[Tóm tắt] Luận án Nghiên cứu ứng dụng phương pháp công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại Gia Lâm Hà Nội

Đông, An Huy, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Hồ Bắc, Tứ Xuyên, Quý Châu, Sơn Tây, Quảng Đông trong đó các tỉnh Sơn Tây, Tứ Xuyên, Hà Bắc, Hà Nam và Sơn Đông là khu vực sản xuất Đan sâm chất lượng và sản lượng cao. Năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì năm 2002 là 10.000 tấn trên toàn thế giới và lên tới 80.000 tấn/năm trong thời gian gần đây (Hu et al, 2005). Một trong các sản phẩm sử dụng phổ biến nhất có chứa dược liệu Đan sâm là Thiên Sứ Hộ Tâm Đan do các nhà khoa học Trung Quốc bào chế trên cơ sở kết hợp hai loại thảo dược là Đan sâm và tam thất để phòng và điều trị các bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tăng cholesterol máu Có mặt trên thị trường từ năm 1993, tính đến nay có hơn 2 tỷ liều dùng được kê đơn cho khoảng 10 triệu bệnh nhân điều trị trong thời gian ngắn hoặc kéo dài tại 34 Quốc gia trên toàn thế giới như Mỹ, Nga, Canada, Singapo, Nam Phi, Việt Nam... 2.2.2. Tại Việt Nam Đan sâm được di thực và sử dụng từ những năm 1960 ở Việt Nam và hiện nay loại dược liệu này được trồng thử nghiệm ở Lào Cai (Sập, Bắc Hà), Vĩnh Phúc (Tam Đảo) và Hà Nội (Văn Điển) và một số vườn thuốc khác (Ngô Quốc Luật và cs., 2014). 2.3. CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT 2.3.1. Phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm Cây Đan sâm có thể nhân giống hữu tính bằng hạt hoặc vô tính từ rễ củ, tách chồi và phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Zhao et al., 1999; Wang et al., 2002; Zhang and Zhang, 2004) (Bảng 2.1). 5 Bảng 2.1 Các phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm Phƣơng pháp nhân giống Phƣơng pháp nhân giống hữu tính Phƣơng pháp nhân giống bằng tách chồi Phƣơng pháp nhân giống từ rễ củ Vật liệu Hạt Chồi Rễ củ Mùa vụ 1. Chuẩn bị cây con và chuyển cây ra đồng ruộng Gieo hạt: tháng 7-8 hoặc tháng 2-3 Chuyển cây ra đồng ruộng: cuối tháng 10 hoặc khi cây đạt chiều cao 6-10 cm Không có thông tin Giâm củ: tháng 2-3 Chuyển cây ra đồng ruộng: khi cây đạt chiều cao 6-10 cm 2. Trồng cây trực tiếp Tháng 8 hoặc tháng 3 Cuối tháng 10 đến đầu tháng 11 Tháng 2-3 Quy trình 1. Chuẩn bị cây con và chuyển cây ra đồng ruộng Lượng hạt: 15,0-22,5 kg/ha Mật độ gieo hạt: hàng cách hàng 12 - 15 cm Mật độ trồng: 33 (30-35 cm) x 23 (20) Không có thông tin Mật độ trồng 33 x 23 cm 2. Trồng cây trực tiếp Lượng hạt: 7,5 kg/ha Gieo xạ: hàng cách hàng 30-35 cm Mật độ cây: 30-35 x 20-25 cm Mật độ trồng: 33x23 cm Mật độ trồng: 33 x 23 cm Nguồn: Sheng (2007) 2.3.2. Khoảng cách trồng Trong các yếu tố kỹ thuật để tăng năng suất cây trồng, ngoài phân bón và cách bón phân thì mật độ quần thể ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của cây trồng. Liu et al. (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng cách trồng đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây Đan sâm trồng tại tỉnh Shanxi, Trung Quốc. Bảy khoảng cách trồng được khảo sát là 20 × 20 cm, 25 × 20 cm, 25 × 25 cm, 25 × 30 cm, 30 × 25cm, 35 × 25 cm và 35 × 30 cm. Kết quả cho thấy tại khoảng cách trồng 20 x 20 cm, tỷ lệ cây sống thấp nhất (47%) trong khi có đến 88% cây sống ở khoảng cách trồng 25 x 20 cm. chỉ tiêu năng suất rễ, khoảng cách trồng 25 x 25 cm cho khối lượng rễ đạt cao nhất, cao hơn 20% so với khối lượng rễ thu được khi trồng cây ở khoảng cách 35 x 30 cm và 60% so với khoảng cách 35 x 25 cm. Hiện nay, ở các quy trình trồng cây Đan sâm thường sử dụng khoảng cách trồng khá lớn với khoảng cách hàng 25 hoặc 30 cm, khoảng cách cây 20 hoặc 25 cm. Khoảng cách trồng này kích thích sự tổng hợp hoạt chất tanshione IIA (Wang et al., 2003c; Jiang et al., 2004). 2.3.3. Phân bón Bón phân quyết định năng suất và hoạt chất tích lũy trong rễ cây Đan sâm. Chế độ phân bón hợp lý sẽ tạo điều kiện cho cây sinh trưởng phát triển thuận lợi, cho 6 năng suất cao, chất lượng dược liệu tốt. Đối với cây Đan sâm đất trồng cần chọn đất phù sa, đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều màu, cao ráo, thoát hơi nước. Sau khi cày bừa kỹ, cần lên luống cao 20 – 25cm, rộng 90 – 120 cm, rãnh phải dốc để thoát nước. Dùng 15 – 20 tấn phân chuồng ủ với 1,4 – 2,8 tấn tro bếp, 270 kg supe lân để bón lót cho một heta. Tốt nhất, nên bón theo hốc để tiết kiệm phân và hạn chế c dại. Hốc được chuẩn bị với khoảng cách 30x30 cm. 2.4. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 2.4.1. Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trong sản xuất cây dƣợc liệu Kỹ thuật nhân giống in vitro được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng cây dược liệu, cho phép cung cấp nguồn giống chất lượng một cách chủ động cho sản xuất. Việt Nam một số tác giả đã tiến hành nhân giống in vitro thành công trên một số cây dược liệu quan trọng khác, sử dụng chồi đỉnh lấy từ các cây Lô hội (Aloe vera Linne.) và tiến hành nhân giống vô tính in vitro. Kết quả cho thấy, môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 2,5 mg/l BAP + 0,6 mg/l α- NAA cho hệ số nhân đạt 4,1 lần. Một đối tượng khác là cây ba kích (Morinda officinalis How) cũng được tái sinh thành công với vật liệu ban đầu là đoạn thân mang chồi nách trên môi trường thích hợp MS + 0,25 mg/l kinetin + 1 mg/l BA với tỷ lệ chồi tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy là 96,6%. Môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 3,0 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA+ 10 mg/l riboflavin, sau 45 ngày đạt hệ số nhân là 10,13 lần (Hoàng Thị Thế và cs., 2013). 2.4.2. Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm Nhiều công trình nhân giống vô tính cây Đan sâm với mục đích tạo ra giống chất lượng cao đã được công bố bới một số tác giả như Feng et al. (2004); Xu et al. (2008); Cai et al. (1991), Zhao et al. (2003. Tại Việt Nam, trước nghiên cứu này, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu liên quan đến nhân nhanh in vitro cây Đan sâm được thực hiện bởi Tạ Như Thục Anh và cs. (2014). Tác giả đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân in vitro cây Đan sâm sử dụng vật liệu là chồi mầm từ củ giống. Nghiên cứu đã chỉ ra loại chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mầm ngủ, nhân nhanh và kích thích ra rễ cây Đan sâm trong điều kiện in vitro. 