Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu

iết các thành phần sinh học Trong các kỹ thuật điện hóa ứng dụng trong nhận biết các phần tử sinh học (DNA, kháng nguyên/kháng thể), mỗi kỹ thuật đều có những ưu điểm riêng. Ưu điểm của 7 phương pháp EIS (phương pháp phổ tổng trở điện hóa) là trong suốt quá trình đo chỉ cần đưa một điện áp kích thích nhỏ vào hệ nên hoạt tính của các thành phần sinh học không bị ảnh hưởng và hệ vẫn được giữ ở trạng thái cân bằng. Hơn nữa phương pháp EIS có độ ổn định cao, cho phép phân tích không chỉ toàn bộ quá trình mà cả các giai đoạn riêng rẽ, diễn ra đồng thời hoặc song song trong hệ nghiên cứu. Ưu điểm của phương pháp đo vi sai là có thể loaị bỏ sư ̣nhiêũ của môi trường, do đó cho kết quả đo chính xác ngay cả khi tín hiệu đo nhỏ hoặc bị nhiễu bởi các nguồn nhiễu khác. Ưu điểm của phương pháp CV (phương pháp quét thế vòng) là do phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong phân tích điện hóa nói chung nên các thiết bị điện hóa được sử dụng cho phép đo CV là phổ biến. Hơn nữa, khi mục tiêu xa hơn được hướng đến là nghiên cứu thiết kế, chế tạo bộ vi phân tích điện hóa ứng dụng trong y sinh (sự kết hợp của đầu đo tích hợp, vi bình phản ứng và thiết bị điện hóa cầm tay) thì phương pháp CV là một lựa chọn phù hợp, khả thi trong việc thiết kế, chế tạo mạch đo cho thiết bị điện hóa cầm tay. Trên cơ sở đó, trong luận án này, cả ba kỹ thuật điện hóa trên sẽ được lựa chọn tùy thuộc vào từng nội dung nghiên cứu cụ thể và điều kiện cơ sở vật chất kỹ thuật trong từng giai đoạn nghiên cứu. 2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE 2.1. Mở đầu Trong nội dung nghiên cứu này, luận án sẽ hướng đến việc nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole. Các kỹ thuật điện hóa được thực hiện trong một hệ đo mở sẽ được tập trung nghiên cứu, các phép đo điện hóa không sử dụng các điện cực thương mại mà trên cơ sở các điện cực tự thiết kế và phát triển, vật liệu thể mềm PPy cấu trúc dây nano sẽ được chế tạo nhằm biến tính bề mặt cảm biến, giúp nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA được lựa chọn làm đối tượng đo vì DNA có độ bền, độ ổn định cao và dễ đặt mua. 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Hóa chất Bảng 2.1 Trình tự chuỗi đơn DNA Chuỗi đầu dò (probe): Thiol-C6-5’-AGACCTCCAGTCTCCATGGTACGTC-3’ Chuỗi đích (target): 5’-GACGTACCATGGAGACTGGAGGTCT-3’ Chuỗi đích không kết cặp: 5’-ACGCTGAGTACGGGTGCAAGAGTCA-3’ 2.2.2. Điện cực tích hợp Hệ hai điện cực Pt tích hợp bao gồm điện cực làm việc với diện tích 0,8 mm2 và điện cực đối với diện tích 5 mm2, hình 2.1. 2.2.3. Tổng hợp dây nano PPy sử dụng kỹ thuật điện hóa Quá trình tổng hợp dây nano PPy được thực hiện trên hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan. Bình điện hóa sử dụng điện cực Pt tích hợp (bao Hình 2.1: (A): quy trình chế tạo rút gọn; (B): điện cực dùng làm cảm biến 8 gồm điện cực làm việc và điện cực đối) và điện cực so sánh Ag/AgCl trong dung dịch KCl bão hòa. Dây nano PPy được tổng hợp trong môi trường trung tính, pH = 7,4 với vai trò của đệm muối phốt phát (PBS). Dung dịch điện li được pha chế gồm: monome pyrrole, gelatin 0,08% về khối lượng, LiClO4 0,1 M và đệm PBS. Dây nano PPy được tổng hợp trực tiếp lên điện cực Pt (WE) nhờ kỹ thuật điện hóa: áp điện thế không đổi 0,75V lên điện cực làm việc và đo dòng phản hồi I theo thời gian, gelatin được sử dụng với vai trò làm khuôn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano PPy. 2.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp lên bề mặt màng cấu tạo bởi các dây nano PPy bằng phương pháp hấp phụ. 10 μl dung dịch DNA dò nồng độ 10 μM được nhỏ đều, phủ lên điện cực Pt-PPy NWs trong 2 giờ. Sau đó điện cực được rửa sạch nhiều lần bằng nước khử ion nhằm loại bỏ các sợi DNA dò không liên kết hoặc liên kết yếu với dây nano PPy. Cuối cùng, cảm biến được làm khô tự nhiên và bảo quản ở 4 oC. 2.2.5. Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò tại các nồng độ DNA đích khác nhau được khảo sát sử dụng hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan. Dòng xoay chiều đặt vào có biên độ Eac = 10 mV, tần số biến thiên f = 0,1 Hz đến 104 Hz, điện áp một chiều không đổi Edc = 0,25 V so với Ag/AgCl trong dung dịch KCl bão hòa. 2.3. Kết quả và thảo luận 2.3.1. Tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Pt 2.3.1.3. Ảnh hưởng của gelatin – khuôn nano trong chế tạo dây polyme Khi không sử dụng gelatin, PPy được hình thành trên bề mặt điện cực Pt với cấu trúc hoa súp lơ (cauliflower). Để khắc phục hiện tượng này, gelatin được sử dụng với vai trò như khuôn mềm trong quá trình polime hóa, kết quả là PPy xuất hiện trên bề mặt điện cực Pt với cấu trúc dây nano, đường kính dây khoảng 65 nm đến 105 nm, chiều dài dây cỡ micromet. Kích thước dây nano PPy tổng hợp được là đồng đều, đường kính đồng đều dọc theo chiều dài của dây và dây nano phân bố tương đối đều trên bề mặt điện cực. So sánh với vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu PPy cấu trúc dây nano với đặc tính diện tích bề mặt riêng lớn được cho là sẽ thuận lợi hơn cho quá trình cố định trực tiếp DNA dò lên cảm biến DNA nhờ sự tạo thành liên kết giữa gốc amin trên dây nano PPy và gốc phốt phát của DNA. Mối liên kết trực tiếp này cùng với khả năng truyền dẫn điện tử tốt của dây nano PPy được cho là góp phần cải thiện độ nhạy của cảm biến DNA. 2.3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ monome pyrrole Hình 2.7: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong pyrrole 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và:(a) 0 %wt gelatin; (b): 0,08 %wt gelatin. Thời gian tổng hợp PPy là 300 s. 9 Khi nồng độ ban đầu của Py là 0,15 M, PPy được hình thành trên bề mặt điện cực Pt với cấu trúc hoa súp lơ (cauliflower), hình 2.9c. Với mục đích tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Pt, phản ứng polime hóa cần được thực hiện trong điều kiện nồng độ Py ban đầu thấp hơn. Khi nồng độ ban đầu của Py là 0,1 M, dây nano PPy có kích thước đồng đều hơn và phân bố đồng đều hơn trên bề mặt cảm biến, hình 2.9b, so với khi nồng độ ban đầu của Py là 0,05 M, hình 2.9a. Với kích thước đồng đều và sự phân bố đồng đều của dây nano PPy trên bề mặt cảm biến, quá trình cố định phần tử cảm nhận sinh học lên trên dây nano PPy sẽ thuận lợi hơn, vì vậy giá trị nồng độ Py ban đầu 0,1 M được lựa chọn trong các quy trình tổng hợp dây nano PPy định hướng ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học. 2.3.1.5. Thời gian polime hóa Khi thời gian phản ứng là 150 giây, dây nano PPy bắt đầu hình thành trên bề mặt điện cực Pt, hình 2.10a. Khi thời gian phản ứng là 200 giây, một số dây nano PPy phát triển dài thêm, tuy nhiên, một số dây nano PPy vẫn ở trạng thái như khi bắt đầu hình thành, hình 2.10b. Khi tăng thời gian phản ứng lên 300 giây, dây nano PPy tiếp tục phát triển dài thêm với kích thước khá đồng đều, đường kính dây khoảng 65 nm đến 105 nm, chiều dài dây cỡ micromet và dây phân bố đồng đều trên bề mặt điện cực Pt, hình 2.10c. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian phản ứng lên 400 giây, do dây nano PPy phát triển quá dài, hiện tượng chồng chập các dây nano xuất hiện dẫn đến sự phân bố không đồng đều của dây nano trên bề mặt điện cực Pt, hình 2.10d. Như vậy, thời gian polime hóa 300 giây là phù hợp đối với nghiên cứu này vì với sự phát triển ổn định, kích thước đồng đều và sự phân bố đồng đều của dây nano PPy trên bề mặt điện cực, quá trình cố định phần tử cảm nhận sinh học lên trên cảm biến sẽ thuận lợi hơn. Việc có thể khống chế được thời gian phản ứng (trong nghiên cứu này là 300 giây) là một trong những ưu điểm của phương pháp tổng hợp điện hóa nhằm tạo ra các sản phẩm mong muốn (trong nghiên cứu này là dây nano PPy). 2.3.1.6. Phổ FT-IR Hình 2.9: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c): 0.15 M. Thời gian tổng hợp PPy là 300 s. Hình 2.10: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M: (a): 150 s; (b): 200 s; (c): 300 s; (d): 400 s 10 Hai pic tại 1378 cm-1 và 1561 cm-1 lần lượt đặc trưng cho liên kết C-H trong cấu trúc quinoid [79] và liên kết C=C trong cấu trúc aromatic [34] của PPy. Pic tại 1464 cm-1 đặc trưng cho dao động đối xứng của vòng PPy. Thêm vào đó, dao động của liên kết C-N và liên kết N-H trong cấu trúc PPy cũng được ghi nhận tại các pic 791 cm-1 [131] và 3375 cm-1. Sự có mặt của gốc 3 4PO được xác định bởi các pic 1045 cm-1 và 2375 cm-1. Các pic tại 1682 cm-1 và 2923 cm-1 đặc trưng cho gelatin và pic tại 963 cm-1 đặc trưng cho nhóm  4ClO . Kết quả phân tích phổ FT-IR cho thấy, dây nano PPy đã được hình thành trên điện cực Pt (WE). Bên cạnh dây nano PPy, xuất hiện thêm các sản phẩm phụ như gelatin, photphat và peclorat. Các hợp chất này được cho là các chất pha tạp, dùng để biến tính dây nano PPy thu được. Polime dẫn biến tính được nhận định là có độ dẫn điện cao hơn so với polime dẫn thuần [53,118] và đặc tính này phù hợp với định hướng ứng dụng dây nano PPy trong cảm biến sinh học với vai trò làm lớp vật liệu trung gian tăng cường hiệu quả truyền tải tín hiệu từ tương tác sinh học đến bộ chuyển đổi. Tóm lại, dây nano PPy đã được tổng hợp trực tiếp trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực thế tĩnh, giá trị điện thế 0,75V được giữ không đổi và gelatin được sử dụng với vai trò làm khuôn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano PPy. Khi nồng độ ban đầu của monome Py là 0,1 M và thời gian thực hiện phản ứng polime hóa là 300 giây, dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt với kích thước đồng đều và sự phân bố đồng đều. So sánh với vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu PPy cấu trúc dây nano với diện tích bề mặt riêng lớn hơn được cho là sẽ giúp nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến DNA. 2.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định DNA dò Tổng trở của cảm biến sau khi cố định DNA dò, tăng lên đáng kể so với tổng trở của cảm biến khi chỉ có dây nano PPy. Điều này được giải thích là do các sợi đơn DNA dò gắn kết trực tiếp lên dây nano PPy thông qua sự tạo thành liên kết giữa gốc phốt phát của DNA và gốc amin trên dây nano PPy, dẫn đến làm tăng giá trị điện trở chuyển điện tích vào điện cực Pt từ 23.63 KΩ đến Hình 2.11: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M Hình 2.13: Phổ tổng trở của điện cực: (a) Pt- PPy NWs; (b): Pt-PPy NWs-DNA dò 11 32.01 KΩ, bảng 2.2. Kết quả là tổng trở của cảm biến DNA tăng lên. So sánh với các phương pháp cố định DNA sử dụng màng PPy [64,80], nhận thấy, trong luận án này, kỹ thuật cố định trực tiếp DNA lên cảm biến sinh học với bề mặt được chức năng hóa bằng dây nano polypyrrole là đơn giản, thuận tiện và cho hiệu quả tốt. Màng cấu trúc bởi các dây nano polypyrrole đóng vai trò điện cực được cố định DNA dò lên bề mặt của nó thông qua mối liên kết trực tiếp giữa nhóm phốt phát của DNA và nhóm amino của polypyrrole. Đồng thời, dây nano polypyrrole đóng vai trò tăng cường khả năng truyền tải tín hiệu từ sự lai hóa DNA dò - DNA đích đến bộ chuyển đổi sinh học, nhờ đó, độ nhạy của cảm biến sinh học có triển vọng được cải thiện. 2.3.3. Đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dò- DNA đích Nhận thấy, phổ tổng trở trong mặt phẳng phức bao gồm một bán cung ở vùng tần số cao đặc trưng cho quá trình chuyển điện tích và một phần tuyến tính ở vùng tần số thấp đặc trưng cho sự chuyển khối. Tổng trở của cảm biến khi có DNA đích trong dung dịch điện li, hình 2.14b-h, tăng lên đáng kể so với tổng trở của cảm biến khi không có DNA đích, hình 2.14a. Các chuỗi DNA chứa các nhóm photphat tích điện âm, trong khi đó, PPy là chất bán dẫn loại p với hạt tải là các lỗ trống. Khi có DNA đích trong dung dịch điện li, hiện tượng lai hóa DNA diễn ra trên bề mặt dây nano PPy dẫn đến làm giảm mật độ hạt tải của PPy, do đó làm giảm độ dẫn và làm tăng tổng trở của cảm biến. Từ sự thay đổi phổ tổng trở, có thể nhận thấy, tại nồng độ DNA đích là 10 pM tín hiệu điện hóa được tạo ra bởi sự lai hóa DNA đã được thiết bị đo thu nhận và hiển thị. Tín hiệu này càng thể hiện rõ (có giá trị lớn hơn) khi tiếp tục tăng nồng độ DNA đích. Đường phổ tổng trở Zim vs. Zre thực nghiệm có thể được mô phỏng bằng một mạch điện tương đương trong đó mỗi phần