành thục sinh dục. 3.3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau đến tăng trưởng khối lượng của hầu: Các loại thức ăn khác nhau có ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng khối lượng; Cụ thể khối lượng ở lô 2 (cho ăn I. galbana HP1, N. oculata HP2 và S. mangrovei PQ6) đạt 94,82 ± 7,12 gram. Tiếp đến là lô 3 (ăn I. galbana HP1, N. oculata HP2) đạt 90,5 ± 9,2 gram và thấp nhất là lô 1 (ăn tảo được bơm từ nước biển tự nhiên) đạt 88,81 ± 9,67 gram. 3.3.2.3. Ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau đến độ béo của hầu: Độ béo của hầu tăng theo thời gian nuôi và cao nhất là ở lô 2 > lô 3 > lô 1 và sự sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Độ béo ở lô 2 (cho ăn I. galbana HP1, N. oculata HP2 và S. mangrovei PQ6) đạt 14,2 ± 1,30%. Tiếp đến là lô 3 (ăn I. galbana HP1, N. oculata HP2) đạt 13,7 ± 0,85% và thấp nhất là lô 1 (ăn tảo được bơm từ nước biển tự nhiên) đạt 12,9 ± 1,03%. 3.3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau đến tỷ lệ thành thục của hầu TBD: Tỷ lệ thành thục sinh dục tỷ lệ thuận với độ béo của hầu. Tỷ lệ thành thục thấp nhất ở lô 1 (53,3%) sau đó đến lô 3 (60,0%) và cao nhất ở lô 2 (70,0%). Kết quả nghiên cứu thu được nêu trên cho phép khẳng định sinh khối hỗn hợp 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 kết hợp với S. mangrovei PQ6 cho kết quả thành thục tốt nhất trong nuôi vỗ hầu TBD, tiếp theo là lô cho ăn sinh khối hỗn hợp 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 và thấp nhất là ở lô cho ăn bằng tảo bơm từ nước biển tự nhiên. 17 3.3.2.5. Các chỉ số thành thục sinh dục của hầu TBD: Các đặc trưng của 4 giai đoạn phát triển tuyến sinh dục hầu TBD có sử dụng VTB quang tự dưỡng và dị dưỡng làm thức ăn đã được quan sát trong thời gian nghiên cứu. 3.3.2.6. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng của hầu TBD: Hầu TBD rất giầu dinh dưỡng với hàm lượng protein chiếm từ 43,93±0,40% đến 52,69±0,63% sinh khối tươi nhưng sự sai khác không có ý nghĩa giữa các lô thí nghiệm (P>0,05). Ngoài ra, chúng rất giàu các khoáng đa và vi lượng. Hàm lượng các kim loại nặng như As, Cd, Hg và Pb ở cả 3 lô đều ở dưới mức cho phép đối với các sản phẩm động vật thân mềm hai mảnh vỏ theo QCVN8-1:2011/BYT. Kết quả phân tích thành phần axít béo của hầu TBD: hàm lượng lipit tổng số ở lô 2 và lô 3 đạt 0,50; 0,51% SKT, tăng 2 và 4% tương ứng so với lô 1. Hàm lượng SFA ở lô 2, lô 3 đạt 26,19% và 26,34% so với TFA, tăng 6,48 và 7,1% tương ứng so với lô 1. Hàm lượng PUFAs ở lô 2, lô 3 đạt 73,81% và 73,66% so với TFA, giảm 2,12 và 2,32%, tương ứng so với lô 1. Hàm lượng DHA ở lô 2 và lô 3 đạt 13,01±0,39 và 12,08±0,36% so với TFA, tăng 17,5 và 9,06%, tương ứng so với lô 1. Hàm lượng EPA ở lô 2, lô 3 đạt 11,52±0,34% và 11,50±0,32% so với TFA, tăng 0,46 và 0,26%, tương ứng so với lô 1. (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Hàm lƣợng lipit tổng số và thành phần các axít béo của hầu Thái bình dƣơng trong các lô thí nghiệm sau 3 tháng nuôi STT Axít béo Tên khoa học Hàm lƣợng axít béo (% so với axít béo tổng số) Lô 1 Lô 2 Lô 3 1 C4: 0 4,15 ±0,12 1,72±0,05 1,63±0,04 2 C10: 0 0,52±0,01 - - 3 C12: 0 0,66±0,01 - - 4 C14: 0 Axít myristic 1,48±0,04 1,84±0,05 1,70±0,05 5 C15: 1n – 5 0,89±0,02 1,13±0,03 - 6 C16: 0 Axít palmitic 11,50±0,34 