Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

Më §Çu Mét trong nh÷ng t¸c nh©n truyÒn nhòng bÖnh hiÓm nghÌo cho ng­êi nh­ sèt rÐt, sèt xuÊt huyÕt, viªm n·o NhËt B¶n… lµ do muçi g©y ra. Muçi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn rÊt tèt ë nh÷ng vïng cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho nhiÒu loµi c«n trïng ph¸t triÓn nh­ nh÷ng vïng nhiÖt ®íi trong ®ã cã ViÖt Nam . Theo thèng kª cña Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO) th× hµng n¨m, trªn ViÖt Nam thÕ giíi cã tíi hµng triÖu tr­êng hîp m¾c c¸c bÖnh do muçi truyÒn. Riªng ë ViÖt Nam , theo thèng kª 6 th¸ng ®Çu n¨m 2001vÉn cßn 126.000 ca sèt rÐt, 8.700 ca sèt xuÊt huyÕt, trong ®ã 20-25% ca tö vong vµ 60-70% ®Ó l¹i di chøng. C¸c bÖnh hiÓm nghÌo do muçi truyÒn ®· cã mÆt ë hÇu hÕt c¸c tØnh thµnh trong c¶ n­íc lµm ¶nh h­ëng ®Õn t×nh h×nh kinh tÕ x· héi. Bªn c¹nh ®ã, sù tiÒm Èn nguy c¬ bïng næ thµnh dÞch do hiÖn t­îng kh¸ng thuèc cña c«n trïng lµm cho c¸c nhµ qu¶n lý ph¶i cã nh÷ng nç lùc ®Ó thanh to¸n c¸c bÖnh trªn. Së dÜ cã nh÷ng nguy c¬ ®ã lµ do mét thêi gian kh¸ dµi tõ tr­íc nh÷ng n¨m ®Çu cña thËp kØ 80, chóng ta ®· sö dông th­êng xuyªn c¸c ho¸ chÊt ®éc thuéc nhãm l©n h÷u c¬, c¸c chÊt thuéc nhãm Pyrethroid ®Ó tÈm nhuém mµn. §iÒu nµy kh«ng nh÷ng ph¸ vì c©n b»ng sinh th¸i, g©y hiÖn t­îng bïng næ c«n trïng do kh¸ng thuèc mµ cßn ¶nh h­ëng tíi søc khoÎ con ng­êi. Loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis (Bti) ®­îc ph¸t hiÖn vµo n¨m 76 t¹i Israel cã kh¶ n¨ng diÖt muçi ®· më ra mét triÓn väng míi cho viÖc kiÓm so¸t c¸c vect¬ truyÒn bÖnh hiÓm nghÌo cho ng­êi. NhiÒu chÕ phÈm sinh häc diÖt muçi tõ Bacillus thuringiensis var.israelensis ®· ®­îc s¶n xuÊt vµ øng dông thµnh c«ng nh­ Bactimos (BØ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mü)… Theo tæ chøc Y tÕ thÕ giíi th× viÖc sö dông chÕ phÈm sinh häc diÖt muçi tõ c¸c chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis lµ mét biÖn ph¸p rÊt an toµn vµ hiÖu qu¶. ë n­íc ta, viÖc nghiªn cøu vÒ Bacillus thuringiensis var.israelensis míi chØ b¾t ®Çu tõ mét vµi n¨m gÇn ®©y nh­ng còng ®· thu ®­îc nh÷ng kÕt qu¶ ®¸ng kÓ. NhiÒu chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis cã ho¹t lùc cao ®· ®­îc ph©n lËp, mét vµi dßng gen ®· ®­îc nghiªn cøu t¸ch dßng, ®äc tr×nh tù vµ biÓu hiÖn. Chóng ta còng ®· b­íc ®Çu thö nghiÖm thµnh c«ng chÕ phÈm trong ph¹m vi phßng thÝ nghiÖm. Tuy nhiªn viÖc s¶n xuÊt vµ øng dông chÕ phÈm diÖt muçi tõ Bacillus thuringiensis var.israelensis cÇn ph¶i ®­îc nghiªn cøu thªm n÷a. PhÇn I:Tæng quan vÒ Bacillus thuringiensis 1.1. Tãm t¾t vÒ lÞch sö nghiªn cøu vµ øng dông cña Bacillus thuringiensis LÞch sö vÒ Bacillus thuringiensis b¾t ®Çu tõ khi Loius Pasteur ph¸t hiÖn thÊy mét loµi vi khuÈn cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh cho t»m «ng ®Æt tªn lµ Bacillus bombyces. N¨m 1901, Ishiwata ph©n lËp ra mét lo¹i vi khuÈn tõ Êu trïng t»mbÞ bÖnh vµ ®Æt tªn lµ Bacillus sotto, n¨m 1911, Berliner ®· ph©n lËp ®­îc mét lo¹i vi khuÈn t­¬ng tù tõ x¸c Êu trïng b­ím §ÞaTrung H¶i. §Õn n¨m 1915, vi khuÈn nµy chÝnh thøc mang tªn Bacillus thuringiensis . N¨m 1928, Huszddax ph©n lËp chñng B.thuringiensis (Bt ) tõ Ephestia, thö nghiÖm nã trªn s©u ®ôc th©n ng« ë Ch©u ¢u, ®©y ®­îc coi lµ øng dông ®Çu tiªn cña Bacillus thuringiensis .ChÕ phÈm th­¬ng m¹i ®Çu tiªn , Sporeine, ®­îc s¶n xuÊt ë Ph¸p n¨m 1938. N¨m 1951-1956 Steinhaus nghiªn cøu kh¶ n¨ng diÖt c«n trïng cña Bacillus thuringiensis