Tóm tắt Luận văn Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường

1 Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường Nguyễn Đình Hải Trường Đại học Công nghệ Luận văn ThS. ngành: Công nghệ Nanô sinh học (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Đức Quang Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tiến hành phân loại đến cấp độ loài của chủng xạ khuẩn có tiềm năng được sử dụng trong việc phòng chống dịch bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam. Đã phối hợp các phương pháp phân loại khác nhau như phân loại hình thái, phân loại hóa sinh và di truyền học phân tử. Tiến hành thử nghiệm tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) và cho thấy chủng xạ khuẩn không gây hại cho các sinh vật trong môi trường sống. Keywords. Công nghệ sinh học; Bệnh bạc lá lúa; Sinh học; Công nghệ Nano Content CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra là một trong những bệnh gây hại chính ở Việt Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới. Bệnh đã gây giảm năng suất lúa gạo ở Châu Á lên tới 60% tổng năng suất lúa hàng năm [4,8]. Có rất nhiều biện pháp ngăn chăṇ sự bùng phát dịch bệnh như: chọn lọc và phát triển các dòng lúa mang các gene kháng bệnh, dùng chất hóa học để diệt trừ vi khuẩn gây bệnh, phòng trừ dịch hại tổng hợp [17]. Tuy nhiên, các biện pháp này vẫn chưa đem lại hiệu quả cao. Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc vào giới các vi khuẩn gram dương. Xạ khuẩn có những đặc điểm quý riêng biệt; đó là nguồn sản xuất tự nhiên các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học [20]. Gần đây người ta ước tính rằng cứ 10000 chất kháng sinh được khám phá ra từ các vi sinh vật, thì 2/3 các chất đó được sản xuất từ xạ khuẩn; và nhiều chất trong số đó là các thuốc kháng sinh đang được ứng dụng và sản xuất rộng rãi ngày nay. Các nghiên nhà cứu chỉ ra rằng: cứ 1000 chủng xạ khuẩn được phân lập một cách ngẫu nhiên, thì khoảng 10 chủng sẽ sinh streptomycin và 4 chủng sẽ sinh tetracycline [2,3]. Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn {những chủng này được phân lập ngẫu nhiên từ các mẫu đất của Việt Nam [14]} tại Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (Viện Vi Sinh và công nghệ 2 sinh học, ĐHQGHN) hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học mới dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam hiện nay. Vì thế, việc sử dụng xạ khuẩn và các chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra để khống chế sinh học (sử dụng cân bằng các vi sinh vật và các sản phẩm tự nhiên của chúng để kìm hãm, ức chế vi sinh vật gây bệnh do đó thúc đẩy cây trồng phát triển tốt hơn) và kiểm soát bệnh bạc lá lúa có triển vọng là một phương pháp hiệu quả và thân thiện về mặt sinh thái và môi trường. Xuất phát từ thưc̣ tiêñ trên , chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 – Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý dịch bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trƣờng”. 1.2. Mục đích của đề tài  Phân loại đến cấp độ loài của chủng xạ khuẩn có tiềm năng được sử dụng trong việc phòng chống dịch bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam.  