15,00±0,45 16,26±0,48 7 C16: 1n – 7 Axít palmitoleic 0,84±0,02 0,71±0,02 - 8 C16: 1n – 9 0,83±0,02 - - 9 C18 : 0 6,29±0,18 7,63±0,22 6,76±0,20 10 C18: 1n – 7 5,98±0,17 6,66±0,19 8,02±0,24 11 C18: 2n – 6 –c 0,58±0,01 - - 12 C20: 1n – 9 4,62±0,13 5,13±0,15 4,54±0,13 13 C20: 1n – 7 2,84±0,08 3,43±0,10 3,40±0,10 14 C20: 4n – 6 AA 9,46±0,28 10,69±0,32 12,46±0,37 15 C20: 5n – 3 EPA 11,47±0,34 11,52±0,34 11,50±0,32 16 C22: 1n- 9 10,76±0,32 9,74±0,29 9,78±0,29 17 C22: 4n – 6 9,41±0,28 3,88±0,11 2,78±0,08 18 C22: 3n – 3 1,99±0,05 2,06±0,06 2,46±0,07 19 C22: 5n – 6 DPA 2,06±0,06 3,09±0,09 4,54±0,13 18 20 C22: 5n – 3 DPA 2,60±0,07 2,750±0,08 2,11±0,06 21 C22: 6n - 3 DHA 11,07±0,33 13,01±0,39 12,08±0,36 (SFAs) 24,60 26,19 26,34 (PUFAs) 75,40 73,81 73,66 % Lipit tổng số (sinh khối tươi) 0,49 0,50 0,51 Ghi chú: - không phát hiện, mỗi lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần (n=3) Như vậy, hầu TBD được nuôi vỗ bằng hỗn hợp tảo quang tự duỡng (I. galbana HP1và N. oculata HP2) kết hợp với tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6 (lô 2) và hỗn hợp tảo quang tự dưỡng (lô 3) có hàm lượng lipit, EPA, DHA đạt 0,50% SKT; 11,52±0,34 và 13,01±0,39% so với TFA; 0,50% SKT; 11,50±0,32% và 12,08±0,36% so với TFA, tương ứng, cao hơn so với ở lô đối chứng (lô 1) chỉ được ăn các loài vi tảo bơm từ nước biển tự nhiên (là 0,49% SKT; 11,47±0,34; 11,07±0,33% so với TFA, tương ứng). 3.3.3. Sử dụng sinh khối vi tảo biển làm thức ăn sống cho tu hài bố mẹ (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) 3.3.3.1. Ảnh hưởng của chất lượng thức ăn lên tăng trưởng của tu hài bố mẹ: Sau 15 ngày nuôi vỗ tu hài bố mẹ ăn với các chế độ ăn khác nhau đã cho thấy có sự khác biệt về kích thước và trọng lượng của tu hài bố mẹ ở lô ĐC (ăn tảo được bơm từ nước biển tự nhiên), lô TN1 (ăn I. galbana HP1 và N. oculata HP2) và TN2 (ăn hỗn hợp I. galbana HP1, N. oculata HP2 và S. mangrovei PQ6). Kết quả cho thấy trọng lượng, chiều dài, chiều rộng và chiều dầy của tu hài bố mẹ ở lô TN2 tăng 63,79; 10,37; 11,41 và 11,94%, tương ứng, so với lô TN1 và sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (P<0,05), còn lô ĐC và TN1 không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Kết quả này cho thấy việc sử dụng thức ăn kết hợp giữa sinh khối VTB dị dưỡng S. mangrovei PQ6 với 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 có hiệu quả cao hơn so với tu hài bố mẹ chỉ sử dụng nguồn thức ăn là các loài VTB quang tự dưỡng truyền thống. 3.3.3.2. Phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng của tu hài bố mẹ: Hàm lượng protein của tu hài bố mẹ ở lô TN2 (đạt 43,98% sinh khối tươi) cao hơn lô TN1 (đạt 41,93% sinh khối tươi) là 5% và ĐC (đạt 40,12% sinh khối tươi) là 9,6%. Thành phần các khoáng đa lượng và vi lượng ở lô TN2 cao hơn so với lô TN1 và ĐC khoảng 10% và 5-40%, tương ứng. Hàm lượng các kim loại nặng ở cả 3 lô đều ở dưới mức cho phép đối với các sản phẩm động vật thân mềm hai mảnh vỏ theo QCVN8-1:2011/BYT. Hàm lượng lipit tổng số và thành phần các axít béo: Hàm lượng lipít tổng số ở lô TN2, TN1 là 0,55% và 0,5% sinh khối tươi tăng 11,46 và 10% so với lô ĐC (đạt 0,48% sinh khối tươi). Hàm lượng SFAs ở lô TN2 và TN1 đạt 48,95%; 64,15% so với TFA, giảm 26,44 và 3,60% tương ứng so với lô ĐC (64,55% so với TFA). Trong khi đó, hàm