vµ ®· s¶n xuÊt ë Mü. Trong suèt nh÷ng n¨m 1960, nhiÒu chÕ phÈm th­¬ng m¹i cña Bt ®· ®­îc s¶n xuÊt ë nhiÌu quy m« kh¸c nhau t¹i Mü, Ph¸p, §øc.Sau ®ã Howard Dulmage vµ Clayton Beesle cña viÖn nghiªn cøu N«ng NghiÖp USDA ®· thu thËp ®­îc bé s­u tÇm ®Çu tiªn vÒ c¸c chñng Bt. N¨m 1970, Dulmage ®· ph©n lËp ®­îc chñng HD-1 vµ cho ®Õn nay nã vÉn ®­îc sö dông cho nhiÒu nghiªn cøu vµ trong chÕ phÈm Bt. ThËp niªn 80, nhiÒu c«ng ty s¶n xuÊt thuèc trõ s©u vi sinh ®· ®¨ng ký s¶n xuÊt vµ kinh doanh c¸c chÕ phÈm BT. §Çu nh÷ng n¨m 90 t¹i mét sè quèc gia nh­ Cuba, Trung Quèc, Mü ®É s¶n xuÊt chÕ phÈm BT ë quy m« c«ng nghiÖp. Ngµy nay mét sè l­îng lín th­¬ng phÈm trõ s©u sinh häc BT ®­îc sö dông trong viÖc kiÓm so¸t Êu trïng bé c¸nh vÈy, hai c¸nh vµ c¸nh cøng… 1.2. Sù ph©n bè cña B.thuringiensis Bacillus thuringiensis tån t¹i ë kh¾p mäi n¬i trong ®Êt vµ trªn bÒ mÆt l¸, ë ®Êt rõng, th¶o nguyªn, sa m¹c hay ë m«i tr­êng cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho s©u bä ph¸t triÓn nh­ bôi h¹t tõ c¸c nhµ m¸y xay lóa m×, trong c¸c kho b¶o qu¶n ngò cèc…Sù ph©n bè cña Bt lµ kh«ng liªn quan ®Õn sù ph©n bè cña c«n trïng ®Ých. Tuy nhiªn ,Bt th­êng cã xu h­íng tån t¹i nhiÒu trong m«i tr­ßng cã nhiÒu s©u bä ph¸t triÓn vµ giµu dinh d­ìng.Cã thÓ ph©n lËp Bt tõ nhiÒu lo¹i m«i tr­êng kh¸c nhau. Bt dÔ dµng ph¸t triÓn trong m«i tr­êng thÝ nghiÖm chØ víi mét l­îng tèi thiÓu chÊt dinh d­ìng. MÆc dï bµo tö Bt tån t¹i trong nhiÒu n¨m, nh­ng chóng kh«ng n¶y mÇm vµ nh©n lªn nh­ c¸c tÕ bµo sinh d­ìng trong ®Êt tù nhiªn. §iÒu nµy chøng tá r»ng Bt kh«ng thÝch nghi víi m«i tr­êng ®Êt. 1.3. §Æc ®iÓm sinh th¸i cña B.thuringiensis B.thuringiensis lµ thµnh viªn cña nhãm I, chi Bacillus. §©y lµ lo¹i vi khuÈn sinh bµo tö, Gram d­¬ng, h« hÊp hiÕu khÝ hoÆc hiÕu khÝ kh«ng b¾t buéc. TÕ bµo cã kÝch th­íc 3x6
m, cã phñ tiªm mao kh«ng dµy, cã kh¶ n¨ng chuyÓn ®éng , tÕ bµo ®øng riªng rÏ hoÆc xÕp thµnh chuçi. Lµ mét loµi thuéc chi Bacillus nªn khi gÆp ®iÒu kiÖn kh«ng thuËn lîi nh­ thiÕu dinh d­ìng, nhiÖt ®é cao, kh« h¹n…Bt cã kh¶ n¨ng sinh néi bµo tö gióp cho chóng chèng chÞu víi ®iÒu kiÖn kh¾c nghiÖt ®ã. Bµo tö cña vi khuÈn cã d¹ng h×nh trøng víi kÝch th­íc 1,5x2
m vµ cã thÓ n¶y mÇm thµnh tÕ bµo sinh d­ìng khi cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi. Sù h×nh thµnh bµo tö diÔn ra ®ång thêi víi sù t¹o thµnh protein tinh thÓ cã kh¶ n¨ng diÖt c«n trïng. Tinh thÓ cã nhiÒu h×nh d¹ng kh¸c nhau ( h×nh vu«ng, ch÷ nhËt, h×nh th¸p, h×nh «van hoÆc v« ®Þnh h×nh ). Khi tÕ bµo ph©n gi¶i tinh thÓ vµ bµo tö ®­îc gi¶i phãng ra ngoµi. Tinh thÓ cã kÝch th­íc kho¶ng 0,6x0,2
m, vµ cã thÓ chiÕm tíi 30% träng l­îng kh« cña tÕ bµo. Tinh thÓ nµy ®­îc gäi lµ thÓ vïi. Tinh thÓ vµ bµo tö cã thÓ quan s¸t d­íi kÝnh hiÓn vi ®èi pha ë vËt kÝnh ®Çu. Tinh thÓ b¾t mµu sÉm cßn bµo tö kh«ng b¾t mµu nh­ng cã mÐp s¸ng. H×nh d¹ng cña tinh thÓ ®­îc quyÕt ®Þnh bëi gen m· ho¸ cho tæng hîp protein cña tinh thÓ n»m trªn plasmid. 1.4. §Æc ®iÓm sinh ho¸ cña B.thuringiensis Nãi chung B.thuringiensis kh«ng lªn men sinh axÝt ®èi víi arabinoza, xiloza, vµ manitol,khö nit¬rat thanh nit¬rit, cã ph¶n øng víi lßng ®á trøng gµ, ph¸t triÓn ®­îc trong m«i tr­êng th¹ch kÞ khÝ cã chøa 1% lizozym. Sinh tr­ëng tèt nhÊt ë nhiÖt ®é 28-30 0C, pH 6,8-7,2. 