Tóm tắt Luận án Tiêu chuẩn hóa cao chiết từ cây xuyên tâm liên (andrographis paniculata (burm.f.) nees)

vào cao toàn phần và các hợp chất chính như AP, DP, NAG, chủ yếu là tác động kháng ung thư trên các dòng tế bào như ung thư gan, ung thư lympho máu ngoại vi,.... Một nghiên cứu ở Việt Nam bởi Hứa Thị Như Cẩm và cộng sự (2010) khảo sát thêm tác dụng kháng virus herpes in vitro trên dòng tế bào Vero. Chưa ghi nhận có nghiên cứu in vitro đối với hợp chất AP1. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Nguyên vật liệu: Dược liệu khô Xuyên tâm liên, lấy toàn cây bỏ rễ, được thu hái tại 3 vùng trồng: Đồng Tháp (tháng 01/2015), Đồng Nai (tháng 02/2016), và Phú Yên (tháng 02/2017). 3.1.2. Hóa chất và dung môi: Dung môi gồm: hexan, dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, methanol, acetonitril, ethanol 96 %, nước cất. Hóa chất gồm: vanillin, acid sulfuric, acid 3,5-dinitrobenzoic, diphospho pentoxid, than hoạt tính, natri tetraborat, natri dedocyl sulphat. Thuốc thử gồm: Kedde, MTT, trypan blue. 3.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu Cân phân tích, máy cô quay, máy HPLC, prep-HPLC, máy điện di mao quản, máy quang phổ UV-Vis, máy quang phổ IR, máy đo khối 7 phổ, máy đo phổ NMR, máy phân tích nhiệt vi sai, máy đọc ELISA, cột HPLC Gemini 3u C6-phenyl 110A (150 × 4,6 mm, 3 µm), cột prep- HPLC HiQ sil-10 KYATECH (21,2 × 250 mm, 10 µm). Nơi nghiên cứu: Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. HCM: Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường, Khoa Dược lý, Khoa Vi sinh, đạt tiêu chuẩn GLP-WHO và ISO/IEC 17025. Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM: Bộ môn Dược lý. Viện Pasteur TP. HCM. Viện Công nghệ Hóa học TP. HCM. 3.2. Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu của đề tài được tóm tắt như sau: Sơ đồ 0.1. Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu. 3.2.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên Chiết xuất: Lá Xuyên tâm liên chiết nóng với methanol ở 70 C, 8 cô thu hồi dung môi thu được cao đặc toàn phần. Phân lập: Cao methanol được pha loãng với cùng dung môi và tiến hành kết tinh lạnh để thu tủa thô andrographolid. Phần cao còn lại được lắc phân bố với n-hexan, cloroform, ethyl acetat thu được các phân đoạn. Các phân đoạn cao được phân lập tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thuận, dung môi khai triển theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan → dicloromethan → cloroform → ethyl acetat → methanol tùy vào phân đoạn, kiểm tra và theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng. Tinh chế: Tinh chế bằng sắc ký cột hoặc sắc ký điều chế. Xác định lại độ tinh khiết bằng HPLC và DSC trước khi đo phổ. Xác định cấu trúc: Bằng phổ UV, IR, MS, NMR so sánh với các tài liệu đã công bố. 3.2.2. Thử tác dụng sinh học in silico và in vitro trên nhóm một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên a. Thử tác dụng sinh học in silico Chọn 4 ligand là 4 diterpen lacton chính: AP, DP, NAG và AP1, kiểm tra các ligand đáp ứng luật 5 Lipinski. Chọn các protein mục tiêu cho 3 tác động: hạ đường huyết, kháng ung thư, kháng HIV. Tải cấu trúc 3D của ligand và protein từ ngân hàng dữ liệu và tiến hành redocking và docking để xác định mức độ tương tác và vị trí gắn kết. b. Thử tác dụng sinh học in vitro Chuẩn bị mẫu: 4 chất đánh dấu: AP, DP, NAG, AP1 và 5 phân đoạn cao H1→H5 tương ứng là cao toàn phần và cao có thành phần chính là các chất đánh dấu. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH: mẫu đối chứng dương là acid ascorbic, tiến hành phản ứng 30 phút, đo độ hấp thu ở 517 nm. Tính hoạt tính chống oxy hóa theo công thức: HTCO (%) = [(ODtrắng – ODthử)/ ODtrắng] × 100 9 Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử. Khảo sát hoạt tính độc tế bào: mẫu đối chứng dương là Paclitaxel 0,25 µM, thực nghiệm trên 3 dòng tế bào: ung thư vú (MDA), ung thư cơ vân (RDA), ung thư gan (HepG2). Đánh giá tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT, đo mật độ quang ở 570 nm. Tính tỷ lệ ức chế tăng trưởng theo công thức: % ức chế = 100% – (OD mẫu thử/ODmẫu chứng âm)  100% Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử. 3.2.3. Thiết lập chất đối chiếu andrographolid và 14-deoxy-11,12- didehydro andrographolid theo WHO và ASEAN a. Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu Phương pháp HPLC, đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 225 nm đối với andrographolid và 210 nm đối với 14-deoxy-11,12-didehydro andrographolid. - Mẫu chuẩn: CĐC USP/Phytolab trong methanol (200 µg/ml). - Mẫu thử: chất phân lập trong methanol (200 µg/ml). - Cột sắc ký: Gemini 3u C6 Phenyl 110A (150 × 4,6 mm, 3 µm). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, Thể tích tiêm: 20 µl, Nhiệt độ cột: 30 C. - Pha động: acetonitril − nước, chương trình gradient: Bảng 0.1. Chương trình dung môi theo thời gian. Thời gian (phút) Tỉ lệ dung môi (%) Acetonitril Nước 0 – 8 25 75 8 – 25 25 → 65 75 → 35 25 – 30 65 35 30 – 32 65 → 25 35 → 75 32 – 35 25 75 b. Thiết lập hồ sơ chất đối chiếu - Đánh giá đồng nhất lô: bằng phân tích ANOVA một yếu tố. - Đánh giá liên phòng thí nghiệm: tại 3 PTN độc lập (VKNT TP. HCM) 10 - Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố: theo hướng dẫn của ISO 13528, tính toán độ không đảm bảo đo. 3.2.4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton đã phân lập trong lá Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản a. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Mục tiêu: định lượng đồng thời 4 marker: AP, DP, NAG, AP1. - Cột sắc ký: Gemini 3u C6 Phenyl 110 A (150 × 4,6 mm, 3 µm). - Đầu dò: PDA (bước sóng tùy theo các chất). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, Thể tích tiêm: 10 µl, Nhiệt độ cột: 30 C. - Pha động: acetonitril − nước, chương trình gradient. Bảng 0.2. Chương trình dung môi định lượng đồng thời 4 marker. Thời gian (phút) Tỉ lệ dung môi (%) Acetonitril Nước 0 – 8 25 75 8 – 20 25→65 75→35 20 – 22 65 35 22 – 25 65→25 35→75 25 – 30 25 75 Thẩm định quy trình phân tích theo ICH 2005 và áp dụng định lượng 3 mẫu dược liệu Xuyên tâm liên từ 3 nguồn thu hái khác nhau. a. Phương pháp điện di mao quản Mục tiêu: Định lượng đồng thời 3 marker: AP, DP, NAG. - Cột mao quản: silica nung chảy (Le.f. 40 cm, i.d. 50 µm). - Đầu dò: UV (bước sóng 210 nm). - Tiêm áp suất: 50 mbar  5 s. - Đệm dinatri tetraborat (khảo sát 30, 35, 40, 45, 50 mM). - SDS (khảo sát 8,5; 10, 15, 20 mM). - pH (khảo sát 9,0; 9,5; 10). - Methanol (khảo sát 2,5; 5, 7,5 %). - Nhiệt độ cột (khảo sát 25, 30, 35 C). 11 - Điện thế (khảo sát 20, 25 kV). - Chất chuẩn nội (khảo sát kirenol, ginkgolid A, quercetin, rutin). Thẩm định quy trình phân tích theo ICH 2005 và áp dụng định lượng 3 mẫu dược liệu Xuyên tâm liên từ 3 nguồn thu hái khác nhau. 3.2.5. Thử tác dụng sinh học in vitro của cao Xuyên tâm liên, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên a. Thử tác dụng sinh học in vitro của cao Xuyên tâm liên Khảo sát một số điều kiện điều chế cao: dung môi (cloroform, methanol, n-hexan, ether dầu hỏa, ethyl acetat, cồn 96 %, dicloromethan), bộ phận dùng (lá, thân, toàn cây), nồng độ dung môi (ethanol 50, 70, 96 %), thời gian chiết: (1, 2, 3, 7 ngày). Khảo sát hoạt tính độc tế bào: mẫu đối chứng dương là Doxorubicin 0,25 µM, thực nghiệm trên dòng tế bào ung thư vú MDA- MB-231. Đánh giá tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT, đo mật độ quang ở 570 nm. Tính tỷ lệ ức chế tăng trưởng theo công thức: % ức chế = 100% – (OD mẫu thử/ODmẫu chứng âm)  100% Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử. b. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng HPLC Mục tiêu: định lượng đồng thời 4 marker: AP, DP, NAG, AP1. - Cột sắc ký: Gemini 3u C6 Phenyl 110 A (150 × 4,6 mm, 3 µm). - Đầu dò: PDA (bước sóng 210 nm). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, Thể tích tiêm: 10 µl, Nhiệt độ cột: 30 C. - Pha động: acetonitril − nước, chương trình gradient. Thẩm định quy trình phân tích theo ICH 2005. 12 Bảng 0.3. Chương trình dung môi định lượng đồng thời 4 marker. Thời gian (phút) Tỉ lệ dung môi (%) Acetonitril Nước 0 – 8 25 75 8 – 20 25 → 65 75 → 35 20 – 22 65 35 22 – 25 65 → 25 35 → 75 25 – 30 25 75 c. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên Các chỉ tiêu dự thảo: a) Tính chất: Cao đặc, thể chất sánh, màu xanh đen, vị đắng. b) Định tính: phải có phản ứng định tính của andrographolid, 14- deoxy-11,12-didehydroandrographolid. c) Độ ẩm: Không quá 20 %. d) Tro toàn phần: Không quá 4,0 %. e) Giới hạn kim loại nặng: Hàm lượng chì < 20 ppm. f) Giới hạn nhiễm khuẩn: Tổng số vi khuẩn hiếu khí Không quá 104 cfu/g Tổng số nấm men và nấm mốc Không quá 102 cfu/g Tổng số Enterobacteria Không quá 500 cfu/g E. coli Không được có/g Salmonella Không được có/10 g Staphylococcus aureus Không được có/g Pseudomonas aeruginosa Không được có/g g) Định lượng: Hàm lượng diterpen lacton không ít hơn 6,7 % tổng hàm lượng andrographolid (C20H30O5), neoandrographolid (C26H40O8), 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid (C20H28O4) và androgra panin (C20H30O3) tính trên chế phẩm nguyên trạng. 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên 13 4.1.1. Kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu Bảng 0.1. Kết quả kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu. Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Mô tả Theo DĐVN IV Đúng Vi phẫu Theo DĐVN IV Đúng Bột Theo DĐVN IV Đúng Định tính Sắc ký lớp mỏng Theo DĐTQ 2015 Đúng Độ ẩm Không quá 10 % Đạt (7,7 %) Tro không tan trong acid Không quá 2,0 % Đạt (0,9 %) Tỷ lệ lá Không ít hơn 30 % Đạt (40,1 %) Tạp chất Không quá 2 % Đạt (0,5 %) Chất chiết được trong dược liệu Chất chiết được trong ethanol 96 % Không ít hơn 8,0 % tính theo dược liệu khô kiệt Đạt (18,4 %) Định lượng Diterpen lacton toàn phần Không ít hơn 6,0 % tính theo C20H30O5 trên dược liệu khô kiệt Đạt (9,11 %) 4.1.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế một số diterpen lacton Kết quả phân lập 6 hợp chất diterpen lacton, gồm AP, DP, NAG, AP1, AP3, AP4, được ghi nhận như sơ đồ 3.1. Sơ đồ 0.1. Sơ đồ phân lập một số hợp chất diterpen lacton. 14 4.1.3. Xác định độ tinh khiết các chất phân lập Phương pháp SKLM: Tiến hành SKLM 6 chất phân lập được (AP, DP, NAG, AP1, AP3 và AP4), mỗi chất 3 hệ dung môi khác nhau. Sắc ký đồ SKLM cho thấy mỗi chất chỉ cho 1 vết có màu tím đặc trưng khi phun thuốc thử vanilin 1 % trong acid sulfuric đậm đặc Phương pháp HPLC-PDA: Trên SKĐ của các mẫu thử, các pic chính của mỗi chất đều có độ tinh khiết trên 95 %. Phương pháp DSC: kết quả như Bảng 3.10. Bảng 0.2. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập bằng DSC. Chất AP DP NAG AP1 AP3 AP4 Độ tinh khiết (%) 99,93 99,42 99,53 99,45 99,79 98,67 Điểm chảy (C) 235,56 208,28 168,72 98,85 200,47 172,07 4.1.4. Xác định cấu trúc các chất phân lập Thông qua kết quả biện giải phổ MS và NMR của các chất, kết hợp so sánh với các tài liệu đã công bố, đã xác định được AP là andrographolid, DP là 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid, NAG là neoandrographolid, AP1 là andrograpanin, AP3 là 14- deoxyandrographisid và AP4 là 14-deoxy-11,12-didehydroandro graphisid. Kết quả biện giải phổ chi tiết ở Bảng 3.11-3.16. 4.2. Thử tác dụng sinh học in silico và in vitro trên nhóm một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên 4.2.1. Thử tác dụng sinh học in silico a. Tác động hạ đường huyết Bảng 0.3. Năng lượng gắn kết của các ligand trên các protein liên quan đến tác động hạ đường huyết (kcal/mol). Ligand 3DDS 2QT9 2WLK Andrographolid −7,4 −7,6 −12,8 Neoandrographolid −8,2 −8,8 −12,9 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid −7,2 −8,8 −13,5 Andrograpanin −6,8 −7,6 −13 Glycogen phosphorylase (3DDS) có điểm số redocking thấp nhất trong các protein được chọn khảo sát nên được chọn làm protein mục 15 tiêu cho tác động hạ đường huyết. Trên 3DDS, neoandrographolid có khả năng gắn kết tốt nhất trong bốn hoạt chất và là hoạt chất tiềm năng nhất ức chế glycogen phosphorylase giúp hạ đường huyết. Ngoài ra, đề tài cũng khảo sát thêm điểm số docking trên 2 protein nữa là DPP4 (2QT9) và KATP (2WLK). b. Tác động kháng ung thư Bảng 0.4. Năng lượng gắn kết của các ligand trên các protein liên quan đến tác động kháng ung thư (kcal/mol). Ligand 1M17 3OVV 3CS9 Andrographolid −8,8 −8,2 −7,4 Neoandrographolid −8,6 −9,7 −9,1 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid −8,6 −9,0 −9,3 Andrograpanin −7,9 −8,7 −9,1 Tyrosin kinase Bcr-Abl (3CS9) có điểm số redocking tốt nhất trong các protein được chọn khảo sát. Trên 3CS9, khả năng gắn kết của 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid là vượt trội nhất. Ngoài ra, đề tài cũng khảo sát thêm điểm số docking trên 2 protein nữa là EGFR (1M17) và PKA/cAMP (3CS9), thì DP cũng cho kết quả rất tốt. c. Tác động kháng HIV Bảng 0.5 và 0.6. Năng lượng gắn kết của các ligand trên các protein liên quan đến tác động kháng HIV (kcal/mol). Ligand 1HVR 1VRT Andrographolid −8 −7,7 Neoandrographolid −9,4 −9 14-Deoxy-11,12-didehydroandrographolid −7,9 −8,9 Andrograpanin −7,6 −9,3 HIV protease (1HVR) có điểm số redocking tốt hơn HIV reverse transcriptase (1VRT), tuy nhiên đề tài vẫn khảo sát song song hai protein mục tiêu này. Neoandrographolid có tiềm năng ức chế HIV protease tốt nhất, còn trên reverse transcriptase thì andrograpanin cho kết quả docking tốt nhất. 4.2.1. Thử tác dụng sinh học in vitro a. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH 16 Bảng 0.7. Nồng độ IC50 của mẫu H1, H5 và acid ascorbic. Mẫu thử Phương trình tuyến tính R2 IC50 H1 ŷ = 0,0007x + 0,1331 0,9910 524,14 µg/ml H5 ŷ = 0,0012x + 0,0365 0,9657 386,25 µg/ml Acid ascorbic ŷ = 8,5490x + 4,9320 0,9995 5,27 µg/ml Trong các cao khảo sát, kết quả cho thấy chỉ có cao H1, H5 có hoạt tính đáng kể (HTCO > 50%). Từ đó, tiến hành khảo sát tiếp HTCO của các cao này ở các nồng độ khác nhau, kết quả IC50 như Bảng 3.30. b. Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú, ung thư cơ vân, ung thư gan Trên dòng tế bào ung thư vú MDA: Kết quả cho thấy tất cả các dịch chiết cao và chất chuẩn đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ sống của tế bào MDA. Trong đó, XA1 ở nồng độ từ 10 µM trở lên đã có tác động cao hơn hẳn chế phẩm Paclitaxel ở nồng độ 0,25 µM. Ở nồng độ 100 µg/ml, các phân đoạn cao cũng cho tác dụng giảm tỷ lệ sống cao và giảm dần tương ứng với sự giảm nồng độ. Bảng 0.8. Nồng độ IC50 của các mẫu thử trên dòng MDA. Mẫu thử H1 H2 H3 H4 H5 PTHQ 1,0871e0,0725x 5,2795e0,0442x 1,1889e0,0701x 8,6328e0,0408x 5,7076e0,039x R2 0,8367 0,7988 0,9722 0,9878 0,9882 IC50 (µg/ml) 40,78 48,12 39,55 66,38 40,11 Mẫu thử XA1 XA2 XD XN PTHQ 1,9993e0,0275x 23,789e0,025x 12,1370e0,0303x 8,6942e0,0767x R2 0,8402 0,9867 0,9568 0,8104 IC50 (µM) 7,91 83,02 55,21 402,48 Trên dòng tế bào ung thư cơ vân RDA: Kết quả cho thấy tất cả các dịch chiết cao và chất chuẩn đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ sống của tế bào RDA. Trong đó, XA1 ở nồng độ từ 25 µM trở lên có tác động cao hơn Paclitaxel nhưng không rõ rệt như ở tế bào MDA. Ở nồng độ 100 µg/ml, các phân đoạn cao cũng cho tác dụng giảm tỷ lệ sống tế bào MDA cao và giảm dần tương ứng với sự giảm nồng độ. Bảng 0.9. Nồng độ IC50 của các mẫu thử trên dòng RDA. Mẫu thử H1 H2 H3 H4 H5 PTHQ 8,1474e0,0306x 6,3703e0,0356x 3,0755e0,0503x 9,2768e0,0313x 3,5546e0,0419x R2 0,9956 0,9832 0,9991 0,9885 0,9979 IC50 (µg/ml) 37,62 37,77 38,02 44,36 28,88 17 Mẫu thử XA1 XA2 XD XN PTHQ 0,2462e0,0486x 10,779e0,0306x 0,714e0,0711x 9,7879e0,0570x R2 0,9851 0,9841 0,9822 0,9788 IC50 (µM) 2,80 49,77 24,97 169,2 Trên dòng tế bào ung thư gan HepG2: Kết quả cho thấy XA1 tiếp tục là chất có hoạt tính mạnh nhất trong các mẫu được khảo sát, tuy nhiên phân đoạn chứa XA1 là H1 lại không có hoạt tính ức chế mạnh như những dòng tế bào trước đó. Điều này có thể là do ngoài XA1 trong cao H1 còn có các thành phần khác có khả năng kìm hãm hoạt tính XA1 hoặc làm tăng sự phát triển của tế bào HepG2, cần phải có thêm các nghiên cứu để làm rõ vấn đề này. Bảng 0.10. Nồng độ IC50 của các mẫu thử trên dòng HepG2. Mẫu thử H1 H2 H3 H4 H5 PTHQ − 33,7385e0,0400x 4,2438e0,0370x − 28,0218e0,0221x R2 − 0,8812 0,9996 − 0,9454 IC50 (µg/ml) − 249,30 26,98 − 84,60 Mẫu thử XA1 XA2 XD XN PTHQ 2,3845e0,0406x 17,6675e0,0301x 3,1419e0,0502x 0,5204e0,1998x R2 0,9022 0,9111 0,8993 0,9590 IC50 (µM) 18,15 79,57 38,65 11348,52 Hoạt tính độc tế bào thường LLCPK1: Kết quả cho thấy tất cả các phân đoạn cao đều không gây độc tế bào bình thường, điều tương tự cũng xảy ra ở các chất chuẩn. Riêng XA1 ở nồng độ cao hơn 25 µM có xảy ra sự ức chế tế bào người phát triển. 4.3. Thiết lập chất đối chiếu andrographolid và 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolid theo WHO và ASEAN Kết quả thiết lập chất đối chiếu được trình bày ở Bảng 3.38 – 3.41. Hai hợp chất diterpen lacton không thiết lập chất đối chiếu, gồm NAG và AP1, đã được xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC- PDA, dùng cho xây dựng quy trình định lượng đồng thời các diterpen lacton bằng HPLC và CE. Các quy trình đều được thẩm định và đạt các yêu cầu theo ICH 2005. Kết quả như sau: - NAG: 101,25 % tính theo NAG chuẩn (PhytoLab). 18 - AP1: 99,55 % tính theo phương pháp 100% diện tích pic. Bảng 0.11 - 0.12. Kết quả thiết lập chất đối chiếu AP và DP. Thông số Andrographolid 14-deoxy-11,12-didehydro andrographolid Tính phù hợp hệ thống RSDTG lưu = 0,052 % RSDDT pic = 1,097 % RSDTG lưu = 0,022 % RSDDT pic = 1,129 % Tính đặc hiệu Đạt, Rt = 10,46 phút Đạt, Rt = 19,22 phút Tính tuyến tính PT hồi quy R2 = 0,9996 ŷ = 42101x R2 = 0,9995 ŷ = 53725x Độ lặp lại RSD = 0,65 % (6 mẫu) RSD = 0,37 % (6 mẫu) Độ tái lặp RSD = 0,66 % (18 mẫu) RSD = 0,73 % (18 mẫu) Độ đúng 98,9 – 99,8 % 98,02 – 101,34 % Khoảng xác định 120,06 – 280,13 (µg/mL) 121,84 – 284,30 (µg/mL) Giá trị ấn định 98,03 % 96,51 % Độ không đảm bảo đo 0,216 0,141 4.4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton đã phân lập trong lá Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản 4.