Tóm tắt luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

ary performed 2 other peaks. Of them, one peak had retention time that was similar to the second peak of culture cell (1.79 min), the another peak had a retention time of 1.21 min. The extractive solution of culture cell had the third peak with retention time of 1.6 minute. The disappearance of the third peak of 1.21 min (in extractive solution of rhizome) in vitro cells can be due to biotransformation happening in culture process. Results in Table 3.16 showed that, the concentration of curcumin (% dry weight) increased gradually from day 2 to day 14, reached 7 2,4-D và 0,5 mg/L BA, nuôi ở tốc độ lắc 100 vòng/phút để thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào. Môi trường MS lỏng bổ sung nguồn carbon khác nhau (sucrose, glucose và fructose) và các chất ĐHST BA và 2,4-D ở dạng riêng rẽ hoặc tổ hợp, nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào. 2.2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù trong hệ lên men 100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) thu từ nuôi cấy lắc trong bình tam giác được đưa vào nuôi trong hệ lên men 14 L chứa 10 L môi trường MS lỏng có 3% sucrose, bổ sung 1,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA; với các điều kiện khác nhau như cỡ mẫu: 100-250 g, tốc độ khuấy: 100-200 vòng/phút và tốc độ sục khí: 1,5-3,5 L/phút. Sinh khối tế bào được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng sinh trưởng của chúng. 2.2.3. Xác định sinh trưởng của tế bào Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nước cất để loại bỏ môi trường và cân xác định khối lượng tươi. Khối lượng khô của tế bào được xác định bằng cách sấy sinh khối tươi trong tủ sấy ở 500C cho đến khi khối lượng không đổi và cân. 2.2.4. Định lượng tinh dầu Tách chiết và xác định hàm lượng tinh dầu theo phương pháp của Manzan và cs 2003. 2.2.5. Định lượng curcumin Tách chiết curcumin theo phương pháp của Paramapojn và Gritsanapan (2009). Phân tích HPLC để xác định hàm lượng curcumin được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). 2.2.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số Tách chiết polysaccharide theo phương pháp của Sun và cs (2005). Xác định hàm lượng polysaccharide dựa vào đường chuẩn D- 8 glucose (4-20 mg/ml) theo Chaplin và cs 1994 và tính toán theo hệ số chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 theo Li và cs 2007. 2.2.7. Xác định sesquiterpene Tách chiết sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs 2004. Phân tích HPLC để xác định sesquiterpene được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). 2.2.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) . 2.2.9. Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05) bằng chương trình SAS. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nuôi cấy callus nghệ đen Kết quả tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi trường khác nhau sau 90 ngày nuôi cấy được ở bảng 3.1. Các môi trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong khi đó môi trường không bổ sung chất ĐTST lại không tạo callus. Môi trường có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA là thích hợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus có màu trắng, xốp và có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A). Ở các môi trường còn lại tỷ lệ tạo callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu trắng và mọng nước (Hình 3.1B). 41 Table 3.13. Effects of aeration rate on cell growth Aeration rate (L/min) Fresh weight (g) Dry weight (g) 1.5 489.67c 36.9b 2.0 561.00b 50.84a 2.5 603.00a 53.25a 3.0 583.33b 50.33a 3.5 441.00d 33.17b Figure 3.9. Growth of Zedoary cell in 10 L bioreactor 3.4. The accumulation of some bioactive compounds in Zedoary cells 3.4.1. Essential oil Concentration of essential oil derived from Zedoary cells cultured in 10 L bioreactor was showed in table 3.14. Overall, concentration of essential oil (% dry weight) of cells increased from 2 to 14 culture days and reached a peak 2.57% (1,61% in natural Zedoary rhizomes). Table 3.14. Concentration of essential oil in Zedoary cells Time (days) Concentration of essential oil (%) 2 1.41c 4 1.49c 6 1.57bc 8 1.98c 10 2.32b 12 2.42b 14 2.57a 16 1.68bc 18 1.09d Rhizome 1.61c 40 Table 3.11. Effects of inoculum size on cell growth Inoculum size (g) Fresh weight (g) Dry weight (g) 100 241.67c 22.28d 150 358.33bc 32.68c 200 514.67a 47.97a 250 441.00b 38.89b 3.3.2.2. Agitation speed This research showed that, the increase of agitation speed 100-150 rpm/min resulted in the increase of cell biomass as well as can got peak 561 g fresh weight (50,84 g dry weight). However, at the higher agitation speed (>150 rpm/min) cell growth decreased with 437 g fresh weight (37,42 g dry weight) at 200 rpm/min (table 3.12). Table 3.12. Effects of agitation speed on cell growth Agitation speed (rpm/min) Fresh weight (g) Dry weight (g) 100 435.67c 38.19c 120 514.67bc 47.97b 150 561.00a 50.84a 180 547.33b 50.03a 200 437.00c 37.42c 3.3.2.3. Effects of aeration rate Increasing aeration rate from 1.5 to 2.5 L/min resulted in a increase of cell growth and reached a peak at 603 g fresh weight (53.25 g dry weight). However, increasing aeration rate from 3 to 3.5 L/min, cell growth were decreased. With aeration rate of 3.5 L/min, fresh weight of cell was 441 g fresh weight (33,17 g dry weight) (Figure 3.9 và Table 3.13). 9 Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 2,4-D (mg/L) BA (mg/L) % mẫu vật tạo callus Sinh trưởng của callus Hình thái callus 0,0 0,0 - - - 0,5 0,5 15,74c ++ Trắng, mọng nước 1,0 1,0 46,01a ++++ Trắng, xốp 2,0 2,0 40,10b ++++ Trắng, xốp 3,0 3,0 10,20d +++ Trắng, mọng nước 4,0 4,0 8,20cd + Trắng, mọng nước ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus. Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất KTST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus 2,4-D (mg/L) BA (mg/L) Sinh trưởng của callus Hình thái callus 0,25 0,25 + Trắng và mọng nước 0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc 1,00 1,00 ++ Trắng và xốp 2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước 4,00 4,00 - Hóa nâu và chết ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng. BA 10 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi trường còn lại không có tác dụng kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển. Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA tạo nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào huyền phù. 3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu Với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh khối đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và 1,44. Mặc dù cỡ mẫu 2 g sau 14 ngày cũng có chỉ số sinh trưởng có cao (2,0), nhưng chất lượng tế bào kém hơn (tế bào có màu vàng nhạt, dịch huyền phù ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g (tế bào có màu 39 3.3. Cell suspension culture of Zedoary in bioreactor 3.3.1. Assessment of cell growth Study showed that cell mass got maximum on the 14th with 241.67 g fresh weight (22.28 g dry weight), then decreased. The fresh cell biomass was 132.67 g fresh weight (10.08 g dry weight) after 18 days of culture. Figure 3.7. Growth of Zedoary cells in 10 litter bioreactor Figure 3.8. Fresh weight biomass (A) and dry weight biomass (B) Based on observating the growth curve of Zedoary cell, we study effects of some culture conditions on cell biomass accumulation after 14 days. 3.3.2. Effects of culture conditions 3.3.2.1. Inoculum size Results showed that the inoculum size effected on cell growth. Biomass increased when supplementing 100-200 g of cell and got pick at 514.64 g fresh weight (47,97 g dry weight). However, when increasing the inoculum size up to 250 g, cell growth was depressed (441 g fresh weight and 38.89 g dry weight) (Table 3.11). 38 from 20-60 g/L, the cell biomass also increases and reaches a maximum of 8.40 g fresh weight (0.62 g dry weight). However, when the fructose up to 70 g/L, the cell growth slowed (7.65 g fresh weight and 0.57 g dry weight). Table 3.10. Effects of fructose on cell growth Fructose (g/L) FW DW GI 20 6.72b 0.35c 2.24 30 7.34b 0.55b 2.45 40 7.70ab 0.57b 2.57 50 7.72ab 0.59b 2.57 60 8.40a 0.62a 2.80 70 7.65b 0.57b 2.55 Cell culture of Zedoary on MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D, shaking speed 120 rpm/min. The maximum biomass was gotten after 14 days with 10.44 g fresh weight (Figure 3.4 and 3.5). 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 D r y c e l l w e i g h t ( g ) F r e s h c e l l w e i g h t ( g ) Culture time (days) Fresh cell weight Dry cell weight Figure 3.4. Growth of Zedoary cells in flask of 250 ml Figure 3.5. Cell culture of Zedoary in flask of 250 ml 11 vàng đậm và tươi, dịch huyền phù đồng nhất). Vì thế, theo nhận định của chúng tôi cỡ mẫu 3 g là thích hợp hơn cả. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen 2 g 3 g 4 g 5 g TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2,22c 0,18d 1,11 3,14d 0,28c 1,05 4,07c 0,32b 1,02 5,20d 0,39c 1,04 4 2,52c 0,24c 1,26 3,52c 0,32c 1,17 4,34c 0,35b 1,09 5,32d 0,42c 1,06 6 3,00b 0,24c 1,50 4,00c 0,35b 1,33 4,94c 0,37b 1,24 5,61c 0,44c 1,12 8 3,30b 0,30b 1,65 4,53b 0,38b 1,51 5,65b 0,40b 1,41 6,09c 0,47b 1,22 10 3,50b 0,33b 1,75 4,92b 0,40a 1,64 6,04a 0,42b 1,51 7,02b 0,48b 1,40 12 3,70a 0,35b 1,85 5,15b 0,40a 1,72 6,15a 0,44a 1,54 7,22a 0,51a 1,44 14 4,00a 0,35b 2,00 5,61a 0,41a 1,87 6,12a 0,46a 1,53 5,68c 0,41c 1,14 16 4,12a 0,37a 2,06 5,21b 0,37b 1,74 5,20b 0,35b 1,30 5,00d 0,32cd 1,00 18 4,01a 0.23c 2,01 4,67b 0,29c 1,56 4,56c 0,27c 1,14 4,12e 0,22d 0,82 TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. Nhìn chung, tốc độ lắc cũng đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào. Ở tốc độ lắc 80-120 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi (0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơn 150-180 vòng/phút, tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế mạnh ở 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào chuyển sang màu nâu nâu sau 14 ngày nuôi cấy. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh sinh trưởng tế bào Tốc độ lắc (vòng/phút) FW DW GI 80 5,00ab 0,34c 1,67 100 5,61b 0,41b 1,87 120 5,91a 0,44a 1,97 150 5,60b 0,42b 1,87 180 4,75ab 0,35c 1,58 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ BA 0,25 và 0,5 mg/L có hiệu quả tương đương (p<0,05), khối lượng tươi của tế bào từ 2,06- 2,08 g (0,45-0,46 g khô) và chỉ số sinh trưởng xấp xỉ 2,1 là cao nhất. 12 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh sinh trưởng tế bào BA (mg/L) FW DW GI 0,25 6,17a 0,45a 2,06 0,5 6,25a 0,46a 2,08 1,0 5,76b 0,42ab 1,92 1,5 5,92b 0,37b 1,97 2,0 5,41bc 0,35b 1,80 2,5 4,55bc 0,32b 1,52 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có ảnh hưởng lớn nhất, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh sinh trưởng tế bào 2,4 D (mg/L) FW DW GI 0,25 5,10c 0,42b 1,70 0,5 5,77b 0,43b 1,92 1,0 6,02b 0,45b 2,01 1,5 6,75a 0,52a 2,25 2,0 6,04b 0,46b 2,01 2,5 5,35c 0,36c 1,78 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và 2,4-D nồng độ từ 0,25-2,5 mg/L. Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh sinh trưởng tế bào 2,4 D (mg/L) BA (mg/L) FW DW GI 0,5 0,25 5,82b 0,43b 1,94 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 0,5 1,0 5,32c 0,40c 1,77 0,5 1,5 5,00c 0,39c 1,67 0,5 2,0 4,45cd 0,38c 1,48 0,5 2,5 4,00d 0,35c 1,33 0,25 0,5 5,12c 0,39c 1,71 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 1,0 0,5 6,20b 0,46b 2,07 1,5 0,5 7,22a 0,55a 2,41 2,0 0,5 6,03b 0,43b 2,01 2,5 0,5 6,01b 0,42b 2,00 37 culture were showed in figure 3.8. Table 3.8. Effects of sucrose on cell growth Sucrose (g/L) FW DW GI 20 7.22c 0.55b 2.41 30 10.44a 0.66a 3.48 40 8.85b 0.64a 2.95 50 8.80b 0.65a 2.93 60 8.75b 0.70a 2.92 70 6.75c 0.60b 2.25 Results showed that, cell growth were slowly at low concentration of 20 g/L sucrose (7,22 g of fresh weight and 0.55 g dry weight). The medium contained 30 g/L sucrose, cell growth increase dramatically (10.44 g fresh weight and 0.66 g dry weight) with growth index of 3.48, the suspension solution was bright yellow and rather homogenous. At the sucrose concentration of 40-70 g/L, cell growth decreased, especially at 70 g/L (6.75 g fresh weight and 0.6 g dry weight). 3.2.4.2. Effects of glucose Results indicated that cell biomass was rather low when culturing cells on medium contain 20-30 g/L glucose. At the glucose of 40-60 g/L cell biomass got maximum (7.32 g fresh weight and 0.59 g dry weight), with growth index of 2.44. At the glucose of 70 g/L, the cell growth was depressed. Table 3.9. Effects of glucose on cell growth Glucose (g/L) FW DW GI 20 3.15cd 0.22c 1.05 30 6.05c 0.42bc 2.02 40 7.12a 0.53b 2.37 50 7.20a 0.55b 2.40 60 7.32a 0.59a 2.44 70 6.65b 0.53b 2.22 3.2.4.3. Effects of fructose The study results showed that fructose has significant influence than glucose. When fructose concentrations in the medium increasing 36 mg/L was most effect, fresh weight of cell got 6.75 g (0.52 g dry weight) and growth index was 2.25, higher than other medium. Table 3.6. Effects of 2,4-D on cell growth 2.4 D (mg/L) FW DW GI 0.25 5.10c 0.42b 1.70 0.5 5.77b 0.43b 1.92 1.0 6.02b 0.45b 2.01 1.5 6.75a 0.52a 2.25 2.0 6.04b 0.46b 2.01 2.5 5.35c 0.36c 1.78 3.2.3.3. Effects of 2,4-D and BA The cells of Zedoary were cultured on the medium supplemented with BA and 2,4-D (0.25-2.5 mg/L). Results after 14 days of culture were showed in table 3.7. Table 3.7. Effects of 2,4-D and BA on cell growth 2.4 D (mg/L) BA (mg/L) FW DW GI 0.5 0.25 5.82b 0.43b 1.94 0.5 0.5 5.91b 0.44b 1.97 0.5 1.0 5.32c 0.40c 1.77 0.5 1.5 5.00c 0.39c 1.67 0.5 2.0 4.45cd 0.38c 1.48 0.5 2.5 4.00d 0.35c 1.33 0.25 0.5 5.12c 0.39c 1.71 0.5 0.5 5.91b 0.44b 1.97 1.0 0.5 6.20b 0.46b 2.07 1.5 0.5 7.22a 0.55a 2.41 2.0 0.5 6.03b 0.43b 2.01 2.5 0.5 6.01b 0.42b 2.00 Overall, the medium that supplemented both 2,4-D and BA showed better result, compared to the medium supplemented only one of them. The cell weight and growth index got maximum on the environment containing 2,4-D 1.5 mg/L and BA 0.5 mg/L, with 7.22 g fresh weight (0.55 g dry weight) and 2.41 respectively. 3.2.4. Effects of carbon sources 3.2.4.1. Effects of sucrose Effects of sucrose on the growth of Zedoary cells after 14 days of 13 Nhìn chung, môi trường có bổ sung đồng thời 2,4-D và BA cho kết quả tốt hơn các môi trường bổ sung riêng rẽ hai chất này. Khối lượng tế bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41. 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng tế bào Sucrose (g/L) FW DW GI 20 7,22c 0,55b 2,41 30 10,44a 0,66a 3,48 40 8,85b 0,64a 2,95 50 8,80b 0,65a 2,93 60 8,75b 0,70a 2,92 70 6,75c 0,60b 2,25 Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ sucrose thấp (20 g/L) tế bào sinh trưởng chậm, chỉ đạt 7,22 g khối lượng tươi (0,55 g khô). Sinh trưởng của tế bào đã tăng mạnh đạt 10,44 g khối lượng tươi (0,66 g khô) với chỉ số sinh trưởng là 3,48 trong môi trường có 30 g/L sucrose, dịch huyền phù có màu vàng tươi và khá đồng nhất. Ở nồng độ sucrose từ 40-70 g/L, sinh trưởng của tế bào giảm, đặc biệt là ở 70 g/L (chỉ đạt 6,75 g tươi/0,60 g khô). 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose Kết quả cho thấy, tế bào có sinh khối tương đối thấp khi được nuôi trong môi trường có 20-30 g/L glucose. Ở nồng độ glucose từ 40- 60 g/L sinh khối tăng lên và đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng dộ 70 g/L đã ức chế sinh trưởng của tế bào. 14 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng tế bào Glucose (g/L) FW DW GI 20 3,15cd 0,22c 1,05 30 6,05c 0,42bc 2,02 40 7,12a 0,53b 2,37 50 7,20a 0,55b 2,40 60 7,32a 0,59a 2,44 70 6,65b 0,53b 2,22 3.2.4.3. Ảnh hưởng của fructose Kết quả nghiên cứu cho thấy, fructose có ảnh hưởng đáng kể hơn glucose. Khi tăng nồng độ fructose trong môi trường từ 20-60 g/L, sinh khối tế bào tăng theo và đạt cực đại là 8,40 g tươi (0,62 g khô). Tuy nhiên, khi bổ sung fructose lên đến 70 g/L thì sinh trưởng của tế bào chậm lại và chỉ còn 7,65 g tươi (0,57 g khô). Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng tế bào Fructose (g/L) FW DW GI 20 6,72b 0,35c 2,24 30 7.34b 0,55b 2,45 40 7,70ab 0,57b 2,57 50 7,72ab 0,59b 2,57 60 8,40a 0,62a 2,80 70 7,65b 0,57b 2,55 Chúng tôi cũng đã thành công khi nuôi cấy tế bào nghệ đen trong môi trường MS có 3% sucrose, 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc độ lắc 120 vòng/phút. Sinh khối cực đại thu được chỉ sau 14 ngày là 10,44 g tươi (Hình 3.4 và 3.5). 