Tóm tắt Luận văn Nghiên cứu xác định thành phần, cấu tạo một số hợp chất hóa học trong lá của cây keo Gai (ACACIA GREGGII)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐÀO THỊ VÂN TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, CẤU TẠO MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG LÁ CỦA CÂY KEO GAI (ACACIA GREGGII) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60.44.27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng- Năm 2014 Công trình được hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 1: TS. Trần Mạnh Lục Phản biện 2: TS. Bùi Xuân Vững Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 29 tháng 06 năm 2014 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Là một quốc gia cận nhiệt đới và được thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Từ xưa đến nay, nhiều loài thực vật đã cung cấp những nguồn dược liệu hết sức quan trọng. Trong y dược, cây keo gai có tác dụng làm thuốc giảm đau, thuốc viêm đường hô hấp, tiêu hóa, trị ho, thuốc nhỏ mắt, trị tiêu chảy và kiết lỵ, chống viêm dạ dày, rửa cầm máu và kháng sinh, chất làm se. Dân gian ta uống nước lá cây keo gai và truyền kinh nghiệm nước từ lá cây keo gai có tác dụng liền xương nhanh, rất thích hợp chữa bệnh khớp. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tác dụng này của cây keo gai ở nước ta. Trên thế giới có một số công trình nghiên cứu về cây keo gai: “Pithedulosides A-G, Oleanane glycosides from Pithecellobium dulce” của SK Nigam, Misra Gopal, Rais Uddin (National Botanical Research Institute and Institule of Unani Medicinal Plants, Lucknow, India), Kazuko Yoshikawa, Miwako Kawamoto và Shigenobu Arihasa (Faculty of Pharmaceutical Sciences, Yamashiro-Cho, Tokushima Bunri University, Tokushima 770, Japan); “Biochemical evaluation of antidiabetic properties of Pithecellobium dulce fruits studied in streptozotocin induced experimental diabetic rats” của S. Pradeepa, S. Subramanian (Department of Biochemistry, University of Madras, Guindy Campus, Chennai 600 025, India), V. Kaviyarasan (Centre for advanced studies in Botany,University of Madras, Guindy Campus, Chennai 600 025, India); “Physical and Mechanical Properties of Three-Layer Particleboard Manufactured from the Tree Pruning of Seven Wood Species” của Ramadan Abdel- Sayed Nasser (Forestry and Wood Technology Department, Faculty of Agriculture (Al-Shatby), Alexandria University, Egypt);“Phytochemical studies on Pithecellobium dulce Benth. A medicinal plant of Sindh, Pakistan” của Samina Kabir Khanzada (Institute of Plant Sciences, University of Sindh, Jamshoro, Pakistan), Wazir Khaikh và Syed Abid Ali (HEJ Research Institute of Chemistry, International Center for Chemical and Biological Sciences (ICCBS), University of Karachi, Karachi-75270, Pakistan); “A review on pharmacological activities of Pithecellobium Dulce extract, and there effective doses”của Sharma Shweta, Mehta B.K. 2 (School of studies in chemistry and Biochemistry department, Ujjain. (M.P.)); “Ten Medicinal Plants from Burma”của Alireza Sesoltani (A literature study, Institue of Pharmacy, The faculty of Mathematics and Nature Sciences, The University of Oslo); “Antioxidant and free radical scavenging activity of Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth wood bark and leaves”của Shankar D. Katekhaye, Maheshkumar S. Kale(MNPRL, Department of Pharmaceutical Sciences and Technology, Institute of Chemical Technology, Matunga (E), Mumbai-400019). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Thành phần chính của cây keo gai gồm: alkaloid, flavonoid, glycosides, saponin, phytosterol, tannin và triterpenoids. Mặc dù cây keo gai có nhiều công dụng và được nghiên cứu nhiều trên thế giới song ở Việt Nam chưa có đề tài nào về cây keo gai. Do đó, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và ứng dụng dược liệu của cây keo gai ở nước ta là hết sức cần thiết. Với mong muốn góp phần tìm hiểu, xác định thành phần hóa học chính của cây keo gai, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định thành phần, cấu tạo một số hợp chất hóa học trong lá của cây keo gai (Acacia greggii)”. 