lượng MUFA + PUFAs ở lô TN2 tăng so với lô TN1 và ĐC là 43,43% và 44,00%, tương ứng; tỷ lệ MUFA + PUFAs/ SFA ở lô ĐC, TN1, TN2 là 0,53; 0,55 và 1,04, tương ứng. Đồng thời, chúng tôi nhận thấy rõ ở lô TN2 có hàm lượng PUFAs như ALA, GLA, AA, DPA cao hơn so với lô TN1 và lô ĐC và sự sai khác 19 này có ý nghĩa thống kê sinh học (P<0,05). Ngoài ra, tỉ lệ sống sót của ấu trùng tu hài ở lô TN2 cao hơn 20-30% và 35% so với lô TN1 và ĐC, tương ứng (Bảng 3.6). Bảng 3.6. Thành phần axít béo của tu hài bố mẹ ở các lô đối chứng và thí nghiệm (% so với TFA) STT Axít béo Tên khoa học Hàm lƣợng các axít béo (% so với TFA) ĐC TN1 TN2 1 C10:0 22,130,66 23,490,70 5,930,17 2 C12:0 3,810,11 2,470,07 1,640,04 3 C14:0 Axít myristic 3,300,09 3,350,10 2,50,07 4 C15:1n-5 - - 1,690,05 5 C16:0 Axít palmitic 15,910,47 15,860,47 15,580,46 6 C16:1n-7 Axít palmitoleic 4,120,12 4,350,13 4,20,12 7 C17:0 - - 1,970,05 8 C17:1n-7 - - 1,490,04 9 C18:0 9,120,27 9,320,27 11,60,34 10 C18:1n-9 Axít oleic 8,520,25 8,090,24 11,360,34 11 C18:1n-7 3,510,10 3,430,10 5,270,15 12 C18:2n-6 6,070,18 6,150,18 - 13 C18:3n-3 ALA 1,890,05 1,950,05 2,430,07 14 C18:3n-6 GLA - - 3,210,09 15 C19:0 - - 2,880,08 16 C19:1n-9 - - 5,420,16 18 C20:1n-9 2,070,06 2,430,07 2,420,07 19 C20:3n-6 0,700,02 0,710,02 - 20 C20:4n-6 AA 2,860,08 2,950,09 5,190,15 21 C22:0 Axít docosanoic 10,280,30 9,660,28 5,250,15 22 C22:3n-3 1,67,05 1,680,05 1,730,05 23 C22:5n-6 DPA 1,020,03 1,010,03 - 24 C24:0 - - 1,600,04 25 C22:5n-3 DPA 3,020,09 3,090,09 6,640,20 26 Loại khác 0,010,003 - SFAs 64,55 64,15 48,95 MUFA và PUFAs 35,45 35,84 51,05 Lipit tổng số (% so với sinh khối tươi) 0,48 0,5 0,55 Ghi chú: - không phát hiện, mỗi lô được lặp lại 2 lần (n=2) 20 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hiện nay, nhu cầu sử dụng sinh khối VTB I. galbana và N. oculata làm thức ăn sống trong các trại NTTS ở Việt Nam là rất lớn. Do vậy, để có thể chủ động sinh khối của 2 loài nói trên đáp ứng nhu cầu của các trại sản xuất giống thủy sản thì việc phân lập được các chủng giống VTB bản địa giàu dinh dưỡng, có khả năng nuôi trồng ở quy mô lớn là rất cần thiết. Trong năm 2008-2009, chúng tôi đã phân lập được 3 chủng Isochrysis spp. và 3 chủng Nannochloropsis spp. từ các vùng biển Hải Phòng, Quảng Ninh, Nam Định và Nha Trang. Theo khóa phân loại của loài I. galabana do Parke, (1949) công bố thì tế bào của loài này có dạng đơn bào, có hình elip hoặc hình cầu, màu nâu vàng, có 2 roi bằng nhau, dài 7 µm, có khả năng chuyển động hoặc đứng yên với chiều dài 5-6 µm, chiều rộng 2-4 µm và dày 2-4 µm. Dựa trên các nghiên cứu về đặc điểm hình thái cho thấy các chủng Isochrysis spp. có đặc điểm phù hợp với khóa phân loại do Parke (1949) công bố và chúng được sơ bộ định tên khoa học thuộc loài Isochrysis galabana Parke 1949. Tương tự, 3 chủng Nannochloropsis spp. phân lập từ vùng biển nêu trên có đặc điểm hình thái hoàn toàn phù hợp với khóa phân loại của loài N. oculata do Hibberd, (1981) công bố như tế bào thường ở dạng đơn bào, hình cầu hoặc hình trứng, màu xanh với kích thước 1,5 - 6 μm. Vì vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái quan sát được dưới kính LM và SEM, chúng tôi sơ bộ xác định 3 chủng nêu trên thuộc loài Nanochloropsis oculata (Droop) Hibberd, 1981. Các chủng giống Isochrysis spp. và