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 K h ố i l ư ợ n g k h ô t ế b à o ( g ) K h ố i l ư ợ n g t ư ơ i t ế b à o ( g ) Thời gian nuôi cấy (ngày) Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml 35 3.2.2. Effects of shaking speed The results were showed in table 3.4. Overall, the shaking speed also affected on biomass. At the speed of 80-120 rpm/min, biomass increases and got the maximum of 5.91 g fresh weight (0.44 g dry weight), growth index was 1.97 and the solution of cell suspension was bright yellow, homogenous. When the speed increased to 150-180 rpm/min, cell growth was slower, depressed especially at 180 rpm/min, the best biomass was 4.75 g fresh weight (0.35 g dry weight), solution of cell suspension become brown after 14 days of culture. Table 3.4. Effects of shaking speed on cell growth Shaking speed (rpm/min) FW DW GI 80 5.00ab 0.34c 1.67 100 5.61b 0.41b 1.87 120 5.91a 0.44a 1.97 150 5.60b 0.42b 1.87 180 4.75ab 0.35c 1.58 3.2.3. Effects of hormones 3.2.3.1. Effects of BA The results indicated that, concentration BA 0.25 and 0.5 mg/L showed similar effects (p<0,05), fresh weight of cell 2.06-2.08 g (0.45-0.46 g dry weight) and growth index got highest at 2.1. Table 3.5. Effects of BA on cell growth BA (mg/L) FW DW GI 0.25 6.17a 0.45a 2.06 0.5 6.25a 0.46a 2.08 1.0 5.76b 0.42ab 1.92 1.5 5.92b 0.37b 1.97 2.0 5.41bc 0.35b 1.80 2.5 4.55bc 0.32b 1.52 3.2.3.2. Effects of 2,4-D The growth ability of the Zedoary cells on the culture medium supplemented with 2,4-D (0.25-2.5 mg/L) after 14 days of culture was expressed on table 3.6. The result showe that, concentration 2,4-D 1.5 34 calluses that were light yellow, compact and friable (Figure 3.2) were collected from MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA and then become materials of suspension cell culture. 3.2. Suspension cell culture in flasks 3.2.1. Effects of inoculum size With inoculum size of 2 g, cell biomass was maximum after 16 days with 4.12 g fresh weight (0.37 g dry weight) and the growth index was 2.06. With inoculum size of 3 g, cell biomass was maximum after 14 days with 5.61 g fresh weight (0.41 g dry weight) and the growth index was 1.87. When increasing the inoculum size up to 4-5 g, cell biomass get maximum after 12 days, with 6.12 g fresh (0.46 g dry weight) and 7.22 g fresh weight (0.51 g dry weight) respectively but the growth index were low, at 1.54 and 1.44. Although inoculum size of 2 g after 14 days got a rather high growth index (2.0), the cell quality was worse (cells were light yellow, suspension was less homogenous), compared to inoculum size of 3 g (cells were bold and bright yellow, homogenous suspension). Thus, the inoculum size of 3g was the best. Table 3.3. Effect of inoculum size on biomass accumulation of Zedoary cells 2 g 3 g 4 g 5 g TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2.22c 0.18d 1.11 3.14d 0.28c 1.05 4.07c 0.32b 1.02 5.20d 0.39c 1.04 4 2.52c 0.24c 1.26 3.52c 0.32c 1.17 4.34c 0.35b 1.09 5.32d 0.42c 1.06 6 3.00b 0.24c 1.50 4.00c 0.35b 1.33 4.94c 0.37b 1.24 5.61c 0.44c 1.12 8 3.30b 0.30b 1.65 4.53b 0.38b 1.51 5.65b 0.40b 1.41 6.09c 0.47b 1.22 10 3.50b 0.33b 1.75 4.92b 0.40a 1.64 6.04a 0.42b 1.51 7.02b 0.48b 1.40 12 3.70a 0.35b 1.85 5.15b 0.40a 1.72 6.15a 0.44a 1.54 7.22a 0.51a 1.44 14 4.00a 0.35b 2.00 5.61a 0.41a 1.87 6.12a 0.46a 1.53 5.68c 0.41c 1.14 16 4.12a 0.37a 2.06 5.21b 0.37b 1.74 5.20b 0.35b 1.30 5.00d 0.32cd 1.00 18 4.01a 0.23c 2.01 4.67b 0.29c 1.56 4.56c 0.27c 1.14 4.12e 0.22d 0.82 TN: culture time (day); FW: fresh weight (g); DW: dry weight (g), GI: Growth index 15 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác đặt trên máy lắc 3.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào Kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm dần. Sinh khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi. 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 K h ố i l ư ợ n g k h ô t ế b à o ( g ) K h ố i l ư ợ n g t ư ơ i t ế b à o ( g ) Thời gian nuôi cấy (ngày) Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 lít Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối tế bào sau 14 ngày. 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 3.3.2.1. Cỡ mẫu Kết quả của chúng tôi cho thấy, lượng mẫu đã ảnh hưởng thật sự 16 lên sự sinh trưởng của tế bào. Sinh khối tăng lên khi đưa vào môi trường từ 100-200 g tế bào và đạt cực đại là 514,64 g tươi (47,97 g khô). Tuy nhiên, khi tăng lượng mẫu lên 250 g thì sinh trưởng của tế bào bị ức chế do tăng mật độ, vì thế chỉ đạt 441 g tươi (38,89 g khô) (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào Cỡ mẫu (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 100 241,67c 22,28d 150 358,33bc 32,68c 200 514,67a 47,97a 250 441,00b 38,89b 3.3.2.2. Tốc độ khuấy Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100- 150 vòng/phút thì sinh khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561 g tươi (50,84 g khô). Tuy nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và chỉ đạt được 437 g tươi (37,42 g khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12). Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào Tốc độ khuấy (vòng/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 100 435,67c 38,19c 120 514,67bc 47,97b 150 561,00a 50,84a 180 547,33b 50,03a 200 437,00c 37,42c 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí Ở tốc độ 1,5-2,5 L/phút, sinh trưởng của tế bào tăng dần và đạt cực đại với 603 g tươi (53,25 g khô). Nếu tốc độ sục khí tiếp tục tăng lên từ 3-3,5 L/phút thì sinh trưởng của tế bào sẽ giảm. Ở tốc độ sục khí 3,5 L/phút, khối lượng tươi của tế bào chỉ đạt 441 g (33,17 g khô) (Hình 3.9 và Bảng 3.13). Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào Tốc độ sục khí (l/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 1,5 489,67c 36,9b 2,0 561,00b 50,84a 2,5 603,00a 53,25a 3,0 583,33b 50,33a 3,5 441,00d 33,17b 33 Figure 3.1. Callus induction culture of Zedoary. (A) White and soft callus, (B) White and viscous callus Table 3.2. Effect of hormone on growth and morphogenesis of callus 2,4-D (mg/L) BA (mg/L) Callus growth Callus morphogenesis 0.25 0.25 + White and viscous 0.50 0.50 ++++ Light yellow, compact and friable 1.00 1.00 +++ White and soft 2.00 2.00 ++ White and viscous 4.00 4.00 - Brown and dead ++++: high growth of callus; +++: medium growth of callus; ++: low growth of callus; +: weak growth; - : no growth. Figure 3.2. The yellow, compact and friable callus after 14 days of culture Primary callus that were white, soft and high growth were subcultured to MS medium supplemented with 2,4-D and BA (0.25 – 4.0 mg/L). The results showed that callus growed on the medium contained 2.0 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L BA become brown and dead after subculture. Callus growing on the medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA become the best secondary callus on the medium containing 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA (Table 3.2). The other medium did not stimulate callus growth (callus was weak growth or becoming brown and dead) after 4 weeks of subculture. Secondary BA 32 method of agar plate diffusion as Lehrer et al. (1991) . 2.2.9. Statistics Every experiment was repeated 3 times. The collected data were calculated average ± standard error and analysed Ducan’s test (p<0,05) by SAS programme. Chapter 3 RESULTS AND DISCUSSION 3.1. Callus culture Results in inducting callus derived from leaf-base of in vitro Zedoary on variety medium after 90 days of culture were summaried in table 3.1. The medium added BA and 2,4-D showed stimulation in inducting callus, meanwhile, free-hormones medium showed no inducted callus. The medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA or 2.0 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L BA seemed most suitable (rate of callus induction as 40.1-46.01%), callus was white, soft and good growth (Figure 3.1A). On other medium, the rate was low (8.2-15.74%), callus was white and viscous (Figure 3.1B). Table 3.1. Callus induction and morphogenesis of Zedoary leaf-base explants 2,4-D (mg/L) BA (mg/L) % explants produced callus Callus induction Callus morphogenesis 0.0 0.0 - - - 0.5 0.5 15.74c ++ White, viscous 1.0 1.0 46.01a ++++ White, soft 2.0 2.0 40.10b ++++ White, soft 3.0 3.0 10.20d +++ White, viscous 4.0 4.0 8.20cd + White, viscous ++++: high production of callus; +++: medium production of callus; ++: low production of callus; +: induction; - : no induction. 17 0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 400 500 600 700 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 K h ố i l ư ợ n g k h ô t ế b à o ( g ) K h ố i l ư ợ n g t ư ơ i t ế b à o ( g ) Thời gian nuôi cấy (ngày) Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 3.4. Khảo sát sự tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong tế bào nghệ đen 3.4.1. Hàm lượng tinh dầu Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi trong hệ lên men 10 l được trình bày ở bảng 3.14. Nhìn chung, hàm lượng tinh dầu (% khối lượng khô) của tế bào tăng dần từ 2-14 ngày nuôi cấy và đạt giá trị cực đại là 2,57% cao hơn của củ nghệ đen tự nhiên (1,61%) khoảng 1,6 lần (p<0,05). Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào nghệ đen Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng tinh dầu (%) 2 1,41c 4 1,49c 6 1,57bc 8 1,98c 10 2,32b 12 2,42b 14 2,57a 16 1,68bc 18 1,09d MTN (củ nghệ đen 1 năm tuổi) 1,61c 18 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số Bảng 3.15 trình bày hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số (% khối lượng khô) trong tế bào nghệ đen tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, hàm lượng polysaccharide tăng từ 2- 10 và đạt cực đại là 6,55% thấp hơn khoảng 1,4 lần so với củ nghệ đen (9,46%) (p<0,05). Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide trong tế bào nghệ đen Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng polysaccharide (%) 2 1,73e 4 2,23d 6 3,53cd 8 5,15bc 10 6,55a 12 5,76b 14 4,53c 16 2,01d 18 1,60e MTN 9,46g 3.4.3. Hàm lượng curcumin Kết quả phân tích HPLC được trình bày ở các hình 3.10-3.12 và bảng 3.16. Curcumin chuẩn có thời gian lưu là 2,05 phút, một peak có thời gian lưu tương đương cũng được tìm thấy ở dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên (2,08 phút) và tế bào nuôi cấy ở các thời gian khác nhau từ 2-18 ngày (1,97-2,09 phút). Bên cạnh đó, dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên còn có thêm 2 peak khác, một peak có thời gian lưu như peak thứ hai ở tế bào nuôi cấy (1,79 phút), peak còn lại có thời gian lưu là 1,21 phút. Dịch chiết tế bào nuôi cấy có một peak thứ ba rất nhỏ với thời gian lưu khoảng 1,6 phút. Sự biến mất của peak thứ ba 1,21 phút (ở dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên) trong tế bào in vitro có thể là do sự chuyển hóa sinh học đã xảy ra trong quá trình nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.16 cho thấy,, hàm lượng curcumin (theo % khối lượng khô) tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14, đạt 31 stored liquid of MS environment including 3% sucrose, added 1.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA, sample amount of 100-250 g, agitation speed of 100-200 rpm/min, aeration rate of 1.5-3.5 L/min. The cell mass was collected every two days during 18 days to study their growth ability. 2.2.3. Determination of the cell growth The fresh cell mass was collected by vacuum-filtering the cell suspension before being rinsed with distilled water to remove remaining environment solution and scaled to determine their fresh mass. The dried amount of cells was indiated by drying the fresh mass in dry cabinet at 500C untill getting constant weight then being scaled. 2.2.4. Quantification of essential oil Extracting and determining the amount of the essential oil using method of Manzan et al 2003. 2.2.5. Quantification of curcumin Extracting curcumin as the method of Paramapojn and Gritsanapan (2009). Analysis of HPLC to determine the quantity of curcumin was conducted by using Spectra System (Thermo Electron, America) ultilized programme ChromQuest (ver. 4.2.34). 