2.5. TẠO VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐAN SÂM Hu and Alfermann (1993) tạo dòng rễ tơ cây Đan sâm thông qua lây nhiễm các cơ quan của cây in vitro với năm chủng vi khuẩn A.rhizogenes. Trong quá trình nhân nuôi rễ tơ, nhóm tác giả đã tìm ra môi trường bổ sung 3% đường và ammonium nitrate có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng sinh khối rễ tơ cũng như sự tích lũy hoạt chất diterpenes. Sử dụng chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 lây nhiễm với cây Đan sâm in vitro, Chen et al. (1999) đã thu được các dòng rễ tơ chuyển gen. Nhóm tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền MS, MS-NH4 (môi trường MS không chứa ammonium nitrate) B5, WPM và 6,7-V đến 7 tốc độ tăng trưởng của rễ tơ cũng như khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp. Kết quả cho thấy, tốc độ tăng trưởng rễ tơ và hoạt chất thứ cấp tích lũy ở rễ tơ khi nuôi cấy trên môi trường MS-NH4 và 6,7-V cao hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường MS, B5 và WPM. Theo kết quả nghiên cứu của Ge and Wu (2005), hàm lượng tanshinone tổng số tích lũy trong rễ tơ Đan sâm tăng 1,2 lần khi bổ sung 30 μM Ag + và 3,1 lần khi bổ sung 100 µg/ml YE vào môi trường nuôi cấy so với công thức đối chứng không bổ sung Ag+ và YE. Yang et al. (2012) đã tiến hành nghiên cứu tác động của PEG, ABA và methyl jasmonate (MJ) đến sự tổng hợp tanshinone ở rễ từ cây Đan sâm. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng 4 loại tanshinone trong rễ tơ cây Đan sâm tăng lên rõ rệt khi bổ sung 2% PEG và 200 µM ABA vào môi trường nuôi cấy. Cheng et al. (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 3 yếu tố elicitor gồm Ag+, YE và MJ đến sự tích lũy hoạt chất tashinones. Kết quả cho thấy, bổ sung kết hợp YE + Ag+, Ag+ + MJ và YE + Ag+ + MJ đã làm tăng hàm lượng tanshinones, đặc biệt bổ sung Ag+ + MJ và YE + Ag+ + MJ làm tăng hàm lượng tanshinone lên 5 lần so với công thức đối chứng. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Hạt Đan sâm Salvia miltiorrhiza Bunge nhập từ tỉnh Tứ Xuyên – Trung Quốc. - Chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 được cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nội dung 1- Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm - Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Đan sâm - Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm - Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm - Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm - Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đan sâm - Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy cây Đan sâm in vitro trên môi trường ra rễ đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm - Thí nghiệm 10. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới sự sinh trưởng và phát triển của cây Đan sâm 8 3.2.2. Nội dung 2-Tạo dòng rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro cây Đan sâm - Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm - Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dịch khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm - Thí nghiệm 13. Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ - Thí nghiệm 14. Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng sinh khối rễ tơ - Thí nghiệm 15. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ - Thí nghiệm 16. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối của rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 17. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 18. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm - Thí nghiệm 19. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm 3.2.3. Nội dung 3-Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trong sản xuất nâng cao năng suất chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm - Thí nghiệm 20: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm - Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm - Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số công thức phân bón đến sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm 3.3. ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM 3.3.1. Nhóm thí nghiệm trong phòng Các thí nghiệm sử dụng môi trường nền MS hoặc B5 + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16 h sáng/8h tối, cường độ ánh sáng 2000 -2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C. Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm của bộ môn CNSH Thực vật, Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 30 mẫu với các thí nghiệm trong nội dung xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm, 100 mẫu đối với thí nghiệm chuyển gen và 9 mẫu đối với thí nghiệm nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm. 3.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành Các thí nghiệm sử dụng môi trường nền MS hoặc B5 theo từng thí nghiệm + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước 9 khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút (khối lượng agar có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm). Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16h sáng/8h tối, cường độ ánh sáng 2000-2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C (thời gian chiếu sáng có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm). 