1.5.Ph©n lo¹i B.thuringiensis Bt ®­îc chia lµm nhiÒu lo¹i phô dùa trªn c¸c ®Æc ®iÓm sau: + Kh¶ n¨ng h×nh thµnh enzym leucitinase. + CÊu tróc tinh thÓ vµ kh¶ n¨ng g©y bÖnh cho c«n trïng. + §Æc tÝnh huyÕt thanh häc. + Ph¶n øng ng­ng kÕt cña c¸c tÕ bµo sinh d­ìng víi c¸c huyÕt thanh t­¬ng øng. Cho ®Õn nay ph­¬ng ph¸p ph©n lo¹i Bt ®­îc sö dông kh¸ phæ biÕn lµ dùa trªn c¸c ®Æc tÝnh huyÕt thanh häc. §Æc tÝnh huyÕt thanh häc cña chñng Bt ®­îc x¸c ®Þnh chñ yÕu dùa trªn kh¸ng nguyªn tiªn mao H vµ ®­îc tiÕn hµnh b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt c¸c tÕ bµo sinh d­ìng víi c¸c kh¸ng huyÕt thanh t­¬ng øng. Tuy nhiªn viÖc ph©n lo¹i chØ dùa trªn typ huyÕt thanh vÉn ch­a ph¶n ¸nh ®­îc mèi liªn hÖ gi÷a chñng gièng vµ ho¹t lùc diÖt c«n trïng. ViÑc ph©n lËp vµ tuyÓn chän c¸c chñng Bt cã gi¸ trÞ vÉn gÆp khã kh¨n. ChÝnh v× vËy, gÇn ®©y mét sè nhµ khoa häc ®· ®Ò nghÞ ®­a ra ph­¬ng ph¸p ph©n lo¹i míi dùa trªn kÕt qu¶ x¸c ®Þnh typ huyÕt thanh, h×nh d¹ng tinh thÓ, ho¹t lùc diÖt c«n trïng, gen Cry vµ thµnh phÇn protein tinh thÓ, h×nh d¹ng tinh thÓ vµ ho¹t lùc diÖt c«n trïng. B¶ng 1: Quan hÖ gi÷a c¸c líp Cry, h×nh d¹ng tinh thÓ, thµnh phÇn protein vµ ho¹t lùc diÖt c«n trïng. Líp gen  Thµnh phÇn Protein (KDa)  H×nh d¹ng tinh thÓ  Typ huyÕt thanh  Ho¹t lùc diÖt c«n trïng   Cry1A Cry1B Cry1C Cry1D Cry1E  131 138 135 133 133  Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i  1 3 6 7 8  C¸nh vÈy C¸nh vÈy C¸nh vÈy C¸nh vÈy C¸nh vÈy   Cry2A Cry2B  71 71  Trßn Trßn  3 3  C¸nh vÈy, hai c¸nh C¸nh vÈy   Cry3A Cry3B Cry3C Cry3D  73 74 129 73  Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i  8 8 8 8  C¸nh cøng C¸nh cøng C¸nh cøng C¸nh cøng   Cry4A Cry4B Cry4C Cry4D  135 128 78 67  H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu  14 14 14 14  Hai c¸nh Hai c¸nh Hai c¸nh Hai c¸nh   Cry5  81  Th¸p ®«i  3  C¸nh vÈy, c¸nh cøng   Cry6  ?  ?  ?  Giun trßn   CytA  28   14    1.6.C¸c lo¹i ®éc tè do B.thuringiensis sinh ra Trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh bµo tö Bt cã kh¶ n¨ng sinh ra 4 lo¹i ®éc tè: +(-Exotoxin hay ngo¹i ®äc tè A N¨m 1954 lÇn ®Çu tiªn Tomanaff ph¸t hiÖn thÊy vi khuÈn Bt var.elesti s¶n sinh ra enzym leucintinase. T¸c ®éng ®éc cña enzym nµy liªn quan ®Õn sù ph©n huû mang tÝnh chÊt c¶m øng cña phospholopit trong m« cña c«n trïng, lµm c«n trïng chÕt.Enym nµy lÇn ®Çu tiªn liªn kÕt víi tÕ bµo ruét sau ®ã t¸ch ra vµ ®­îc ho¹t ho¸ bëi mét chÊt kh«ng bÒn nhiÖt. ChÊt nµy cã träng l­îng ph©n tö thÊp, cã thÓ lµ lipit. (-Exotoxin cã kh¶ n¨ng hoµ tan vµo n­íc vµ ®Æc biÖt chØ t¸c ®éng vµo loµi ong xÎ cã pH ®­êng ruét phï hîp víi ho¹t ®«ng cña enzym nµy. (-Exotoxin còng cã hiÖu lùc víi s©u thuéc bé c¸nh cøng, c¸nh vÈy… +(-Exotoxin hay ngo¹i ®äc tè B §äc tè nµy bÒn nhiÖt ë 1200C trong vßng 15 phót vÉn gi÷ ®­îc ho¹t tÝnh. Mét sè Bt kh«ng sinh ra tinh thÓ ®éc nh­ng cã thÓ sinh ra ngo¹i ®éc tè (. Ho¹t tÝnh cña ngo¹i ®éc tè ( b¾t ®Çu xuÊt hiÖn trong giai ®o¹n ph¸t triÓn m¹nh tr­íc khi h×nh thµnh bµo tö. Ngo¹i ®éc tè lµ mét nucleotid cã träng l­îng ph©n tö thÊp. Ngo¹i ®éc tè ( cßn cã t¸c dông céng h­ëng víi néi ®éc tè (, sau khi cã t¸c dông g©y dËp vì, ph¸ huû hoµn toµn biÓu m« ruét gi÷a cña «n trïng mÉn c¶m, ngo¹i ®éc tè nhanh chãng x©m nhËp vµo huyÕt t­¬ng vµ m¸u g©y thay ®æi sinh lý dÉn tíi c¸i chÕt nhanh cña c«n trïng. +(-exotoxin hay ®éc tè tan trong n­íc (-exotoxin thuéc nhãm photpholipaza, nã t¸c ®éng lªn photpholipit vµ gi¶i phãng ra axit bÐo (-exotoxin cã chøa c¸c peptid víi träng l­îng ph©n tö thÊp vµ mét sè axitamin tù do. Ngo¹i ®éc tè nµy tan trong n­íc, kh«ng æn ®Þnh, mÉn c¶m víi ¸nh s¸ng, oxy, kh«ng khÝ vµ nhiÖt ®é. +(-endotoxin (tinh thÓ ®éc) §Æc ®iÓm quan