2.2.6. Quantification of the total water soluble polysaccharide Polysaccharide extracted by using method of Sun et al (2005). Determination of polysaccharide concentration was based on standard curve D-glucose (4-20 mg/ml) as Chaplin et al. (1994) and calculated via the coefficient of converting into polysaccharide of 3.168 as Li et al. (2007). 2.2.7. Determination of sesquiterpenes Extracting sesquiterpene based on the method of Jang et al. (2004). Analysis HPLC to determine sesquiterpene was conducted on Spectra System (Thermo Electron, America) ultilized programme ChromQuest (ver. 4.2.34). 2.2.8. Determination of the antibacterial activity of essential oil The antibacterial activity of essential oil was identified via 30 anticancer, protecting brave, antiulcerated, anti-inflammatory, antibacterian and antifungus. There have been some studies in in vitro multiplication of the curcuma such as regenerating buds from callus of Zedoary. Overmore, some initial results in culturing callus and cell suspension of the curcuma have been published already. Up to now, there have been no any studies of cell culture of the Zedoary in fermentation system as well as no any assessment in their ability in accumulating bioactive compounds. Chapter 2 RESEARCH OBJECTIVE AND METHODS 2.1. Research objective The objective was C. zedoaria Roscoe. The materials were callus from leaf-base of in vitro Zedoary. 2.2. Methods 2.2.1. Callus culture Leaf-base of in vitro Curcuma zedoaria Roscoe were cultured on the MS medium supplemented with sucrose 2% and agar 0.8%; 0.5-4.0 mg/L 2,4-D; and 0.5-4.0 mg/L BA. 2.2.2. Cell suspension culture 2.2.2.1. Culturing cells in flask 2 g callus of two weeks age were transfered into flasks of 250ml containing 50 mL of MS liquid medium supplemented with 2% sucrose, 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA, cultured on the shaking machine with speed of 500 rpm/min. The liquid MS medium added variety of carbon resources and hormones like BA and 2,4-D cultured on the shaking machine with speed of 500 rpm/min to evaluate the ability of cells growth. 2.2.2.2. Cell suspension culture in bioreactor 100 g of cell mass was transfered to fermentation system of 10 L 19 cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của tế bào (Hình 3.9). Nhìn chung, hàm lượng curcumin trong tế bào ở các thời gian nuôi cấy khác nhau đều cao hơn trong củ nghệ đen tự nhiên (0,43%), lúc cao nhất gấp khoảng 2,7 lần. Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít Thời gian nuôi cấy (ngày) Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (mAU)2 Hàm lượng curcumin (%) 2 2,09 1909 0,44g 4 1,98 2226 0,52e 6 2,05 2285 0,53e 8 2,00 2442 0,56e 10 1,97 4244 0,98b 12 1,99 4448 1,03b 14 2,07 5034 1,16a 16 1,99 3631 0,84c 18 2,07 2573 0,60d MTN 2,06 1868 0,43g Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml) Hình 3.11. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên 20 Hình 3.12. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào nghệ đen sau 2-18 ngày nuôi cấy 3.4.4. Xác định sesquiterpene Kết quả cho thấy, sự hiện diện của các peak phân tách trong củ nghệ tự nhiên nhiều hơn trong tế bào huyền phù (Hình 3.13). Nhìn chung, các peak có thời gian lưu liên quan với các hợp chất sesquiterpene (được đánh số từ 1-9) trong củ nghệ và tế bào huyền phù có chiều cao phổ hấp thụ (mAU) khác nhau, đặc biệt là peak số 1 và 4 29 bottles, jars to flasks of 1 litter in shaking culture, after that, glass fermentation system of 1-10 litter, and then unrested steel bioreactor of 30-150 L and final up to 1000 L. Bioreactor is a automatic culture system with main aim of improving the ability of controlling optimal condition for cell growth or for producing products. Some collected evidences from reality over recent decades indicated that secondary substance possed basic functions such as protecting from herbivores, antibacterial, antivirus. Such substances were also applied in pharmacy, agriculture chemicals, staining chemical, perfurme – created substances, insecticide. Secondary substances come from plant can be devided into 3 groups: terpene, phenol and nitrogen compounds. Studies in the ability of biosynthetic of cultured cells were conducted by botanist and microbiologist in many nations. Most of applications of plant cell culture in biotechnology are focused on producing secondary substance. Some archievements in the field of plant cell culture to produce substances applied in treatment indicated the future of producing with a large – scale substances of class of alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid and amino acids. In Vietnam. The technology of plant cell has been culture developed from 1970s and already got some suscesses up to now. One of most successful archivements is culturing ginseng Ngoc Linh. Besides, there were some other cell culture of others medicinal plants like Taxus Wallichiana zucc, Solanum hainanense, Centella asiatica, vinca rosea... Zedoary possess essential oil including sesquiterpene and monosesquiterpene; curcuminoid. Moreover, the plant also stores starch, plastic and some other bitterness compounds. Zedoary has been utilized in some remedies of oriental medicine for treatment. Many studies indicated that compounds like essential oil, curcumin, sesquiterpene… of Zedoary possess precious bioactivities such as 28 and discussion, 36 pages; Conclusion and recommendation, 2 pages; Publcation related to the thesis: 1 page. References: 23 pages (including 193 English and Vietnamese references); 18 table of data and 16 