Nannochloropsis spp. sau khi phân lập đã được lưu giữ ở nhiệt độ phòng (trên môi trường thạch có 1,2% agar và lỏng F/2; có 5-7mL dịch tảo/ống nghiệm; MĐTB là 0,5-0,7 triệu tb/mL đối với chủng Isochrysis spp. và 2,0-5,0 triệu tb/mL đối với chủng Nannochloropsis spp.; CĐAS yếu <60 µmol/m2.s; nhiệt độ 15-200C; chu kỳ cấy chuyển 1-2 tháng/1 lần; giữ mẫu đã được cấy chuyển ở 3 thế hệ liên tiếp). Tuy nhiên, lưu giữ vi tảo ở điều kiện nêu trên mặc dù có rất nhiều thuận tiện song cũng có nhiều bất lợi như dễ nhiễm tạp; tốn công sức và môi trường nuôi cho việc cấy chuyển; dễ mất và thoái hóa giống. Vì vậy, để khắc phục những hạn chế nêu trên, chúng tôi đã bảo quản chủng Isochrysis sp. HP1 và Nannochloropsis sp. HP2 ở nhiệt độ thấp (-80ºC) có sử dụng 10% DMSO (Tzovenis et al., 2004). Bảo quản ở -80ºC là kỹ thuật phổ biến được áp dụng trong hầu hết các ngân hàng giống trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam thì việc lưu giữ và bảo quản chủng giống ở -800C mới chỉ có ở vi sinh vật, động vật, chưa có trên đối tượng vi tảo. Bảo quản ở -80ºC có sự hỗ trợ của chất bảo quản DMSO – chất có ưu điểm thẩm thấu qua màng tế bào nhanh hơn nhưng cũng dễ dàng bị loại bỏ ra khỏi tế bào hơn so với glycerol và các chất bảo quản khác, góp phần làm giảm khả năng lây nhiễm và bùng phát của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy. Ngoài ra, mẫu được đưa xuống nhiệt độ thấp bằng phương pháp làm lạnh hai bước với ưu điểm tế bào tảo được đưa xuống nhiệt độ thấp một cách từ từ theo một chương trình đã được lập sẵn, bảo đảm tế bào được nguyên vẹn, không bị tổn thương do bị sốc nhiệt đột ngột. Tuy nhiên, giá thành của thiết bị điều khiển nhiệt độ này khá đắt và do tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng nên phải bổ sung nitơ thường xuyên. Vì vậy, chi phí cho việc bảo quản này rất tốn kém. Trong điều kiện Việt Nam, chúng tôi đã đưa mẫu từ nhiệt độ phòng tới nhiệt độ cần bảo quản (-80°C) nhờ sử dụng isopropanol có tác dụng giảm nhiệt độ một cách từ từ với tốc độ giảm trung bình 1C/phút. Sau 2-3 giờ, mẫu được lấy ra khỏi dung dịch isopropanol và bảo quản ở -80°C. Với kỹ thuật này, chúng tôi đã tiết kiệm được chi phí lưu giữ giống, đồng thời nâng được tỷ lệ sống sót của chủng Nannochloropsis sp. HP2 lưu giữ ở -80C đạt 62,45% tương tự như kết 21 quả của Mori và cs., (2002). Đối với chủng Isochrysis sp. HP1, do không có thành tế bào mà chỉ có màng plasma bao bọc nên tế bào rất dễ bị vỡ khi có sự chênh lệch về nhiệt độ trong quá trình bảo quản (Zhu et al., 1997). Tỷ lệ sống sót của chủng Isochrysis sp. HP1 lưu giữ ở - 80°C cũng chỉ đạt 7,3%, tương tự như công bố của Cafiavate và Lubirin (1995). Do vậy, chúng tôi khuyến cáo không nên bảo quản loài Isochrysis spp. ở -80°C và -20C với 10% DMSO mà chỉ nên bảo quản loài VTB này ở nhiệt độ phòng (trong môi trường lỏng và thạch nghiêng hay thạch ẩm). Trong số 6 chủng vi tảo phân lập được, chúng tôi đã lựa chọn được chủng Isochrysis sp. HP1 và Nannochloropsis sp. HP2 tiềm năng để định tên khoa học bằng sinh học phân tử và nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học, công nghệ nuôi cũng như sử dụng sinh khối của các chủng này làm thức ăn sống cho một số đối tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Dựa trên các đặc điểm hình thái và kết quả đọc và so sánh trình