2. Mục đích nghiên cứu - Xây dựng quy trình chiết tách thích hợp. - Xác định thành phần, cấu tạo một số hợp chất trong lá của cây keo gai. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Lá tươi của cây keo gai. - Phạm vi nghiên cứu: Chiết tách và xác định thành phần hóa học trong lá cây keo gai. 4. Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết: Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của cây keo gai. - Nghiên cứu thực nghiệm: + Phương pháp chọn mẫu. + Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu, hàm lượng kim loại bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). + Chiết bằng phương pháp soxhlet và chưng ninh. + Định danh và xác định thành phần các dịch chiết hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol từ lá cây keo gai bằng phương 3 pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS). + Phân lập dịch chiết, tách một số cấu tử bằng sắc ký lớp mỏng (TCL). + Dùng phổ khối (MS) và phần mềm ChemSketch kiểm tra lại một số hợp chất đã định danh. + Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Cung cấp thêm thông tin về cây keo gai: một số chỉ tiêu hóa lý, thành phần hóa học và cấu tạo của một số hợp chất chính có trong cây. - Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích khoa học các kinh nghiệm dân gian, thuận tiện cho việc ứng dụng. 6. Bố cục luận văn Luận văn gồm 93 trang, trong đó có 25 bảng và 42 hình. Phần mở đầu (04 trang), kết luận và kiến nghị (01 trang), tài liệu tham khảo (06 trang) và phần phụ lục. Nội dung của luận văn chia làm 3 chương: Chương 1 - Tổng quan Chương 2 - Nghiên cứu thực nghiệm Chương 3 - Kết quả và bàn luận 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. NGUỒN GỐC CÂY KEO GAI TRONG GIỚI THỰC VẬT 1.1.1. Họ Đậu (Fabaceae) và chi Me Keo (Pithecellobium) 1.1.2. Giới thiệu về cây keo gai 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KEO GAI 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KEO GAI 1.4. GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY KEO GAI CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.1.1. Thu gom nguyên liệu 2.1.2. Xử lí nguyên liệu 2.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất 2.2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HÓA LÝ 2.2.1. Độ ẩm 2.2.2. Hàm lượng tro 2.2.3. Hàm lượng một số kim loại 2.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT 2.3.1. Phương pháp chiết 2.3.2. Khảo sát thời gian chiết thích hợp 2.4. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, ĐỊNH DANH CÁC DỊCH CHIẾT LÁ KEO GAI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ 2.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 5 2.6. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 6 7 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA LÁ CÂY KEO GAI 3.1.1. Độ ẩm Độ ẩm trung bình của lá keo gai là 51.885 %. 3.1.2. Hàm lượng tro Hàm lượng tro trung bình của lá keo gai là 18.265%. 3.1.3. Hàm lượng một số kim loại Hàm lượng một số kim loại so với tiêu chuẩn khá cao. Theo kết quả QCVN 8-2:2011/BYT-Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm) thì Pb và Zn không nằm trong khoảng cho phép; Pb vượt cao gấp 8.45 lần, Zn vượt cao gấp 8.9 lần so với hàm lượng cho phép, riêng As nằm trong giới hạn quy định. Vì vậy khi sử dụng lá keo gai làm dược phẩm phải hết sức lưu ý. 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET 3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi hexane Lấy 5 mẫu bột lá cây keo gai, mẫu có khối lượng mo. Tiến hành chiết soxhlet với 100 ml hexane (d = 0.655 g/ml) trong các khoảng thời gian là 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ. Đối với mỗi mẫu đo thể tích (V) dịch chiết thu được. Dùng pipet lấy chính xác 10 ml dịch chiết của mỗi mẫu cho vào cốc đã biết chính xác khối lượng. Cân cốc và tính khối lượng (m) của 10 ml dịch chiết, từ đó suy ra khối lượng riêng (d’) của mỗi mẫu dịch chiết. Khối lượng sản phẩm chiết được tính như sau: ' 10 m d = (g/ml) (3.1) Gọi m’ là khối lượng chất chiết ra được từ 10g nguyên liệu: m’ = mcao chiết + dung môi – mdung môi nguyên chất => m’ = d’.