Tiến hành thử nghiệm tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) để kiểm tra sự tương tác của chủng xạ khuẩn với các sinh vật trong môi trường sống. CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ 2.1. Tổng quan chung về xạ khuẩn 2.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 2.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 2.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 2.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 2.2. Các phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn 2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 2.2.2. Phân loaị hóa hoc̣ (Chemotaxonomy) 2.2.3. Đặc điểm hóa sinh 2.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 2.2.5. Phân loaị dƣạ trên triǹh tƣ ̣gene 16s rRNA 2.2.6. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 2.3. Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn 2.4. Bệnh bạc lá lúa và các biện pháp phòng trừ 2.5. Tình hình nghiên cứu kiểm soát bêṇh bằng biêṇ pháp sinh hoc̣ CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu 3.1.1. Chủng xạ khuẩn VN08A12 và sản phẩm lên men 3.1.2. Vi sinh vật kiểm định 3.1.3. Các chủng Xoo 3.1.4. Giống đỗ xanh thƣ̉ nghiêṃ nghiên cƣ́u 3.1.5. Chuột thí nghiệm 3.1.6. Môi trƣờng nghiên cứu 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Định loại chủng xạ khuẩn 3.2.1.1. Điṇh loại bằng đặc điểm sinh học 3.2.1.2 . Điṇh loại bằng các đặc tính hóa sinh 3.2.1.3. Phương pháp phân loaị dưạ trên trình tư ̣16S - rRNA 3 3.2.2. Chọn lọc môi trƣờng nuôi cấy phù hợp nhất cho khả năng sinh kháng sinh của VN08A12 3.2.3. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch lên men xạ khuẩn lên cây đậu xanh 3.2.4. Phƣơng pháp thử nghiệm ảnh hƣởng của dịch lên men xạ khuẩn lên chuột nuôi thí nghiệm CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân loại chủng xạ khuẩn VN08A12 4.1.1. Đặc điểm sinh học Chủng xạ khuẩn VN08A12 sinh trưởng tốt tạo khuẩn lạc chắc, xù xì màu nâu vàng và có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và ăn sâu vào thạch. Trên bề mặt khuẩn lạc quan sát thấy các giọt tiết nhỏ (hình 4.1.1.A). Sau khi cài lamel rồi soi dưới kính hiển vi quan sát, kết quả như hình 4.1.1B chủng VN08A12 có các chuỗi bào tử dài, có cả dạng thẳng và dạng xoắn (mỗi chuối xoắn có từ 2-7 vòng xoắn). Bào tử có khả năng di động. Hình 4.1.1. Hình thái học của chủng xạ khuẩn VN08A12 4.1.2. Đặc tính hóa sinh 4.1.2.1. Khả năng đồng hoá và sử dụng các nguồn carbon khác nhau Theo Shirling & Gottlieb (1966), khả năng đồng hóa và sử dụng các nguồn carbon khác nhau được đánh giá theo 4 mức: - Sử dụng mạnh nguồn carbon (++) khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường carbon kiểm tra bằng hoặc mạnh hơn trên môi trường đối chứng (+) chứa glucose. C. Chuỗi sợi nấm và bào tử Ảnh SEM ở 15KV x 3.500 thành 5μm D. Bề mặt bào tử Ảnh SEM ở 30 kv x 3.500 thành 1μm A. Khuẩn lạc VN08A12 B. Tế bào VN08A12 C. 4 - Có thể sử dụng nguồn carbon (+) khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường carbon kiểm tra mạnh hơn rõ rệt so với môi trường đối chứng (-) nhưng mà yếu hơn khi phát triển trên môi trường đối chứng (+). - Không xác định về khả năng sử dụng nguồn carbon (±) khi trên môi trường kiểm tra xạ khuẩn chỉ phát triển mạnh hơn môi trường đối chứng (-) một chút, không rõ ràng và kém hơn hẳn so với môi trường đối chứng (+). - Không sử dụng nguồn carbon (-) khi sự phát triển của xạ khuẩn trên môi trường kiểm tra ngang bằng hoặc kém hơn so với sự phát triển trên môi trường đối chứng (-). Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.2 và hình 4.1.2A. Bảng 4.1.2. Khả năng sử dụng các nguồn đƣờng khác nhau của VN08A12 Nguồn carbon Khả năng sử dụng nguồn carbon D-xylose - D-fructose ++ Cellobiose - L-arabinose + I-inositol ± Rhamnose + Sucrose - D-mannitol + Raffinose ± Ghi chú: ++: Sử dụng mạnh nguồn cacbon; +: Có thể sử dụng nguồn cacbon ±: Không xác định khả năng sử dụng nguồn cacbon; - : Không sử dụng nguồn cacbon 5 Môi trƣờng chứa Cellobiose Môi trƣờng chứa arabinose Môi trường chứa xylose Môi trường chứa fructose Đ.c (-) Đ.c (+) chứa glucose 6 Môi trƣờng chứa innositol Môi trƣờng chứa Rhamnose Môi trƣờng chứa Sucrose Môi trƣờng chứa Mannitol Môi trƣờng chứa Raffinose Đ.c (-) Hình 4.1.2A. Khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau Ngoài ra các nguồn carbon: α-D-lactose, β-methyl D-glucoside, D-tagatose, lactamide, alaninamide, adenosine, -cyclodextrin, D-arabitol, lactulose,α-methyl D-mannoside,D- trehalose, D-lactic acid methyl ester, D-alanine, 2’-deoxy adenosine, β-cyclodextrin, arbutin, maltose, palatinose, turanose, L-lactic acid, L-alanine, inosine, cellobiose, maltotriose, D- psicose, xylitol, D-malic acid, L-alanyl-glycine, thymidine, glycogen, D-fructose, D-mannitol, D-raffinose, L-malic acid, L-asparagine, uridine, inuline, L-fucose, D-mannose, L-rhamnose, 7 acetic acid, methyl pyruvate, L-glutamic acid, adenosine-5’- monophosphate, mannan, D- galactose, D-melezitose, α-hydroxybutyric acid, glycyl-L- glutamic acid, thymidine-5’- onophosphate, tween 40, D- galacturonic acid, D-melibiose, salicin, β- hydroxybutyric acid, propionic acid, L- pyroglutamic acid, uridine-5’- monophoshate, gentiobiose, α-methyl D- galactoside, sedoheptulosan, γ- hydroxybutyric acid, pyruvic acid, L-serine, fructose-6- phosphate, N-acetyl-D- glucosamine, D- gluconic acod, β-methyl D-galactoside, D-sorbitol, p-hydroxyphenyl acetic acid, succinamic acid, putrescine, glucose-1- phosphate, N-acetyl-D- mannosamine, α-D-glucose, 3-methyl glucose, stachyose, α-keto glutaric acid, succinic acid, 2,3-butanediol, glucose-6- phosphate, amygdalin, m-inositol, α-methyl D-glucoside, sucrose, α-keto valeric acid, N-acetyl L-glutamic acid, glycerol, D-L-α-glycerol phosphate, VN08A12 không thể sử dụng được. Do đó, có thể thấy rằng chủng VN08A12 có thể sử dụng D-fructose, Cellobiose, L- arabinose, Rhamnose, D-mannitol làm nguồn carbon chủ yếu; trong đó, khả năng sử dụng D- fructose là tốt nhất (gần bằng khả năng sử dụng D-glucose). 4.1.2.2. Khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối 8 Hình 4.1.2B. Khả năng chịu muối và khả năng đồng hóa Melanin của VN08A12 Các thử nghiệm về khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối của chủng VN08A12 (theo hình 4.1.2B) cho thấy chủng này không có khả năng đồng hóa Melanin và có thể chịu được nồng độ muối đến 4%. Từ các kết quả phân loại về hình thái, sinh lí và sinh hóa đó, có thể xếp loại chủng VN08A12 thuộc vào chi Streptomyces sp. 4.1.3. Trình tự 16S-rRNA của chủng VN08-A12 Hình 4.1.3A. Ảnh điện di DNA tổng số Hình 4.1.3B.