tự nucleotide của 1 phần gen 18S rRNA, chúng tôi đã định tên được chủng HP1 và HP2 thuộc loài Isochrysis galbana Parke 1949 và Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd 1981. Trình tự đoạn gen 18S rRNA của các chủng này đã được đăng ký trên trên Genbank với mã số FJ536744 và GU220364, tương ứng. Hai chủng HP1 và HP2 đã được nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học như môi trường nuôi, nồng độ muối, nhiệt độ, ánh sáng và pH. Đối với chủng HP1 môi trường F/2 là phù hợp nhất để nuôi trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả này cũng tương tự với các nghiên cứu của Cái Ngọc Bảo Anh (2010), Lê Thị Hương và Võ Hành (2012) đã công bố. Kết quả nghiên cứu về điều kiện thích hợp về độ mặn, nhiệt độ, CĐAS, pH đối với chủng I. galbana HP1 là 30‰, 250C, 100mol/m2.s, pH 7, tương ứng là hoàn toàn phù hợp với công bố của tác giả Liu và Lin, (2001); Liu và cs., (2013). Kết quả phân tích thành phần các axít béo của chủng HP1 phù hợp công bố của Lin và cs., (2007), hàm lượng DHA và EPA cao nhất đạt 14,7±0,8 và 1,7±0,2% so với TFA ở pha cân bằng sớm (khi tảo được nuôi trong môi trường có sử dụng N-NO3) và giảm dần ở pha cân bằng muộn (đạt 13,6±1,4 và 1,5±0,1% so với TFA, tương ứng). Các axít béo chủ yếu của chủng HP1 phù hợp với nghiên cứu của các tác giả Grima và cs., (1994), Sukenik và Wahnon (1991) với hàm lượng DHA cao chiếm 14,7±0,8%, EPA - 1,7±0,2% và DPA - 2,7±0,2% so với TFA. Chủng HP1 ngoài hàm lượng DHA cao còn có hàm lượng PUFAs cao (từ 30,7-48,2% so với TFA), tỷ lệ n-3 và n-6 PUFA từ 4,5-5,69 tùy thuộc vào pha sinh trưởng, hàm lượng protein cao, giàu khoáng đa và vi lượng; hàm lượng các kim loại nặng nằm dưới ngưỡng cho phép sử dụng cho thấy sinh khối chủng VTB này làm thức ăn sống rất phù hợp cho các đối tượng NTTS, đặc biệt là cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Các kết quả này phù hợp với công bố của Lin và cs., (2007); Parnet và cs., (2003). Tương tự chúng tôi cũng xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng N. oculata HP2 ở điều kiện phòng thí nghiệm: môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25-300C, cường độ ánh sáng là 100 μmol/m2.s, pH 7. Thời điểm thu hoạch sinh khối của các chủng này có giá trị dinh dưỡng cao nhất ở pha cân bằng sớm. Các kết quả nghiên cứu thu được nêu trên đối với chủng HP2 hoàn toàn phù hợp với công bố của các tác giả Campana-Torres và cs., (2012); Cái Ngọc Bảo Anh (2010); Cho và cs., (2007); Hu và Gao (2006); Wahidin và cs., (2013). Trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi, chủng HP2 có hàm lượng PUFAs và EPA thay đổi từ 44,10 đến 53,48% và 20,5±1,10 đến 24,70 ±1,42 % so với TFA, tương ứng, tùy thuộc vào pha sinh trưởng của tảo và hoàn toàn phù hợp với công bố của Fabregas và cs., (2004); Hu và Gao (2004) nhưng lại thấp hơn so với công bố 22 của Das và cs., (2011) (EPA đạt 42,9 – 44,39% so với TFA khi chủng Nannochloropsis sp. được nuôi cấy 2 pha trong hệ thống kín). Các axít béo chiếm ưu thế của chủng HP2 gồm C14:0, C16:0, C18:1n-9; C18:3n-3, C20:4n-6 và C20:5n-3 phù hợp công bố của Das và cs., (2011). Hàm lượng C16:1n-7 của chủng HP2 đạt 2,94 - 5,67% so với TFA lại thấp hơn so với công bố của các tác giả nêu trên trong khí hàm lượng các axít béo khác như C18:1n-9 và C18:3n-3 đạt 7,99 - 10,12%, 