(Vchất tan + Vdung môi) – d.Vdung môi Vì Vchất tan quá nhỏ, có thể bỏ qua nên: m’ = d’.Vdung môi – d. Vdung môi m’ = d’.V – d.V (g) (3.2) Với d là khối lượng riêng của dung môi nguyên chất Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng 8 sản phẩm chiết đối với dung môi hexane được biểu diễn ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi hexane Thời gian (h) m0 (g) V (ml) m (g) d’ (g/ml) m' (g) %m 0.5 10.052 92 6.567 0.657 0.156 1.556 1 10.036 87 6.577 0.658 0.235 2.341 2 10.056 84 6.581 0.658 0.260 2.589 3 10.048 89 6.603 0.660 0.472 4.694 4 10.016 85 6.611 0.661 0.519 5.177 5 10.028 88 6.597 0.660 0.414 4.124 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy khi tăng thời gian chiết từ 30 phút lên 4 giờ thì khối lượng sản phẩm chiết tăng lên nhưng khi tiếp tục tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết giảm. Nguyên nhân do ban đầu khi được gia nhiệt khả năng hòa tan của các chất trong nguyên liệu vào dung môi lớn nên khối lượng chất chiết ra tăng lên. Sau một thời gian, các chất có trong nguyên liệu không thể tan vào dung môi thêm được nữa, khi đó quá trình hòa tan kém dần và quá trình bay hơi tăng lên nên khối lượng sản phẩm chiết giảm. Hơn nữa, những chất tan được trong dung môi hexane là những chất kém phân cực, dễ bay hơi nên khi đun càng lâu thì số chất bay hơi càng nhiều, đồng thời một số chất bị phân cắt thành những cấu tử nhỏ hơn làm hiệu suất chiết giảm. Vì vậy, đối với dung môi hexane chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 4 giờ, tỉ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 5.177%. 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi chloroform Lấy 2 mẫu nguyên liệu lá keo gai, 30 g/mẫu. Tiến hành chiết soxhlet mỗi mẫu với 300 ml hexane trong 4 giờ. Tổng bã rắn thu được chia thành 5 phần, khoảng 10 g/mẫu. Mỗi mẫu tiếp tục chiết soxhlet với 100 ml dung môi chloroform (d = 1.489 g/ml) trong các khoảng thời gian là 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi chloroform được biểu diễn ở bảng 3.5. 9 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi chloroform Thời gian (h) mo (g) V (ml) m (g) d’(g/ml) m' (g) %m 2 10.028 86 14.908 1.491 0.155 1.544 3 10.071 82 14.918 1.492 0.230 2.280 4 10.016 79 14.921 1.492 0.245 2.445 5 10.064 71 14.919 1.492 0.206 2.046 6 10.096 75 14.917 1.492 0.202 2.006 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy khối lượng chất chiết ra được là rất ít và đạt kết quả cao nhất sau 4 giờ. Điều này có thể giải thích là do quá trình chiết phân lập, chiết bằng hexane trước, hầu hết các chất này đã được chiết ra nên khi chiết với chloroform lượng chất còn lại là rất ít. Dù có tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết không tăng lên được nữa. Vì vậy, đối với dung môi chloroform chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 4 giờ, tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 2.445%. 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi ethyl acetate Bã rắn sau khi chiết hexane và chloroform tiếp tục chiết soxhlet với dung môi ethyl acetate (d = 0.897 g/ml) trong các khoảng thời gian 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết được biểu diễn ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi ethyl acetate Thời gian (h) mo (g) V (ml) m (g) d’(g/ml) m' (g) %m 2 10.018 91 9.027 0.903 0.519 5.178 3 10.051 89 9.094 0.909 1.104 10.980 4 10.036 86 9.121 0.912 1.299 12.939 5 10.014 83 9.176 0.918 1.710 17.074 6 10.048 85 9.115 0.912 1.232 12.266 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.6 cho thấy khối lượng sản phẩm chiết tăng lên khi tăng thời gian và đạt kết quả cao nhất sau 5 giờ. Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết giảm (Tương tự cách giải thích với dung môi hexane). Đối với dung môi ethyl acetate chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 5 giờ, tỉ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 17.074%. 