3.3.1.2. Phương chuyển gen và kiểm tra mẫu chuyển gen a) Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes Vi khuẩn A.rhizogenes chủng ATCC 15834 bảo quản ở -800C được hoạt hóa bằng cách nuôi trải trên môi trường LB đặc trong 48h ở 280C trong điều kiện tối. Sau đó, một khuẩn lạc đơn được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường LB l ng, lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 16h. Dịch khuẩn được ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Sinh khối vi khuẩn sau đó được hòa loãng trong môi trường MS l ng và xác định mật độ vi khuẩn dựa trên giá trị mật độ quang của dịch mẫu ở bước sóng 600 nm (OD600). b) Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Lá, cuống lá và đoạn thân cây Đan sâm in vitro sinh trưởng phát triển tốt được cắt và tạo vết thương bởi dao cấy đã nhúng vào dịch khuẩn A.rhizogenes và cấy trên môi trường đồng nuôi cấy là môi trường MS + 30 g/l sucrose trong 5 ngày trong điều kiện tối. c) Diệt khuẩn và tái sinh tạo rễ tơ Kết thúc giai đoạn đồng nuôi cấy, mẫu cấy được chuyển sang môi trường diệt khuẩn và tái sinh là môi trường MS + 30 g/l sucrose + 400 mg/l cefotaxim trong điều kiện tối. Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 4 tuần. d) Xác định rễ tơ chuyển gen bằng kỹ thuật PCR DNA tổng số của các mẫu rễ tơ được tách chiết theo Kit tách chiết của Qiagen. Phương pháp PCR được thực hiện để khuếch đại gen rolA và gen virD bằng các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agrose 1%, bổ sung ethidium bromide (7 µl/100ml đệm TAE), hiệu điện thế 60 V, thời gian 60 phút. Gel agarose được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. 3.3.2. Nhóm thí nghiệm ngoài đồng ruộng Các thí nghiệm được bố trí từ tháng 1/2014 -4/2015 tại khu thí thực nghiệm của Khoa CNSH – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thí nghiệm bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ, mỗi công thức nhắc lại 3 lần (3 ô thí nghiệm). Diện tích mỗi ô thí nghiệm 5 m2, tổng diện tích thí nghiệm của 1 công thức là 15 m2. Các ô thí nghiệm được đánh luống cao 30 cm, mỗi ô thí nghiệm cách nhau 40 cm. Cây Đan sâm được trồng vào thời vụ tháng 2 năm 2014 (riêng thí nghiệm thời vụ bố trí theo các công thức đã xây dựng), với khoảng cách trồng 30 x 30 cm, tương đương 11 cây/m2 (riêng thí nghiệm mật độ trồng, bố trí theo công thức đã xây dựng), 55 cây/1 ô thí nghiệm, 165 cây/công thức, sử dụng lượng phân 10 bón chung cho các thí nghiệm là 2 tấn phân vi sinh sông gianh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O (riêng thí nghiệm phân bón, bón theo các công thức đã xây dựng). Bón lót toàn bộ phân vi sinh và phân lân. Phân đạm và kali được bón thúc làm 3 đợt: Đợt 1 sau trồng 45 ngày bón 30% phân N + 30% K; Đợt 2: sau trồng 3 tháng bón 50% N + 30% K, đợt cuối cùng sau trồng 6 tháng bón nốt lượng phân N và K còn lại. Làm c và quản lý nước, kiểm tra sâu bệnh thường xuyên đảm bảo cây sinh trưởng, phát triển tốt. Cây giống được trồng trong 3 thí nghiệm này là đều là cây có nguồn gốc nuôi cấy mô. Tiêu chuẩn cây con khi trồng: Cây được giâm trên giá thể cát + xơ dừa (tỷ lệ 1:1) trong thời gian 30 ngày, cây có chiều cao >4 cm, có 9 lá/cây, cây sinh trưởng kh e. 3.3.2.1. Phương pháp xác định khối lượng rễ tươi Kết thúc quá trình nuôi cấy, rễ tơ được thu nhận, rửa sạch môi trường và loại b hoàn toàn nước bằng giấy thấm. Sau đó cân rễ bằng cân phân tích để xác định khối lượng rễ tươi. 3.3.2.2. Phương pháp xác định khối lượng rễ khô Rễ tơ sau khi thu sinh khối được sấy ở nhiệt độ 400C đến khối lượng không đổi để xác định khối lượng rễ khô theo phương pháp của Ge et al. (2005). 3.3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất mục tiêu Ba hoạt chất mục tiêu gồm cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA trong rễ tơ Đan sâm được xác định bằng phương pháp sắc ký l ng cao áp (HPLC) tại Phòng Thí nghiệm Trung tâm – Khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các chỉ tiêu được theo dõi và đo đếm sau 2-10 tuần tùy từng thí nghiệm. Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và IRRISTAT 5.0. Mô hình thống kê sử dụng cho thí nghiệm Yij = µij + aij + eij; Trong đó: i=1.I; j= 1Ii - Yij: Giá trị quan sát của chỉ tiêu theo dõi - µij: Giá trị trung bình mẫu - ai: Hiệu quả của công thức thí nghiệm i - eij: Sai số ngẫu nhiên của các giá trị quan sát PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐAN SÂM 4.1.1. Tạo vật liệu khởi đầu Tạo nguồn vật liệu khởi đầu là bước quan trọng có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quy trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu tái sinh và sinh trưởng cao. 11 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt Đan sâm sau 2 tuần nuôi cấy GA3 (mg/l) Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi 0,0 14,33 1,95 5,43 0,5 28,33 4,61 7,35 1,0 40,43 4,75 6,20 2,0 20,00 6,91 6,00 3,0 18,33 7,40 6,09 CV% 2,3 1,9 LSD0,05 0,21 0,21 GA3 có tác dụng làm tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt Đan sâm trên môi trường MS. Nồng độ bổ sung tối ưu nhất là 1,0 mg/l GA3, cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 40,43%. 4.1.2. Nhân nhanh chồi Trong nhân giống cây trồng in vitro, để có được hệ số nhân giống cao, số lượng cây giống lớn, đồng nhất, cây có sức sinh trưởng tốt thì việc xác định được môi trường nhân nhanh thích hợp có vai trò quyết định. Cytokinin là nhóm chất điều tiết sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự tái sinh mẫu cấy theo hướng tạo chồi làm tăng hệ số nhân. Tuy nhiên, với mỗi loại chất kích thích sinh trưởng khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau ở mỗi loài cây và giai đoạn nuôi cấy. Bổ sung BA làm tăng hệ số nhân chồi Đan sâm so với công thức đối chứng. Trong đó, môi trường MS+0,5mg/l BA cho hệ số nhân chồi (5,05 lần) và chiều cao chồi (4,08 cm) đạt cao nhất (Bảng 4.2). Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy BA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) 0,0 1,08 3,13 0,5 5,05 4,08 1,0 4,63 3,67 1,5 3,77 3,59 2,0 3,53 2,92 CV% 7,3 2,6 LSD0,05 0,32 0,31 Hệ số nhân chồi Đan sâm trên môi trường bổ sung kinetin dao động từ 2,58 đến 3,04 lần so với 1,08 lần trên môi trường đối chứng. Tuy nhiên sự khác biệt về chiều cao chồi Đan sâm giữa các công thức môi trường có bổ sung kinetin là không rõ rệt (Bảng 4.3). Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy Kinetin (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) 0,0 1,08 3,13 0,5 2,58 3,83 1,0 2,58 3,24 1,5 2,62 3,42 2,0 3,04 3,67 CV% 7,1 10,1 LSD0,05 0,3 0,3 12 Bổ sung kinetin (từ 0,1 – 0,5 mg/l) vào môi trường MS + 0,5 mg/l BA đã làm giảm hệ số nhân chồi cũng như chiều cao chồi cây Đan sâm (Bảng 4.4). Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy BA (mg/l) Kinetin (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) 0,5 0,0 5,05 4,08 0,1 3,17 3,56 0,2 2,73 3,15 0,3 2,77 2,67 0,4 2,57 3,11 0,5 2,57 3,36 CV% LSD0,05 3,0 5,2 0,15 0,11 Bổ sung kết hợp 0,5 mg/l BA và α-NAA ở nồng độ 0,01 – 0,1 mg/l đã làm giảm hệ số nhân chồi cũng như chất lượng chồi Đan sâm. Trong các công thức kết hợp giữa BA và α-NAA, hệ số nhân chồi đạt cao nhất là 3,37 lần ở công thức bổ sung kết hợp 0,5 mg/l BA và 0,01 mg/l α-NAA, tuy nhiên, hệ số nhân này thấp hơn công thức đối chứng chỉ bổ sung 0,5 mg/l BA (5,05 lần). Tương tự như trong trường hợp bổ sung kết hợp BA và kinetin, bổ sung BA và α-NAA đã làm giảm chiều cao chồi Đan sâm (Bảng 4.5). Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy BA (mg/l) α-NAA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) 0,5 0,00 5,05 4,08 0,01 3,37 3,58 0,025 2,93 2,99 0,05 3,16 2,96 0,075 3,13 2,97 0,10 2,36 3,05 CV% LSD0,05 3,0 3,0 0,15 0,17 Như vậy, môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi Đan sâm là MS + 0,5 mg/l BA, cho hệ số nhân chồi đạt 5,05 lần, chiều cao chồi đạt 4,08 cm, các chồi sinh trưởng, phát triển tốt. 4.1.3. Tạo cây hoàn chỉnh Trong quá trình nuôi cấy trong ống nghiệm, ngoài một số rất ít các chồi có thể hình thành rễ, còn lại là hầu hết đều chưa có rễ. Để cây thích nghi với điều kiện tự nhiên bên ngoài được thuận lợi phải sử dụng các biện pháp kích thích cho chồi ra rễ. Một số nghiên cứu cho thấy rằng đối với một số loài cây “khó” ra rễ in vitro hoặc “chậm” hình thành rễ trên môi trường MS thì nền môi trường giảm đi một nửa (½ MS) sẽ kích thích hình thành rễ nhanh hơn. Ngoài ra, bổ sung vào môi trường nuôi cấy chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin hoặc than hoạt tính cũng giúp nâng cao hiệu quả ra rễ của chồi in vitro. Trong nghiên cứu này, các chồi Đan sâm có chiều cao 2-3 cm, sinh trưởng phát triển bình thường được cấy chuyển sang môi trường ½ MS bổ sung α-NAA, IAA, IBA để cảm ứng tạo rễ. 13 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của α-NAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy α-NAA (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (cm) 0,00 100,00 2,40 4,23 0,10 79,17 2,84 6,15 0,25 79,17 3,37 7,06 0,50 92,31 3,04 5,33 0,75 76,92 2,90 5,22 1,00 73,08 3,47 3,8 CV% 3,8 1,7 LSD0,05 0,21 0,16 Ghi chú: môi trường nền là ½ MS Chồi Đan sâm có thể tạo rễ trên môi trường nền MS với tỷ lệ 100%. Tuy nhiên số rễ/cây thấp (2,4 rễ), rễ ngắn (4,23 cm). Bổ sung α-NAA vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng số rễ/cây và chiều dài rễ trung bình so với công thức đối chứng với số rễ/cây đạt dao động từ 2,84 (0,1 mg/l α-NAA) đến 3,47 rễ (1,0 mg/l α-NAA) và chiều dài rễ TB đạt từ 3,8 (1,0 mg/l α-NAA) đến 7,06 cm (0,25 mg/l α-NAA) (Bảng 4.6). Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của IBA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy IBA (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ TB (rễ) Chiều dài TB rễ (cm) 0,00 100,00 2,40 4,23 0,10 91,67 3,50 6,30 0,25 100,00 3,88 5,26 0,50 100,00 3,65 7,24 0,75 87,50 3,45 4,16 1,00 84,62 3,10 6,30 CV% 4,2 2,0 LSD0,05 0,25 0,2 Ghi chú: môi trường nền là ½ MS Bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy đã cải thiện chất lượng bộ rễ cây Đan sâm. So với công thức đối chứng, số rễ trung bình/cây trên môi trường bổ sung IBA đạt được cao hơn (3,1-3,88) rễ và rễ dài hơn (từ 4,16-7,24 cm). So với α-NAA, bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ chồi ra rễ cao hơn. Tỷ lệ chồi ra rễ đạt cao nhất (100%) trên môi trường bổ sung 0,25 hoặc 0,5 mg/l IBA (Bảng 4.7). Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của IAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy IAA (mg/l) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ TB (rễ) Chiều dài TB rễ (cm) 0,0 100 2,40 4,23 0,1 100 3,71 8,63 0,25 100 3,69 9,65 0,5 100 4,25 11,03 0,75 100 6,19 9,29 1,0 100 5,62 9,02 CV% 2,8 1,2 LSD0,05 0,22 0,19 Ghi chú: môi trường nền là ½ MS 14 Trên môi trường bổ sung IAA, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, số rễ TB đạt 3,69 – 6,19 rễ và chiều dài rễ dao động từ 8,63 đến 11,03 cm sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.8). Như vậy, môi trường thích hợp nhất để tạo rễ cho chồi là MS bổ sung 0,75 mg/l IAA cho 100% với số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt 9,29 cm. 4.1.4. Thích nghi cây ngoài vƣờn ƣơm Thời gian nuôi cấy trên môi trường ra rễ có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cây Đan sâm cấy mô khi ra cây ngoài vườn ươm. Cây in vitro nuôi cấy trên môi trường ra rễ 30 và 40 ngày có tỷ lệ sống 100%, trong khi đó cây non hơn (20 ngày nuôi cấy trên môi trường ra rễ) có tỷ lệ sống thấp hơn (90%) (Bảng 4.9). Xét về hiệu quả kinh tế của quy trình nuôi cấy, cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày tuổi là thích hợp để đưa ra thích nghi ngoài vườn ươm. Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy cây in vitro trên môi trƣờng ra rễ đến tỷ lệ sống của cây con ngoài vƣờn ƣơm trên giá thể xơ dừa: cát (1:1) sau 4 tuần Thời gian nuôi cấy (ngày) Tỷ lệ cây sống (%) Chiều cao cây (cm) Số lá Chất lượng cây 20 90 4,18 7,07 Cây và lá nh , lá màu xanh nhạt 30 100 4,32 9,33 Cây mập, lá to, lá màu xanh đậm 40 100 5,93 9,40 Cây cao, mập, lá to, lá màu xanh đậm CV% 3,4 3,6 LSD0,05 0,38 0,89 Tỷ lệ sống của cây Đan sâm dao động rất lớn giữa các giá thể khác nhau. Tỷ lệ cây sống đạt cao nhất (100%) trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát. Khi giảm lượng xơ dừa trong giá thể thì tỷ lệ cây sống cũng giảm theo, chỉ đạt 93,33% trên giá thể xơ dừa: cát (3:7) và 80% trên giá thể cát. Đặc biệt, tỷ lệ cây sống giảm rất mạnh khi trồng trên giá thể có chứa đất (36,67 – 46,67%), cây sinh trưởng, phát triển chậm (Bảng 4.10). Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây Đan sâm 30 ngày tuổi Giá thể Tỷ lệ cây sống (%) Chiều cao cây (cm) Số lá Nhận xét Cát 80,00 3,65 7,97 Cây cao, mập, bộ lá phát triển, phiến lá to, lá màu xanh đậm Đất: cát (3:7) 46,67 3,42 3,40 Cây và bộ lá phát triển trung bình, phiến lá to, màu xanh đậm Đất: cát (1:1) 36,67 3,33 2,87 Cây và bộ lá phát triển kém, phiến lá nh , màu xanh nhạt Xơ dừa: cát (3:7) 93,33 3,34 9,27 Cây cao, mập, bộ lá phát triển, phiến lá to, lá màu xanh đậm Xơ dừa: cát (1:1) 100 5,31 9,07 Cây cao, mập, bộ lá phát triển, phiến lá to, lá màu xanh đậm CV% LSD0,05 3,0 4,0 15 Như vậy, cây in vitro cần nuôi cấy trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích hợp để chuyển ra ngoài vườn ươm. Giá thể thích hợp để ươm cây in vitro là cát + xơ dừa (tỷ lệ 1:1), cho tỷ lệ cây sống đạt 100%, cây sinh trưởng, phát triển kh e mạnh. 4.2. TẠO DÒNG RỄ TƠ VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ IN VITRO CÂY ĐAN SÂM 4.2.1. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm Sau 4 tuần lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes tại nồng độ dịch khuẩn tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2, đoạn thân và cuống lá Đan sâm hoàn toàn không tạo rễ, trong khi đó, mô lá cho tỷ lệ tái sinh tạo rễ tơ với tỷ lệ 53,85%, số rễ trung bình đạt 8,54 rễ/mẫu (Bảng 4.11, Hình 4.1). Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ Đan sâm sau 4 tuần Vật liệu Tỷ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu (rễ) Mô lá 53,85 8,54 Cuống lá 0 0 Đoạn thân 0 0 Hình 4.1. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm: A: mô lá; B: cuống lá; C: đoạn thân. 4.2.2. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ mô lá Đan sâm Có sự khác nhau về tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu khi lây nhiễm mô lá Đan sâm với vi khuẩn ở các mật độ khác nhau tương ứng với các giá trị OD600 = 0,05; 0,1; 0,2 và 0,3. Tỷ lệ mô lá tạo rễ (53,85%) và số rễ/mẫu (8,54 rễ) đạt cao nhất khi mật độ vi khuẩn ở giá trị OD600 = 0,2 (Bảng 4.12, Hình 4.2). Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ mô lá Đan sâm OD600 Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu (rễ) 0,05 18,18 0,52 0,1 23,53 0,94 0,2 53,85 8,54 0,3 25,00 2,33 Hình 4.2. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ mô lá Đan sâm Nghiên cứu đã thu được 4 dòng rễ tơ chuyển gen sau khi kiểm tra sự có mặt của gen rolA và virD bằng phương pháp PCR trong 10 dòng rễ thu nhận được sau lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes. Qua khảo sát nhận thấy, các dòng rễ tơ này tăng sinh khối nhanh, ổn định trong môi trường nuôi cấy không chứa chất điều tiết sinh trưởng. 4.2.3. Ảnh hƣởng của thành môi phần môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Trong hai môi trường khảo sát là MS và B5, môi trường B5 là thích hợp để nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm, cho sinh khối rễ cao hơn so với môi trường MS (Bảng 4.13). A B C OD600 = 0,2 OD600 = 0,3 16 Do vậy B5 được lựa chọn làm môi trường nên để nhân nuôi rễ tơ Đan sâm ở những thí nghiệm sau. Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy Môi trường Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi sau 4 tuần (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) MS 0,55 3,25 5,90 0,297 B5 0,57 4,34 7,61 0,373 CV% 2,2 4,6 LSD0,05 0,19 0,034 4.2.4. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Tốc độ tăng trưởng rễ tơ trên môi trường rắn cao nhất, theo sau là môi trường bán l ng; l ng, tĩnh và kém nhất là trạng thái môi trường phân lớp với khối lượng rễ tăng lần lượt là 7,67; 3,67; 3,08 và 2,83 lần so với khối lượng rễ ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.14). Bảng 4.14. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy Trạng thái môi trường Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi sau 4 tuần (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) Rắn 0,57 4,34 7,67 0,37 Bán l ng 0,69 2,53 3,67 0,14 L ng, tĩnh 0,73 2,25 3,08 0,11 Phân lớp 0,77 2,18 2,83 0,11 CV% 4,2 3,7 LSD0,05 0,33 0,02 Như vậy, môi trường đặc là thích hợp cho nhân nuôi thu sinh khối rễ tơ Đan sâm. 4.2.5. Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Trong các loại bình nuôi cấy, khối lượng rễ tơ tăng đạt cao nhất (15,90 lần) khi nuôi cấy trong bình tam giác 500 ml, theo sau là túi nilon với khối lượng rễ tăng 14,70 lần sau 10 tuần nuôi cấy, khối lượng rễ tơ tăng đạt thấp nhất (9,70 lần) khi nuôi cấy rễ trong bình chữ nhật 750 ml (Bảng 4.15). Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của các loại bình nuôi đến sự tăng sinh khối rễ tơ dòng A5.14 sau 10 tuần nuôi cấy Loại bình Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi sau 10 tuần (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) Bình trụ 250 ml 0,84 11,97 14,25 0,703 Bình tam giác 500 ml 0,83 13,12 15,90 0,837 Bình chữ nhật 750 ml 0,85 8,25 9,70 0,547 Túi nilon 13 x 25 cm 0,85 12,95 14,70 0,757 CV% 1,5 4,3 LSD0,05 0,38 0,06 17 Do sự khác biệt không đáng kể về khối lượng rễ khi nuôi cấy trong túi nilon, bình tam giác cũng như bình trụ, có thể sử dụng túi nilon để nuôi cấy rễ tơ Đan sâm để nâng cao hiệu quả kinh tế khi sản xuất ở quy mô lớn. 4.2.6. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ Đan sâm A5.14 Trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau, nuôi cấy rễ tơ ở điều kiện 16h sáng/8h tối trong 8 tuần (CT2) cho sinh khối rễ tơ đạt cao nhất (Bảng 4.16). Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy Điều kiện chiếu sáng Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) 8 tuần tối hoàn toàn (CT1) 0,73 8,61 11,80 0,573 8 tuần 16h sáng - 8 h tối (CT2) 0,72 10,67 14,82 0,643 3 tuần CT2 - 5 tuần CT1 (CT3) 0,71 7,55 10,63 0,530 4 tuần CT2 - 4 tuần CT1 (CT4) 0,73 9,62 13,19 0,660 5 tuần CT2 - 3 tuần CT1 (CT5) 0,72 8,61 11,96 0,580 CV% 3,6 2,8 LSD0,05 0,58 0,03 Tuy nhiên, hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone và tanshinone I tích lũy trong rễ sau 8 tuần nuôi cấy đạt thấp ở CT2, tương ứng 0,061% và 0,056% chất khô. Ngược lại, hàm lượng các hoạt chất này tích lũy cao nhất khi nuôi cấy rễ ở điều kiện 3 tuần 16h sáng/8h tối và 5 tuần tối hoàn toàn (CT3) với hàm lượng cryptotanshinone đạt 0,754% và hàm lượng tanshinone I đạt 0,257% chất khô. Trong khi đó, hàm lượng tanshinone IIA đạt cao nhất (0,145% chất khô) khi nuôi cấy ở điều kiện 4 tuần 16h sáng/8h tối và 4 tuần tối hoàn toàn (CT4) và đạt thấp nhất (0,072% chất khô) khi nuôi cấy rễ tơ 8 tuần trong tối hoàn toàn (CT1) (Bảng 4.17). Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy Công thức Cryptotanshinone (% chất khô) Tanshinone I (% chất khô) Tanshinone IIA (% chất khô) 8 tuần tối hoàn toàn (CT1) 0,074 0,132 0,072 8 tuần 16h sáng - 8 h tối (CT2) 0,061 0,056 0,075 3 tuần CT2 - 5 tuần CT1 0,754 0,257 0,141 4 tuần CT2 - 4 tuần CT1 0,134 0,210 0,145 5 tuần CT2 - 3 tuần CT1 0,137 0,172 0,101 4.2.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm Khối lượng rễ tơ Đan sâm tăng tuyến tính từ tuần thứ 2 và đạt cực đại vào tuần thứ 8. Sau 8 tuần nuôi cấy, khối lượng rễ tươi tăng 13,96 lần. Tuy nhiên, sau 10 tuần 18 nuôi cấy, sinh khối rễ tươi giảm so với tuần thứ 8, chỉ còn 12,40 lần (Bảng 4.18). Như vậy, thời điểm dừng nuôi cấy rễ tơ Đan sâm thích hợp là 8 tuần sau nuôi cấy. Bảng 4.18. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Thời gian nuôi cấy Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) 2 tuần 0,71 1,69 2,38 0,107 4 tuần 0,72 3,73 5,18 0,327 6 tuần 0,71 7,38 10,40 0,490 8 tuần 0,72 10,05 13,96 0,617 10 tuần 0,72 8,93 12,40 0,593 CV% 1,3 3,4 LSD0,05 0,14 0,026 4.2.8. Ảnh hƣởng của một số chất điều tiết sinh trƣởng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, tốc độ tăng trưởng của rễ Đan sâm trên môi trường bổ sung phối hợp BA và TDZ/ABA thấp hơn so với tốc độ tăng trưởng của rễ Đan sâm trên môi trường đối chứng (B5) (Bảng 4.19). Bảng 4.1 . Ảnh hƣởng của tổ hợp của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Môi trường Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi sau 8 tuần nuôi cấy (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) B5 0,75 7,33 9,77 0,51 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA 0,74 6,94 9,38 0,50 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA 0,74 4,37 5,90 0,41 CV% 4,4 3,9 LSD0,05 0,31 0,033 Hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA trong rễ tơ Đan sâm nuôi cấy trên môi trường có bố sung tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng đều thấp hơn so với công thức đối chứng không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng (Bảng 4.20). Bảng 4.20. Ảnh hƣởng của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường Cryptotanshinone (% chất khô) Tanshinone I (% chất khô) Tanshinone IIA (% chất khô) B5 0,466 0,153 0,203 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA 0,039 0,109 0,125 B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA 0,072 0,085 0,158 19 4.2.9. Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tổng hợp hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 Sinh khối rễ tơ đạt được trên môi trường bổ sung elicitor cao hơn so với trên môi trường đối chứng không bổ sung elicitor. Cụ thể, sinh khối rễ tươi Đan sâm trên môi trường chứa elicitor tăng từ 7,37 đến 8,66 lần, trong khi đó sinh khối rễ Đan sâm trên môi trường đối chứng tăng 7,13 lần. Sinh khối rễ Đan sâm đạt cao nhất trong trường hợp bổ sung 100 mg/l YE + 0,1 mM ABA, tăng 8,66 lần sau 39 ngày nuôi cấy (Bảng 4.21). Bảng 4.21. Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14 (sau 3 ngày nuôi cấy) Công thức Khối lượng rễ ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi sau 39 nuôi cấy (g) Khối lượng rễ tăng (lần) Khối lượng rễ khô (g) B5 0,70 4,99 7,13 0,35 B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol 0,69 5,09 7,37 0,36 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic 0,70 6,03 8,61 0,44 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate 0,70 5,89 8,42 0,43 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít abscisic 0,69 5,97 8,66 0,46 CV% 3,7 4,1 LSD0,05 0,26 0,013 Kết quả phân tích hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA ở bảng 4.22 cho thấy, bổ sung các elicitor vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng hàm lượng hoạt chất mục tiêu tích lũy trong rễ tơ Đan sâm so với môi trường đối chứng không bổ sung elicitor. Bảng 4.22. Ảnh hƣởng của các elicitor đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu dòng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy Môi trường Cryptotanshinone (% chất khô) Tanshinone I (% chất khô) Tanshinone IIA (% chất khô) B5 0,126 0,082 0,113 B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol 0,227 0,106 0,141 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic 0,161 0,098 0,108 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate 0,549 0,230 0,213 B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít abscisic 0,221 0,094 0,103 4.3. NGHIÊN CỨU CÁC BIỆN PHÁP KỸ THUẬT TRONG SẢN XUẤT NÂNG CAO NĂNG SUẤT CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM Đan sâm được di thực vào Việt Nam từ vài chục năm trước và được Viện Dược liệu trồng ở trại thuốc Sa Pa. Sau đó, cây Đan sâm được trồng thử nghiệm tại 20 nhiều vùng có điều kiện sính thái, khí hậu khác nhau như Phú Thọ, Thanh Hóa, Tam Đảo, Sapa, Hà Nộisử dụng rễ củ làm vật liệu nhân giống. Nghiên cứu này tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của một số biện pháp kỹ thuật như thời vụ trồng, mật độ trồng, phân bón, thời điểm thu hoạch đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất cũng như chất lượng dược liệu của cây Đan sâm nguồn gốc nuôi cấy mô. Các kết quả thu được sẽ góp phần xây dựng quy trình kĩ thuật trồng cây Đan sâm tại Hà Nội nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao, cho chất lượng dược liệu tốt. 4.3.1. Ảnh hƣởng của thời vụ đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất, chất lƣợng dƣợc liệu cây Đan sâm Có sự sai khác có ý nghĩa của các chỉ tiêu cấu thành năng suất như số củ/cây, chiều dài củ, đường kính củ và khối lượng củ/cây giữa các thời vụ trồng cây Đan sâm thí nghiệm. Trong 6 