träng nhÊt cña vi khuÈn Bt lµ cã kh¶ n¨ng t¹o thµnh trong tÐ bµo mét lo¹i tinh thÓ cã b¶n chÊt lµ protein ®éc tÝnh ®èi víi nhiÒu lo¹i c«n trïng. Néi ®éc tè (lµ mét lo¹i protein kÕt tinh tõ 1180 gèc axitamin. C¸c axitamin chñ yÕu gåm axit glutamic, axit asparaginic chiÕm trªn 29% tæng sè axitamin trong ph©n tö protein, lµ nguyªn nh©n g©y ®iÓm ®¼ng ®iÖn thÊp. Nguyªn tè cña tinh thÓ, ngoµi C, H, O, N, S cßn thÊy mét sè nguyªn tè kh¸c nh­ lµ Ca, Mg, Si, Fe… víi mét l­îng nhá Ni, Zn, Al… vµ hÇu nh­ kh«ng cã P. Sù tæng hîp tinh thÓ xÈy ra kho¶ng 3 giê sau pha c©n b»ng. Mçi tÕ bµo sinh bµo tö chØ cã thÓ cã tõ 1 ®Õn 3 tinh thÓ ®éc. Tinh thÓ ®éc kh«ng tan trong dung m«i h÷u c¬. Cã nh÷ng tinh thÓ khi míi t¸ch khái bµo tö chØ tan trong pH rÊt kiÒm. Tinh thÓ ®äc rÊt bÒn nhiÖt,ñ 1 giê ë 650C vÉn kh«ng bÞ mÊt ho¹t tÝnh, tÝnh ®éc chØ mÊt ®i nÕu ñ ë 1000C trong 30-40 phót. 1.7. Ph©n lo¹i gen ®éc tè diÖt c«n trïng cña B.thuringiensis Ngµy nay ng­êi ta ®· ph©n tÝch 50 gen ®éc tè cña Bt vµ nhËn thÊy mét sè hoµn toµn gièng nhau, ®¹i diÖn cho cïng mét gen hay biÕn d¹ng tõ mét gen. Trong ®ã cã kho¶ng 20 gen ph©n biÖt chÞu tr¸ch nhiÖm tænh hîp c¸c protein tinh thÓ, nhÊt lµ c¸c protein tinh thÓ ®éc. B¶ng 2. Ph©n lo¹i gen ®éc tè vµ phæ t¸c dông cña Bt Tªn ®éc tè  Träng l­îng ph©n tö, kDa  C«n trïng ®Ých  Chñng Bacillusthuringiensis  H×nh d¹ng tinh thÓ   Cry1A(a, b, c) Cry1B Cry1C Cry1D, E, F  130-133 138 135 130-134  C¸nh vÈy C¸nh vÈy Hai c¸nh Hai c¸nh  B. berliner B. kurstaki KTO B. entomocidus B. aizawai  L­ìng th¸p   Cry2A Cry2B, C  71 71  C¸nh vÈy Hai c¸nh  B. aizawai B. kurstaki HD-1  LËp ph­¬ng   Cry3A, B, C, D  66-73  C¸nh cøng  B. tenebrionis  Thoi dÑt   Cry4A, B Cry4C, D  125-140 68  Hai c¸nh  B. morrisoni PG14 B. israelensiss  CÇu Ch÷ nhËt   Cry5A Cry5C  81  Hai c¸nh C¸nh cøng  B. kurstaki JHCC  L­ìng th¸p   Cry6  44  Giun trßn  B. thãmponi  L­ìng th¸p   PhÇn II. Tæng quan vÒ Bacillus thuringiensis var.israelensis 2.1. LÞch sö ph¸t triÓn cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis Bacillus thuringiensis ®­îc chia lµm nhiÒu loµi phô. Theo bé s­u tËp cña trung t©m Bacillus diÖt c«n trïng Quèc tÕ, ViÖn Pasteur Paris n¨m 1996,®· cã tíi h¬n 69 loµi phô kh¸c nhau nh­: c¸nh vÈy, c¸nh cøng, hai c¸nh. ë mét sè loµi phô cña Bacillus thuringiensis var.berliner, Bacillus thuringiensis var.thompsoni… Kh¸c víi loµi Bacillus thuringiensis, loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis míi ®­îc ph¸t hiÖn gÇn ®©y. Loµi phô nµy cã t¸c dông diÖt Êu trïng muçi. C¸c nhµ khoa häc Goldberg, Margarit lµ nh÷ng ng­êi ®Çu tiªn ph©n lËp, nghiªn cøu loµi vi khuÈn nµy vµ De Bajac ®Æt tªn cho lµ Bacillus thuringiensis var.israelensis. Hä ®· ph©n lËp vµ nu«i cÊy,thö ho¹t lùc diÖt Èutïng muçi víi hµng tr¨m chñng kh¸c nhau. Tuy nhiªn chØ cã mét sè chñng cã ho¹t lùc diÖt c¸c loµi muçi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti vµ Anopheles sergentti… Chñng ®Çu tiªn ®ã ®­îc kÝ hiÖu lµ ORN-60A vµ thuéc typ huyÕt thanh H14. Kh¶ n¨ng sinh ®éc tè vµ t¸c dông diÖt muçi cña vi khuÈn nµy ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh c«ng bè. Ngµy nay ®· cã rÊt nhiÒu chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis ®­îc t×m thÊy vµ ®­îc ph©n lo¹i lµm phong phó thªm bé s­u tËp vÒ Bacillus diÖt c«n trïng. C¸c chñng th­êng ®­îc sö dông trong viÖc s¶n xuÊt chÕ phÈm sinh häc diÖt muçi víi c¸c tªn gäi kh¸c nhau: Bactimos (BØ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mü)… chÕ phÈm d¹ng láng, d¹ng bét thÊm n­íc, d¹ng viªn, b¸nh næi cã t¸c dông diÖt Êu trïng cña nhiÒu loµi ruåi muçi trong ®ã cã loµi Aedes Aegypti ( lµ vect¬ truyÒn bÖnh sèt xuÊt huyÕt). ChÕ phÈm Bacillus thuringiensis var.israelensis cã t¸c dông tèt trong m«i tr­êng n­íc s¹ch, n­íc kh«ng tï ®äng hoÆc n­íc cã nång ®é muèi lo·ng vµ ®­îc Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi lùa chän ®Ó diÖt trõ c¸c vect¬ truyÒn bÖnh sèt rÐt, sèt xuÊt huyÕt ë c¸c n­íc nhiÖt ®íi. 2.2.