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Quy trình phân tích đạt các yêu cầu thẩm định theo ICH 2005. Bảng 0.13. Tóm tắt kết quả thẩm định quy trình phân tích bằng HPLC. Chỉ tiêu AP NAG DP AP1 Tính phù hợp hệ thống RSD%TG lưu 0,68 0,11 0,15 0,10 RSD%DT pic 0,40 0,59 0,23 1,10 Tính đặc hiệu Yêu cầu Đạt Đạt Đạt Đạt Tính tuyến tính R2  1  1  1 0,9999 PTHQ ŷ = 34629x ŷ = 27267x ŷ = 44273x + 12799 ŷ = 41087x Khoảng TT 25,19 − 403,02 8,37 − 133,86 11,41 − 182,59 0,57 − 9,18 Độ lặp lại RSD% (6 mẫu) 4,08 1,26 3,82 1,17 Độ chính xác trung gian RSD% (12 mẫu) 3,05 1,20 4,44 1,09 Độ đúng % Phục hồi 96,42 − 97,63 97,09 − 100,78 101,54 − 103,55 95,16 − 98,19 RSD% 0,53 1,17 1,30 1,05 Miền giá trị (µg/mL) 157,85−395,91 46,09−112,60 84,07−174,48 3,51−8,03 19 Ứng dụng quy trình vào định lượng 3 mẫu dược liệu được thu hái tại 3 vùng trồng khác nhau: Tỉ lệ các diterpen lacton chính có sự khác nhau giữa các mẫu. Trong khi mẫu dược liệu đến từ Đồng Tháp và Đồng Nai có AP chiếm tỉ lệ cao nhất rồi đến DP, NAG thì mẫu dược liệu đến từ Phú Yên lại có DP chiếm tỉ lệ cao nhất rồi đến AP và NAG. Nhưng nhìn chung, cả AP và DP vẫn chiếm tỉ lệ cao trong dược liệu ở cả 3 vùng. Hàm lượng AP1 chiếm tỉ lệ rất thấp (dưới 0,05 %) trong dược liệu cả ba vùng, kết quả minh họa ở Hình 3.23. Hình 0.1. Biểu đồ so sánh hàm lượng các diterpen lacton từ dược liệu Xuyên tâm liên ở ba vùng. 4.4.2. Phương pháp điện di mao quản Kết quả khảo sát các điều kiện điện di cho thấy, điều kiện tối ưu để định lượng đồng thời ba chất đánh dấu AP, DP và NAG là: dung dịch đệm dinatri tetraborat 45 mM, SDS 8.5 mM, pH 10, methanol 5%, nhiệt độ 35 C, điện thế 25 kV và chất chuẩn nội rutin. Quy trình phân tích đạt các yêu cầu thẩm định theo ICH 2005. Bảng 0.14. Tóm tắt kết quả thẩm định quy trình phân tích bằng CE. Chỉ tiêu AP DP NAG Tính tương thích hệ thống RSD%TG lưu 0,98 2,27 2,19 RSD%Corr A 2,65 2,92 2,70 Tính đặc hiệu Yêu cầu Đạt Đạt Đạt 20 Tính tuyến tính R2 0,9992 0,9987 0,9984 PTHQ ŷ = 0,0084x + 0,5460 ŷ = 0,009x + 0,2135 ŷ = 0,0082x + 0,2494 Khoảng TT 200 – 600 75 – 300 50 – 250 Độ lặp lại RSD% (6 mẫu) 5,19 4,50 4,26 Độ chính xác trung gian RSD% (12 mẫu) 4,18 4,15 5,21 Độ đúng % Phục hồi 93,3 − 105,3 93,3 − 106,4 96,0 − 106,4 RSD% 3,71 3,78 4,20 Ứng dụng quy trình vào định lượng 3 mẫu dược liệu được thu hái tại 3 vùng trồng khác nhau: Kết quả ở Bảng 3.53 cho thấy, tổng hàm lượng của ba diterpen lacton trong dược liệu ở ba vùng đều cao và cao nhất là ở Đồng Nai, AP và DP đều chiếm tỉ lệ cao trong dược liệu ở cả ba vùng. Mẫu dược liệu từ Đồng Nai có hàm lượng AP cao nhất, trong khi đó mẫu Phú Yên có hàm lượng DP cao nhất. NAG chiếm tỉ lệ thấp hơn AP và DP trong dược liệu cả 3 vùng. Kết quả trên phù hợp với kết quả định lượng bằng phương pháp HPLC. Bảng 0.15. Bảng so sánh kết quả hàm lượng các chất trong dược liệu Xuyên tâm liên ở ba vùng khác nhau. Đồng Nai Phú Yên Đồng Tháp Hàm lượng AP (%) 4,38 1,37 2,16 Hàm lượng DP (%) 1,89 2,26 1,82 Hàm lượng NAG (%) 1,01 2,18 0,66 Tổng hàm lượng (%) 7,28 5,81 4,64 4.5. Thử tác dụng sinh học in vitro của cao Xuyên tâm liên, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên 4.5.1. Thử tác dụng in vitro của cao Xuyên tâm liên Kết quả khảo sát một số điều kiện chiết xuất cao cho thấy: chiết bằng dung môi ethanol 96 % cho lợi ích kinh tế và an toàn, đồng thời cũng thu được nhiều hoạt chất, với nồng độ ethanol là 96 %. Chọn bộ 21 phận chiết là lá để thu được nhiều diterpen lacton nhất. Thời gian chiết nên là 2 ngày với phương pháp ngấm kiệt. Cao