Trích ly Collagen và ứng dụng

MỤC LỤC 1. Tổng quan về collagen 4 2. Các loại collagen và cấu tạo của chúng 6 3. Thành phần các acid amin có trong collagen 9 4. Tính chất của collagen 9 4.1 Tác dụng với nước 9 4.2 Tác dụng với acid, kiềm 10 4.3 Các tính chất khác của collagen 11 4.3.1 Khả năng tạo nhũ tương 11 4.3.2 Khả năng hòa tan 11 4.3.3 Sự biến tính 11 4.3.4 Tính kị nước 12 4.3.5 Tính chất của dung dịch keo 12 4.3.6 Tính chất điện ly lưỡng tính 12 5. Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen 12 6. Quy trình công nghệ của trích ly collagen từ da cá tra 13 6.1 Phương pháp hóa học 13 6.2 Phương pháp dùng enzyme 16 7. Các ứng dụng của collagen 18 7.1 Trong công nghiệp thực phẩm 18 7.2 Trong mỹ phẩm 19 7.3 Trong y học và dược phẩm 19 8. Thành tựu 21 8.1 Nghiên cứu trích ly collagen bằng enzyme collagenase kết hợp với acid 21 8.1.1 Mở đầu 21 8.1.2 Cách tiến hành 21 8.1.3 Kết quả 23 8.1.4 Kết luận 24 8.2 Nghiên cứu ứng dụng của collagen trong lĩnh vực y khoa: Tổng hợp polymer-collagen hydrogel để làm chất tải thuốc và dùng trong công nghệ mô 25 8.2.1 Mở đầu 25 8.2.2 Giới thiệu 25 8.2.3 Tổng quan 26 8.2.4 Tổng hợp hydrogel 29 8.2.5 Kết quả 31 8.2.6 Bàn luận 42 8.2.7 Kết luận 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC HÌNH Hình 11: Cấu trúc lớp hạ bì của da 5 Hình 12: Các liên kết sợi ở collagen 5 Hình 21: Cấu trúc phân tử collagen 7 Hình 22: Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen 7 Hình 23: Từng bậc cấu trúc trong chuỗi collagen 8 Hình 24: Tổ chức bó sợi collagen 8 Hình 61: Quy trình chiết collagen bằng acid acetic 14 Hình 62: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá. (Điện di trên 5% gel chứa urea 3,5M). (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu 15 Hình 63: Quy trình chiết collagen bằng pepsin 16 Hình 71: HANAMAI COLLAGEN: sản phẩm dạng bột, được trộn chung với đậu hủ hay natto dùng trong bữa ăn của các phụ nữ Nhật. 18 Hình 72: Tóc bị hư tổn và phục hồi sau khi sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen hydrolysate. 19 Hình 73: Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng ((a): vết bỏng mới trước khi sử dụng collagen, (b): sau 3 ngày sử dụng, (c): sau 10 ngày sử dụng) 20 Hình 74: Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa 21 Hình 81: Cấu trúc của polymer PEO-PPO-PEO 23 Hình 82: Quá trình tạo micelle 24 Hình 83: Lược đồ phương pháp chế tạo hydrogel tổng hợp 26 Hình 84: Mẫu hydrogel C-F108 (1%) ở các vị trí khác nhau 26 Hình 85: Hình ảnh SEM cấu trúc của A) Collagen gel; B) C-L103 (1%); C) C-L103 (3%); D) C-L103 (5%); E) C-F108 (1%); F) C-F108 (3%); G) C-F108 (5%) khi nồng độ collagen là 3,2 mg/ml (độ phóng đại: 2500) 29 Hình 86: So sánh sự phóng thích của FITC-dextran trong hydrogel collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 và 15% 30 Hình 87: So sánh sự phóng thích của FITC-dextran trong hydrogel collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 và 15% 30 Hình 88: So sánh sự phóng thích của FITC-dextran trong hydrogel collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30% và 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10% 31 Hình 89: Tế bào K562 trên A) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) B) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) ở những nồng độ khác nhau đo bằng cách bổ sung Alamar blue. Giá trị trung bình được sử dụng trên đồ thị. Thanh sai số thể hiện sai số chuẩn của giá trị trung bình (n = 3) 31 Hình 810: A) Tế bào K562 trên ma trận hydrogel C-F108 (1%) sau 1 tuần B) Hình ảnh SEM của tế bào K562 trên C-F108 (1%) sau khi liên kết với glutaraldehyde (2%) (độ phóng đại 2500) 32 Hình 811: Hình ảnh điện di của BSA tinh khiết và BSA-PPG diglycidyl ether liên kết dọc trong môi trường ở những thời điểm khác nhau 32 Hình 812: Hình ảnh điện di của collagen tinh khiết và collagen diglycidyl ether trong môi trường ở những thời điểm khác