Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sao biển culcita novaeguineae müller & troschel, 1842 và pentaceraster gracilis (lutken, 1871) ở Việt Nam

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Ngoan NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI SAO BIỂN CULCITA NOVAEGUINEAE MÜLLER & TROSCHEL, 1842 VÀ PENTACERASTER GRACILIS (LUTKEN, 1871) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018 2 Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS. VS. Châu Văn Minh Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Hoài Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2018. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Hà Nội 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Sao biển là loài động động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai (Echinodermata), lớp Asteroidea. Gọi tên sao biển là do cơ thể có 5 cánh xuất phát từ trung tâm của cơ thể sao biển, tương tự như hình ngôi sao. Theo phân loại của Blacke (1987), lớp Asteroidea được chia thành 7 bộ: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida. Theo thống kê của tác giả Guang Dong và cộng sự trong giai đoạn từ năm 1997- 2007 đã có khoảng 98 loài sao biển trên toàn thế giới được nghiên cứu về thành phần hóa học. Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất thứ cấp có mặt trong sao biển bao gồm: các steroid, steroid glycoside (glycoside của polyhydroxysteroid, asterosaponin và cyclic steroid glycoside), các hợp chất thuộc nhóm glycosphingolipid (cerebroside và ganglioside). Ngoài ra còn một số các hợp chất khác như: anthraquinon, alkaloid, phospholipid, peptid và acid béo. Các thành phần hóa học này thể hiện rất nhiều các hoạt tính quý báu như: hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính làm tan máu, chống virut, kháng nấm, kháng vi sinh vật, kháng viêm Theo đánh giá của các nhà khoa học trong nước, loài sao biển thuộc lớp động vật da gai (Echinodermata), lớp động vật da gai này có khoảng 350 loài thuộc 58 họ, 5 lớp (Huệ Biển, Hải Sâm, Sao Biển, Cầu Gai và Đuôi Rắn) sống ở biển Việt Nam. Cho đến thời điểm này, nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học trên đối tượng sao biển ở Việt Nam đã thực hiện trên 09 loài, bao gồm: Sao biển Archaster typicus, Asterina batheri, Asteropsis carinifera, Astropecten polyacanthus, Astropecten monacanthus, Protoreaster nodosus, Acanthaster planci, Linckia laevigata và Anthenea aspera. Các hợp chất phân lập được từ sao biển ở Việt nam cũng thuộc các lớp chất steroid, steroid glycoside có hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm. 2 Chính vì vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc C. novaeguineae và loài sao biển P. gracilis ở Việt Nam tạo cơ sở khoa học trong việc nghiên cứu ứng dụng các loài sao biển này trong lĩnh vực y-dược học, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sao biển Culcita novaeguineae Müller & Troschel, 1842 và Pentaceraster gracilis (Lutken, 1871) ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án  Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của hai loài C.novaeguinea và P. gracilis ở vùng biển Đông bắc của Việt nam;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:  Phân lập các hợp chất từ loài C. novaeguineae và P. gracilis ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký;  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan trình bày các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học trên đối tƣợng sao biển trên thế giới. Các lớp chất có được trong thành phần hóa học của các loài sao biển trên thế giới tập trung chủ yếu ở lớp steroid, glycoside (glycoside của polyhydroxysteroid, asterosaponin và cyclic steroid 3 glycoside...) với hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật kiểm định và kháng viêm. 1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của số loài sao biển ở Việt Nam. Cho đến nay, ở Việt nam đã nghiên cứu thành phần hóa học các loài Sao biển Archaster typicus, Asterina batheri, Asteropsis carinifera, Astropecten polyacanthus, Astropecten monacanthus, Protoreaster nodosus, Acanthaster planci, Linckia laevigata và Anthenea aspera. Các hợp chất thu được là các steroid, glycoside bao gồm cả glycoside của polyhydroxysteroid, asterosaponin... với hoạt tính gây độc tế bào, kháng viêm rất tốt. CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Loài sao biển Culcita novaeguineae Mẫu sao biển C. novaeguineae được thu vào tháng 10 năm 2013 tại Quảng Ninh. 2.1.2. Loài sao biển Pentaceraster gracilis. Mẫu sao biển P. gracilis được thu vào tháng 3 năm 2014 tại Cô Tô, Quảng Ninh. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký cột (CC). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR- ESI-MS), độ quay cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào của các hoạt chất được xác định theo phương pháp SRB. 4 2.3. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Culcita novaeguineae Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ loài sao biển C. novaeguineae. C8.5 (560 mg) C8.5A,B C8.5C (46mg CC, Silicagel EMW 10/1/0,1 C8.5D (18mg) C8.5E (76mg) C8.5F (150mg) C8.5G (150mg) CN4 (7,5mg) CN3 (4,0mg) CN5 (9,5mg) Silica gel CC D/M/W 5/1/0,1 H8.5F1 H8.5F2 CN8 (3,5mg) Sephadex LH-20 M/W 2/1 CN7 (5,0mg) CN6 (2,5mg) YMC CC A/W 1/1 CH2CL2 (15,2 g) C1 C8 (2 g) C9 MPLC SNAP-Sil DM 100:1 – 1:1 C8.1 C8.2 (500 mg) C8.3 (387mg) C8.4 (172 mg) C8.6 (185 mg) CC, YMC RP-18 MW 1:1 – 5:1 C4 C7 CN9 (5,4 mg) Silica gel CC E/M/W 10/1/0,1 YMC CC M/W 1,5/1 Hình 2.4-6. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn nước sao biển C. novaeguineae 2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài Pentaceraster gracilis Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ loài P. gracilis W3 8.5 g W3E 900 mg DMW: 4/1/0.15 W3 A 2.7 g YMC CC, MW: 1/1 W3B 700 mg DMWa: 2.5/1/0.15/0.002 W3B2 80 mg W3B1 50 mg W3C 720 mg W3C1 220 mg DMWa: 2.7/1/0.15/0.002 PG2 12 mg Sephadex MW: 1/1 Sephadex MW: 1/1 PG1 9 mg W3D 1.3 g DMWa: 2.5/1/0.15/0.002 W3D2 700 mg W3D1 210 mg W3D2a 240 mg EMW: 1.8/1/0.2 EMW: 2.5/1/0.15 W3D2a2 40 mg W3D2a1 60 mg W3D2a2a 25 mg MW: 1.5/1 W3E4 100 mg Sephadex MW: 2/1 W3E3 60 mg EMW: 5/1/0.1 W3E3a 25 mg W3E3b 10 mg Sephadex MW: 1/1 PG4 10 mg PG6 8 mg Sephadex MW: 1/1 Sephadex MW: 1/1 W3E1 80 mg W3E1a 50 mg DAW: 1/2/0.1 PG7 18 mg W3E2 120 mg W3E2a 80 mg W3E5 65 mg PG5 25 mg PG3 10 mg DAW: 1/3/0.1 EMW: 3.5/1/0.1 W3E5a 23 mg MW: 2.5/1 Hình 2.7-9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Pentaceraster gracilis 2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất 2.4.1. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài sao biển C. novaeguineae và P. gracilis Hợp chất CN1: Novaeguinoside E (chất mới) 5 Chất bột màu trắng, HR-ESI-MS: m/z 1273,5257 [M + Na] + , CTPT: C56H91NaO27S. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13 C- NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.1.1). Hợp chất CN2: Natri 6α-[(O-β-D-fucopyranosyl-(l2)-O-β-D- galactopyranosyl-(l4)-O-[β-D-quinovopyranosyl-(l2)]-O-β-D- xylopyranosyl-(l3)-O-β-D-quinovopyranosyl)-oxy]-5α-pregn- 9(11)-ene-20-one-3β-yl-sulfate. Chất bột màu trắng. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.1.2). Hợp chất CN3: Linckoside B Chất bột màu trắng, CTPT: C40H68O14. 1 H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13 C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.3). Hợp chất CN4: Halityloside E Chất bột màu trắng, CTPT: C39H68O13. 1 H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13 C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.4). Hợp chất CN5: Halityloside D Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy: 243-248 0C, CTPT: C39H68O14. 1 H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13 C-NMR (pyridine- d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.5). Hợp chất CN6: Culcitoside C5 Chất dạng bột không màu, CTPT: C38H66O14. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.1.6). Hợp chất CN7:Halityloside B Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C40H70O14. 1 H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13 C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.7). Hợp chất CN8: Halityloside A. Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C40H70O15. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.1.8). Hợp chất CN9: 5α-cholestane-3β,6β,7α,8β,15α,16β,26-heptol Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C27H48O7. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.1.9). 6 III.3.10. Hợp chất PG2: Protoreasteroside Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C56H92O27S. 1 H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13 C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.2.1). Hợp chất PG1: Maculatoside Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C56H92O27S. 1 H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13 C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.2.2). Hợp chất PG3: Pentaceroside A (chất mới) Chất bột màu trắng, FT-ICR-MS: m/z 755,41935 [M + Na]+, CTPT: C37H64O14. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.3). Hợp chất PG4: Pentaceroside B (chất mới) Chất bột màu trắng, FT-ICR-MS: m/z 623,3771 [M + Na]+, CTPT: C32H56O10. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.4). Hợp chất PG5: Nodososide Chất dạng bột, CTPT: C38H66O14. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.5). Hợp chất PG6: (5α,25S)-Cholestane-3β,6α,8,15β,16β,26-hexol 3-O- [(2-O-methyl)-β-D-xylopyranoside] Chất dạng bột, CTPT: C33H58O10. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.6) Hợp chất PG7: 5α-cholestane-3β,6α,7α,8β,15α,16β,26-heptol Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C27H48O7. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.2.7). 2.5. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá trên 05 dòng tế bào ung thư người là: LNCaP (tuyến tiền liệt), MCF7 (vú), KB (ung thư biểu mô), HepG2 (gan) và SK-Mel-2 (sắc tố). Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học. 7 2.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài sao biển Culcita novaeguineae Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển C. novaeguineae cho thấy: Chỉ có các hợp chất CN5CN8 thể hiện hoạt tính, các hợp chất CN1CN4 và CN9 không có biểu hiện hoạt tính với giá trị IC50> 100 µM. Bảng 4.1. Giá trị IC50 của các chất từ sao biển C. novaeguineae trên 5 dòng tế bào ung thư Chất sạch IC50 trên dòng tế bào (µM) LNCaP MCF7 KB HepG2 SK-Mel2 CN1 >100 >100 >100 >100 >100 CN2 >100 >100 >100 >100 >100 CN3 >100 >100 >100 >100 >100 CN4 >100 >100 >100 >100 >100 CN5 31,801,59 33,961,57 32,661,47 75,014,11 32,993,05 CN6 57,081,81 62,952,96 92,042,84 >100 89,762,47 CN7 39,682,65 39,992,65 44,373,00 80,223,67 50,094,06 CN8 48,592,30 51,612,70 70,703,56 >100 73,993,10 CN9 >100 >100 >100 >100 >100 Elipticinea 1,990,16 1,950,12 2,070,12 1,710,16 2,150,24 achất chuẩn dương Trong đó, hợp chất halityloside D (CN5) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 31,80  1,59 µM), MCF7 (IC50 = 33,96  1,57 µM), KB (IC50 = 32,66  1,47 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 32,99  3,05 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 75,01  4,11 µM). Hợp chất halityloside B (CN7) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,68  2,65 µM), MCF7 (IC50 = 39,99  2,65 µM) và KB (IC50 = 44,37  3,00 µM); hoạt tính trung bình trên dòng tế bào SK-Mel2 (IC50 = 50,09  4,06 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 80,22  3,67 µM). Hai hợp 8 chất culcitoside C5 (CN6) và halityloside A (CN8) thể hiện hoạt tính trung bình hoặc yếu trên các dòng tế bào LNCaP, MCF7, KB, và SK- Mel2 với giá trị IC50 từ 48,59  2,30 đến 92,04  2,84µM, và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên dòng Hep-G2. 2.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài sao biển Pentaceraster gracilis Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển P. gracilis cho thấy: hợp chất maculatoside (PG1) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,75  3,34 µM), KB (IC50 = 36,53  0,78 µM), HepG2 (IC50 = 16,75  0,69 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 19,44  1,45 µM) và hoạt tính trung bình trên dòng MCF7 (IC50 = 47,34  7,01 µM). Hợp chất PG7 thể hiện hoạt tính yếu trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 86,57  2,19 µM), HepG2 (IC50 = 79,69  3,14 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 