thời vụ trồng, thời vụ tháng 3 cho số củ có đường kính lớn hơn 6 mm /cây (12,2 củ), chiều dài củ (29,2 cm), đường kính củ (2,7 cm) và khối lượng củ/cây (300 g) đạt cao nhất ở mức có ý nghĩa so với các công thức còn lại. Thời vụ tháng 3 cũng là thời vụ cho năng suất thực thu đạt cao nhất (3,35 tấn/ha). Theo sau là các thời vụ tháng 2, tháng 1, tháng 4, tháng 5 và thấp nhất ở mức sai khác có ý nghĩa về năng suất là tháng 6 chỉ đạt 1,92 tấn/ha. Đặc biệt khi trồng cây vào tháng 6, tất cả các chỉ tiêu cấu thành năng suất đều đạt thấp nhất với 7,2 củ/cây, chiều dài củ 19,3 cm, đường kính củ 1,8 cm, khối lượng lượng củ/cây 177 g nên tạo năng suất thực thu thấp nhất (Bảng 2.23). Về tỷ lệ tươi/khô, kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với cây đan sâm tỷ lệ tươi/khô biến động từ 3,4 - 4. TV3 cây sinh trưởng tốt nhất nên cho tỷ lệ tươi/khô cao nhất đạt 4 lần. Bảng 4.23. Ảnh hƣởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dƣợc liệu Đan sâm Thời vụ Số củ/cây (củ có đường kính> 6 mm) Chiều dài củ (cm) Đường kính củ (cm) Khối lượng củ/cây (g) Tỷ lệ tươi/khô (%) Năng suất thực thu (tấn/ha) TV1 8,1 23,0 2,0 254,0 3,4 2,76 TV2 9,9 25,8 2,4 275,0 3,8 3,11 TV3 12,2 29,2 2,7 300,0 4,0 3,35 TV4 8,9 23,6 2,1 234,0 3,5 2,52 TV5 8,1 21,0 2,0 215,0 3,4 2,25 TV6 7,2 19,3 1,8 177,0 3,4 1,92 CV% 7,3 3,7 4,3 4,0 5,0 LSD0,05 1,2 1,61 0,17 17,5 0,24 Cả ba hoạt chất phân tích đều tích lũy cao nhất khi trồng cây ở thời vụ tháng 3. Cụ thể, hàm lượng cryptotanshinone đạt 0,221%, hàm lượng tanshinone đạt 0,070% và hàm lượng tanshinone IIA đạt 0,247% chất khô (Bảng 4.24). 21 Như vậy, trong sáu thời vụ trồng khảo sát, thời vụ trồng tháng 3/2014 cho cây Đan sâm sinh trưởng, phát triển, năng suất và tích lũy hoạt chất mục tiêu cao nhất. Do vậy, trong sáu thời vụ khảo sát, tháng 3 là thời vụ trồng cây Đan sâm thích hợp tại Gia Lâm - Hà Nội. 4.3.2. Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất dƣợc liệu Đan sâm Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ trồng tới các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất củ Đan sâm được thể hiện qua bảng 4.25. Bảng 4.25. Ảnh hƣởng của mật độ trồng đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm CT Mật độ (cây/m 2 ) Số củ/cây (củ có đường kính> 6 mm) Chiều dài củ (cm) Đường kính củ (cm) Khối lượng củ/cây (g) Năng suất (tấn/ha) CT1 13 8,1 20,5 1,9 231,7 2,65 CT2 11 9,4 24,2 2,2 279,3 2,90 CT3 9 10,9 27,6 2,5 315,7 3,00 CT4 8 12,0 32,2 2,7 327,3 2,71 CT5 7 11,5 31,5 2,6 337,6 2,58 CV% 5,3 4,9 4,2 4,8 5,0 LSD0,05 1,0 2,5 0,19 26,9 0,16 Số củ/cây, chiều dài củ, đường kính củ và khối lượng củ/cây đạt cao nhất khi trồng cây Đan sâm ở mật độ từ 7-9 cây/m2. Tăng thêm mật độ trồng (11 -13 cây/m2) các chỉ tiêu về số củ, chiều dài, đường kính và khối lượng củ càng giảm. Cụ thể, trồng Đan sâm ở mật độ 13 cây/m2 (30 x 25 cm), số củ có đường kính > 6 mm chỉ đạt 8,1 củ, chiều dài củ đạt 20,5 cm, đường kính củ đạt 1,9 cm và khối lượng củ/cây đạt 231,7 g. Trong khi đó, các chỉ tiêu này đạt cao hơn ở các khoảng cách trồng thưa hơn và đạt cao nhất mật độ trồng 8 cây/m2. Các chỉ tiêu số củ/cây, đường kính củ ở hai mật độ 7 và 8 cây/m2 là sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Kết quả tính toán năng suất thực thu của các công thức thí nghiệm cho thấy: Năng suất củ của công thức trồng với mật độ trông 11 cây/m2 (30 x 30 cm), và 9 cây/m 2 (30 x 35 cm) đạt cao nhất (2,90 tấn/ha và 3,00 tấn/ha), theo sau là công thức trồng với mật độ 8 cây/m2, đạt 2,71 tấn/ha tương đương với mật độ 13 cây/m2 và 7 cây/m 2 ở cùng mức sai khác (Bảng 4.27). Như vậy mật độ cho năng suất dược liệu Đan sâm đạt cao nhất là trồng cây với mật độ 9 và 11 cây/m2 tương đương với khoảng cách từ 30 x 30 cm và 30 x 35 cm. 4.3.3. Ảnh hƣởng của phân bón đến năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu Đan sâm Bón phân ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất củ Đan sâm. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.26 Số củ/cây (11,4 củ), chiều dài củ (25,4 cm), đường kính củ (2,3 cm) và khối 22 lượng củ (282,7 g) đạt cao nhất khi bón 2 tấn phân vi sinh, 90 kg N, 120 kg P2O5 và 90 kg K2O/ha (CT4). Đây cũng là công thức bón phân cho năng suất cao nhất, đạt 3,13 tấn/ha. Trong khi đó, nếu chỉ bón phân vi sinh mà không bón bổ sung phân NPK, năng suất củ Đan sâm chỉ đạt 1,91 tấn/ha (Bảng 4.26). Bảng 4.26. Ảnh hƣởng của phân bón đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm CT Số củ/cây (củ có đường kính > 6 mm) Chiều dài củ (cm) Đường kính củ (cm) Khối lượng củ/cây (g) Năng suất (tân/ha) CT1 6,7 18,6 1,7 180,3 1,91 CT2 8,4 21,0 2,0 212,0 2,30 CT3 9,6 23,5 2,2 242,3 2,75 CT4 11,4 25,4 2,3 282,7 3,13 CT5 9,8 23,6 2,1 242,0 2,77 CV% 7,1 4,0 5,6 3,9 3,5 LSD0,05 1,22 1,68 0,22 17,04 0,17 Từ kết quả trên có thể thấy, khi cây Đan sâm không được bón phân đầy đủ, cây không được cung cấp đủ chất dinh dưỡng, cây sinh trưởng, phát triển kém dẫn đến bộ rễ phát triển kém. Trong khi đó, nếu bón phân đầy đủ cho cây, cây phát triển cân đối, tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển và hình thành củ, củ lớn nhanh. Tuy nhiên, nếu bón phân quá nhiều sẽ thúc đẩy sự phát triển mạnh về thân lá, bộ rễ ăn nông, do vậy mà ảnh hưởng đến năng suất củ. Theo nghiên cứu của Chen et al. (1992), N, P, K đóng vai trò rất quan trọng sinh trưởng, phát triển, năng suất và tích lũy hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm. Hai thời điểm hấp thụ N và P cao nhất của cây Đan sâm là 90-100 ngày và 150-170 ngày sau khi trồng. Thời điểm đầu cây Đan sâm phát triển mạnh các bộ phận sinh dưỡng, trong khi đó thời điểm thứ 2 là thời kỳ lan rộng của rễ cây Đan sâm. Theo Han et al. (2005); Sheng (2006), Đan sâm là cây dược liệu có nhu cầu photpho cao, khối lượng củ Đan sâm tăng tỷ lệ thuận với lượng phân bón chứa photpho do hàm lượng photpho cao trong phân bón giúp hấp thu photpho từ trong đất. Trong khi đó ảnh hưởng của N đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dược liệu Đan sâm là do N có tác dụng kích thích quá trình quang hợp của lá (Han and Liang, 2005) và kéo dài rễ (Sheng, 2007). 