§Æc ®iÓm ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis Bacillus thuringiensis var.israelensis lµ loµi phô cña loµi Bacillus thuringiensis. De Bajac lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis thuéc typ huyÕt thanh H14. Tuy nhiªn vµo n¨m 1988, Ohba vµ Aiawa (NhËt B¶n) ®· ph©n lËp ®­îc hai chñng Bacillus thuringiensis thuéc typ huyÕt thanh H14 nh­ng l¹i kh«ng cã ho¹t lùc diÖt muçi, ruåi ®en. Tr­íc ®ã (n¨m 1982) Pachun vµ céng sù ®· ph©n lËp ®­îc chñng PG-14 thuéc typ huyÕt thanh H8A,B cã ho¹t lùc cao ®èi víi Êu trïng muçi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti vµ Anopheles sergentti… Do ®ã nÕu chØ dùa trªn ®Æc diÓm typ huyªt thanh th× kh«ng thÓ ®¶m b¶o ®­îc ph©n lo¹i mét c¸ch chÝnh x¸c mµ ph¶i dùa trªn nh÷ng ®Æc ®iÓm kh¸c nhau nh­ líp Cry, thµnh phÇn vµ h×nh d¹ng protein tinh thÓ. Hofte vµ Whiteley lµ nh÷ng ng­êi ®Çu tiªn ®­a ra ý t­ëng ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis dùa trªn sù kÕt hîp cña tÊt c¶ c¸c ®Æc ®iÓm: gen Cry, thµnh phÇn vµ h×nh d¹ng protein tinh thÓ, ho¹t lùc diÖt c«n trïng vµ typ huyÕt thanh. ý t­ëng nµy ®½ ®­îc rÊt nhiÒu nhµ khoa häc h­ëng øng vµ ®­îc sö dông chñ yÕu cho ®Õn nay ®Ó ph©n lo¹i Bacillus thuringiensis var.israelensis. B¶ng 3: §Æc ®iÓm ph©n lo¹i cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis (theo Hofte vµ Whiteley, 1989). Líp gen Cry  Thµnh phÇn protein(KDa)  H×nh d¹ng tinh thÓ  Typ huyÕt thanh  Ho¹t lùc diÖt c«n trïng   Cry4A Cry4B Cry4C Cry4D Cyt  135 138 78 67 28  H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu H×nh cÇu  H14 H14 H14 H14 H14  Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en Muçi, ruåi ®en   2.3.Protein diÖt muçi cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis Sù h×nh thµnh protein tinh thÓ Bacillus thuringiensis th­êng xÈy ra trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh bµo tö vµ nhiÒu nghiªn cøu gÇn ®©y ®· cho thÊy nã cã liªn quan mËt thiÕt tíi sù cã mÆt cña DNA plasmit. Gen m· ho¸ protein ®éc th­êng n»m trªn c¸c pl¸mid cì lín trªn 3 kb gåm mét phÇn lµ genm· ho¸ protein ®éc vµ phÇn cßn l¹i m· ho¸ protein liªn quan ®Õn tÝnh g¾n. Khi nghiªn cøu c¸c c¸ch chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis cã ho¹t lùc ®èi víi c«n trïng thuéc bé hai c¸nh, ng­êi ta thÊy protein ®éc cña chóng bao gåm c¸c tiÓu phÇn protein cã träng l­îng ph©n tö: 130 KDa, 128 KDa, 78 KDa, 6 KDa , 28 KDa do c¸c líp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D vµ Cyt m· ho¸ tæng hîp nªn.§©y còng chÝnh lµ ®Æc ®iÓm quan träng nhÊt ®Ó ph©n biÖt loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis víi c¸c loµi kh¸c. Nhãm Cry4 m· ho¸ tæng hîp c¸c protein tinh thÓ cã träng l­îng 130, 128, 78 vµ 67 KDa,
cã kÝch th­íc th«ng th­êng kho¶ng tõ 0.7-1.2
m. Nhãm gen Cry4 m· ho¸ tæng hîp c¸c protein tinh thÓ cã träng l­îng 130, 128, 78vµ 67 kDa cã kÝch th­íc th«ng th­êng ®¹t tõ 0.7-1.2