15,92 - 22,65% so với TFA, tương ứng, lại cao hơn so với công bố của Das và cs., (2011). Đây có thể được xem là đặc trưng về thành phần axit béo của chủng HP2 phân lập ở Việt Nam. Chủng HP2 rất giàu dinh dưỡng với hàm lượng protein, hydratcabon và lipit đạt 8,20 ±0,64; 34,77 ±2,30; 18,72 ±1,74 % SKK, tương ứng. Chúng tôi nhận thấy hàm lượng protein và hydratcacbon luôn tỉ lệ nghịch với nhau. Theo Hu và Gao (2003) hàm lượng protein và hydratcacbon của chủng Nannochloropsis sp. đạt 44 và 11% SKK, tương ứng. Như vậy, ngoài việc sinh khối rất giàu khoáng đa và vi lượng, chủng HP2 còn có hàm lượng PUFAs và EPA thay đổi từ 44,1 đến 53,48% và 20,5±1,10 đến 24,70 ±1,42 % so với TFA, tương ứng, tỉ lệ n-3/n-6 dao động từ 4,42 đến 4,74 tùy thuộc vào các pha sinh trưởng khác nhau; hàm lượng các kim loại nặng (Cd, Pb, As, Hg) của chủng này phù hợp với tiêu chuẩn quy định làm thức ăn cho các đối tượng thủy hải sản theo QCVN8-1:2011/BYT. Chính vì vậy, sinh khối tảo chủng HP2 là nguồn thức ăn rất phù hợp cho các đối tượng NTTS đặc biệt là các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Để so sánh khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của hai chủng bản địa I. galbana HP1 và N. oculata HP2 phân lập từ vùng biển Hải Phòng (Việt Nam) so với chủng nhập ngoại (Singapore), chúng tôi đã nghiên cứu tính chống chịu của các chủng này dưới điều kiện môi trường nuôi bất lợi như nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ muối và pH ở các vùng cực trị. Chủng bản địa N. oculata HP2 có tính chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi (được xử lý ở điều kiện cực đoan như: 11 và 550C; 500 µmol/m2.s; nồng độ muối 2 và 70‰) cao hơn so với chủng LB2164 của Singapore trong khi khả năng nêu trên chưa được thể hiện rõ ở chủng bản địa I. galbana HP1 so với chủng LB2307 của Singapore. Điều này cũng cho thấy I. galbana không phải là loài có khả năng thích nghi với sự biến động rộng của môi trường nuôi. Vì vậy, để có thể đánh giá ưu thế của loài bản địa I. galbana so với các chủng có nguồn gốc nhập ngoại, cần phải có những nghiên cứu tiếp tục cũng như xét đến những đặc điểm sinh học khác nữa của chúng. Sự khác biệt giữa hai loài I. galbana và N. oculata nêu trên có thể là do đặc điểm di truyền của từng loài và điều này cũng được Saudi-Helis và cs., (1994) lưu ý. Kết quả nghiên cứu thu được nêu trên cho thấy việc phân lập và lựa chọn được các loài VTB bản địa, thích nghi với biến động rộng của khí hậu sẽ cho phép nhân nhanh sinh khối tảo cũng như nuôi trồng ở quy mô lớn, cung cấp sinh khối VTB cho các mục đích sử dụng khác nhau ở Việt Nam. Trong điều kiện phòng thí nghiệm và pilot, quy trình công nghệ nuôi I. galbana HP1 và N. oculata HP2 đã được thiết lập. Tùy thuộc vào cấp độ nuôi, môi trường dinh dưỡng với giá thành thấp; điều kiện nhiệt độ, độ mặn, CĐAS, MĐTB ban đầu, thời gian đạt MĐTB cực đại cũng đã được giới thiệu đối với 2 chủng HP1 và HP2. Với quy trình công nghệ nêu trên, sinh khối 2 chủng HP1 và HP2 có thể bảo đảm chủ động cung cấp cho các đối tượng nuôi ở các trại NTTS. So với công nghệ nuôi trồng 2 loài I. galbana và N. oculata do Ugwu cs., (2008); Su cs., (2011) và Olofsson cs., (2012) công bố thì quy trình công nghệ nuôi trồng hai chủng HP1 23 và HP2 của chúng tôi có hiệu quả cao với năng suất và chất