Ảnh điện di sản phẩm PCR M. Marker 10kb 1,2. gen 16s -rRNA Hình 4.1.3. Trình tƣ ̣16S-rRNA của chủng VN08A12 Kết quả điêṇ di DNA tổng s ố hình 4.1.3A cho thấy ch ỉ có một băng duy nhất, rõ nét đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. Hàm lượng DNA thu được là tương đối lớn và sạch để tiến hành phản ứng PCR. Tiến hành phản ứng PCR với căp̣ mồi 27F và 1525R, chúng tôi đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1.5kb (hình 4.1.3B) theo đúng kích thước lí thuyết căp̣ mồi có thể nhân đươc̣. Chứng tỏ đoaṇ DNA nhân đươc̣ chính là gen 16s-rRNA của xa ̣khuẩn . Chúng tôi, tiến hành thôi gel và tinh sac̣h DNA để giải trình tư ̣bằng bô ̣kit tinh sac̣h sản phẩm PCR của QIAgen. 1.5kb 1kb 9 - Kết quả giải trình tư ̣của gen 16S rRNA chúng tôi đa ̃giải đươc̣ môṭ đoaṇ gen dài 1387 Nu, có trình tự như sau: TGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAG TAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTA ATACCGGATACGACTGCGGAAGGCATCTTCCGCGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGA AGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGA CGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCT GATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAG CAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGAGCTCGTAGGCGGCCAGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCT CGGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCC TGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGG ATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATT CCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGC CGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCAT GTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGA AAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGG GGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTT GGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTG GAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCC ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCC GGTGGCCCAACCCTTGTGGAGG Trình tự này được sử dụng để Search blast trên GenBank để xác định các trình tự tương đồng, kết quả đươc̣ thể hiêṇ ở bảng 4.1.3. Bảng 4.1.3. Kết quả Search Blast triǹh tƣ ̣gen 16s – rRNA trên GenBank 10 Kết quả Blast search trên GenBank kết quả cho thấy chủng VN 08A12 có trình tự 16S rRNA hoàn toàn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lê ̣100%. Chúng tôi cũng vẽ hình cây phân loại chủng VN 08A12 dưạ trên công cu ̣Tree view trên GenBank . Kết quả thể hiêṇ ở hình 4.1.4 cho thấy chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhóm với nhóm chủng Streptomyces toxytricini. 