m. Nhãm gen Cyt bao gåm hai líp CytA vµ CytB th­êng tån t¹i ë c¸c chñng Bacillus thuringiensis mang nhãm gen Cry4 vµ tæng hîp c¸c protein cã träng l­îng ph©n tö kho¶ng 28 kDa. C¸c chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis th­êng tæng hîp c¸c tinh thÓ protein h×nh cÇu chØ g©y ®éc ®èi víi bé c«n trïng hai c¸nh. Tinh thÓ ®éc cña Bti gåm ba lo¹i thÓ vïi protein kh¸c nhau g¾n víi nhau b»ng c¸c líp vá bäc. Mçi thÓ vïi ®­îc b¶o qu¶n bëi mét hay nhiÒu líp nguyªn liÖu gièng thµnh phÇn vá bäc mµ ®©y còng lµ mét ®Æc ®iÓm chØ cã vá Bacillus thuringiensis var.israelensis gióp cho tinh thÓ ®éc vÉn gi÷ ®­îc tÝnh ®éc víi c«n trïng d­íi t¸c dông cña proteaza cïng mét sè ho¸ chÊt kh¸c mµ cô thÓ nh­ sau : Protein 28kDa cã trong thÓ vïi lín nhÊt (chiÕm kho¶ng 40-50% tinh thÓ). Nã thÓ hiÖn râ trªn gen polyarclamide (SDS-PAGE) bëi tÝnh hßa tan cña nã cao h¬n h¼n c¸c protein kh¸c. §èi víi protein nµy d­íi t¸c dông cña enzyme proteaza, nã bÞ thuû ph©n thµnh protein cã träng l­îng chØ cßn lµ 25kDa vµ ho¹t tÝnh diÖt Êu trïng muçi rÊt thÊp. Protein 67kDa cã trong thÓ vïi líp thø hai chiÕm kho¶ng 15-20% tinh thÓ. Còng gièng nh­ tiÓu phÇn 28 kDa th× protein nµy còng bÞ thuû ph©n thµnh c¸c tiÓu phÇn nhá h¬n 31kDa, 35kda bëi enzyme proteaza vµ ho¹t tÝnh ®èi víi Êu trïng muçi còng kÐm. Cuèi cïng c¸c protein 128kDa vµ 135kDA cã trong thÓ vïi nhá nhÊt, bÞ ph©n huû thµnh c¸c nh©n ®éc 58-73 kDa d­íi t¸c dông cña proteaza nh­ng cã ho¹t lùc diÖt Êu trïng muçi cao nhÊt. HiÖn nay protein nµy ®ang ®­îc tËp trung nghiªn cøu nhiÒu nhÊt vµ ng­êi ta cho r»ng hai protein nµy lµ thµnh phÇn quan träng ®èi víi ho¹t lùc diÖt Êu trïng cña tinh thÓ. C¸c thö nghiÖm thùc tÕ b»ng c¸ch t¸ch riªng rÏ tõng lo¹i protein tinh thÓ cña Bacillus thuringiensis var.israelensis cho thÊy r»ng c¸c protein 28, 67, 128, 135 kDa ®Òu cã ho¹t tÝnh ®éc ®èi víi Êu trïng muçi. Tuy nhiªn , Chichott vµ Ellar ®· chøng minh r»ng viÖc sö dông c¶ 4 lo¹i protein tinh thÓ sÏ cho hiÖu qu¶ cao h¬n do cã sù t¸c ®éng qua l¹i gi÷a 2 hay nhiÒu protein. B¶ng 3: So s¸nh ho¹t lùc diÖt Êu trïng muçi Aedes aegypti cña protein riªng rÏ vµ hçn hîp protein ( theo Chichott vµ Ellar ,1988 ) ChÕ phÈm  LC50 (
g/ml )   Hçn hîp tinh thÓ  0,32   Tinh thÓ hoµ tan  1,0   Protein 130 kDa  32,0   Protein 67 kDa  4,0   Protein 28 kDa  115,0   PhÇn III . C¬ chÕ g©y ®éc cña protein tinh thÓ do Bacillus thuringiensis var.israelensis tæng hîp Knowles ®· nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña mét sè chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis lªn tÕ bµo c«n trïng th× cã thÓ thÊy r»ng c¬ chÕ ho¹t ®éng cña tinh thÓ ®éc chñ yÕu diÔn ra trong ruét cña c«n trïng. Bëi khi nuèt ph¶i tinh thÓ (hay gäi lµ tiÒn ®éc tè) d­íi t¸c dông cña pH cao vµ enzyme proteaza cña ®­êng ruét mµ tinh thÓ ®­îc hoµ tan, thuû ph©n vµ ho¹t ho¸ thµnh c¸c nh©n ®éc cã ho¹t tÝnh. Sau ®ã c¸c nh©n tè ®éc nµy b¸m dÝnh lªn tÕ bµo th­îng b× ruét, lµm ph¸ huû cÊu tróc tÕ bµo ruét vµ t¹o nªn c¸c lç rß rØ. V× vËy, trong ruét c«n trïng cã sù chªnh lÖch ¸p suÊt thÈm thÊu gi÷a ruét c«n trïng víi m«i tr­êng ngoµi t¹o ®iÒu kiÖn cho c¸c ion còng nh­ n­íc khuÕch t¸n tõ ngoµi vµo g©y nªn sù ph×nh cña tÕ bµo ruét. Cuèi cïng c«n trïng ngõng ¨n sau 1 giê vµ sau 4 giê xö lý th× c«n trïng trë nªn chËm ch¹p vµ chÕt h¼n sau 6 giê. PhÇn IV .H­íng më Gen Cry4 ®­îc cÊu thµnh tõ nhãm gen kh«ng ®ång nhÊt gåm c¸c gen Cry4A, B, C, D m· hãa cho sù tæng hîp c¸c protein cã träng lu¬îng ph©n tö kh¸c nhau 133,4 kDa ;127,8kDa; 77,8kDa vµ 72,4kDa. Hai gen Cry4A, Cry4B m· ho¸ tæng hîp protein