lượng sinh khối vi tảo tốt, rất thích hợp với điều kiện Việt Nam. Cho tới nay, việc nuôi trồng tảo trong các HTNK ở Việt Nam còn khá mới mẻ. Hiện nay, hầu hết các HTNK dạng ống thường sử dụng hệ thống bơm tuần hoàn khép kín (Briassoulis et al., 2010), đây là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng chênh lệch nhiệt độ giữa trong và ngoài HTNK do vậy đều phải sử dụng hệ thống làm mát; điều này đã làm tăng giá thành lắp đặt HTNK và hạn chế khả năng mở rộng hệ thống. HTNK dạng ống tự thiết kế của chúng tôi không sử dụng bơm mà chỉ dùng máy nén khí và nâng bình chứa tảo lên cao để tạo lực đẩy giúp dịch tảo luân chuyển tuần hoàn trong hệ thống theo dòng chảy rối với hệ số Renol > 4000, vừa có tác dụng phân tán oxy trong dịch nuôi mà không gây tổn thương đến tế bào tảo so với việc sử dụng bơm cơ học cũng như hạn chế tối đa tế bào tảo lắng xuống đáy ống và bám dính. Ngoài ra, do không sử dụng bơm để đẩy khí nên hầu như không gây nên sự chênh lệch nhiệt độ ở trong hệ thống nuôi và ngoài môi trường, điều này rất thuận lợi cho việc nâng cấp hệ thống nuôi lên quy mô lớn hơn, không cần hệ thống làm mát đi kèm, giúp làm giảm giá thành sản phẩm. Nhờ sử dụng HTNK dạng ống nói trên, chúng tôi đã nuôi thành công chủng N. oculata HP2 đạt MĐTB cao (197,2 triệu tb/mL) sau 23 ngày nuôi cấy. Sinh khối thu hoạch trong hệ thống này không bị tạp nhiễm, tảo luôn trong trạng thái huyền phù và năng suất ổn định, giúp chủ động cung cấp giống sơ cấp cho các cơ sở sản xuất giống. Sinh khối VTB quang tự dưỡng (I. galbana HP1 và N. oculata HP2) và dị dưỡng (S. mangrovei PQ6) đã được kết hợp sử dụng thành công làm thức ăn tươi sống cho một số đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, hầu Thái bình dương và tu hài bố mẹ, đã nâng cao tỉ lệ thành thục, rút ngắn thời gian chuyển giai đoạn và nâng cao được tỉ lệ sống sót của ấu trùng nuôi, không gây ô nhiễm môi trường, phù hợp với các công bố của Ngô Anh Tuấn và cs., (2007), Byung cs., (1988); Trần Thế Mưu và Vũ Văn Sáng (2013). Các kết quả này đã góp phần quan trọng trong việc sản xuất giống thủy sản sạch bệnh, chất lượng cao và thúc đẩy nghề nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Đã phân lập được 3 mẫu Isochrysis spp. và 3 mẫu Nannochloropsis spp. ở các vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh và Nha Trang - Khánh Hòa năm 2008-2009. Sáu mẫu nêu trên được lưu giữ và bảo quản ở nhiệt độ phòng; đã bảo quản thành công mẫu Nannochloropsis sp. HP2 ở - 80ºC có sử dụng 10% DMSO với tỉ lệ sống sót đạt 62,45%. 2. Đã định tên khoa học 2 chủng Isochrysis sp. HP1 và Nannochloropsis sp. HP2 phân lập được từ vùng biển Hải Phòng thuộc loài Isochrysis galbana Parke 1949 và Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd 1981. Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của 2 chủng nêu trên đã được đăng ký trên Genbank với mã số FJ536744 và GU220364, tương ứng. Xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 ở điều kiện phòng thí nghiệm: môi trường dinh dưỡng F/2 (đối với chủng HP1) và Erd (chủng HP2), độ mặn 30‰, nhiệt độ 25C (chủng HP1) và 25-300C (chủng HP2), cường độ ánh sáng là 100 μmol/m2/s, pH 7. Thời điểm thu hoạch sinh khối của các chủng này có giá trị dinh dưỡng cao nhất ở pha cân bằng sớm. 24 Chủng bản địa N. oculata HP2 có tính chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi (được xử lý ở điều kiện cực đoan như: 11 và 550C; 500 µmol/m2/s; nồng độ muối 2 và 70‰) cao hơn so với chủng LB2164 của Singapore trong khi đó khả năng nêu trên chưa được thể hiện rõ ở chủng bản địa I. galbana HP1 so với chủng LB2307 của Singapore. 