96,77  4,07 µM) và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên các dòng tế bào còn lại. Các hợp chất PG2PG6 không có biểu hiện hoạt tính trên tất cả năm dòng tế bào ung thư được thử nghiệm với giá trị IC50> 100 µM. Bảng 4.2. Giá trị IC50 của các chất từ sao biển Pentaceraster gracilis trên 5 dòng tế bào ung thư Chất sạch IC50 trên dòng tế bào (µM) LNCaP MCF7 KB Hep-G2 SK-Mel2 PG1 39,753,34 47,347,01 36,530,78 16,750,69 19,441,45 PG2 >100 >100 >100 >100 >100 PG3 >100 >100 >100 >100 >100 PG4 >100 >100 >100 >100 >100 PG5 >100 >100 >100 >100 >100 PG6 >100 >100 >100 >100 >100 PG7 86,572,19 >100 >100 79,693,14 96,774,07 Elipticinea 1,990,16 1,950,12 2,070,12 1,710,16 2,150,24 achất chuẩn dương 9 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài Culcita novaeguineae Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 09 hợp chất được phân lập từ loài C. novaeguineae. CN1: Novaeguinoside E CN3: Linckoside B CN2: natri 6α-[(O-β-D- fucopyranosyl-(l2)-O-β-D- galactopyranosyl-(l4)-O-[β-D- quinovopyranosyl-(l2)]-O-β-D- xylopyranosyl-(l3)-O-β-D- quinovopyranosyl)-oxy]-5α-pregn- 9(11)-ene-20-one-3β-yl-sulfate CN4: Halityloside E CN5: Halityloside D CN6: Culcitoside C5 CN7: Halityloside B CN8: Halityloside A CN9: 5α-cholestane- 3β, 6β,7α,8β,15α,16β,26-heptol 10 Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một hợp chất mới. 3.1.1. Hợp chất CN1: Novaeguinoside E (chất mới) Hợp chất CN1 được phân lập từ loài sao biển Culcita novaeguineae dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C56H91NaO27S bằng phổ HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion phân tử tại m/z1273,5257 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C56H91Na2O27S + , 1273,5258). Các phổ NMR của nó đặc trưng cho một hợp chất asterosaponin, một lớp chất chính của các loài sao biển. Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR (đo trong DMSO-d6) của CN1 tương tự như các số liệu của protoreasteroside, ngoại trừ có sự khác nhau ở các tín hiệu của chuỗi đường. 155.0736 274.2765 353.2659 413.2667 566.2132 648.2584 803.5400 1273.5257 +MS, 1.4min #83 0 2 4 6 8 4x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Hình 3.1. Phổ HR-ESI-MS của CN1 Hình 3.2a. Phổ 1H-NMR của CN1 trong DMSO-d6 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của CN1 trong pyridine-d5 11 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của CN1 Phân tích chi tiết các phổ 1D- và 2D-NMR của CN1 chứng minh sự có mặt của ba nhóm methyl [C 75,2 (C-3), 78,1 (C-6) và 76,2 (C-22)/H 3,83-3,87 (H-3), 3,45-3,47 (H-6) và 3,04-3,06 (H-22), mỗi tín hiệu 1H, m], một cacbon bậc bốn mang oxi [C 75,1 (C-20)], hai liên kết đôi bị thế ba vị trí [C 145,2 (s, C-9) vàC 115,7 (d, C- 11)/H 5,24 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-11); C 124,0 (d, C-24)/H 5,20 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24) và C 130,4 (s, C-25)] và năm nhóm tert- metyl [C 13,0 (C-18), 19,0 (C-19), 19,9 (C-21), 17,8 (C-26) và 25,6 (C-27)/H 0,72 (H-18), 0,88 (H-19), 1,06 (H-21), 1,55 (H-26) và 1,65 (H-27), mỗi tín hiệu 3H, s]. Vị trí của cacbon bậc bốn mang oxi tại C-20, một nhóm oxymethin tại C-22 và một liên kết đôi tại C-24/C- 25 được xác định bằng các tương tác COSYH-22/H-23/H-24 kết hợp với các tương tác xa HMBC của H-21 (H 1,06) với C-17 (C 53,8)/C-20 (C 75,1)/C-22 (C 76,2) và của H-26 (C 1,55)/H-27 (H 1,65) với C-24 (C 124,0)/C-25 (C 130,4). Phân tích chi tiết các tương tác HMBC và COSY khác cho phép xác định chính xác cấu trúc phẳng phần aglycon của CN1. Hình 3.4. Phổ HSQC của CN1 12 Hình 3.5. Phổ COSY của CN1 Hình 3.6. Phổ HMBC của CN1 Trên phổ ROESY tương tác không gian của H-3 (H3.83- 3.87) với H-5 (H1.05-1.07) cho thấy cấu hình α của H-3. Tương tác NOE giữa H-6 (H3.45-3.47) và H-8 (H1.97-1.99)/H-19 (H 0.88) cũng như giữa H-8 (H1.97-1.99) và H-18 (H 0.72), chứng minh cho cấu hình β của H-6 (hình 4.9). Giá trị độ dịch chuyển hóa học 13C- NMR của C-21 tại C 19.9 (đo trong DMSO-d6) cho thấy cấu hình tương đôi R* tại C-20 [3]. Để xác định cấu hình tại C-22, phổ 1H- NMR của CN1 được đo lại trong pyridine-d5. Giá trị độ dịch chuyển hóa học 1H-NMR của H-21 tại H 1.64 (pyridine-d5) chứng minh cho cấu hình S* tại C-22. Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của CN1 C aC bC C c,d H c,e dạng pic (J = Hz) HMBC (H  C) Aglycon 1 35,9 35,15 1,26 m/1,62 m 2 29,2 28,35 1,36 m/2,12 m 3 78,3 75,18 3,85 m 4 30,6 29,49 1,04 m/2,35 m 5 49,2 48,43 1,06 m 6 80,0 78,11 3,46 m 7 41,2 40,63 0,83 m/2,27 m 8 35,4 34,67 1,98 m 9 145,6 145,18 - 10 38,2 37,70 - 11 116,6 115,67 5,24 d (5,0) 10, 13 12 42,6 41,99 1,96 m/2,18 m 13 41,6 40,51 - 14 54,0 53,36 1,15 m 15 22,6 24,55 1,10 m/1,63 m 16 25,3 21,15 1,62 m/1,75 m 13 17 55,1 53,80 1,83 m 18 13,4 13,00 0,72 s 12, 13, 14,17 19 19,2 19,04 0,88 s 1, 5, 9, 10 20 76,4 75,14 - 21 21,5 19,91 1,06 s 17, 20, 22 22 77,8 76,24 3,05 m 23 29,6 28,99 1,75 m/2,35 m 24 124,2 124,04 5,20 t (7,0) 25 131,8 130,40 - 26 17,4 17,85 1,55 s 24, 25, 27 27 25,6 25,64 1,65 s 24, 25, 26 Qui I 1 105,1 104,4 102,75 4,31 d (7,5) 6 2 74,1 74,1 73,00 3,18 f 3 90,5 89,8 87,90 3,28 f 4 74,5 74,3 72,96 2,91 t (9,0) 5 72,0 72,3 70,74 3,27 f 6 18,4 17,8 17,81 1,16 d (6,5) 4, 5 Xyl 1 104,5 104,0 102,49 4,53 d (7,5) 3 2 81,9 82,7 82,68 3,35 f 3 75,6 75,1 73,99 3,58 f 4 78,8 78,3 76,54 3,60 f 5 64,5 64,2 63,07 3,31/3,94 f Qui II 1 104,8 105,2 104,54 4,44 d (7,5) 2 2 76,2 75,6 74,84 3,06dd (7,5, 9,0) 3 76,8 77,0 75,58 3,12t (9,0) 4 75,5 76,0 74,63 2,86 t (9,0) 5 73,6 73,3 72,44 3,22dd (6,0, 9,0) 6 17,8 17,8 17,31 1,19 d (6,0) 4, 5 Fuc I Qui 1 102,0 101,2 100,08 4,42 d (7,5) 4 2 82,8 84,0 81,47 3,44 f 3 74,9 75,9 72,44 3,50 f 4 71,7 77,3 70,22 3,45 f 5 71,6 73,4 70,10 3,58 f 6 16,9 18,2 16,51 1,14 d (6,0) Fuc II 1 106,9 106,2 105,60 4,21 d (7,0) 2 2 73,8 71,8 72,05 3,32 f 3 75,0 74,7 73,23 3,51 f 4 72,5 72,8 70,99 3,38 br s 5 71,9 71,8 70,47 3,54 f 6 17,1 16,9 16,65 1,15 d (6,0) 4, 5 aC của novaeguinoside A [4], bC của protoreasteroside [3], cđo trong DMSO-d6, d125 MHz, e500 MHz, etín hiệu bị chồng lấp. 14 Hình 3.7. Phổ ROESY của CN1 Hình 3.8. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chính của CN1 Ngoài ra, phổ 13C-NMR của CN1 xuất hiện 5 tín hiệu cacbon anome tại C 102,7 (C-1), 102,5 (C-1), 104,5 (C-1), 100,1 (C- 1) và 105,6 (C-1); có tương tác HSQC với các proton anome tương ứng (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 7,5 Hz) tại H 4,31 (H-1), 4,53 (H-1), 4,44 (H-1), 4,42 (H-1) và 4,21 (H-1) chứng minh sự có mặt của 05 gốc đường. So sánh chi tiết số liệu phổ 1H và 13C- NMR phần chuỗi đường của CN1 với các số liệu tương ứng của protoreasteroside kết hợp với phân tích các phổ 1D TOCSY, COSY, HMBC, HSQC và ROESY và (hình 4.9), cho thấy sự khác nhau giữa hai hợp chất chỉ được ghi nhận ở các tín hiệu của đơn vị đường thứ 4. Số liệu phổ 13C-NMR của gốc đường này đo trong DMSO-d6 tại C 100,1 (C-1), 81,5 (C-2), 72,4 (C-3), 70,2 (C-4), 70,1 (C-5) và 16,5 (C-6) tương tự như các số liệu tương ứng của novaeguinoside A đo trong pyridine-d5 tại C 102,0 (C-1), 82,8 (C-2), 74,9 (C-3), 71,7 (C- 4), 71,6 (C-5) và 16,9 (C-6) và khác xa so với các số liệu của protoreasteroside đo trong pyridine-d5 tại C 101,2 (C-1), 84,0 (C-2), 75,9 (C-3), 77,3 (C-4), 73,4 (C-5) và 18,2 (C-6), chứng minh gốc đường thứ 4 là fucose. Điều này cũng phù hợp với cơ sở lý luận sinh tổng hợp lý thuyết với sự cùng có mặt trong loài sao biển C. novaeguineae của CN1 và hợp chất novaeguinoside A, có chứa cùng chuỗi năm đơn vị đường. 15 Hình 3.9. Phổ 1D TOCSY của CN1 Trên phổ 1D TOCY của CN1, với sự kích thích chương trình xung vào các tín hiệu proton anome: H-1 tại H 4,53 (A), H-1 tại H 4,44 (B), H-1 tại H 4,42 (C), H-1 tại H 4,31 (D), and H-1 tại H 4,21 (E) sẽ giúp cho việc xác định chính xác proton của phân tử đường. Tương tác xa HMBC của proton anome H-1 (H 4.21) với C-2 (C 81.5), H-1 (H 4.42) với C-4 (C 76.5), H-1 (H 4.44) với C-2 (C 82.7) và của H-1 (H 4.53) với C-3 (C 87.9), chứng minh vị trí liên kết tương ứng của đường fucose II tại C-2, fucose I (A) (B) (C) (D) (E) 16 tại C-4, quinovose II tại C-2 và xylose tại C-3. Ngoài ra, proton anome H-1 (H 4.31) của đường quinovose I có tương tác HMBC với C-6 (C 78,1) chứng minh vị trí liên kết thường gặp của chuỗi đường tại vị trí C-6 của phần algycon. Giá