11 Hình 4.1.4. Cây phân loại chủng VN08A12 dƣạ trên trình tự gen 16S –rRNA 4.2. Kết quả chọn lọc môi trƣờng sinh kháng sinh phù hợp cho VN08A12 12 Kết quả được tóm tắt ở bảng 4.2 và hình 4.2 Bảng 4.2. Vòng ức chế của chủng VN08A12 đối với 10 nòi Xoo (D-d, cm) Nòi Xoo Môi trƣờng YS Môi trường 2M Môi trường 301 Môi trường A-16 Môi trường No 8 Môi trường A-3M APM MAPM* R1 1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1 0.9 ± 0.3 1.0 ± 0.1 2.0 ± 0.2 2.4 ± 0.1 R2 0.6 ± 0.2 0.9 ± 0.3 1.1 ± 0.1 0.6 ± 0.2 0.7 ± 0.2 1.2 ± 0.2 1.3 ± 0.3 1.8 ± 0.2 R3 0.7 ± 0.1 1.8 ± 0.1 1.6 ± 0.1 1.4 ± 0.1 1.9 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2.2 ± 0.3 R4 0.7 ± 0.2 1.8 ± 0.1 2.0 ± 0.3 1.6 ± 0.1 1.6 ± 0.1 1.4 ± 0.2 1.7 ± 0.4 2.0 ± 0.1 R5 0.3 ± 0.1 2.0 ± 0.2 2.2 ± 0.1 1.6 ± 0.1 1.8 ± 0.2 1.6 ± 0.3 2.2 ± 0.1 2.4 ± 0.3 R6 0.6 ± 0.1 0.6 ± 0.3 0.8 ± 0.2 0.5 ± 0.1 0.8 ± 0.1 1.0 ± 0.1 0.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1 R7 0.4 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.8 ± 0.3 1.5 ± 0.3 0.7 ± 0.1 0.5 ± 0.1 2.0 ± 0.1 R8 0.5 ± 0.1 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.4 ± 0.1 1.1 ± 0.3 1.6 ± 0.3 2.2 ± 0.1 R9 0.2 ± 0.1 1.0 ± 0.2 1.3 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.5 ± 0.2 1.3 ± 0.2 1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.2 R10 1.0 ± 0.2 1.2 ± 0.1 1.6 ± 0.4 1.2 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.3 1.8 ± 0.2 1.8 ± 0.2 *: Chỉ ra giá trị P có ý nghĩa về mặt thống kê. (YS. 2M, 301, A-16, No 8, A-3M và APM < MAPM) Kết quả cho thấy môi trường cải tiến, thay thế thành phần khô dậu tương bằng bã đậu là phù hợp nhất cho VN08A12 . Vì thế, môi trường MAPM được chọn để lên men VN08A12 cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 4.2A. Trên môi trƣờng YS Hình 4.2B. Trên môi trƣờng APM; MAPM Hình 4.2. Vòng kháng khuẩn của VN08A12 trên các môi trƣờng khác nhau Từ kết quả trên cho thấy, môi trường sinh kháng sinh thay thế khô đậu tương bằng bã đậu tương cho kết quả khá tốt. Như vậy có thể dùng môi trường cải tiến này cho việc lên men VN08A12 cho các thí nghiệm tiếp theo. A Hình 4.2A. Trên môi trường YS Hình 4.2B. Trên môi trường APM; MAPM A B MAPM 4 MAPM1 16 4.3. Kết quả thử nghiệm ảnh hƣởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây đỗ xanh Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trƣởng và phát triển của đỗ xanh N g à y L ô 2/8 3/8 4/8 5/8 6/8 7/8 8/8 9/8 10/8 11/8 12/8 13/8 14/8 15/8 17/8 19/8 Lô 1 14.65 ±1.36 15.95 ±1.24 17.10 ±1.14 18.10 ±1.22 18.83 ±1.09 19.03 ±1.18 19.40 ±1.23 19.58 ±1.21 19.90 ±1.33 20.05 ±1.31 20.35 ±1.37 20.55 ±1.35 20.88 ±1.39 21.08 ±1.45 21.73 ±1.60 22.85 ±1.89 Lô 2 13.13 ±1.33 13.93 `±1.41 15.23 ±1.45 15.93 ±1.38 16.33 ±1.42 16.73 ±1.40 17.10 ±1.38 17.38 ±1.42 17.53 ±1.47 17.93 ±1.34 18.03 ±1.46 18.35 ±1.58 18.53 ±1.50 18.63 ±1.56 19.60 ±1.73 20.78 ±1.72 Lô 3 13.90 ±1.98 15.05 ±2.09 16.73 ±2.12 17.48 ±2.12 18.08 ±2.06 18.55 ±2.10 19.05 ±2.06 19.11 ±1.98 19.34 ±2.03 19.55 ±2.05 19.92 ±2.12 20.16 ±2.09 20.39 ±2.13 20.50 ±2.13 21.00 ±2.13 21.97 ±2.16 Lô 4 8.98 ±1.31 10.05 ±1.54 11.30 ±1.32 11.55 ±1.40 12.08 ±1.25 12.60 ±1.39 13.03 ±1.41 13.33 ±1.36 13.58 ±1.41 13.90 ±1.42 14.15 ±1.45 14.50 ±1.40 14.73 ±1.46 14.95 ±1.53 15.63 ±1.50 16.55 ±1.19 Lô 5 6.35 ±3.27 7.45 ±3.53 8.35 ±3.52 9.23 ±3.59 9.60 ±3.46 10.20 ±3.56 10.78 ±3.49 11.33 ±3.32 11.68 ±3.44 12.18 ±3.20 12.63 ±3.21 12.98 ±3.11 13.38 ±3.15 13.60 ±3.06 15.03 ±3.22 16.45 ±3.30 Lô 6 10.13 ±1.85 11.28 ±1.95 12.53 ±1.94 13.45 ±1.98 