tử của mạch đại diện cho một tính chất điện của hệ điện hóa. Mạch tương đương Randles, thường được sử dụng để mô phỏng hệ điện hóa trong dung dịch điện li, gồm các thành phần sau: (1) điện trở dung dịch Rdd; (2) trở kháng Warburg ZW; (3) điện dung lớp kép Clk ; và (4) điện trở chuyển điện tích Rct. Trong mô hình mạch tương đương Randles, phần tử pha QCPE có thể được sử dụng để hiệu chỉnh và thay thế cho phần tử điện dung lớp kép Clk, hình 2.15. Điều này được giải thích là do trên thực tế, trong một hệ điện hóa khó có thể tồn tại Hình 2.15: Mô hình mạch tương đương Randles được sử dụng trong luận án Hình 2.14: Phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs- DNA dò tại các nồng độ DNA đích khác nhau 12 một tụ điện lý tưởng vì đặc tính không đồng nhất và độ gồ ghề của vật liệu trên bề mặt điện cực. Mối quan hệ giữa trở kháng Z(ω) và QCPE được biểu diễn theo phương trình [15]:   n CPE jQ Z )( 1    (2.1) trong đó, ω = 2πf là tần số góc, f là tần số, n là hệ số CPE, n có giá trị trong khoảng từ 0 đến 1 và giá trị của n đặc trưng cho tính không đồng nhất và độ gồ ghề của bề mặt điện cực [64]. Tương ứng với các giá trị n = 1, 0 và 0,5, QCPE lần lượt đại diện cho một tụ điện lý tưởng, một điện trở thuần hay một thành phần Warburg [123]. Bảng 2.2 Các thông số trở kháng mô phỏng theo mạch tương đương Randles Bề mặt điện cực Rs (Ω) Rct (KΩ) QCPE (μF) n χ2 (x 10-3) PPy NWs 317 23.63 1.19 0.82 2.84 PPy NWs/DNA dò/DNA đích 0 pM 295.3 32.01 0.74 0.90 2.43 10 pM 282.1 32.25 0.78 0.90 1.75 100 pM 269.6 32.33 0.76 0.90 2.23 1 nM 256.4 32.40 0.85 0.89 1.71 10 nM 219.3 32.57 0.92 0.89 1.71 100 nM 214.4 34.66 0.92 0.89 1.63 300 nM 207.6 36.24 0.92 0.89 1.62 500 nM 202.6 36.39 0.93 0.89 2.13 Trong luận án này, n nhận giá trị từ 0,82 đến 0,90, chứng tỏ sự hiện diện của QCPE trong mô hình mạch tương đương Randles là cần thiết. Kết quả này cũng phù hợp với những kết quả có được khi phân tích hình thái bề mặt của cảm biến được chức năng hóa bởi dây nano PPy. Giá trị nhỏ của χ2 (chuẩn χ bình phương) cho thấy trong khoảng nồng độ DNA đích từ 10 pM đến 500 nM, việc sử dụng mô hình Randles trên để mô phỏng tổng trở của hệ là hợp lý và kết quả thu được sau mô phỏng là đáng tin cậy. 2.4. Kết luận Một trong những đóng góp mới của luận án là việc tổng hợp được vật liệu polime dẫn PPy cấu trúc dây nano tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) sử dụng kỹ thuật điện hóa, khắc phục được tình trạng tạo thành PPy cấu trúc hoa súp lơ. Dây nano PPy được tổng hợp trực tiếp trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực thế tĩnh, điện thế 0,75V được giữ không đổi và gelatin được sử dụng với vai trò làm khuôn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano PPy. Khi nồng độ ban đầu của monome Py là 0,1 M và thời gian thực hiện phản ứng polime hóa là 300 giây, dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt với kích thước đồng đều và sự phân bố đồng đều. Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp trên bề mặt cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano PPy. Hiện tượng lai hóa DNA được khảo sát sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa. Cảm biến DNA có giới hạn phát hiện 10 pM tại 25 oC. 13 3. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TÍCH HỢP HỆ VI LƯU 3.1. Mở đầu Phát triển từ các kết quả đã đạt được trong nội dung nghiên cứu 1 với các phép đo điện hóa được thực hiện trong hệ đo mở, trong nội dung nghiên cứu 2, mục đích tích hợp cảm biến DNA điện hóa với một bình phản ứng kích thước nhỏ có khả năng ghép nối với mạch đo nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, đồng thời nâng cao tỷ lệ tín hiệu/nhiễu sẽ được tập trung hướng đến. Việc thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng mẫu tiêu thụ có ý nghĩa rất quan trọng trong phân tích y sinh vì các mẫu phân tích có thể là mẫu máu, vi khuẩn, virus Cũng trong nội dung nghiên cứu 2, dây nano PPy sẽ được tổng hợp bên trong vi bình phản ứng nhằm biến tính bề mặt cảm biến (đã tích hợp với hệ vi lưu) thay vì tổng hợp trong hệ mở như nội dung nghiên cứu 1. Cấu trúc dây nano của PPy và hệ ba điện cực tích hợp với vi bình phản ứng được hi vọng sẽ cải thiện các đặc tính của cảm biến sinh học điện hóa, đồng thời giúp thu nhỏ hê ̣ thống phân tích. 3.2. Thực nghiệm 3.2.2. Hệ ba điện cực tích hợp kết nối với bình phản ứng mini Chế tạo hệ ba điện cực tích hợp: Hệ ba điện cực Pt tích hợp bao gồm WE với diện tích 0,8 mm2, CE với diện tích 5 mm2 và điện cực so sánh thay thế. Chế tạo hệ vi lưu trên cơ sở vật liệu PDMS: Khuôn SU-8 được chế tạo sử dụng kỹ thuật quang khắc, hình 3.3. Phiến SU-8 được dùng làm khuôn để chế taọ các vi kênh PDMS (polydimethylsiloxane). Khuôn SU-8 đươc̣ cố điṇh vào môṭ điã nhưạ petri. Tiền chất polime PDMS và chất đóng rắn (curing agent) (theo tỷ lê ̣10 : 1 về thể tích) đươc̣ trôṇ đều và rót vào điã. Sau đó, hỗn hợp trên đươc̣ xử lý trong bình hút chân không để loaị bỏ hoàn toàn các boṭ khí và se ̃đóng rắn sau 2 giờ gia nhiêṭ taị 70 oC. Cuối cùng, phiến PDMS đươc̣ lôṭ ra khỏi khuôn, cắt thành từng vi kênh riêng biêṭ, khoan lỗ và luồn dây để taọ đầu vào và đầu ra cho mỗi vi kênh. Gắn kết vi kênh và điện cực: Phương pháp gắn kết plasma oxy: Điện cực sau khi đươc̣ xử lý bề măṭ bằng phương pháp hoá se ̃được gắn kết với vi kênh PDMS trong buồng plasma oxi (10 Pa, 20 W, 20 s). Sư ̣gắn kết giữa vi kênh PDMS và điêṇ cưc̣ được củng cố bằng cách gia Hình 3.3: Quy trình chế taọ khuôn SU-8 Hình 3.1: (a): mặt nạ cho chế tạo hệ ba điện cực tích hợp; (b): mặt nạ cho chế tạo khuôn SU-8 14 nhiêṭ trong 15 phút ở 70 oC, sau đó giảm nhiêṭ đô ̣về nhiệt độ phòng. 3.2.3. Tổng hợp dây nano PPy trong biǹh vi phản ứng Dây nano PPy được tổng hợp trong vi bình phản ứng sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực thế tĩnh (PS-Potentiostatic): điện thế phân cực không đổi là 0,5 V trong thời gian phản ứng là 1200 giây và quét thế vòng tuần hoàn: điêṇ áp từ 0 đến 0,6 V, 6 vòng, tốc đô ̣quét 25 mV/s. Các bước xử lý bề mặt điện cực và pha chế dung dịch điện li được thực hiện tương tự như đã trình bày trong phần 2.2.3. 3.