4.3.3.1. Ảnh hưởng của phân bón đến chất lượng dược liệu đan sâm Hàm lượng cryptotanshinone đạt cao nhất (0,191%) khi bón phân ở liều lượng 90 N, 120 P và 90 K cho cây Đan sâm. sự tích lũy của hai hoạt chất tanshinone I và tanshinone IIA cũng có xu hướng tương tự. Hàm lượng tanshinone I (0,065%) và tanshinone IIA (0,245%) đạt được cao nhất ở công thức bón phân CT4 (Bảng 4.27). 23 Bảng 4.27. Ảnh hƣởng của phân bón đến sự tích lũy ba hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm sau trồng 10 tháng CT Cryptotanshinone (%) Tanshinone I (%) Tanshinone IIA (%) CT1 0,091 0,045 0,199 CT2 0,080 0,027 0,183 CT3 0,098 0,033 0,191 CT4 0,191 0,065 0,245 CT5 0,178 0,050 0,218 4.3.3.2. Ảnh hưởng của phân bón đến hiệu quả kinh tế trồng cây đan sâm Kết quả tính toán cho thấy, tại các công thức bón phân N, P, K cho lãi thuần thu được sau 10 tháng trồng đều cao hơn công thức đối chứng. Cụ thể, ở công thức chỉ bón 2 tấn phân vi sinh, thu nhập thuần là 123,245 triệu đồng, ở các công thức bón phân N, P, K, thu nhập thuần dao động từ 148,478 triệu đồng (CT2) đến 240,810 triệu đồng (CT4). Từ đó cho thấy việc sử dụng phân bón trong quá trình sản xuất dược liệu Đan sâm giúp nâng cao hiệu quả kinh tế một cách rõ rệt và liều lượng phân bón ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả kinh tế trồng cây Đan sâm. Trong các công thức bón phân, công thức bón 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha (CT4) cho thu nhập thuần đạt cao nhất (240,810 triệu đồng). Như vậy, phân bón có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển và năng suất dược liệu Đan sâm. Xét về hiệu quả kinh tế, việc bón phân cũng giúp làm tăng thu nhập thuẩn so với công thức không bón phân. Trong các công thức bón phân, công thức bón 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha là phù hợp nhất cho cây Đan sâm trong điều kiện Hà Nội. Bảng 4.28. Ảnh hƣởng của liều lƣợng phân bón đến hiệu quả kinh tế trồng cây Đan sâm Đơn vị: 1000 đồng CT Giống Phân bón Chi phí khác Tổng chi Năng suất thực thu (tấn/ha) Giá bán 1 kg khô Tổng thu Thu nhập thuần N P K Vi sinh CT1 55.555 0 0 0 16.000 50.000 121.555 1,91 120 229.200 107.645 CT2 55.555 300 240 427.5 16.000 55.000 127.522 2,30 120 276.000 148.478 CT3 55.555 600 480 855 16.000 58.000 131.490 2,75 120 330.000 198.510 CT4 55.555 900 480 855 16.000 61.000 134.790 3,13 120 375.600 240.810 CT5 55.555 1.200 600 1.140 16.000 64.000 138.495 2,77 120 332.400 193.905 Ghi chú: Cây giống (cây nuôi cấy mô): 5.000 đồng/cây; Phân vi sinh Sông Gianh: 8.000 đồng/kg; Phân đạm Phú Mỹ: 10.000 đồng/kg; Phân lân Phú Mỹ: 4.000 đồng/kg; Phân Kali Phú Mỹ: 9.500 đồng/kg; Giá một kg đan sâm khô tương đương là 120.000 đ/kg Như vậy, phân bón có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển và năng suất dược liệu Đan sâm. Xét về hiệu quả kinh tế, việc bón phân cũng giúp làm tăng thu nhập thuần so với công thức không bón phân. Trong các công thức bón phân, 24 công thức bón 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha là phù hợp nhất cho cây Đan sâm. PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 1. Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm cho hệ số nhân cao, chất lượng tốt, có khả năng ứng dụng rộng rãi với các thông số như sau: Sử dụng môi trường gieo hạt Đan sâm là MS + 1,0 mg/l GA, sau đó nhân nhanh chồi Đan sâm trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA đạt hệ số nhân chồi 5,05 lần. Tạo cây Đan sâm hoàn chỉnh thích hợp trong môi trường ½ MS + 0,75 mg/l IAA. Giá thể thích hợp để tiếp nhận cây Đan sâm ngoài vườn ươm là giá thể xơ dừa: cát (1:1) trong thời gian 30 ngày đạt tiêu chuẩn cây giống cao > 4 cm, có 9 lá sinh trưởng phát triển tốt và tỷ lệ sống 100%. 2. Nghiên cứu đã xác định được các vật liệu và điều kiện thích hợp để tạo và nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm: Xác định được mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ cây Đan sâm. Trong nồng độ dịch khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm thích hợp là B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate, trong điều kiện 16h sáng/8h tối, cho tốc độ tăng trưởng rễ trong thời gian nuôi cấy 8 tuần khối lượng rễ tăng lên 13,96 lần so với khối lượng ban đầu, tích lũy hoạt chất mục tiêu cao nhất. 3. Nghiên cứu đã xác định được một số các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu Đan sâm khi trồng trên đồng ruộng tại Hà Nội sử dụng cây giống có nguồn gốc nuôi cấy mô. Trồng cây Đan sâm vào tháng 3 với khoảng cách 30 cm x 35 cm, liều lượng phân bón là 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha cho cây sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất dược liệu cao. 5.2. ĐỀ NGHỊ 1. Ứng dụng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm vào sản xuất cây giống Đan sâm chất lượng cao ở các cơ sở sản xuất giống góp phần chủ động nguồn giống dược liệu Đan sâm trong nước. Đồng thời, tiến hành trồng sản xuất thử nghiệm cây Đan sâm có nguồn gốc nuôi cấy mô tại Hà Nội và các tỉnh lân cận. 2. Các dòng rễ tơ Đan sâm là nguồn vật liệu quý phục vụ nghiên cứu khoa học và sản xuất hợp chất thứ cấp. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn cơ chế phân tử liên quan đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu, từ đó có phương thức tác động để nâng cao hoạt chất mục tiêu hiệu quả. Đồng thời, thiết lập quá trình nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm ở quy mô lớn nhằm sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ đan sâm phục vụ nền công nghiệp dược liệu Việt Nam. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Lê Tiến Vinh, Ninh Thị Thảo, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy và Nguyễn Thị Phương Thảo (2014). Quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge). Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 12, số 5, trang 744-752. 2. Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy và Nguyễn Thị Phương Thảo (2015). Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 13, số 2, trang 251-258.