14.15 ±1.93 15.13 ±1.74 15.63 ±1.64 16.05 ±1.95 16.38 ±1.79 16.73 ±1.71 16.98 ±1.78 17.28 ±1.71 17.53 ±1.78 17.73 ±1.71 19.08 ±1.77 20.30 ±1.74 Lô 7 8.73 ±2.52 9.75 ±2.67 10.65 ±2.65 11.45 ±3.54 11.63 ±2.83 12.03 ±2.93 12.40 ±3.02 12.85 ±3.00 13.23 ±3.08 13.53 ±3.11 13.95 ±3.09 14.28 ±3.16 14.65 ±3.21 14.98 ±3.37 16.74 ±2.68 17.63 ±2.91 Lô 8 3.88 ±1.62 4.70 ±1.79 5.40 ±1.77 5.60 ±1.66 5.89 ±1.53 6.50 ±1.77 6.79 ±1.72 7.08 ±1.77 7.26 ±1.78 7.37 ±1.80 7.63 ±1.89 7.74 ±1.85 7.97 ±1.79 8.11 ±1.88 8.11 ±1.88 8.47 ±1.94 17 Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của VN08A12 đến sự sinh trƣởng và phát triển của đỗ xanh Chú thích: Từ lô 1→ lô 5: Lô thí nghiệm (Phun sản phẩm lên men) Từ lô 6 → lô 8: Lô đối chứng (Không phun sản phẩm lên men) Chiều cao của từng cây đỗ xanh được đo hàng ngày từ 2 đến 19 tháng 8 năm 2012. Chiều cao trung bình và trị số độ lệch chuẩn (SD, standard deviation) của các cây trong từng lô được tính và ghi chép trong từng ô trên bảng 4.3. Biểu đồ 4.3 cho thấy các lô từ 1-3 là các lô cây đậu xanh được phun dịch lên men có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, các lô cây đậu xanh không được phun dịch lên men có tốc độ sinh trưởng chậm hơn (ngoại trừ lô số 6). Điều này chứng tỏ sản phẩm lên men của chủng xạ khuẩn VN08A12 không làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của cây đỗ xanh, thậm chí nó còn có tác dụng kích thích sự sinh trưởng phát triển của cây. Có thể là do trong quá trình lên men, các tế bào xạ khuẩn bài tiết ra môi trường các chất thứ cấp có tác dụng kích thích sinh trưởng thực vật hoặc tạo ra các chất dinh dưỡng tốt cho cây trồng. Khi được phun vào đất trồng, tế bào xạ khuẩn có thể góp phần cải biến môi trường đất, biến đổi các chất khó hấp thu thành dạng dạng dễ hấp thu cho hệ rễ của cây hấp thụ. Sản phẩm lên men của chủng xạ khuẩn thân thiện với môi trường trồng trọt. 4.4. Kết quả thử nghiệm ảnh hƣởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trƣởng và phát triển của chuột bạch Sản phẩm lên men của chủng xạ khuẩn VN08A12 đã được sơ bộ thử nghiệm đánh giá sự ảnh hưởng lên sức khoẻ của động vật môi trường thông qua trộn lẫn vào thức ăn của chuột bạch và nuôi theo dõi trong phòng thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng dưới đây: Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trƣởng và phát triển của chuột bạch N g à y L ô 15/08 25/08 30/08 10/09 20/09 30/09 5/10 10/10 17/10 Thí nghiệm 209 ± 7.20 215 ± 6.19 217 ± 8.22 247 ± 7.10 298 ± 7.22 315 ± 7.21 329 ± 6.11 336 ± 5.50 389 ± 7.69 Thời gian (ngày đo) C h iề u c a o ( c m ) 18 Đối chứng 210 ± 5.34 216 ± 7.21 219 ± 8.10 244 ± 7.44 301 ± 7.36 309 ± 7.32 331 ± 6.25 342 ± 7.67 346 ± 7.71 Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của VN08A12 đến sự sinh trƣởng của chuột nuôi thí nghiệm Các giá trị trong mỗi ô của bảng trên là trị số trung bình và độ lệch chuẩn của các giá trị này được tính dựa trên dẫn liệu đo được về cân nặng (đơn vị là gram) của 30 con chuột bạch được nuôi trong điều kiện thí nghiệm (có tẩm dịch lên men vào thức ăn) và đối chứng (thấm nước cất vô trùng vào thức ăn). Qua bảng 4.4 và biểu đồ 4.4 cho thấy chuột bạch ăn thức