trị hằng số tương tác lớn (J = 7,5 Hz) của các proton anome cho thấy các liên kết đường đều có dạng β. Cấu hình của các đơn vị đường được xác định là D bởi sự tương đồng với hợp chất novaeguinoside A và tất cả các hợp chất asterosaponin đã được công bố. Như vậy, cấu trúc hóa học của CN1 được chứng minh là sodium (20R*,22S*)-6α-O-{-D-fucopyranosyl-(12)--D- fucopyranosyl-(14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D- xylopyranosyl-(13)--D-quinovopyranosyl}-3β,6α,20,22- tetrahydroxy-5α-cholesta-9(11),24-dien-3β-yl sulfate. Đây là một chất mới và được đặt tên là novaeguinoside E. 3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài Pentaceraster gracilis Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 07 hợp chất được phân lập từ loài P. gracilis PG2: Protoreasteroside PG1: Maculatoside PG3: Pentaceroside A (chất mới) PG4: Pentaceroside B (chất mới) 17 PG5: Nodososide PG6: (5α,25S)-cholestane- 3β,6α,8,15β,16β,26- hexol 3-O-[(2-O- methyl)-β-D-xylopyranoside] PG7: 5α-cholestane-3β,6α,7α,8β,15α,16β,26-heptol Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư. 3.2.1. Hợp chất PG1: Maculatoside Hợp chất PG1 cũng được phân lập từ loài sao biển sao biển Pentaceraster gracilis dưới dạng chất bột màu trắng. Bảng 4.4. Phổ NMR của PG1 C aC C b,c H b,d Dạng pic (J = Hz) HMBC (H  C) Aglycon 1 35,9 35,97 1,38 m/1,65 m 2 29,2 29,46 1,89 m/2,76 m 3 78,3 77,64 4,86 m 4 30,6 30,74 1,69 m/3,45 m 5 49,2 49,37 1,46 m 6 80,0 80,33 3,79 m 7 41,2 41,67 1,26 m/2,70 m 8 35,4 35,39 2,12 m 9 145,6 145,55 - 10 38,2 38,29 - 11 116,6 116,84 5,24 d (5,5) 8, 10, 13 18 12 42,6 42,79 2,14 m/2,35 m 13 41,6 41,61 - 14 54,0 54,07 1,33 m 15 22,6 22,58 2,08 m/2,48 m 16 25,3 25,38 1,30 m/1,84 m 17 55,1 55,06 2,40 m 18 13,4 13,63 1,13 s 12, 13, 14,17 19 19,2 19,29 0,96 s 1, 5, 9, 10 20 76,4 76,34 - 21 21,5 21,38 1,66 s 17, 20, 22 22 77,8 78,24 3,88 m 23 29,6 30,62 2,45 m 2,92 br dd (6,5, 13,5) 24 124,2 124,67 5,66 t (6,5) 25 131,8 131,79 - 26 17,4 18,02 1,67 s 24, 25, 27 27 25,6 25,92 1,68 s 24, 25, 26 Qui I 1 104,4 105,01 4,80 d (7,5) 6 2 74,1 74,16 3,98* 3 89,8 89,98 3,85* 4 74,3 74,53 3,57 t (9,0) 5 72,3 71,99 3,67* 6 17,8 18,47 1,55 d (6,0) 4, 5 Xyl 1 104,0 104,35 5,07 d (7,5) 3 2 82,7 82,20 4,10* 3 75,1 75,55 4,23* 4 78,3 78,62 4,18* 5 64,2 64,41 3,81*/4,49 dd (5,0, 12,0) Qui II 1 105,2 105,12 5,28 d (7,5) 2 2 75,6 75,61 4,08* 3 77,0 77,47 4,14* 4 76,0 75,96 3,64* 5 73,3 73,71 3,70* 6 17,8 17,98 1,77 d (6,0) 4, 5 Qui III 1 101,2 101,51 4,92 d (7,5) 4 19 2 84,0 84,96 3,98* 3 75,9 76,27 4,14* 4 77,3 76,93 4,08* 5 73,4 73,03 3,75* 6 18,2 18,17 1,50 d (6,0) 4, 5 Fuc 1 106,2 107,01 4,97 d (7,5) 2 2 71,8 73,88 4,42 dd (7,5, 9,0) 3 74,7 74,96 4,06* 4 72,8 72,55 3,98 br s 5 71,8 71,99 3,73* 6 16,9 17,23 1,48 d (6,0) 4, 5 aC của protoreasteroside [3], bđo trong pyridine-d5, c125 MHz, d500 MHz, *tín hiệu bị chồng lấp Phân tích các số liệu phổ thu được từ phổ cộng hưởng từ 1D, 2D cho thấy PG1 là dạng glycosid với các tín hiệu rất đặc trưng của một asterosaponin có 05 đơn vị đường, phân algycon rất đặc trưng của khung steroid với liên kết đôi tại 9(11), phân mạch nhánh có nhóm keton. Hình 4.1. Phổ 1 H-NMR của PG1 Hình 4.2. Phổ 13 C-NMR của PG1 Hình 4.3. Phổ HSQC của PG1 Hình 4.4. Phổ COSY của PG1 20 Hình 4.5. Phổ HMBC của PG1 Hình 4.6. Phổ ROESY của PG1 So sánh các phổ NMR của PG1 với các phổ tương ứng của Protoreasteroside cho thấy hai hợp chất chỉ khác nhau ở cấu trúc mạch nhánh. Các phổ NMR phần nhánh của PG1 có các tín hiệu đặc trưng của một cacbon bậc bốn mang oxi, một nhóm tert-metyl, một nhóm keton và hai nhóm sec-metyl. So sánh số liệu phổ NMR của PG1 với các số liệu đã được công bố kết hợp với phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HSQC, HMBC, COSY và ROESY cho phép xác định PG1 chính là maculatoside. 4.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá trên 05 dòng tế bào ung thư người là: LNCaP (tuyến tiền liệt), MCF7 (vú), KB (ung thư biểu mô), Hep-G2 (gan) vàSK-Mel2 (sắc tố). Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học. 4.