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs Quy trình cố định DNA dò lên điện cực Pt-PPy NWs được thực hiện tương tự như đã trình bày trong phần 2.2.4. Tuy nhiên, vì hệ điện cực Pt tích hợp đã được gắn kết với vi kênh PDMS nên dung dịch DNA dò cần được bơm vào vi bình phản ứng thay vì thực hiện việc nhỏ phủ trực tiếp lên bề mặt điện cực làm việc (WE). 3.2.5. Phát hiêṇ tín hiêụ lai hoá DNA sử duṇg Lock-in Amplifier Tín hiệu dòng xoay chiều với tần số 10 kHz và biên độ 100 mV từ nguồn phát điện của thiết bi ̣Lock-in Amplifier SR830 được đặt vào hai điện cực giống nhau tích hợp trong các bình vi phản ứng. Trong đó, bề mặt của một điện cực được cố định DNA dò/PPy NWs (đóng vai trò điện cực làm việc) và bề mặt của điện cực còn lại được biến tính chỉ với PPy NWs (đóng vai trò điêṇ cưc̣ so sánh). Hình 3.6: Hê ̣đo vi sai sử duṇg Lock-in Amplifier SR830 DSP Khi 4 µl dung dic̣h DNA đích (chuỗi bổ sung) được bơm vào bình vi phản ứng, hiêṇ tươṇg lai hoá DNA se ̃diêñ ra trên bề măṭ điện cực làm việc (đa ̃đươc̣ cố định DNA dò), dẫn đến sự thay đổi điêṇ tích của màng dâñ, do đó làm chuyển dic̣h tín hiệu đầu ra. Tín hiệu đầu ra từ điện cực làm việc và điện cực so sánh của cảm biến đi qua hai điện trở 1 k, được thu thập trên kênh A và kênh B của Lock-in, sau đó sẽ được xử lý và hiển thị kết quả trên máy tính. 3.3. Kết quả và thảo luâṇ 3.3.1. Kết quả chế taọ hê ̣vi kênh tích hơp̣ với điêṇ cưc̣ Hình 3.7 mô tả hệ vi kênh PDMS tích hợp với điện cực. Kích thước của chip là 12 x 15 mm. Thể tích của vi bình phản ứng được tính theo công thức: V = a. b. h Trong đó: a là chiều rộng của kênh, a = 3,5 mm = 3500 µm b là chiều dài của kênh, b = 5 mm = 5000 µm h là chiều cao của kênh, h = 260 µm Hình 3.7: Cảm biến ba điện cực tích hợp sử dụng PRE Pt trong bình phản ứng mini. 15 Như vậy, hệ ba điện cực tích hợp với vi kênh PDMS có thể tích rất nhỏ: V = 3,5 . 5. 0,26 = 4,55 mm3 = 4,55 µl 3.3.1.1. Kết quả đo bề dày vi kênh PDMS Với tốc đô ̣quay phủ SU-8 3050 thấp nhất, 500 rpm, kết quả đo bề dầy của vi kênh PDMS là cao nhất, 260 µm. Khi tăng tốc đô ̣quay phủ SU-8 3050, bề dày của vi kênh PDMS đo đươc̣ se ̃giảm. Trong nghiên cứu này, viêc̣ chế taọ vi kênh PDMS là nhằm muc̣ đích tích hơp̣ với cảm biến sinh hoc̣ điêṇ hoá, sau đó se ̃ thưc̣ hiêṇ quá trình polime hoá điêṇ hóa trong bình vi phản ứng nhằm biến tính bề măṭ cảm biến trên cơ sở dây nano PPy, do đó, bề dày vi kênh PDMS khoảng 260 µm là phù hơp̣ với muc̣ đích nghiên cứu và tốc đô ̣quay phủ SU-8 đươc̣ lưạ choṇ cho các thí nghiêṃ tiếp sau là 500 rpm. 3.3.1.2. Kết quả gắn kết vi kênh PDMS và điêṇ cưc̣ Quy trình gắn kết vi kênh PDMS với điêṇ cưc̣ bằng phương pháp plasma oxi và phương pháp sử duṇg chất đóng rắn đều cho kết quả tốt, tuy nhiên, phương pháp gắn kết plasma oxi được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp sau vì những ưu điểm nổi bật như thời gian gắn kết nhanh và chất lượng gắn kết tốt, ổn định qua nhiều thí nghiệm. PDMS là hợp chất polime với các mắt xích cơ bản -O-Si(CH3)2-. Khi vi kênh PDMS được xử lý trong buồng plasma oxy, các nhóm -CH3 có thể được thay thế bởi các nhóm -OH [107]. Sau đó, vi kênh PDMS được ốp lên điện cực và các liên kết cộng hóa trị bền vững được hình thành giữa nhóm >Si(CH3)-OH và nhóm ≡ Si-OH (đồng thời giải phóng phân tử H2O) chính là nguyên nhân dẫn đến sự gắn kết bền chặt và ổn định giữa vi kênh PDMS và điện cực. 3.3.3. Tổng hơp̣ PPy NWs trong biǹh vi phản ứng Ảnh FE-SEM của PPy NWs Hình 3.13 là ảnh FE-SEM của dây nano PPy đươc̣ tổng hợp sử dụng ky ̃thuâṭ điêṇ hoá phân cưc̣ thế tiñh, hình 3.13a, và quét thế vòng tuần hoàn, hình 3.13b. Đối với cả hai trường hơp̣, sản phẩm polime dâñ PPy đều được hình thành trên bề mặt điện cực làm việc với cấu trúc dây nano, đường kính dây khoảng 80 nm đến 110 nm và chiều dài dây cỡ vài micromet. Kích thước dây nano PPy tổng hợp được là đồng đều và dây nano phân bố tương đối đều trên bề mặt điện cực. Việc tổng hợp vật liệu polime PPy cấu trúc dây nano tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) trong vi kênh có thể tích rất nhỏ (4 µl) là thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm được. Kết quả nghiên cứu này là một trong những đóng góp mới của luận án. Thông thường, phản ứng tổng hợp điện hóa vật liệu cấu trúc nano được thực hiện ở ngoài vi kênh (hệ đo mở), sau đó, tiến hành các bước gắn kết vi kênh và hệ điện cực. Tuy nhiên, khi lựa chọn sử dụng phương pháp gắn kết plasma oxi (với những ưu điểm nổi bật như thời gian gắn kết nhanh, chất lượng gắn kết tốt, phù hợp với mục Hình 3.13: Ảnh FE-SEM của dây nano PPy đươc̣ tổng hợp trong vi bình phản ứng sử dụng kỹ thuâṭ điêṇ hoá: (a) phân cưc̣ thế tiñh (0,5 V, 1200 s);(b) quét thế vòng tuần hoàn (0-0,6V, 6 vòng, tốc đô ̣quét 25 mV/s) 16 đích chế tạo hệ thống phân tích thu nhỏ), sản phẩm PPy NWs trên điện cực làm việc sẽ bị phá hủy trong môi trường plasma oxi, do đó, cần thực hiện qui trình gắn kết vi kênh và hệ điện cực trước, sau đó thực hiện phản ứng trùng hợp điện hóa nhằm tổng hợp PPy cấu trúc dây nano trong vi kênh. Vai trò của gelatin đối với sự phát triển dây nano PPy trong bình vi phản ứng Để hiểu rõ hơn về vai trò của gelatin đối với sự phát triển dây nano PPy trong bình vi phản ứng, quá trình tổng hợp điện hóa đã được thực hiện sử dụng kỹ thuật phân cực thế tĩnh (0,5 V, 150 s) với 0,08 %wt gelatin mà không có monome Py, hình 3.15a và có 0,1 M monome Py, hình 3.15b. Trên hình 3.15a, có thể quan sát thấy các khối gelatin hình viên nang đã được hình thành với đường kính khoảng 1 µm. Trong khi đó, trên hình 3.15b, các dây nano PPy với đường kính khoảng 100 nm bắt đầu phát triển xung quanh các khối gelatin. Hình 3.14: Ảnh FE-SEM của các sản phẩm được tổng hợp điện hóa sử dụng kỹ thuật phân cực thế tĩnh (0,5 V, 150 s), dung dịch điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, gelatin 0,08 % wt và: (a) không có Py; (b) Py 0.1 M trong vi bình phản ứng Gelatin có cấu trúc chuỗi dài gồm nhiều axit amin khác nhau với các nhóm chức -NH2 và -COOH. Các nhóm -NH của monome Py có thể tạo thành liên kết hidro với các nhóm -COOH của gelatin, hình 3.16. Kết quả là, monome Py được hấp phụ trên bề mặt của chuỗi gelatin và tiếp tục được polime hóa để phát triển thành các dây nano PPy. Như vậy, gelatin đóng vai trò như khuôn mềm định hướng cho sự hình thành vật liệu PPy cấu trúc dây nano [38]. 