ăn có tẩm dịch lên men không bị ảnh hưởng về sức khỏe và tốc độ tăng trưởng trong suốt thời gian nghiên cứu. CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Bằng phương pháp hình thái học và kiểm tra sinh lí, sinh hóa và phân tích trình tư ̣gen 16S rRNA chúng tôi xác điṇh chủng VN08A12 là Streptomyces toxytricini - Chúng tôi đã chọn lọc được môi trường MAPM lên men thích hợp cho VN08A12 . Đây là môi trường sinh kháng sinh đã được cải tiến: dùng bã đậu tươi đẻ thay thế khô đậu tương trong thành phần môi trường sinh kháng sinh. Việc sử dụng bã đậu, tận dụng được nguồn bã đậu phế thải trong sản xuất đậu phụ góp phần vào việc bảo vệ môi trường và có ý nghĩa kinh tế. - Bằng phương pháp thực nghiệm chúng tôi nhận thấy khi tiến hành thử nghiệm tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) cho thấy chủng xạ khuẩn không gây hại cho các sinh vật trong môi trường sống. 5.2. Kiến nghị Để đạt được những kết quả cao hơn cần thực hiện rất nhiều các nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng VN08A12 cho việc phòng trừ bệnh. Do đó, chúng tôi đề xuất một vài hướng nghiên cứu:  Nghiên cứu bản chất chất kháng sinh sinh ra từ chủng xạ khuẩn VN08A12 để có thể nắm được cơ chế đối kháng của VN08A12 đối với Xoo. K h ố i lư ợ n g ( g ra m ) Thời gian (ngày cân) 19  Tối ưu các điều kiện nuôi cấy để có thể chuyển từ quy mô phòng thí nghiệm lên những quy mô lớn hơn và ứng dụng để sản xuất chế phẩm trừ bệnh bạc lá lúa góp phần giảm những thiệt hại nghiêm trọng mà bệnh đang gây ra.  Thử nghiệm trên các giống lúa khác để kiểm tra mức độ thể hiện của chủng VN08A12 .  Thử nghiệm trên nhiều loài động vật, thực vật, động vật đất, vi sinh vật để kiểm tra tính thân thiện của chủng VN08A12 đối với môi trường. References 1. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 2. Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội. 3. Nguyễn Hoàng Chiến (2001), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Hà Nội. 4. Dinh, H.D.O., N. K., Toan, N. D., Du, P. V., Loan, L. C. (2008), “Pathotype profilce of Xanthomonas oryzae pv. oryzae isolates from the rice ecosystem in Cuulong river delta”, Omonrice, 16, 34-40. 5. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, 6. 6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1977), Vi sinh vật học, tập 2, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo (2006), “Các nhóm vi khuẩn chủ yếu”, Vietsiences. 8. Đỗ Tấn Dũng & Nguyễn Văn Viên (2005), Bệnh bạc lá, Một số bệnh chính hại lúa và biện pháp phòng trừ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 42-45. 9. Nguyễn Thành Đạt, K.A. Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin Act.A. buraviensis, microbiologia, NXB Academia cccp. 10. Fang, D.a.L.a. (1995), “Emerging concept of secondary metabolism in actinomycetes”, J. Actinomycetologica,, 9, 98-117. 11. Furuya, N., Taura, S., Thuy, B. T., Ton, P. H., Hoan, N. V., Yoshimura, A. (2002), “Experimetal technique for bacterial Blight of rice”. 12. Gnanamanickan, S. S. (2009), Biological control of rice diseases, Springer Dordrecht 13. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. 