10 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi methanol Bã rắn sau khi chiết hexane, chloroform, ethyl acetate tiếp tục chiết soxhlet với dung môi methanol (d = 0.792 g/ml) trong các khoảng thời gian là 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung methanol được biểu diễn ở bảng 3.11 và đồ thị hình 3.12. Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi methanol Thời gian (h) mo (g) V (ml) m (g) d’(g/ml) m' (g) %m 0.5 10.018 87 8.011 0.801 0.792 7.903 1 10.063 88 8.016 0.802 0.845 8.395 2 10.027 86 8.045 0.805 1.075 10.721 3 10.047 83 8.096 0.810 1.461 14.540 4 10.058 85 8.027 0.803 0.909 9.043 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.7 cho thấy khi tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết tăng dần và đạt giá trị cao nhất sau 3 giờ; tiếp tục tăng thời gian chiết đến 4 giờ thì khối lượng sản phẩm chiết giảm nhẹ. Nguyên nhân là do methanol là dung môi có khả năng hòa tan được nhiều cấu tử nên khi tăng thời gian chiết, lượng chất chiết ra được càng nhiều nhưng khi đun với thời gian lâu thì một số cấu tử có khối lượng phân tử lớn, mạch phân tử dài bị bẻ gãy thành những phân tử nhỏ hơn nên dễ bị bay hơi hơn. Do đó, khối lượng sản phẩm chiết giảm. Vì vậy, đối với dung môi methanol chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 3 giờ, tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 14.540%. Nhận xét chung: Qua khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết trong quá trình chiết phân lập lá cây keo gai lần lượt với các dung môi hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol với tỷ lệ rắn/lỏng là 10g/100ml chúng tôi nhận thấy: Thời gian chiết thích hợp tương ứng với các dung môi lần lượt là 4 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 3 giờ. Tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra từ dung môi ethyl acetate là lớn nhất (17.074%), từ dung môi chloroform là bé nhất (2.445%). Các dịch chiết đã khảo sát đều có màu. Tiến hành pha loãng các dịch chiết và đo UV-VIS để xác định khoảng bước sóng hấp thụ của từng dịch chiết, tạo điều kiện ứng dụng rộng rãi hơn. Phổ hấp thụ 11 UV-VIS của các mẫu chiết được trình bày ở hình 3.6. và 3.7. 430.0 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640.0 0.000 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.800 nm A 580.0 600 620 640 660 680 700 720 740 760.0 0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.50 nm A Hình 3.6. Phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết hexane (trái) và dịch chiết chloroform (phải) 550.0 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700.0 0.00 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.10 nm A 400.0 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600.0 0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.40 nm A Hình 3.7. Phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết ethyl acetate (trái) và dịch chiết methanol (phải). Nhận xét: Dịch chiết hexane có màu vàng, phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết hexane có bước sóng cộng hưởng từ 430 nm đến 470 nm, λmax = 444 nm. Dịch chiết chloroform có màu xanh lục nhạt, phổ hấp thụ phân tử có bước sóng cộng hưởng 660 - 680 nm, λmax = 668 nm. Dịch chiết ethyl acetate có màu xanh đen, phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết có bước sóng cộng hưởng 660 - 670 nm, λmax = 666 nm. Dịch chiết methanol có màu xanh lục đậm, phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết có bước sóng cộng hưởng 400 - 480 nm, λmax = 414 nm. 3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC DỊCH CHIẾT THEO PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN LẬP 3.4.1. Dịch chiết hexane Kết quả xác định thành phần hóa học bằng GC–MS dịch chiết hexane của lá keo gai được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.8. 12 Hình 3.8. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết hexane Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết hexane thể hiện ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Thành phần hóa học trong dịch chiết hexane STT RT Area Định danh 1 3,204 0.22 3-Hexen-1-ol, (Z)- 2 3,357 0.14 Hexanol 3 3,049 0.12 Benzene, 1,3-dimethyl- 4 3,709 0.10 Styrene 5 5.303 0.33 Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl- 6 9.743 0.33 Benzofuran, 2,3-dihydro- 7 21.406 4.96 Hexadecanal 8 23.291 0.16 cis,cis,cis-7,10,13-Hexadecatrienal 9 25.642 3.96 cis,cis-7,10,-Hexadecadienal 10 25.808 6.79 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- 11 26.366 0.64 Oxirane, hexadecyl- 12 27.009 0.40 Z-7-Hexadecenoic acid 13 27.734 8.79 n-Hexadecanoic acid 14 31.111 7.87 Phytol 15 31.735 6.26 9,12-Octadecadienoic acid, (Z,Z)- 16 31.920 7.05 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)- 17 32.466 2.14 Octadecanoic acid 18 39.620 0.37 Tetracosane 19 40.096 0.77 Octacosane 20 40.261 1.10 Squalene 21 40.596 10.61 Nonacosane 22 42.055 11.51 Vitamin E 23 44.179 1.19 Lup-20(29)-en-3-one Nhận xét: Bằng phương pháp GC–MS đã định danh được 23 cấu tử trong dịch chiết hexane từ lá cây keo gai, chủ yếu là những 13 cấu tử có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm alkane, ankene, arene, alcohol, andehyt, ketone, các acid hữu cơ và ester của chúng, hợp chất dị vòng chứa oxi. Cấu tử có hàm lượng lớn nhất là vitamin E. 3.4.2. Dịch chiết chloroform Kết quả xác định thành phần hóa học bằng GC–MS dịch chiết chloroform của lá keo gai được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.9. Hình 3.9. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết chloroform Kết quả định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết hexane thể hiện ở bảng 3.13. Bảng 3.9. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform STT RT (phút) Area (%) Định danh 1 3.212 0.69 3-Hexen-1-ol, (E)- 2 3.360 0.56 Hexanol 3 6.004 0.12 Limonene 4 20.037 0.45 Ethyl citrate 5 21.296 2.75 Hexadecanal 6 25.677 2.43 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- 7 26.288 0.46 Oxirane, hexadecyl- 8 27.365 1.28 n-Hexadecanoic acid 9 30.857 3.68 Phytol 10 40.227 1.14 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene, 11 40.541 13.14 Tetracosane 12 41.609 5.15 Heneicosane 13 41.963 8.64 Vitamin E 14 42.615 18.27 Oxirane, heptadecyl- 15 43.507 5.07 Stigmasta-7,16-dien-3-ol,(3.beta.,5.alpha.)- Nhận xét: Bằng phương pháp GC–MS đã định danh được 15 cấu 14 tử trong dịch chiết chloroform từ lá cây keo gai, chủ yếu là những cấu tử có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm alkane, alkene, terpene, alcohol, andehyt, acid và ester, hợp chất dị vòng chứa oxi. Cấu tử có hàm lượng lớn nhất là oxirane, heptadecyl- (18,27%). 3.4.3. Dịch chiết ethyl acetate Kết quả xác định thành phần hóa học bằng GC–MS dịch chiết ethyl acetate của lá keo gai được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.10. Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết ethyl acetate thể hiện ở bảng 3.10. Hình 3.10. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết ethyl acetate Bảng 3.10. Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate STT RT (phút) Area (%) Định danh 1 3.255 0.83 3-Hexen-1-ol, (Z)- 2 4.396 0.47 1R-.alpha.-Pinene 3 5.324 0.35 Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl- 4 5.610 0.59 3-Hexen-1-ol, acetate, (Z)- 5 8.430 0.15 Benzene, 1,2,3,5-tetramethyl- 6 9.060 0.16 Naphthalene 7 10.963 0.19 Benzene, pentamethyl- 8 11.250 0.57 Naphthalene, 1-methyl- 9 11.607 0.32 Naphthalene, 2-methyl- 10 13.680 0.43 Naphthalene, 2,6-dimethyl- 11 14.024 0.38 Naphthalene, 1,7-dimethyl- 12 14.102 0.26 Naphthalene, 1,4-dimethyl- 13 14.484 0.20 Naphthalene, 1,6-dimethyl- 14 16.703 0.27 Naphthalene, 1,6,7-trimethyl- 15 21.370 1.85 Hexadecanal 16 22.055 1.61 4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2- methoxyphenol 17 25.158 3.94 Phthalic acid, isobutyl octyl ester 15 18 25.750 2.64 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- 19 26.361 0.39 Oxirane, heptadecyl- 20 27.439 1.60 n-Hexadecanoic acid 21 30.962 5.26 Phytol 22 31.546 0.51 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)- 23 38.753 0.71 1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono(2-ethylhexyl) ester 24 40.260 2.50 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene, 2,6,10,15,19,23-hexamethyl-, (all-E)- 25 40.574 8.16 Tetracosane 