cã träng l­îng ph©n tö xÊp xØ 130kDa. Protein nµy d­íi t¸c dông cña enzyme protease sÏ ph©n gi¶i thµnh c¸c nh©n tè ®éc 53-67 kDa cã ho¹t lùc diÖt muçi rÊt cao. VÞ trÝ ph©n gi¶i cña protein nµy vÉn ch­a ®­îc x¸c ®Þnh. Gen Cry4C m· hãa tæng hîp protein 77,8 kDa vµ mét sè t­¬ng ®ång víi ®Çu 5’ cña gen Cry4A, Cry4B. Khi g¾n gen nµy vµo vi khuÈn Bacillus sudtilÝ hoÆc mét trong thÓ Bacillus thuringiensis var.israelensis ®ét biÕn kh«ng ®éc th× gen nµy trùc tiÕp tæng protein ®éc tè 58 kDa, t­¬ng tù protein ®éc tè 58kDa cña Bacillus thuringiensis var.israelensis. Gen Cry4D m· hãa tæng hîp protein 72,4 kDa lµ thµnh phÇn chñ yÕu trong tinh thÓ cña Bacillus thuringiensis var.israelensis . D­íi t¸c dông cña enzyme protease, protein nµy ph©n gi¶i thµnh nh©n ®éc30 kDa vµ vÞ trÝ ph©n gi¶i còng ch­a ®­îc x¸c ®Þnh. Gen Cry4A, B, C cã sù t­¬ng ®ång rÊt lín, trong khi ®ã møc ®é t­¬ng ®ång víi gen Cry4D rÊt thÊp. C¸c gen Cry4A, B, C, D ph©n lËp tõ Bacillus thuringiensis var.israelensis ®Òu ®· ®­îc nghiªn cøu biÕn n¹p riªng rÏ vµo E.coli. C¸c thÓ t¸i tæ hîp mang c¸c gen Cry ®Òu cã kh¶ n¨ng tæng hîp protein ®éc tè nh­ng chØ cã protein do gen Cry4B cã tÝnh ®éc cao ®èi víi Êu trïng. Bacillus megaterium còng ®­îc sö dông nh­ chñng chñ ®Ó biÕn n¹p gen Cry4D, tæng hîp protein 70 kDa. Tuy nhiªn tÝnh ®éc cña thÓ t¸i tæ hîp vÉn thÊp h¬n chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis ban ®Çu. Nh÷ng thÓ t¸i tæ hîp Bacillus thuringiensis var.israelensis (chñng ®ét biÕn kh«ng cã tinh thÓ, kh«ng ®éc) mang gen Cry4D tæng hîp protein 70 kDa cña chñng Bacillus thuringiensis morrisoni Pg14 biÓu hiÖn tÝnh ®éc cao. Gen Cry4D còng ®· ®­îc t¸ch vµ biÓu hiÖn trong tÕ bµo Bacillus subtilis vµ Bacillus sphaericus 2362. §iÒu ®¸ng chó ý lµ khi thö nghiÖm ®éc tè cña thÓ t¸i tæ hîp víi Aedes aegypty th× kÕt qu¶ thu ®­äc cho thÊy ®éc tè cña thÓ t¸i tæ hîp cã tÝnh ®éc gÊp 100 lÇn so víi chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis. Thùc chÊt sù t¨ng tÝnh ®éc mét c¸ch bÊt th­êng cña thÓ t¸i tæ hîp nµy lµ do mét m×nh protein 128 kDa hay lµ cã sù t­¬ng t¸c gi÷a protein nµy víi thµnh phÇn bµo tö cña hai chñng Bacillus subtilis vµ Bacillus sphaericus 2362 ®Õn nay vÉn ch­a ®­îc lý gi¶i. DelÐcluse cïng céng sù (1993) ®· tiÕn hµnh t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen Cry4A, B trªn chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis t¸i tæ hîp 4Q2-81. KÕt qu¶ cho thÊy chñng t¸i tæ hîp khi mang gen Cry4B th× s¶n sinh c¸c thÓ vïi nhá h¬n so víi chñng gèc cßn khi mang gen Cry4A th× hÇu nh­ kh«ng nh×n thÊy thÓ vïi. Tuy nhiªn dÞch nu«i cÊy bµo tö trong c¶ hai tr­êng hîp ®Òu g©y ®éc ®èi víi Êu trïng muçi. Kh«ng chØ dõng ë viÖc biÓu hiÖn gen Cry4 trªn c¸c chñng vi khuÈn, nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi ®· tiÕn hµnh biÓu hiÖn gen m· hãa protein diÖt muçi trªn t¶o lam.§©y lµ mét h­íng nghiªn cøu cã rÊt nhiÒu triÓn väng ®èi víi viÖc s¶n xuÊt chÕ phÈm bëi v× nã sÏ kh¾c phôc ®­îc nh÷ng nh­îc ®iÓm cña chÕ phÈm th«ng th­êng nh­ : l¾ng nhanh trong m«i tr­êng n­íc dÉn tíi hiÖu qu¶ tiªu thô cña Êu trïng muâi khong cao, nhanh chãng mÊt ho¹t l­c bëi tia tö ngo¹i trong ¸nh n¾ng mÆt trêi… Nh÷ng nghiªn cøu ban ®Çu ®èi víi chñng t¶o lam Anabaena PCC7120 cho thÊy tao lam ®­îc chuyÓn gen m· hãa protein diÖt muâi thu ®­îc tõ c¸c chñng Bti cã thÓ giÕt t¬i 91% sè Êu trïng muçi Aedes aeggypti ®em ®i thö nghiÖm trong vßng 24 giê. Khi tiÕn hµnh chuyÓn gen Cry4A, Cry11A vµo t¶o lam Anabaena