nhau 33 Hình 813: Hình ảnh SEM của collagne tinh khiết ở các độ phóng đại khác nhau 33 Hình 814: Hình ảnh SEM của PG-COLc20 ở các độ phóng đại khác nhau 34 Hình 815: A) Đường cong TGA của PPG diglycidyl ether tinh khiết; B) Đường cong TGA của gel tổng hợp 34 Hình 816: Đồ thị DSC của PPG diglycidyl ether tinh khiết; Tg = -76,7oC 34 Hình 817: Đường cong nhiệt của collagen tinh khiết,, PG-COLc5 và PG-COLc20. A) Quét lần 1 B) Quét lần 2 35 Hình 818: Đường NMR của A) PPG diglycidyl ether B) Collagen tinh khiết C) Gel tổng hợp 35 Hình 819: Đồ thị thể hiện liên hệ của nồng độ amin với độ hấp thu tia UV 36 Hình 820: Độ độc của collagen-PPG gel lên nguyên bào sợi, đo bằng phần trăm tế bào sống, 72 giờ sau khi cấy 37 Hình 821: Nguyên bào sợi (mũi tên) trong A) PG-COLc20 b) blank glass coverslip C) bottom well plastic ở ngày 1 dưới kính hiển vi quang học,. Độ phóng đại × 10 38 Hình 822: Hình ảnh SEM của nguyên bào sợi trên A) glass coverslip và B) PG-COLc20 ở các độ phóng đại khác nhau 38 Hình 823: Minh họa sự tạo liên kết dọc của collagen với diglycidyl ether 40 Hình 824: Cơ chế phản ứng của nhóm epoxy với nhóm((-amino của lysine ở pH(12 41 Hình 825: A) Bề mặt của collagen-PPG diglycidyl B) Bề mặt của collagen tinh khiết 43 Hình 826: Hình ảnh điện di của mẫu collagen từ da cá hồi trong điều kiện khử và không khử. Đường 1: protein có MW cao; đường 2: collagen loại I; đường 3-5:; đường 6-8: collagen chiết xuất bằng acid acetic, collagenase từ CNA1 và CNL3 trong điều kiện khử 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 31: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide 9 Bảng 81: Các loại polymer dùng để tổng hợp hydrogel 23 Bảng 82: Phương pháp chuẩn bị mẫu hydrogel 27 Bảng 83: Vật liệ sử dụng để sản xuất hydrogel tổng hợp bằng phương pháp thủy phân 27 Bảng 84: A) Tỉ lệ của BSA & PPG trong các môi trường có pH khác nhau B) Tỉ lệ của Vitrogen 100 & PPG trong NaOH ở các pH khác nhau 27 Bảng 85: Tỉ lệ tế bào sống trên hydrogel C-F108 ở các nồng độ polymer khác nhau 32 Bảng 86: Độ hấp thu tia UV của hỗn hợp BSA ở các nồng độ khác nhau 36 Bảng 87: Số lượng nhóm amin tự do trên dung dịch tổng hợp ở các tỉ lệ polymer khác nhau 36 Bảng 88: Phần trăm phát triển tế bào trên gel tổng hợp so với mẫu chuẩn 37 Bảng 89: Số lượng tế bào sống sót sau 24 giờ trên các chất mang khác nhau 37 Bảng 810: Góc tiếp xúc với nước của mẫu chuẩn và lớp màng kết hợp, độ lặp lại n=4 43 Bảng 811: Lượng collagen chiết xuất bằng acid và collagenase 46 Tổng quan về collagen Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật. Nó được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương và răng... Collagen là một loại protein chiếm tới 25% lượng protein trong cơ thể người, có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau. Ví dụ như các sợi collagen chiếm chủ yếu trong sợi dây chằng, ảnh hưởng đến khả năng nén ở các khớp sụn và tính linh động của mạch máu và da. Nó được coi như là một chất keo dính các bộ phận trong cơ thể con người thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có collagen cơ thể người chỉ là các phần rời rạc. Chỉ riêng điều này cũng đủ chỉ ra tầm quan trọng của collagen với sự sống của con người. Trong thành phần của da, ở lớp bì chứa rất nhiều collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm... Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, sợi collagen mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá vỡ. Đối với da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da (hình 1-1). Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da. Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy sệ. Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng...
Hình 11: Cấu trúc lớp hạ bì của da Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc (hình 1-2). Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kị nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen.