26 41.656 2.87 Octadecane 27 42.027 16.4 Vitamin E 28 42.667 3.56 1,30-Triacontanediol 29 44.174 0.94 Lup-20(29)-en-3-one Nhận xét: Bằng GC-MS đã định danh được 29 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate từ lá cây keo gai, chủ yếu là những cấu tử có độ phân cực trung bình, bao gồm alkane, alkene, terpene, aren, alcohol, các acid hữu cơ tồn tại ở dạng tự do và ester, hợp chất dị vòng chứa oxi. Cấu tử vitamin E có hàm lượng lớn nhất. 3.4.4. Dịch chiết methanol Kết quả xác định thành phần hóa học bằng GC–MS dịch chiết methanol của lá keo gai được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.11. Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết methanol thể hiện ở bảng 3.11. Hình 3.11. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết methanol 16 Bảng 3.11. Thành phần hóa học trong dịch chiết methanol STT RT (phút) Area (%) Định danh 1 4.294 0.66 Butyrolactone 2 4.448 0.26 1,2-Cyclopentanedione 3 8.402 3.75 4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- 4 9.789 5.26 Benzofuran, 2,3-dihydro- 5 11.649 3.51 2-Methoxy-4-vinylphenol 6 12.463 1.85 Phenol, 2,6-dimethoxy- 7 14.624 1.35 trans-Cinnamic acid 8 14.734 0.58 Phenol, 2-methoxy-4-(1-propenyl)-,(Z)- 9 21.025 0.30 Phenol, 2,6-dimethoxy-4-(2-propenyl)- 10 22.045 1.35 4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenol 11 27.428 0.50 n-Hexadecanoic acid 12 27.809 0.31 Adenine 13 30.819 1.34 Phytol 14 31.348 0.25 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- 15 31.537 0.64 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)- 16 39.388 0.73 7-(3,4-Methylenedioxy)-tetrahydrobenzofuranone 17 41.958 0.16 Vitamin E Nhận xét: Phương pháp GC–MS định danh được 17 cấu tử trong dịch chiết methanol từ lá cây keo gai. Hầu hết các cấu tử đều có hàm lượng thấp, thành phần hóa học chủ yếu là các acid hữu cơ và dẫn xuất của phenol, ngoài ra có các hợp chất dị vòng chứa oxi. Nhận xét chung: Bằng phương pháp GC–MS, đi từ nguyên liệu lá tươi của cây keo gai, tổng kết quả đã định danh được 56 cấu tử trong 4 dịch chiết khác nhau, bao gồm: alkane, alkene, terpene, arene, ancol, aldehyt, acid, ester, hợp chất dị vòng chứa oxi... Trong đó dịch chiết ethyl acetate định danh được nhiều cấu tử nhất với 29 cấu tử. 3.5. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG GC– MS ĐI TỪ TỔNG CAO METHANOL 3.5.1. Định danh dịch chiết hexane từ tổng cao methanol Kết quả định danh bằng GC–MS dịch chiết hexane theo 17 phương pháp chiết từ tổng cao methanol được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.12. Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết hexane thể hiện ở bảng 3.12. Hình 3.12. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết hexane từ cao methanol Bảng 3.12. Thành phần hóa học trong dịch chiết hexane từ cao methanol STT RT (phút) Area (%) Định danh 1 3.186 0.35 Ethylbenzene 2 3.286 0.34 Benzene, 1,3-dimethyl- 3 30.616 9.67 Phytol 4 40.180 2.99 Squalene 5 40.489 23.86 Nonacosane 6 41.546 9.89 Eicosane 7 41.889 14.73 Vitamin E 8 43.381 5.30 Stigmasta-7,25-dien-3-ol, (3.beta.,5.alpha.)- 9 43.978 3.37 Lup-20(29)-en-3-one 3.5.2. Định danh dịch chiết chloroform từ tổng cao methanol Kết quả định danh bằng GC–MS dịch chiết chloroform theo phương pháp chiết từ tổng cao methanol được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.13. Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết chloroform thể hiện ở bảng 3.14. 18 Hình 3.13. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết chloroform từ cao methanol Bảng 3.14. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform từ cao methanol STT RT (phút) Area (%) Định danh 1 3.204 0.70 Ethylbenzene 2 3.306 0.52 Benzene, 1,3-dimethyl- 3 19.892 0.33 Ethyl citrate 4 26.334 1.56 Hexadecanoic acid, methyl ester 5 30.174 1.18 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, methyl ester 6 30.322 3.12 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- 7 30.614 25.92 Phytol 8 30.989 0.78 Heptadecanoic acid, 16-methyl-, methyl 9 40.486 3.23 Octadecane 10 41.916 11.98 Vitamin E 11 43.376 7.40 Stigmasta-7,16-dien-3-ol, 12 43.975 3.87 Lup-20(29)-en-3-one Nhận xét: Phương pháp GC–MS đã định danh được 12 cấu tử trong dịch chiết chloroform từ cao methanol của lá keo gai, chủ yếu là những cấu tử có độ phân cực yếu, gồm alkane, alkene, alcohol, aren, acid và ester. Nhiều cấu tử có hàm lượng cao hơn so với phương pháp chiết phân lập. Cấu tử có hàm lượng cao nhất là phytol chiếm 25,92%, tiếp theo là vitamin E 11.98%. 