3.3.4. Phát hiện hiện tượng lai hóa DNA Khi 4 µl DNA đích 2 nM được bơm vào vi bình phản ứng, hiện tượng lai hóa DNA diễn ra nhanh, được đặc trưng bởi sự thay đổi trong tín hiệu đầu ra (sự chênh lệch thế, ΔE = 33 mV) và thời gian đáp ứng chỉ là một vài giây, hình 3.18a. Điều này được giải thích là do hiện tượng lai hóa DNA diễn ra trên bề mặt điện cực làm Hình 3.15: Liên kết hidro giữa monome Py và gelatin Hình 3.18: Tín hiệu lai hóa DNA, CDNA dò = 10 μM, T = 298K: (a) Chuỗi DNA đích 2 nM; (b) Chuỗi DNA đích không kết cặp 2 nM 17 việc (đa ̃đươc̣ cố định DNA dò), dẫn đến sự thay đổi điêṇ tích của màng dâñ, do đó làm chuyển dic̣h tín hiệu đầu ra. Thí nghiệm trên được lặp lại tương tự nhưng với chuỗi DNA đích không kết cặp, tín hiệu đầu ra gần như không thay đổi (sự chênh lệch thế, ΔE = 1 mV) và đã ổn định ngay sau một phút, hình 3.18b. Các mẫu DNA đích với nồng độ khác nhau được bơm vào vi bình phản ứng tích hợp với cảm biến DNA điện hóa. Từ các kết quả đo vi sai, có thể tính được các giá trị chênh lệch thế, ΔE (mV), tương ứng với các nồng độ DNA đích khác nhau. Trên cơ sở đó, xây dựng được đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đáp ứng, ΔE, và nồng độ DNA đích đã được thêm vào vi bình phản ứng, hình 3.19. Kết quả thực nghiệm cho thấy giới hạn mà cảm biến có thể phát hiện là 20 pM DNA đích. Khi tăng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 2 µM, kết quả đo vi sai, ∆E, tăng lên và đạt bão hòa tại nồng độ 200 nM DNA đích chứng tỏ có sự tăng lên về số lượng bắt cặp DNA đích - DNA dò trên bề mặt dây nano PPy. Hình 3.19 cho thấy, cảm biến DNA điện hóa đạt tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 và bình phương hệ số tương quan đạt 0,9932. 3.4. Kết luận Vi kênh PDMS và hệ ba điện cực tích hợp sử dụng PRE Pt đã được thiết kế, chế tạo và gắn kết. Dây nano PPy được tổng hợp trong vi bình phản ứng thay vì trong hệ mở. Việc tổng hợp vật liệu PPy cấu trúc dây nano tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) trong vi kênh có thể tích rất nhỏ (4 µl) là thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm được. Kết quả này là một trong những đóng góp mới của luận án. Trong quá trình polime hóa điện hóa, do sử dụng PRE Pt, điện thế 0,5 V được giữ không đổi thay vì giá tri ̣ 0,75 V áp duṇg cho hê ̣ mở sử duṇg điêṇ cưc̣ so sánh Ag/AgCl (KCl baõ hòa). Vai trò của gelatin đối với sự phát triển dây nano PPy cũng được giải thích. Dây nano PPy được hình thành trong vi bình phản ứng có tính đồng nhất cao và sư ̣phân bố đồng đều trên khắp bề măṭ điêṇ cưc̣, thuận lợi cho quá trình cố định DNA dò lên cảm biến DNA. Hình 3.19: Tín hiệu lai hóa DNA tương ứng với các giá trị nồng độ DNA đích khác nhau 18 Sợi đơn DNA dò được cố định trực tiếp lên cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano PPy. Hiện tượng lai hóa DNA diễn ra trong vi bình phản ứng được khảo sát sử dụng phương pháp đo vi sai. Giới hạn phát hiện của cảm biến là 20 pM tại nhiệt độ 25 oC. Cảm biến đạt tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 và bình phương hệ số tương quan đạt 0,9932. Bên cạnh đó, việc tích hợp cảm biến DNA điện hóa và vi bình phản ứng đã giúp thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm đáng kể lượng mẫu tiêu thụ so với khi thực hiện các phép đo trong hệ mở. Kết quả này cũng là một trong những đóng góp mới của luận án. 4. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA TÍCH HỢP BÌNH PHẢN ỨNG MINI ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN VIRUS NEWCASTLE 4.1. Mở đầu Sau khi hoàn thành nội dung nghiên cứu 2 với các qui trình đo lường điện hóa được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ, trong nội dung nghiên cứu 3, luận án sẽ tiến gần thêm một bước đến ứng dụng thực tiễn. Các kết quả đạt được của luận án sẽ không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học mà còn có khả năng hướng đến sự hợp tác với các công ty, các nhà sản xuất. Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử dụng DNA làm phần tử dò cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, đòi hỏi chi phí cao và thời gian dài, luận án sẽ sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà – một sản phẩm đã được bán trên thị trường do công ty cổ phần công nghệ sinh học thú y BTV (Biotech- Vet) cung cấp, tương lai hướng đến việc đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt hàng từ phía công ty. Cũng trong nội dung nghiên cứu 3, cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini sẽ được phát triển phù hợp với định hướng ứng dụng trong phát triển một bộ vi phân tích điện hóa phát hiện virus gây bệnh. Bộ vi phân tích điện hóa, sẽ là một hệ thống hoàn chỉnh bao gồm: 01) đầu đo được cố định kháng nguyên/kháng thể; 02) bình phản ứng kích thước nhỏ đảm bảo nâng cao tỷ số tín hiệu/nhiễu, tăng độ chính xác và giảm thể tích mẫu phân tích; và 03) bộ thu thập và xử lý tín hiệu tích hợp trong hệ thống; có khả năng được mở rộng và phát triển như một nền tảng (platform) cho việc phân tích các đối tượng y sinh khác nhau, hình 4.1. Cảm biến sinh học điện hóa tích hợp bình phản ứng mini được phát triển theo định hướng ứng dụng trong chế tạo bộ vi phân tích điện hóa cho phép phát hiện nhanh các dấu hiệu về virus gây bệnh sẽ giải quyết được những nhược điểm của các phương pháp phân tích y sinh truyền thống và giữ vai trò quan trọng trong việc thực hiện các nhiệm vụ phân tích lưu động. Nội dung nghiên cứu 3 sẽ bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo và ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl và Hình 4.1: Mô phỏng sơ lược hệ điện hóa mini đi kèm bình phản ứng mini và đầu đo tích hợp 19 một bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến miễn dịch; nghiên cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã chế tạo trong phát hiện virus Newcastle. 