PCC7120 (mét nguån thøc ¨n quan träng cña Êu trung muçi )th× htÊy ho¹t lùc diÖt Êu trïng muçi vÉn ®­îc b¶o vÖ khái ¶nh h­ëng cã h¹i cña tia UV-B trong ¸nh s¸ng mÆt trêi (nh÷ng tia tö ngo¹i cã b­íc sãng 280-330nm vµ kh«ng bÞ h¸p thô bëi tÇng ozone ). Ngoµi viÖc nghiªn cøu t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen Cry4 cña c¸c chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis , c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng ®Õn viÖc biÓu hiÖn cña gen Cry4 còng ®­îc nghiªn cøu. Theo b¸o c¸o gÇn ®©y nhÊt cña Trung t©m Quèc tÒ vÒ c«ng nghÖ Gen vµ c«ng nghÖ sinh häc (ICGEB) th× sù biÓu hiÖn cña gen Cry4 ®­îc biÓu hiÖn cña gen Cry4A bÞ ®iÒu khiÓn bái nh÷ng nh©n tè dinh d­ìng nh­ glucose vµ phosphat v« c¬ th«ng qua con ®­êng ®iÒu hoµ tæng sè cña sù øc chÕ dÞ hãa. Trong vi khuÈn Gram (+) th× sù øc chÕ dÞ hãa bÞ gi¸n tiÕp bëi mät phosphoprotein – Hpr ho¹t ®éng nh­ lµ mét ph©n tè ®iÒu hßa phiªn m· trong suèt qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen. Nghiªn cøu vÒ sù phosphoryl hãa vµ dophosphoryl hãa phô thuéc glucose vµ mèi t­¬ng quan víi sù biÓu hiÖn cña gen Cry4A còng ®· ®­îc tiÕn hµnh. ThÝ nghiÖm víi chñng Bti ®ét biÕn kh«ng s¶n sinh Hpr th× thÊy chñng nµy Ýt nh¹y c¶m víi glucose vµ phosphat v« c¬ h¬n so víi chñng gèc ban ®Çu. HiÖu qu¶ ®­îc quan s¸t ë c¸c møc ®é protein vµ mRNA ®· chøng minh r»ng sù phosphoryl hãa Hpr gi÷ mét vai trß quan träng trong sù øc chÕ glucose trong suèt qu¸ tr×nh biÓu hiÖn cña gen Cry4A. KÕt luËn Do thêi gian lµm tiÓu luËn cßn nhiÒu h¹n hÑp, cïng víi kiÕn thøc cßn nhiÒu h¹n chÕ nªn tiÓu luËn cña em cßn nhiÒu thiÕu sãt kh«ng tr¸nh khái. Em mong thÇy chØ b¶o tËn t×nh, gióp em söa ch÷a c¸c sai sãt Êy ®Ó em cã thªm nh÷ng kiÕn thøc bæ Ých vÒ Bacillus thuringiensis nãi chung vµ Bacillus thuringiensis var.israelensis nãi riªng. Em xin ch©n thµnh c¶m ¬n ! tµi liÖu tham kh¶o 1. Ng« §×nh Quang BÝnh, NguyÔn Quúnh Ch©u, NguyÔn V¨n Th­ëng, NguyÔn ¸nh NguyÖt, TrÞnh ThÕ C­êng, Ng« §×nh Anh TrÝ, Jasser Mohamad Jamil, NguyÔn Hoµi Tr©m, 2000. Nghiªn cøu sù ph©n bè vµ ®a d¹ng sinh häc cña B.thuringiensis ph©n lËp tõ mét sè tØnh ë ViÖt Nam. Nh÷ng vÊn ®Ò nghiªn cøu c¬ b¶n trong sinh häc. NXB §¹i häc Quèc gia Hµ Néi. 2. NguyÔn L©n Dòng, 1981. Vi sinh vËt häc. NXB khoa häc kü thuËt. 3. Vâ ThÞ Thø vµ céng sù, 1999. Ph©n lËp vµ tuyÓn chän chñng Bacillus thuringiensis var.israelensis cã ho¹t lùc cao víi Êu trïng muçi Aedes Aegypti. Héi nghÞ C«ng nghÖ Sinh häc toµn quèc. 4.Hofte.H and Whiteley H.R, 1989. Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis. Microbiol.Rev. Môc lôc Më §Çu 1 PhÇn I:Tæng quan vÒ Bacillus thuringiensis 3 1.1. Tãm t¾t vÒ lÞch sö nghiªn cøu vµ øng dông cña Bacillus thuringiensis 3 1.2. Sù ph©n bè cña B.thuringiensis 3 1.3. §Æc ®iÓm sinh th¸i cña B.thuringiensis 4 1.4. §Æc ®iÓm sinh ho¸ cña B.thuringiensis 4 1.5.Ph©n lo¹i B.thuringiensis 5 1.6.C¸c lo¹i ®éc tè do B.thuringiensis sinh ra 6 1.7. Ph©n lo¹i gen ®éc tè diÖt c«n trïng cña B.thuringiensis 8 PhÇn II. Tæng quan vÒ Bacillus thuringiensis var.israelensis 9 2.1. LÞch sö ph¸t triÓn cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis 9 2.2.§Æc ®iÓm ph©n lo¹i loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis 10 2.3.Protein diÖt muçi cña loµi phô Bacillus thuringiensis var.israelensis 11 PhÇn III . C¬ chÕ g©y ®éc cña protein tinh thÓ do Bacillus thuringiensis var.israelensis tæng hîp 14 PhÇn IV .H­íng më 15 KÕt luËn 18 tµi liÖu tham kh¶o 19