3.5.3. Định danh dịch chiết ethyl acetate từ tổng cao methanol Kết quả định danh bằng GC–MS dịch chiết ethyl acetate theo phương pháp chiết từ tổng cao methanol được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.14. 19 Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết ethyl acetate thể hiện ở bảng 3.17. Hình 3.14. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết ethyl acetate từ cao methanol Bảng 3.17. Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate từ tổng cao methanol STT RT (phút) Area (%) Định danh 1 3.201 1.17 Ethylbenzene 2 3.301 1.35 Benzene, 1,3-dimethyl- 3 4.687 0.24 Benzene, 1-ethyl-3-methyl- 4 5.237 0.29 Benzene, 1,3,5-trimethyl- 5 5.761 0.19 Benzene, 1,2,4-trimethyl- 6 21.133 0.83 Pentadecanal 7 26.332 2.72 Hexadecanoic acid, methyl ester 8 30.174 2.11 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, methyl ester 9 30.319 7.37 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- 10 30.633 33.77 Phytol 11 30.986 1.36 Heptadecanoic acid, 16-methyl-, methyl ester 12 40.178 2.29 Squalene 13 41.920 10.49 Vitamin E 14 43.381 2.24 Stigmasta-7,16-dien-3-ol, (3.beta.,5.alpha.)- 15 43.976 1.79 Lup-20(29)-en-3-one Nhận xét: Phương pháp GC–MS định danh được 15 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate từ cao methanol, chủ yếu là những cấu tử có độ phân cực trung bình đến yếu, bao gồm alkene, aren, alcohol, andehyt, ketone, acid và ester; trong đó các cấu tử có hàm lượng cao 20 hơn so với dịch chiết ethyl acetate đi từ mẫu nguyên liệu lá keo gai. Cấu tử có hàm lượng cao nhất là phytol (33,77%), tiếp đến là vitamin E (10.49%). 3.5.4. Định danh dịch chiết methanol từ tổng cao methanol Kết quả định danh bằng GC–MS dịch chiết methanol theo phương pháp chiết từ tổng cao methanol được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.15. Hình 3.15. Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết methanol từ cao methanol Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết methanol từ cao methanol: Không định danh được chất nào. Nguyên nhân là những hợp chất có khả năng định danh được bằng GC-MS đã tan hết trong các dung môi hexane, chloroform và ethyl acetate. Kết quả định danh các dịch chiết hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol theo phương pháp chiết phân lập từ nguyên liệu lá tươi cây keo gai được trình bày ở bảng 3.19. 21 Bảng 3.19. Thành phần hóa học của dịch chiết lá tươi cây keo gai theo phương pháp chiết phân lập STT Cấu tử Hàm lượng (%) 1 3-Hexen-1-ol, (Z)- 1.05 2 Hexanol 0.70 3 Benzene, 1,3-dimethyl- 0.12 4 Styrene 0.10 5 Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl- 0.68 6 Benzofuran, 2,3-dihydro- 5.59 7 Hexadecanal 9.56 8 cis,cis,cis-7,10,13-Hexadecatrienal 0.16 9 cis,cis-7,10,-Hexadecadienal 3.96 10 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- 11.86 11 Oxirane, hexadecyl- 1.10 12 Z-7-Hexadecenoic acid 0.40 13 n-Hexadecanoic acid 12.17 14 Phytol 18.15 15 9,12-Octadecadienoic acid, (Z,Z)- 6.51 16 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)- 8.20 17 Octadecanoic acid 2.14 18 Tetracosane 21.67 19 Octacosane 0.77 20 Squalene 4.74 21 Nonacosane 10.61 22 Vitamin E 36.79 23 Lup-20(29)-en-3-one 2.13 24 3-Hexen-1-ol, (E)- 0.69 25 Limonene 0.12 26 Ethyl citrate 0.45 27 Heneicosane 5.15 28 Oxirane, heptadecyl- 18.66 29 Stigmasta-7,16-dien-3-ol,(3.beta.,5.alpha.)