figures Chapter 1 OVERVIEW 17 Vietnamese references and 189 English references were refered, related to: (1) Plant cell culture; (2) Accumulation of secondary metabolites in in vitro plant cell culture; (3) Introduction of C. zedoaria Rocoe. The first experience of plant tissue was published in 1902 by Haberlandt-the German plant Physiologist, known as the man invented method of plant cell culture. First experiments in single cell culture for pharmaceutical production in 1950s in Charles Pfizer company. Up to now, 1 century since Haberlandt research, many sub – substances were produced via plant cell culture. Plant cell culture started from appearance of unsplitting cells that called callus. Callus culture was based on tissue culture taken from plants on the essential culture environment including agar. The cell suspension culture started by transferring callus mass to liquid culture using stirring machine, spin or whirl filter membrane. The callus cultured were fragile, so it is possible to establish the cell suspension liquid with highest level of dispersion. Culturing the cell suspension in liquid environment provided a unique system for detail studies about growth and production transformef substances. In this culture process, some elements should be in high interst such as: culture environment including hormones, carbon resource, culture conditions such as size of original samples, agitation, aeration rate. The order of a improved process started from culturing cell in 21 (Bảng 3.17). Chẳng hạn, peak số 1 (thời gian lưu 4,7 phút) co độ hấp thụ là 6,05 mAU trong củ nghệ nhưng chỉ đạt 2,55 mAU trong tế bào huyền phù, ngược lại peak số 4 (thời gian lưu 7,5 phút) ở tế bào huyền phù có độ hấp thụ là 7,33 mAU còn củ nghệ là 2,23 mAU. Một số peak hiện diện trong củ nghệ (5-8) thì không có hoặc chỉ có ở dạng vết (< 1 mAU) trong tế bào huyền phù. Tuy nhiên, ở tế bào huyền phù lại xuất hiện những peak mới (không đánh số) với các thời gian lưu xấp xỉ 6,8; 7,8; 8,2 và 9,2 min tương ứng với độ hấp thụ 1,38-4,10; 5,62-7,54; 1,70-8,41 và 1,06-8,38 mAU. Kết quả này cho thấy, trong quá trình nuôi cấy tế bào đã xuất hiện sự chuyển hóa sinh học của các sesquiterpene, tạo ra những hợp chất sesquiterpene khác so với củ nghệ. Bảng 3.17. Chiều cao của của phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên en 10 L và củ nghệ tự nhiên Hợp chất sesquiterpene (số)/thời gian lưu (phút) TN 1/4,7 2/5,1 3/6,0 4/7,5 5/12,7 6/13,8 7/19,2 8/20,5 9/26,7 2 2,11 - 2,49 5,99 - vết vết vết - 4 1,93 - 2,23 5,76 - vết vết vết - 6 1,15 vết 2,81 3,17 - vết - - - 8 1,06 - 1,54 3,57 - - - - - 10 1,22 - 1,02 4,05 - vết vết - - 12 1,04 vết 2,14 3,29 - vết - vết - 14 2,55 1,59 - 7,33 - vết - vết - 16 1,58 - 3,82 4,04 - vết - - - 18 2,36 1,15 1,15 5,11 - vết - vết - MTN 6,05 2,59 2,15 2,23 6,23 1,46 3,59 1,29 1,19 22 Hình 3.13. Phổ HPLC về sự phân bố sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít từ 2-18 ngày 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen Kết quả trình bày ở bảng 3.18 cho thấy, tinh dầu tách chiết từ tế bào và củ nghệ đen tự nhiên đều có khả năng ức chế sinh trưởng của cả 3 loài vi khuẩn E. coli, S. aureus và B. cereus. Nhìn chung, tinh dầu 27 4. Thesis contributions - Successful selection of cell line (compact and friable) from the leaf-base explants of in vitro Zedoary to culture suspension, along with systematical identification of suitable conditions and culture medium for the quick and stable growth of cells of C. zedoaria Roscoe that were from suspension culture in flasks and 10 litter bioreactor. - Study the accumulation of some bioactive substances such as: essential oil, curcummin, sesquiterpene and polysaccharide in cells of Curcuma zedoaria Roscoe. - Studied the antibacterial ability of the essential oil extracted from the in vitro cultured zedoary cells and already found that the essential oil was able to depress growth of some pathogenic microorganisms. 5. Science meaning and reality 5.1. Science meaning The thesis results can provide some new science data systematically on cell culture of Zedoary and on their accumulation ability of some bioactive compounds. Moreover, the results can be a useful reference for other researches and teaching in cell culture and producing high valuable bioactive substances. 5.2. Reality meaning The study results also could be a science base to develop the process of cell culture for Zedoary in order to quickly produce biomass and provide a stable material resource for extracting and collecting some secondary metabolites used for medicine. 6. The thesis structure The thesis concluded 105 pages (including references), involved: Introduction: 4 pages: Chapter 1: Overview, 32 pages; Chapter 2: Research objects, contents and methods, 7 pages; Chapter 3: Results 26 sesquiterpen are capable of inhibiting the formation of TNF-α of activated macrophages, which has therefore the anti-inflammatory effects. Besides, curcumin is also an antioxidant that is capable of cells protection. Essential oil has the high capacity of antimicrobial and mutation resistance. In addition, its polysaccharide effectively inhibited the growth of sarcoma (sarcoma 180), preventing chromosome mutation, as well as has macrophages stimulating activity. In the nature, Zedoary is propagated by rhizome. The growth of bulb takes place in a long time, leading to the less multiplier coefficient and lower yield. On top of that, it especially depends greatly on the conditions of weather, seasons, labor costs and production materials. On the other hand, the natural Zedoary is also susceptible to diseases such as root rot and leaf spot. It is, therefore, very difficult to have a stable and abundant raw materials for the production of a large number of precious activities used in pharmaceutical preparations. In the light of the above facts, we do the thesis of “Study on cell culture of Zedoary (Curcuma Zedoaria Roscoe) and investigate the accumulation of some bioactive compounds”. 