4.2. Thực nghiệm 4.2.2. Thiết kế và chế tạo hệ điện cực tích hợp bình phản ứng mini Hệ cảm biến bao gồm ba điện cực: WE/cảm biến miễn dịch (cố định kháng thể), CE và RE. Hai điện cực vàng WE và CE được tích hợp lên trên cùng một chip. Kích thước của chíp là 12 x 3,6 mm, đường kính của WE là 1 mm, diện tích của WE là πR2 = π0,52 =0,785 mm2. Điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl được chế tạo với kích thước rất nhỏ gọn (đường kính 1 mm, chiều dài 10 mm). Thiết kế này cho phép ghép nối với một bình phản ứng mini có thể tích nhỏ dao động từ 100 µL tới 1 ml, cho phép thực hiện các phép đo với lượng mẫu rất nhỏ, đảm bảo độ chính xác cao, hình 4.3. Hình 4.3: Bình phản ứng mini kết nối với hệ điện cực Bình phản ứng mini được thiết kế và chế tạo trên cơ sở kỹ thuật vi cơ khí nhằm mục đích sử dụng lặp lại nhiều lần (chỉ cần thực hiện các thao tác đóng, mở và thay thế điện cực tương ứng với các phép đo khác nhau). 4.2.3. Cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến Điện cực vàng sau khi được làm sạch bề mặt, được ủ với 20 µl dung dịch PrA (1 mg/ml) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, sau đó tiếp tục được ủ với 20 µl dung dịch GA 5 % (30 phút, nhiệt độ phòng), cuối cùng, điện cực được ủ với 20 µl kháng thể (60 µg/ml) ở 4 ᵒC trong 3 giờ. Sau khi kháng thể được cố định lên bề mặt điện cực, 20 µl BSA 1% được sử dụng để khóa phủ các vị trí không đặc hiệu (30 phút, nhiệt độ phòng). Sau mỗi bước cố định, điện cực đều được rửa sạch bằng nước khử ion và được sấy khô bằng khí N2 nhằm loại bỏ những phần tử không tương tác hoặc tương tác yếu. 4.2.4. Phát hiện virus (bất hoạt) sử dụng cảm biến miễn dịch điện hóa 20 µl virus bất hoạt Newcastle được nhỏ lên trên điện cực ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó, điện cực được rửa với nước khử ion để loại bỏ những phần tử đích không tương tác hoặc tương tác yếu. Quá trình đo CV (Cyclic Voltammetry) được thực hiện trên hệ điện hóa EC301 từ Stanford Research Systems. Bình điện hóa sử dụng ba điện cực: điện cực làm việc (WE) là điện cực cảm biến miễn dịch/virus, điện cực đối (CE) là điện cực Au tích hợp và điện cực so sánh (RE) là điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl. Dung dịch điện li gồm Fe(CN)63-/4- 0,03 M, KCl 0,1 M, khoảng quét thế từ -0,2 đến 0,5 V và tốc độ quét 25 mV/s. 4.2.5. Thống kê và xử lý số liệu Để xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) và hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml), các mẫu virus 20 Newcastle (bất hoạt) có hàm lượng thay đổi từ 102 đến 106 EID50/ml (EID50: 50% Empryo Infective Dose – Liều nhiễm trùng trên phôi gà) đã được sử dụng. Từ các đường CV thực nghiệm có thể xác định được giá trị dòng cực đại Ipeak và ∆Ipeak theo các công thức sau [67]: 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 = 𝐼𝑝,𝑎 − 𝐼𝑝,𝑐 (4.1) ∆𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 = 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘(0)− 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘(𝑖) 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘(0) (4.2) Trong đó: Ipeak(0) là dòng cực đại của điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch); Ipeak(i) là dòng cực đại của điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA/Ag (cảm biến miễn dịch/virus Newcastle). 4.3. Kết quả và thảo luâṇ 4.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể Dòng cực đại Ipeak của điện cực Au/PrA (Ipeak, Au/PrA = 118,43 µA) giảm so với điện cực Au (Ipeak, Au = 123,25 µA). Giá trị Ipeak của điện cực Au/PrA/GA/Ab (Ipeak, Au/PrA/GA/Ab = 114,51 µA) giảm so với điện cực Au/PrA (Ipeak, Au/PrA = 118,43 µA). Cuối cùng, sau khi khóa phủ các vị trị tương tác không đặc hiệu sử dụng BSA, giá trị Ipeak của điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (Ipeak, cảm biến miễn dịch = 112,01 µA) giảm so với điện cực Au (Ipeak, Au = 123,25 µA). Kết quả trên được giải thích là do việc hấp phụ các lớp PrA, PrA/GA/Ab và cuối cùng là PrA/GA/Ab/BSA đã dẫn đến sự sụt giảm điện thế tại bề mặt các lớp này, do đó làm tăng giá trị điện trở chuyển điện tích của cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào điện cực Au và làm giảm cường độ dòng của cảm biến. Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử kháng thể IgG đã được tinh chế làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch như trong phần lớn những công bố khác [21,30,106], luận án đã tập trung nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà lên bề mặt cảm biến. Kháng thể IgG (đơn dòng và đa dòng) đều phải được sản xuất và tinh chế tại các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn, sử dụng các bộ sinh phẩm thương mại và kỹ thuật hiện đại, vì vậy, đòi hỏi chi phí cao và thời gian dài [84,97]. Tuy nhiên, theo Jones và cộng sự [71], dịch bệnh truyền nhiễm thường diễn ra bất ngờ, khó có thể dự đoán khi nào sẽ diễn ra dịch bệnh, dẫn đến khó khăn trong việc chủ động nguồn kháng thể IgG tinh chế cần thiết cho các xét nghiệm trong thời gian ngắn. Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng kháng thể IgY thu thập từ trứng gà, không cần phải qua các qui trình tinh chế phức tạp, yêu cầu kỹ thuật hiện đại, chi phí cao và thời gian dài làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch sẽ không những giúp giảm chi phí mà còn là giải pháp hiệu quả nhằm phát hiện kịp Hình 4.10: Đường CV của điện cực: (a): Au; (b): Au/PrA; (c): Au/PrA/GA/Ab và (d): Au/PrA/GA/Ab/BSA trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M 21 thời virus gây bệnh trong các vụ dịch bệnh truyền nhiễm do không còn phụ thuộc nhiều vào nguồn kháng thể IgG tinh chế. 4.3.3. Đặc trưng tín hiệu tương tác virus – kháng thể Giá trị Ipeak của điện cực cảm biến miễn dịch/virus Newcastle (Ipeak, cảm biến miễn dịch/virus Newcastle = 97,90 µA) giảm so với Ipeak của cảm biến đo được khi chưa có tương tác sinh học với virus Newcastle (Ipeak, cảm biến miễn dịch = 112,57 µA). Kết quả trên được giải thích là do virus Newcastle đã được gắn kết trên bề mặt cảm biến miễn dịch trên cơ sở tương tác đặc hiệu virus - kháng thể, dẫn đến cản trở quá trình chuyển điện tích của cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào điện cực Au, kết quả là mật độ dòng