14. Hop, D. V., Kastuhiko Ando (2010), “Taxonomic and Ecological studies of Microorganisms in Vietnam and the utilization”, Joint research project between VNUH- IMBT, Vietnam and NITE-DOB, Japan. 15. Jiang Bian, YanLi, Jian Wang, Fu-Hang Song, Mei Liu, Huan-Qin Dai, Biao Ren, Hong Gao, Xinling Hu, Zhi-Heng Liu, Wen-Jun Li and Li-Xin Zhang (2009), “Amycolatopsis marina sp. nov., an actinomycete isolated from an ocean sediment”, International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 59, 477-481. 16. Jongsik Chun, S.B.K., Youn Kyung Oh, Goodfellow. M (1999), “Amycolatopsis thermoflava sp.nov, anovel soil actinomycete from Hainan Island, China”, Int. J, Syst. Bacteriol, 49, 1369 - 1373. 20 17. Lang, N.T.L., T. T.; Khuyeu, B. T. D.; Vu, B. C. (2008), “Genetics and breeding for blast and bacterial leaf blight resistance of rice (Oryza sativa. L)”, Omonrice, 16, 41-49. 18. Lo, C.W., N.S.L. H-Y Cheah, N.K.I. Wong and C.C. Ho1 (2002), “Actiomycetes isolated from soil samples from the crocker range Sabah”, ASEAN Review of Biodiversity and Environmental Conservation (ARBEC), 7, 1-2. 19. Vũ Triệu Mân & Lê Lương Tề (1999), Bệnh vi khuẩn, virus hại cây trồng, NXB Giáo dục. 20. Miyadoh, S. Actinomycetes: Isolation and their antibiotic screening. Workshop manual. 2005, VNU-CBT and NITE cooperation project. 21. Moncheva, P., Tishkov, Sava, Dimitrova, Nadezhda, Chipeva, Valentina, Antonova-Nikolova, Stefka, Bogatzevska, Nevena (2002), “Characteristics of soil actinomycetes from Antarctica”, Journal of culture collections, 3, 3-14. 22. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội. 23. Mai Văn Quyền (1969-1970), Ảnh hưởng của các loại phân vô cơ đến sự phát sinh, phát triển bệnh bạc lá vi khuẩn, Kỷ yếu kết quả nghiên cứu khoa học Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp. 24. Robert D. Nolan, T.C. (1988), “Isolation and Screeming of Actinomycetes”, In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, london. 25. Tạ Minh Sơn (1987), Bệnh bạc lá vi khuẩn (Xanthomonas oryzae) và tạo giống chống bệnh, Luận án tiến sĩ Khoa học, viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. 26. Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H. & Ando, K. (2009), “Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam”, Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554. 27. Shirling, E.B. & D.Gottlieb (1966). Methods for characterization of Streptomyces species. Int.J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340. 28. Srivastava, D. N. (1972), Bacterial leaf blight of rice, Phytopathol 26. 29. Phan Huu Ton, Bui Trong Thuy and Tong Van Hai, 2003. Pathogenicity of the Bacterial Leaf Blight Strains from Northern Vietnam. The 2 nd National Conference on Plant Pathology and Molecular Biology. 30. Hà Minh Trung (1996), Hiện trạng và triển vọng nghiên cứu bệnh virus, vi khuẩn hại cây trồng ở Việt Nam, Tạp chí Bảo vệ thực vật tháng 4. 31. Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập1, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 328 - 345. 32. Waksman, S.A. (1961), “The Actinomycetes. Classification, identification and descriptions of genera and species”, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, 2.