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài sao biển Culcita novaeguineae Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển C.novaeguineae cho thấy: Chỉ có các hợp chất CN5CN8 thể hiện hoạt tính, các hợp chất CN1CN4 và CN9 không có biểu hiện hoạt tính với giá trị IC50> 100 µM. Trong đó, hợp chất halityloside D (CN5) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 31,801,59 µM), MCF7 (IC50 = 33,961,57 µM), KB (IC50 = 32,661,47 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 32,993,05 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 21 75,014,11 µM). Hợp chất halityloside B (CN7) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,682,65 µM), MCF7 (IC50 = 39,992,65 µM) và KB (IC50 = 44,373,00 µM); hoạt tính trung bình trên dòng tế bào SK-Mel2 (IC50 = 50,094,06 µM) và hoạt tính yếu trên dòng Hep-G2 (IC50 = 80,223,67 µM). Hai hợp chất culcitoside C5 (CN6) và halityloside A (CN8) thể hiện hoạt tính trung bình hoặc yếu trên các dòng tế bào LNCaP, MCF7, KB, và SK-Mel2 với giá trị IC50 từ 48,592,30 đến 92,042,84µM, và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên dòng Hep-G2. IV.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài sao biển Pentaceraster gracilis Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển P. gracilis cho thấy: hợp chất maculatoside (PG1) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,753,34 µM), KB (IC50 = 36,530,78 µM), HepG2 (IC50 = 16,750,69 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 19,441,45 µM) và hoạt tính trung bình trên dòng MCF7 (IC50 = 47,347,01 µM). Hợp chất PG7 thể hiện hoạt tính yếu trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 86,572,19 µM), HepG2 (IC50 = 79,693,14 µM) và SK- Mel2 (IC50 = 96,774,07 µM) và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên các dòng tế bào còn lại. Các hợp chất PG2PG6 không có biểu hiện hoạt tính trên tất cả năm dòng tế bào ung thư được thử nghiệm với giá trị IC50> 100 µM. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A. Kết luận Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về hai loài sao biển Culcita novaeguineae và Pentaceraster gracilis thu thập tại vùng biển Việt Nam. 1. Về nghiên cứu hóa học Đã phân lập được tổng cộng 16 hợp chất từ hai loài sao biển, trong đó 9 hợp chất từ loài sao biển C. novaeguineae trong đó có 1 chất mới và 6 hợp chất từ loài sao biển P. gracilis trong đó có 2 chất 22 mới. Dựa vào các phương pháp phổ hiện đại, cấu trúc hóa học của chúng được xác định như sau:  Novaeguinoside E (CN1, chất mới)  Natri 6α-[(O-β-D-fucopyranosyl-(l2)-O-β-D- galactopyranosyl-(l4)-O-[β-D-quinovopyranosyl-(l2)]- O-β-D-xylopyranosyl-(l3)-O-β-D-quinovopyranosyl)-oxy]- 5α-pregn-9(11)-ene-20-one-3β-yl-sulfate (CN2)  Linckoside B (CN3)  Halityloside E (CN4)  Halityloside D (CN5)  Culcitoside C5 (CN6)  Halityloside B(CN7)  Halityloside A (CN8)  5α-cholestane-3β,6β,7α,8β,15α,16β,26-heptol(CN9)  Maculatoside (PG1)  Protoreasteroside(PG2)  Pentaceroside A (PG3, chất mới)  Pentaceroside B (PG4, chất mới)  Nodososide(PG5)  (5α,25S)-Cholestane-3β,6α,8,15β,16β,26-hexol 3-O-[(2-O- methyl)-β-D-xylopyranoside] (PG6)  5α-Cholestane-3β,6α,7α,8β,15α,16β,26-heptol (PG7) Các hợp chất thu được từ hai loài sao biển đều là các dẫn xuất steroid, một lớp chất chính đã được công bố từ các loài sao biển. Trong số 9 hợp chất phân lập từ sao biển C. novaeguineae có 2 saponin (1 chất mới), 6 polyhydroxy steroid glycosit và 1 polyhydroxy steroid và trong số 7 hợp chất phân lập được từ sao biển P. gracilis có 2 saponin, 4 polyhydroxy steroid glycosit (2 chất mới) và 1 polyhydroxy steroid. 23 2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học Đã khảo đánh gia tính gây độc tế bào in vitro trên 05 dòng tế bào ung thư người là: LNCaP (tuyến tiền liệt), MCF7 (vú), KB (ung thư biểu mô), HepG2 (gan) và SK-Mel2 (sắc tố) của các hợp chất phân lập được từ hai loài sao biển. Kết quả cho thấy: Hợp chất halityloside D (CN5) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 31,80  1,59 µM), MCF7 (IC50 = 33,96  1,57 µM), KB (IC50 = 32,66  1,47 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 32,993,05 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 75,01  4,11 µM). Hợp chất halityloside B (CN7) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,68  2,65 µM), MCF7 (IC50 = 39,99  2,65 µM) và KB (IC50 = 44,37  3,00 µM); hoạt tính trung bình trên dòng tế bào SK- Mel2 (IC50 = 50,09  4,06 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 80,22  3,67 µM). Hai hợp chất culcitoside C5 (CN6) và halityloside A (CN8) thể hiện hoạt tính trung bình hoặc yếu trên các dòng tế bào LNCaP, MCF7, KB và SK-Mel2 với giá trị IC50 từ 48,59  2,30 đến 92,04  2,84 µM, và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên dòng HepG2. Hợp chất maculatoside (PG1) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,75  3,34 µM), KB (IC50 = 36,53  0,78 µM), HepG2 (IC50 = 16,75  0,69 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 19,44  1,45 µM) và hoạt tính trung bình trên dòng MCF7 (IC50 = 47,34  7,01 µM). Hợp chất PG7 thể hiện hoạt tính yếu trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 86,57  2,19 µM), Hep-G2 (IC50 = 79,69  3,14 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 96,77  4,07 µM) và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên các dòng tế bào còn lại. Các hợp chất PG2PG6 không có biểu hiện hoạt tính trên tất cả năm dòng tế bào ung thư được thử nghiệm với giá trị IC50> 100 µM. 24 B. Kiến nghị - Các hợp chất halityloside D (CN5), halityloside B (CN7) và maculatoside (PG1) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khá tốt, cần được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn theo định hướng cơ chế tác dụng. - Tiếp tục mở rộng nghiên cứu các hoạt tính khác của các hợp chất đã phân lập được nhằm định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Nghiên cứu về hóa học - 03 hợp chất mới là Novaeguinoside E (CN1); Pentaceroside A (PG3) và Pentaceroside B (PG4). - lần đầu tiên các hợp chất CN2-CN9 được phát hiện từ thành phần hóa học của loài sao biển C. novaeguineae ở Việt Nam - lần đầu tiên các hợp chất PG1-PG2, PG5-PG7 được phát hiện từ thành phần hóa học của loài sao biển P. gracilis - Lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển C. novaeguineae và loài sao biển P. gracilis thu thập ở vùng biển đông bắc của Việt Nam 2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học - Lần đầu tiên tiến hành các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào đối với các hợp chất phân lập được từ học loài sao biển C. novaeguineae và loài sao biển P. gracilis thu thập ở vùng biển đông bắc của Việt Nam. Đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của 16 hợp chất sạch trên 05 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (LNCaP, MCF7, KB, Hep-G2 và SK-Mel2), kết quả đã xác định được 03 hợp chất (CN5, CN7 và PG1) thể hiện khả năng gây độc trên dòng LNCaP, MCF7, KB và SK-Mel2; có 02 hợp chất (PG1 và PG7) thể hiện khả năng gây độc tế bào trên dòng HepG2. 25 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Bui Thi Ngoan, Tran Thi Hong Hanh, Le Thi Vien, Chau Ngoc Diep, Nguyen Phuong Thao, Do Thi Thao, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Do Cong Thung, Phan Van Kiem, Young Ho Kim and Chau Van Minh. Asterosaponins and glycosylated polyhydroxysteroids from the starfish Culcita novaeguineae and their cytotoxic activities. Journal of Asian Natural Products Research, 2015, 17(10), 1010–1017. 2. Le Thi Vien, Bui Thi Ngoan, Tran Thi Hong Hanh, Le Ba Vinh, Do Cong Thung, Do Thi Thao, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem and Chau Van Minh. Steroid glycosides from the starfsh Pentaceraster gracilis. Journal of Asian Natural Products Research, 2017, 19(5), 474–480. 3. Bui Thi Ngoan, Tran Thi Hong Hanh, Le Thi Vien, Chau Ngoc Diep, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Do Cong Thung, Phan Van Kiem, Chau Van Minh. A polyhydroxylated sterol and a saponin isolated from the starfish Culcita novaeguineae. Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53(2e), 23- 27. 4. Bùi Thị Ngoan, Trần Thị Hồng Hạnh, Lê Thị Viên, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Đỗ Công Thung, Châu Văn Minh. Các hợp chất steroit diglycosit phân lập từ loài sao biển Culcita novaeguineae. Tạp chí Hóa học, 2016, 54(2e), 44-48.