Hình 12: Các liên kết sợi ở collagen Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vết thương, là thành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thành mạch. Thêm vào đó sự phát triển của một số bệnh di truyền được xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gen của collagen. Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagen đều được ghi lại như là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phức tạp như chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường và ung thư cũng như những bệnh có liên quan đến sự lão hoá. Xét về mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất ra gelatine, chất có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Các loại collagen và cấu tạo của chúng Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Đã có 29 loại collagen được tìm thấy và công bố trong các tài liệu khoa học. Trên 90% collagen trong cơ thể là loại I, II, III và IV. Collagen loại I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính của xương). Collagen loại II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn). Collagen loại III: có trong bắp (thành phần chính của bắp), tìm thấy bên cạnh collagen I. Collagen loại IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào. Collagen loại V: có trong dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô. Collagen loại VI: có trong gan, thận, màng sụn. Collagen loại VII: có trong sự nối liền của da và biểu bì. Collagen loại VIII: có trong tế bào màng trong. Collagen loại IX: có trong sụn. Collagen loại X: có trong sụn bị khoáng hóa và phình to. Collagen loại XI: có trong sụn. Collagen loại XII: có trong dây chằng, sợi liên kết collagen. Collagen loại XIII: có trong biểu bì, nang tóc, tế bào gốc của móng. Collagen loại XIV: có trong sợi liên kết collagen. Collagen loại XV: có trong nhiều mô khác nhau, tương đồng với collagen loại XVII. Collagen loại XVI: còn đang được nghiên cứu. Collagen loại XVII: có trong da. Collagen loại XVIII: có trong gan. Collagen loại XIX: có trong mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu phát triển. Collagen loại XX-XXIX: còn đang được nghiên cứu. Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân. Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5 - 10%. Những loại colagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt. Về cấu trúc của phân tử collagen, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5nm. Mỗi sợi collagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (alpha peptide) nối với nhau bằng các liên kết hydro và xoắn lại với nhau giống như sợi dây thừng (hình 2-1). Mỗi một vòng xoắn có độ dài là 3,3 gốc amino acid, chiều cao là 2,9 A0. Mỗi chuỗi có hình dạng xoắn ống từ trái sang phải. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau hình thành một cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix.
Hình 21: Cấu trúc phân tử collagen Mỗi một chuỗi polypeptide trong collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật tự, thông thường là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X – Hyp (hình 2-2). Trong đó, X, Y là những đơn vị amino acid khác. Proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, và glycine chiếm 1/2 chuỗi collagen. Các amino acid còn lại chiếm 1/2. Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trong cấu trúc sợi siêu xoắn của collagen.
Hình 22: Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh nhỏ. Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi hình thành nên bộ ba tropocollagen. Sau đó tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành collagen fibril. Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp – collagen fiber (hình 2-3, 2-4).
Hình 23: Từng bậc cấu trúc trong chuỗi collagen
Hình 24: Tổ chức bó sợi collagen Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và có 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng. Vì thế collagen rất chắc, dai và bền. Thành phần các acid amin có trong collagen Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline. Collagen không chứa tryptophan, và là một trong số ít các protein chứa hydroxylysine. Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau: Bảng 31: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide
Trong đó I là amino acid (proline và hydroxyproline), X là các amino acid khác. Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau tạo thành một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Trong collagen không chứa tryptophan, cystine như các loại protein khác, còn tyrosin, histidin, và các acid amin chứa lưu huỳnh mỗi loại hiện diện không quá 1%, điều này làm các cầu nối disulfur (-S-S) trong cấu trúc collagen xuất hiện ít và là nguyên nhân cho tính mềm dẻo của nó so với keratin, nhưng chứa rất nhiều hydroxyproline. Hydroxyproline này là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có Trong collagen chứa đến 30% glycine, 10% hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine. Tính chất của collagen Tác dụng với nước Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100g Collagen khô có thể hút được khoảng 200g nước. Collagen kết hợp với nước nở ra trong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần. Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của collagen làm giảm tính vững chắc của sợi gelatin từ 3 – 4 lần. Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tương đối nhỏ. Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 – 650C collagen hút nước bị phân giải. Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao. Khi nguyên liệu đã khử hết chất khoáng, thì nhiệt độ phân giải sẽ giảm xuống. Tác dụng với acid, kiềm Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốc carboxyl và amin. Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó. Trong điều kiện có acid tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp). Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+.