2. Research purposes Study to propose suitable culture conditions and medium for quick production of cell biomass, simultaneously for identification of the ability in accumulating some bioactive compounds in cells of Curcuma zedoaria Roscoe that were from suspension culture. 3. Research contents - Callus induction from in vitro leaf-base explants of Zedoary; - Suspension culture of Zedoary cells; - Study the accumulation of some bioactive compounds in in vitro Zedoary cells; - Investigate of antibacterial activity of essential oil in in vitro Zedoary cells. 23 thu được từ tế bào nghệ đen có khả năng kháng khuẩn cao nhất thể hiện qua đường kính vòng ức chế (Hình 3.14). Tinh dầu tế bào nuôi cấy ức chế mạnh nhất đối với S. aureus (đường kính vô khuẩn 31 mm), sau đó đến B. cereus (22,33 mm) và kém nhất đối với E. coli (18,33 mm). Trong khi đó, khả năng ức chế sinh trưởng của tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên đối với B. cereus và E. coli là tương đương nhau (16 mm và 17,67 mm), kém nhất là đối với S. aureus chỉ đạt 14 mm. Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen Đường kính vòng vô khuẩn D-d (mm) Vi khuẩn Đối chứng Tinh dầu tế bào Tinh dầu củ nghệ B. cereus ATCC 11778 0 22,33b 16,00a E. coli ATCC 25922 0 18,33b 17,67a S. aureus ATCC 6538 0 31,00a 14,00a Đối chứng: không có tinh dầu nghệ đen Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen. A: E. coli ATCC 25922. B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: đối chứng. TN: tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên. TB: tinh dầu của tế bào nghệ đen KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1. Môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L thích hợp cho nuôi cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen in vitro. Callus được tạo thành có màu có màu vàng, rắn và rời rạc được dùng làm nguyên liệu để thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù. 2. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút thích hợp cho sinh 24 trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml. Sinh khối đạt cực đại là 10,44 g tươi (0,66 g) sau 14 ngày khi nuôi cấy với cỡ mẫu là 3 g. 3. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí 2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14 ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g. 4. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khối lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở củ nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Đã có chuyển hóa sinh học curcuminoid trong nuôi cấy tế bào. Hàm lượng polysaccharide trong tế bào cao nhất là 6,55% khối lượng khô sau 10 ngày nuôi cấy, thấp hơn ở củ nghệ tự nhiên khoảng 1,4 lần. Có sự tích lũy các hợp chất sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy. Thành phần sesquiterpene hiện diện trong tế bào huyền phù ít hơn so với củ nghệ 1 năm tuổi. Trong tế bào có 3-4 peak của sesquiterpene giống như tế bào củ nghệ. Đã có chuyển hoá sinh học sesquiterpene trong nuôi cấy tế bào. 5. Tinh dầu tế bào cây nghệ đen có khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn B. cereus ATCC 11778 (đường kính vô khuẩn 31 mm), S. aureus ATCC 6538 (22,33 mm) và E. coli ATCC 25922 (18,33 mm). Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của tinh dầu thu hồi từ tế bào nuôi cấy khá cao. ĐỀ NGHỊ 1. Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tế bào nghệ đen. 2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của curcuminoid, sesquiterpenes, polysaccharides được sản xuất từ tế bào nghệ đen. 25 INTRODUCTION 1. The necessity of the thesis Plants are the source of carbohydrate, protein and food fat. Furthermore, they are also a diversified source of natural compounds used in pharmaceuticals, agrochemicals and flavors... These products are known as secondary metabolites, which are also considered as the product of the chemical reactions of the plants with the environment or its chemical protections against microorganisms and animals. The studies on the plant - originated sub compounds have developed from the late 50s of the 20th century. To date, there are about more than 80,000 compounds published. The exploitation of natural resources of medicinal plants is becoming an important issue globally as they are more increasingly commercialized. The question is now that the natural habitats of medicinal plants are rapidly disappearing due to fluctuations in environmental conditions and geography, as well as the indiscriminate exploitation of human beings. That is the reason why scientists must take into account the potential of plant tissue culture technique as an alternative to a stable supply of raw materials for the pharmaceutical industry. Plant tissue culture has been researched since the 1950s. Many studies showed that it is an effective method in producing bioactive substances or their metabolites. Based on the method, a wide variety of valuable compounds has been produced successfully, such as anthraquinone, vincristine, berberine, diosgenin, taxol, ginsenoside, and so on. Zedoary is a non-toxic herb, containing the substances such as curcumin, terpenoids and essential oils. Curcumin is capable of inhibiting tumors, which helps to against some forms of cancer in mice, such as colon cancer, stomach cancer, breast cancer and ovarian cancer. It has also the effects of anti-clotting and hypotension. Both curcuminoid and