điện giảm. Khi tương tác không đặc hiệu kháng nguyên (virus viêm não Nhật Bản) - kháng thể (kháng virus Newcastle) diễn ra trên bề mặt cảm biến miễn dịch, giá trị Ipeak (Ipeak, cảm biến/virus VNNB = 113,10 µA) gần như không thay đổi so với Ipeak của cảm biến đo được khi chưa có tương tác sinh học với virus viêm não Nhật Bản (Ipeak, cảm biến = 112,57 µA). Kết quả trên cho thấy cảm biến miễn dịch điện hóa đã chế tạo có độ chọn lọc tốt 4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến miễn dịch 4.3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể Khi nồng độ kháng thể tăng từ 20 µg/ml đến 60 µg/ml, tín hiệu đầu ra của cảm biến (∆Ipeak) tăng lên. Kết quả này được giải thích là do khi nồng độ kháng thể tăng, số lượng kháng thể được cố định hiệu quả trên bề mặt cảm biến sẽ tăng lên, nhờ đó, làm tăng xác suất bắt cặp với kháng nguyên đặc hiệu. Trong nghiên cứu này, kháng thể được sử dụng làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch là kháng thể IgY kháng virus Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà và Hình 4.12: Đường CV của: (a): cảm biến miễn dịch và (b): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s Hình 4.13: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch; (b): cảm biến miễn dịch/virus VNNB trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s Hình 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể đến giá trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch 22 nồng độ 60 µg/ml là giá trị nồng độ kháng thể cao nhất (dung dịch kháng thể được cung cấp bởi nhà sản xuất). Do đó, giá trị nồng độ kháng thể 60 µg/ml sẽ được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp sau. 4.3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp kháng thể - virus Hình 4.16 biểu diễn các đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus: (b): 15 phút, (c): 30 phút, (d): 45 phút, (e): 90 phút và (f): 60 phút. Từ các đường CV thực nghiệm, có thể tính toán để thu được các giá trị Ipeak và ∆Ipeak theo các công thức (4.1) và (4.2). Hình 4.17 cho thấy khi thời gian bắt cặp kháng thể - virus là từ 5 đến 15 phút, tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) thấp và gần như hông thay đổi. Khi tăng thời gian bắt cặp kháng thể - virus từ 15 đến 60 phút, tín hiệu đầu ra của cảm biến tăng lên và đạt giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602) tương ứng với thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 60 phút. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian bắt cặp kháng thể - virus lên 90 phút thì tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch cũng không tăng lên nữa. Như vậy, khoảng thời gian 60 phút là đủ để các liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể được thiết lập. Do đó, thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 60 phút sẽ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp sau. 4.3.5. Độ nhạy của cảm biến miễn dịch Hình 4.18 biểu diễn các đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi hàm lượng virus Newcastle: (b):102 EID50/ml, (c): 103 EID50/ml, (d): 104 EID50/ml, (e): 105 EID50/ml và (f): 106 EID50/ml. Từ các đường CV thực nghiệm có thể tính được các giá trị Ipeak và ∆Ipeak theo các công thức (4.1) và (4.2) tương ứng với các hàm lượng virus Newcastle khác nhau. Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp kháng thể - virus đến giá trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch Hình 4.16: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus Hình 4.18: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi hàm lượng virus Newcastle 23 Hình 4.19 là đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) và hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml). Hình 4.19 cho thấy, giới hạn phát hiện của cảm biến miễn dịch là 102 EID50/ml virus Newcastle. Cảm biến miễn dịch điện hóa đạt tuyến tính tốt trong khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ là: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 và bình phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,9969. 4.4 Kết luận Hệ ba điện cực sử dụng PRE Ag/AgCl đã được thiết kế, chế tạo và ghép nối với một bình phản ứng mini. Việc sử dụng PRE Ag/AgCl thay thế RE thương mại, sau đó tích hợp hệ điện cực với một bình phản ứng mini (có khả năng sử dụng lặp lại nhiều lần, chỉ cần đóng, mở và thay thế điện cực tương ứng với mỗi phép đo), giúp thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm lượng mẫu tiêu thụ, là một trong những đóng góp mới của luận án. Kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà được cố định làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch thay vì sử dụng kháng thể IgG tinh chế với qui trình tách chiết phức tạp đòi hỏi chi phí cao và thời gian dài. Kết quả này cũng là một trong những đóng góp mới của luận án. Cảm biến miễn dịch tích hợp bình phản ứng mini được ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle sử dụng phương pháp CV. Khi nồng độ kháng thể được cố định là 60 µg/ml, thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 1 giờ, tín hiệu đầu ra của cảm biến đạt giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602). Giới hạn phát hiện của cảm biến là 102 EID50/ml tại 25 oC. Cảm biến đạt tuyến tính tốt trong khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 và bình phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,9969. Như vậy, cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã được phát triển phù hợp với định hướng ứng dụng trong phát triển một bộ vi phân tích điện hóa. Bộ vi phân tích điện hóa, sẽ là một hệ thống hoàn chỉnh bao gồm: 01) đầu đo được cố định kháng nguyên/kháng thể; 02) bình phản ứng kích thước nhỏ đảm bảo nâng cao tỷ số tín hiệu/nhiễu, tăng độ chính xác và giảm thể tích mẫu phân tích; và 03) bộ thu thập và xử lý tín hiệu tích hợp trong hệ thống; có khả năng được mở rộng và phát triển như một nền tảng (platform) cho việc phân tích các đối tượng y sinh khác nhau. Việc phát triển bộ vi phân tích điện hóa nói trên sẽ giúp khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp phân tích y sinh truyền thống và có ý nghĩa quan trọng trong việc thực hiện các nhiệm vụ phân tích lưu động. KẾT LUẬN CHUNG Các kết quả chính của luận án được tóm tắt như sau: 1. Đã phát triển bộ cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano PPy: Hình 4.19: Sự thay đổi tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) phụ thuộc vào hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml) 24 Dây nano PPy được tổng hợp trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực thế tĩnh, điện thế không đổi 0,75V và gelatin được sử dụng với vai trò khuôn mềm định hướng cho sự phát triển dây nano PPy. Việc tổng hợp được vật liệu polime dẫn PPy cấu trúc dây nano tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) sử dụng kỹ thuật điện hóa, khắc phục được tình trạng tạo thành PPy cấu trúc hoa súp lơ là một trong những đóng góp mới của luận án. Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp trên bề mặt cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano PPy. Hiện tượng lai hóa DNA được khảo sát sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa. Cảm biến DNA có giới hạn phát hiện 10 pM tại nhiệt độ 25 oC. 2. Đã phát triển bộ cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu: Vi kênh PDMS và hệ ba điện cực tích hợp sử dụng điện cực so sánh thay thế Pt được thiết kế, chế tạo và gắn kết. Dây nano PPy được tổng hợp tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) trong vi bình phản ứng có thể tích rất nhỏ (4 µl) thay vì trong hệ mở. Đây là thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm được. Kết quả này là một trong những đóng góp mới của luận án. Sợi đơn DNA dò được cố định trực tiếp lên cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano PPy. Hiện tượng lai hóa DNA diễn ra trong vi bình phản ứng được khảo sát sử dụng phương pháp đo vi sai. Giới hạn phát hiện của cảm biến là 20 pM tại nhiệt độ 25 oC. Cảm biến đạt tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 và R2 = 0,9932. Bên cạnh đó, việc tích hợp cảm biến DNA điện hóa và vi bình phản ứng đã giúp thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm đáng kể lượng mẫu tiêu thụ so với khi thực hiện các phép đo trong hệ mở. Kết quả này cũng là một trong những đóng góp mới của luận án. 3. Đã phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle: Hệ ba điện cực sử dụng PRE Ag/AgCl đã được thiết kế, chế tạo và ghép nối với một bình phản ứng mini. Việc tích hợp hệ điện cực và bình phản ứng mini, giúp thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm lượng mẫu tiêu thụ, là một trong những đóng góp mới của luận án. Kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà (do Biotech- Vet cung cấp) được cố định lên bề mặt cảm biến thay cho các loại kháng thể IgG tinh chế làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch. Đây cũng là một trong những đóng góp mới của luận án. Cảm biến miễn dịch tích hợp bình phản ứng mini được ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle sử dụng phương pháp CV. Khi nồng độ kháng thể được cố định là 60 µg/ml, thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 1 giờ, tín hiệu đầu ra của cảm biến đạt giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602). Giới hạn phát hiện của cảm biến là 102 EID50/ml tại 25 oC. Cảm biến đạt tuyến tính tốt trong khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 và R2 = 0,9969. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Thi Luyen Tran, Thi Xuan Chu, Dang Chinh Huynh, Duc Thanh Pham, Thi Hoai Thuong Luu, Anh Tuan Mai (2014), Effective immobilization of DNA for development of polypyrrole nanowires based biosensor, Applied Surface Science 314, p. 260-265 (*IF 2016: 3.15*). 2. Trần Thị Luyến, Huỳnh Đăng Chính, Phan Trung Nghĩa, Đỗ Phúc Quân, Chu Thị Xuân, Mai Anh Tuấn (2014), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện hóa trong tổng hợp dây nano polypyrrole định hướng ứng dụng trong cảm biến sinh học, Tạp chí Hóa học, 52(5A), p. 61-65. 3. Trần Thị Luyến, Chu Thị Xuân, Phạm Đức Thành, Huỳnh Đăng Chính, Mai Anh Tuấn (2014), Cố định trực tiếp DNA lên cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano polypyrrole, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52(3B), p. 166-173. 4. Tran Thi Luyen, Huynh Dang Chinh, Pham Duc Thanh, Chu Thi Xuan, Mai Anh Tuan (2014), Label-free electrochemical biosensor based on polypyrrole nanowires, The 7th International Workshop on Advanced Materials Science and Nanotechnology (IWAMSN), Ha Long 2-6/11/2014, Vietnam, p. 377. 5. Luu Thi Hoai Thuong, Tran Thi Luyen, Do Phuc Quan, Pham Duc Thanh, Pham Thi Kim Thanh, Chu Thi Xuan, Mai Anh Tuan (2014), Design and fabrication of microfluidic biosensor composed of a PDMS microchannel and three electrode platform for electrochemical measurement, The 2nd International Conference on Advanced Materials and Nanotechnology (ICAMN), Hanoi, Vietnam, p. 254-260. 6. Thi Luyen Tran, Thi Xuan Chu, Phuc Quan Do, Duc Thanh Pham, Van Vu Quan Trieu, Dang Chinh Huynh and Anh Tuan Mai (2015), In-Channel-Grown Polypyrrole Nanowire for the Detection of DNA Hybridization in an Electrochemical Microfluidic Biosensor, Journal of Nanomaterials, vol. 2015, Article ID 458629, 7 pages (*IF 2016: 1.758*). 7. Tran Thi Luyen, Chu Thi Xuan, Huynh Dang Chinh, Mai Anh Tuan (2015), Development of electrochemical biosensors integrated with microchambers for DNA detection, Tạp chí Hóa học, 53(6e4), p. 169-173. 8. Luu Thi Hoai Thuong, Tran Thi Luyen, Pham Duc Thanh, Trieu Van Vu Quan, Pham Van Tong, Ta Thi Nhat Anh, Chu Thi Xuan, Mai Anh Tuan (2015), Fabrication of PDMS-based Microfluidic Devices Toward Biomedical Applications, Tap̣ chí Khoa hoc̣ và Công nghê ̣ các Trường Đaị hoc̣ Ky ̃ thuâṭ, 105A, p. 38-42. 9. Trần Thị Luyến, Chu Thị Xuân, Đỗ Phúc Quân, Phạm Đức Thành, Nguyễn Hải Nam, Nguyễn Quang Long, Huỳnh Đăng Chính, Mai Anh Tuấn (2015), Thiết kế chế tạo cảm biến điện hóa vi dòng chảy tích hợp điện cực giả so sánh để chế tạo dây nano polypyrrole nhằm cố định DNA, Hội nghị Vật lý chất rắn và Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ 9 (SPMS2015), Hồ Chí Minh 8-10/11/2015, Viet Nam, p. 460-463.