Xuyên tâm liên đã được thử in vitro với tác dụng ức chế sự tăng trưởng của dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231. Kết quả cho thấy, cao Xuyên tâm liên thể hiện khả năng ức chế sự tăng trưởng của MDA-MB-231 với giá trị IC50 trung bình là 69,64 µg/ml. Đối với tế bào bình thường, cao Xuyên tâm liên không thể hiện hoạt tính độc tế bào LLC-PK1 ở các nồng độ 25, 50, 100 µg/ml; nhưng ở nồng độ 200 µg/ml, cao thử làm giảm khoảng 69,5% số lượng tế bào LLC-PK1 sống so với mẫu đối chứng âm (DMSO 0,4 %). Như vậy, bước đầu cho thấy cao Xuyên tâm liên thể hiện hoạt tính độc tế bào chọn lọc trên tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 ở các nồng độ khảo sát ≤ 100 µg/ml. 4.5.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng phương pháp HPLC Quy trình phân tích đạt các yêu cầu thẩm định theo ICH 2005. Bảng 0.16. Kết quả tóm tắt thẩm định phương pháp định lượng các diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên. Chỉ tiêu AP NAG DP AP1 Tính phù hợp hệ thống RSD%TG lưu 0,10 0,05 0,04 0,04 RSD%DT pic 0,18 0,17 0,19 0,67 Tính đặc hiệu Yêu cầu Đạt Đạt Đạt Đạt Tính tuyến tính R2 0,9999 0,9999 0,9999 0,9999 Khoảng TT 9,98 − 199,53 3,44 − 68,74 5,75 − 114,96 0,15 – 3,07 Độ lặp lại RSD% (6 mẫu) 1,50 1,43 1,47 0,79 Độ chính xác trung gian RSD% (12 mẫu) 1,27 1,48 1,30 0,80 Độ đúng % Phục hồi 98,42 − 100,66 98,17 − 101,47 98,24 − 101,20 94,84 − 100,60 RSD% 0,10 − 1,11 0,23 − 1,12 0,10 − 0,93 0,89 − 1,33 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng LOD (µg/ml) 3,69 1,02 1,93 0,05 LOQ (µg/ml) 11,19 3,08 5,84 0,15 22 4.5.3. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên Kết quả thực nghiệm dự thảo được trình bày trong Bảng 3.63. Bảng 0.17. Kết quả kiểm tra chất lượng cao Xuyên tâm liên. Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Mô tả Cao đặc, sánh, màu nâu, vị đắng. Đúng Định tính Sắc ký lỏng Sắc ký lớp mỏng Pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic andrographolid, 14-deoxy- 11,12-didehydroandrographolid, neoandro grapholid, andrograpanin trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết Rf và màu sắc giống với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu. Đúng Đúng Độ ẩm Không quá 20,0 % Đạt (13,07 %) Tro toàn phần Không quá 4,0 % Đạt (2,92 %) Giới hạn kim loại nặng (Pb) Không quá 20 ppm Đạt Định lượng Diterpen lacton toàn phần Không ít hơn 6,7 % tổng hàm lượng andro grapholid (C20H30O5), neoandrogra pholid (C26H40O8), 14-deoxy-11,12-didehydroandro grapholid (C20H28O4), và andrograpanin (C20H30O3) tính trên chế phẩm nguyên trạng Đạt (26,62 %) Giới hạn nhiễm khuẩn Tổng số vi khuẩn hiếu khí Tổng số nấm men và nấm mốc E. coli Salmonella Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Không quá 104 cfu/g Không quá 102 cfu/g Không được có/g Không được có/g Không được có/g Không được có/g Đạt 5. KẾT LUẬN Các kết quả thu được của luận án được tóm tắt như sau: ❖ Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên: Đã phân lập và xác định cấu trúc 6 hợp chất diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên, gồm: andrographolid (AP), 14-deoxy-11,12-didehydroandro grapholid (DP), neoandro grapholid (NAG), andrograpanin (AP1), 14- deoxyandrographisid (AP3) và 14-deoxy,11,12-didehydroandrogra phisid (AP4), kèm theo các dữ liệu phổ nghiệm đầy đủ, gồm UV, IR, MS và NMR. 23 ❖ Thử tác dụng sinh học in silico và in vitro trên nhóm một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên: - Khảo sát 3 hoạt tính: hạ đường huyết, kháng ung thư, kháng HIV đối với 4 ligand: AP, DP, NAG và AP1 trên các protein mục tiêu bằng phương pháp docking và redocking, để xác định các chất tiềm năng cho thử nghiệm in vitro tiếp theo. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH và hoạt tính chống ung thư in vitro bằng phương pháp MTT đối với 4 chất đánh dấu và 5 phân đoạn cao, trên 3 dòng tế bào: ung thư vú, ung thư cơ vân và ung thư gan. ❖ Thiết lập chất đối chiếu andrographolid và 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolid theo WHO và ASEAN: Thiết lập quy trình và hoàn thành hồ sơ chất đối chiếu cho 2 hợp chất diterpen lacton quan trọng trong cây Xuyên tâm liên, là andrographolid và 14-deoxy- 11,12-didehydroandro grapholid, đạt các yêu cầu theo tiêu chuẩn WHO và ASEAN. ❖ Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton đã phân lập trong lá Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời bằng HPLC cho 4 chất đánh dấu, gồm AP, DP, NAG và AP1; và quy trình định lượng đồng thời bằng CE cho 3 chất đánh dấu, gồm AP, DP và NAG, đạt các yêu cầu thẩm định theo ICH 2005. Các quy trình đã được áp dụng để định lượng và so sánh hàm lượng các diterpen lacton tương ứng trong mẫu dược liệu Xuyên tâm liên thu hái tại 3 vùng trồng khác nhau. ❖ Thử tác dụng sinh học in vitro của cao Xuyên tâm liên, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng phương pháp 24 HPLC và dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên: - Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư vú MDA đối với cao chiết Xuyên tâm liên đã điều chế. - Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời bằng HPLC cho 4 chất đánh dấu, gồm AP, DP, NAG và AP1 trong cao Xuyên tâm liên, đạt các yêu cầu thẩm định theo ICH 2005. - Đưa ra dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho cao Xuyên tâm liên. 6. KIẾN NGHỊ Một số kiến nghị: (1) Nghiên cứu động thái tích lũy theo mùa, thổ nhưỡng,... của các diterpen lacton trong các giai đoạn sinh trưởng của cây Xuyên tâm liên. (2) So sánh hàm lượng các diterpen lacton giữa các bộ phận dùng khác khác: rễ, thân, toàn cây. (3) Thử tác dụng sinh học in vivo cao Xuyên tâm liên. (4) Thiết lập quy trình điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Xuyên tâm liên để làm cao định chuẩn hướng tác dụng sinh học. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Lữ Thị Kim Chi, Huỳnh Tự Thuật, Nguyễn Ngọc Vinh: “Nghiên cứu phân lập andrographolid làm chất đối chiếu từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm. f) Nees.)”. Tạp Chí Dược Học. Số 503, tháng 3 - 2018. 2. Lê Nguyễn Trung Nguyên, Lữ Thị Kim Chi, Phan Thanh Dũng: “Xây dựng qui trình định lượng đồng thời các diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm. f) Nees.) bằng phương pháp HPLC”. Tạp Chí Y Học TP. HCM. Số 1, tháng 4 - 2018. 3. Hà Thị Thanh Nga, Lữ Thị Kim Chi, Phan Thanh Dũng: “Xây dựng qui trình định lượng đồng thời andrographolid, dehydroandro grapholid, neoandrographolid trong lá Xuyên tâm liên (Andro graphis paniculata (Burm. f) Nees.) bằng phương pháp HPLC”. Tạp Chí Y Học TP. HCM. Phụ bản tập 23. Số 2, tháng 2019. 4. Huỳnh Lê Trí Thiện, Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Thụy Việt Phương: “Nghiên cứu in silico hướng tác dụng dược lý trên nhóm chất diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm. f) Nees.)”. Tạp Chí Y Học TP. HCM. Phụ bản tập 23. Số 2, tháng 2019. 5. Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Trường Thịnh, Nguyễn Ngọc Vinh, Vĩnh Định: “Nghiên cứu phân lập 14-deoxy-11,12-didehydro andrographolid làm chất đối chiếu từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm. f) Nees.)”. Tạp Chí Y học Việt Nam. Tập 526. Tháng 5. Số 2 năm 2023.