3. Đã phát triển được công nghệ nuôi trồng 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot. Đã thiết kế và sử dụng thành công hệ thống nuôi kín dạng ống với dung tích 20-26 L (không dùng bơm chỉ dùng máy nén khí và nâng bình chứa tảo lên cao để tạo lực đẩy cho dòng chảy trong hệ thống kín) để nuôi chủng N. oculata HP2 đạt mật độ tế bào rất cao (197,2 triệu tb/mL) sau 23 ngày nuôi cấy. 4. Sinh khối 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 rất giàu dinh dưỡng, đặc biệt là các axit béo. Chủng HP1 có hàm lượng PUFAs và DHA chiếm 30,70- 48,20% và 8,30-14,70% so với axit béo tổng số, tương ứng. Còn chủng HP2 có hàm lượng PUFAs và EPA chiếm 44,10-53,48% và 20,50-24,70% so với axit béo tổng số, tương ứng. Sinh khối tươi của hai chủng này sử dụng tốt làm thức ăn sống cho nhuyễn thể hai mảnh vỏ. 5. Bước đầu sử dụng thành công sinh khối I. galbana HP1, N. oculata HP2 và Schizochytrium mangrovei PQ6 trong nuôi động vật thân mềm hai mảnh vỏ: + Đã sử dụng sinh khối hỗn hợp vi tảo biển quang tự dưỡng I. galbana HP1, N. oculata HP2 với Chaetoceros gracilis, Tetraselmis convolutae, Chlorella vulgaris làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao Bến tre, nâng tỷ lệ sống sót của ấu trùng ngao (trong giai đoạn 0-40 ngày tuổi) từ dưới 10% lên đến trên 75%. + Hàm lượng DHA của hầu Thái bình dương được nuôi vỗ bằng hỗn hợp I. galbana HP1 và N. oculata HP2 với tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6 (lô 2); hỗn hợp chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 (lô 3) tăng 17,5% và 9,06% so với cho ăn bằng các loài vi tảo có trong nước biển tự nhiên (lô 1). Hàm lượng EPA của hầu Thái bình dương ở lô 2 và lô 3 tăng 0,46 và 0,26% so với lô 1. + Khối lượng, chiều dài, chiều rộng và chiều dầy của tu hài bố mẹ sử dụng thức ăn kết hợp sinh khối S. mangrovei PQ6 với 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 (lô TN2) tăng 63,79; 10,37; 11,41 và 11,94%, tương ứng so với lô TN1 (chỉ ăn I. galbana HP1 và N. oculata HP2) với sự sai khác có ý nghĩa thống kê sinh học (P<0,05). Hàm lượng protein, lipit, MUFA + PUFAs của tu hài bố mẹ; tỷ lệ sống sót của ấu trùng tu hài ở lô TN2 đều cao hơn so với lô TN1 và đối chứng (sử dụng vi tảo có trong nước biển tự nhiên). Lô TN2 có hàm lượng PUFAs như ALA, GLA, AA và DPA cao hơn so với lô TN1 và lô ĐC (P<0,05). KIẾN NGHỊ + Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và chất lượng sinh khối của vi tảo biển I. galbana HP1 trong hệ thống nuôi kín tự tạo (20 lít) và nâng cấp hệ thống kín lên 50, 100, 1000 lít nhằm góp phần cung cấp chủ động tảo giống cho sản xuất giống thủy sản ở các trại nuôi trồng thủy sản; + Cần nghiên cứu sâu hơn, rộng hơn việc sử dụng phối hợp sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng gồm I. galbana HP1 và N. oculata HP2 với vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6 để làm thức ăn sống cho ấu trùng các loài cá biển nhằm nâng cao giá trị của các sản phẩm thủy sản phục vụ nhu cầu của thị trường ngày càng cao.