- 5.07 30 1R-alpha-Pinene 0.47 31 3-Hexen-1-ol, acetate, (Z)- 0.59 32 Benzene, 1,2,3,5-tetramethyl- 0.15 33 Naphthalene 0.16 34 Benzene, pentamethyl- 0.19 35 Naphthalene, 1-methyl- 0.57 22 36 Naphthalene, 2-methyl- 0.32 37 Naphthalene, 2,6-dimethyl- 0.43 38 Naphthalene, 1,7-dimethyl- 0.38 39 Naphthalene, 1,4-dimethyl- 0.26 40 Naphthalene, 1,6-dimethyl- 0.20 41 Naphthalene, 1,6,7-trimethyl- 0.27 42 4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenol 2.96 43 Phthalic acid, isobutyl octyl ester 3.94 44 1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono (2-ethylhexyl) ester 0.71 45 Octadecane 2.87 46 1,30-Triacontanediol 3.56 47 Butyrolactone 0.66 48 1,2-Cyclopentanedione 0.26 49 4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- 3.75 50 2-Methoxy-4-vinylphenol 3.51 51 Phenol, 2,6-dimethoxy- 1.85 52 trans-Cinnamic acid 1.35 53 Phenol, 2-methoxy-4-(1-propenyl)-,(Z)- 0.58 54 Phenol, 2,6-dimethoxy-4-(2-propenyl)- 0.30 55 Adenine 0.31 56 7-(3,4-Methylenedioxy)-tetrahydro benzofuranone 0.73 Kết quả định danh các dịch chiết theo phương pháp chiết từ tổng cao methanol được trình bày ở bảng 3.20. Bảng 3.20. Thành phần hóa học của dịch chiết lá tươi cây keo gai theo phương pháp chiết từ tổng cao methanol STT Cấu tử Hàm lượng (%) 1 Ethylbenzene 2.22 2 Benzene, 1,3-dimethyl- 2.21 3 Phytol 69.36 4 Squalene 5.28 5 Nonacosane 23.86 6 Eicosane 9.89 7 Vitamin E 37.20 8 Stigmasta-7,25-dien-3-ol, (3β,5α)- 5.30 9 Lup-20(29)-en-3-one 9.03 23 10 Ethyl citrate 0.33 11 Hexadecanoic acid, methyl ester 4.28 12 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-,methyl ester 5.23 13 9,12,15-Octadecatrienoic acid,methyl ester, (Z,Z,Z)- 10.49 14 Heptadecanoic acid, 16-methyl-, methyl ester 2.14 15 Octadecane 3.23 16 Stigmasta-7,16-dien-3-ol, (3.beta,5.alpha.)- 9.64 17 Benzene, 1-ethyl-3-methyl- 0.24 18 Benzene, 1,3,5-trimethyl- 0.29 19 Benzene, 1,2,4-trimethyl- 0.19 20 Pentadecanal 0.83 Nhận xét chung: Phương pháp chiết phân lập thu được nhiều cấu tử hơn phương pháp chiết từ tổng cao methanol: Có 10 cấu tử giống nhau và đây là những cấu tử chiếm hàng lượng đáng kể và có hoạt tính sinh học cao. 3.6. KIỂM TRA LẠI CÔNG THỨC CẤU TẠO MỘT SỐ CẤU TỬ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT THU ĐƯỢC Dùng phổ MS và phần mềm ChemSketch nhằm xác định và kiểm tra lại những cấu tử có hoạt tính sinh học cao trong các dịch chiết. 3.7. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH Các cao chiết hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol từ lá keo gai được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp pha loãng đa nồng độ. Kết quả cho thấy: Cao chiết hexane, cao chiết chloroform, cao chiết ethyl acetate và cao chiết methanol đều không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật trên ở nồng độ thấp hơn hoặc bằng 128 g/ml. 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: - Đã xác định các thông số hóa lý của nguyên liệu lá keo gai tươi: Độ ẩm trung bình là 51.885%; hàm lượng tro trung bình là 18.265%, hàm lượng kim loại nặng (Pb: 16.9mg/kg; Zn: 356mg/kg; Fe: 797 mg/kg; As: 0.88 mg/kg). Đặc biệt hàm lượng canxi trong lá cây keo gai khá cao 0.48%. - Đã thu được dịch chiết hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol của lá keo gai tươi; với hiệu quả chiết tốt nhất ở các thời gian: hexane: 4 giờ, chloroform: 4 giờ, ethyl acetate: 5 giờ và methanol: 3 giờ. - Đã định danh được một số cấu tử có trong các dịch chiết bằng phương pháp chiết phân lập từ nguyên liệu lá cây keo gai tươi: dịch chiết hexane: 23 cấu tử; dịch chiết chloroform: 15 cấu tử; dịch chiết ethyl acetate: 29 cấu tử; dịch chiết methanol: 17 cấu tử. - Đã định danh được một số cấu tử có trong các dịch chiết bằng phương pháp chiết từ tổng cao methanol: dịch chiết hexane: 9 cấu tử; dịch chiết chloroform: 12 cấu tử; dịch chiết ethyl acetate: 15 cấu tử. Trong đó có những cấu tử có hoạt tính sinh học cao: Vitamin E; phytol; 9,12,15-octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)-; 9,12- octadecadienoic acid, (Z,Z)-; n-hexadecanoic acid. - Bằng phương pháp ChemSketch đã kiểm tra, xác định lại công thức cấu tạo một số cấu tử được định danh bằng phương pháp GC-MS. 2. KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn về ứng dụng của cây keo gai. - Tiếp tục chiết tách bằng các dung môi khác nhau; phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học cao để nâng cao giá trị sử dụng của cây keo gai.