Trong điều kiện có nước, nước có thể tác dụng với nhóm gốc có mang điện trong kết cấu protide và những ion Na+ và Cl- làm tăng tính hấp phụ nước của collagen do đó trong môi trường acid và kiềm thì tính trương nở của collagen được tăng lên Ngoài ra acid và kiềm còn gây ra 1 số biến đổi là : Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa –NH3+ và COO-) làm đứt mạch peptide trong mạch chính Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO, NH- của mạch xung quanh nó Làm acid amin bị phân hủy giải phóng ra ammoniac Cùng với biển đổi đó điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen tuy nhiên theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thì vôi cũng làm tăng tỷ lệ phân hủy của collagen. Trong điều kiện thường, thời gian dài có thể làm cho collagen bị phân giải( mức độ phân giải thấp) khi nhiệt độ tăng thì độ phân giải cũng tăng lên nhanh chóng Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành như sau:
Nếu xử lý trong điều kiện nhiệt độ cao và có nước thì keo dễ tiếp tục biến đổi thành
Do đó nếu muốn sản xuất gelatin thì ta phải khống chế nhiệt độ thích hợp cho chất lượng của gelatin được đảm bảo Các tính chất khác của collagen Khả năng tạo nhũ tương - Là một protein không tan, collagen có thể có ít dấu hiệu cho thấy là một chất nhũ hóa. Tuy nhiên, thực ra collagen có nguồn gốc từ da sống được xử lý và biến tính ở mức độ khác nhau có thể là một chất nhũ hóa tốt hơn sữa gầy. Khả năng hòa tan Collagen tan trong glycerin, acid acetic, ure nhưng không tan trong nước lạnh. Collagen cũng đã được phân chia thành bốn lớp trên cơ sở tính hòa tan trong các dung dịch đệm khác nhau: tan trong muối trung tính, tan trong acid, tan trong kiềm, và không tan trong kiềm. Các phần tan trong acid thường bao gồm hai tập hợp khác nhau bên cạnh một tiểu phân tử chuỗi α. Một có tên là β2 hoặc β11 bao gồm hai chuỗi α1, và thứ hai β1 hoặc β12 bao gồm một chuỗi α1 và một chuỗi α2 liên kết bởi liên kết cộng hóa trị kiểu este. Collgagen hòa tan trong muối được tìm thấy bao gồm 90% chuỗi của một chuỗi α và một số dạng β (l0%), trong khi collagen hòa tan trong acid là khoảng 10% chuỗi α và 90% ở dạng β. Chỉ có 50% nhóm ion trong acid hòa tan có trong collagen hòa tan trong muối. Các nhóm còn lại có thể tham gia vào mối liên kết chéo. Mặt khác, phần tan trong kiềm và không hòa tan trong kiềm đại diện cho collagen trưởng thành Sự biến tính Dưới tác dụng của các chất hóa học như acid, base, muối, các dung môi alcohol, và các tác nhân vật lý như khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi làm cho các liên kết hydro, các cầu nối disunfit, các liên kết ion bị phá vở nhưng không phá vỡ liên kết peptide, tức là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên, protein sẽ thay đổi tính chất so với ban đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein thường có các tính chất sau: Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kị nước vốn ở bên trong phân tử protein. Tức là khi protein chưa biến tính, các acid amin có các nhóm kị nước nằm bên trong phân tử protein. Khi bị biến tính, phân tử protein lúc này chỉ là trình tự sắp xếp các acid amin mạch thẳng, làm cho các nhóm kị nước lộ ra ngoài cho nên độ hòa tan giảm. Khả năng giữ nước giảm. Cấu trúc bậc bốn giúp cho protein có khả năng hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh. Khi biến tính làm mất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa không còn. Vì thế protein giữ nước kém. Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi. Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn. Khi các cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptide, và không có hoạt tính sinh học. Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease. Tăng độ nhớt nội tại. Mất khả năng kết tinh. Protein có khả năng kết tinh trong các môi trường muối, hoặc cồn. Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch protein không bền và kết tủa, được gọi là pH đẳng điện. Khi bị biến tính, điểm đẳng điện của protein không còn, và chúng khó thể kết tinh. Tính kị nước Do các gốc kị nước của các acid amin trong chuỗi polypeptide của protein hướng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kị nước. Độ kị nước có thể giải thích là do các acid amin có chứa các gốc R- không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước. Tính kị nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của protein. Tính chất của dung dịch keo Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm. Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là: Sự tích điện cùng dấu của các protein. Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein. Khi dung dịch keo không bền, chúng sẽ kết tủa, có hai dạng kết tủa: kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch: Kết tủa không thuận nghịch: Sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa Kết tủa thuận nghịch: Sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu. Tính chất điện ly lưỡng tính Protein có tính chất lưỡng tính vì trong acid amin có chứa cả gốc acid (COO-) và gốc base (NH2-). Cả acid amin và protein đều có tính chất lưỡng tính. Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen Collagen chứa trong hầu hết các bộ phận của cơ thể như mô, gân, xương, tủy, da… của các loại động vật như cá nước ngọt, cá nước mặn, ếch, cá xấu, lợn, bò , trâu… tuy nhiên do ở nước ta lượng xuất khẩu cá tra, cá basa là rất lớn do đó lượng phế phẩm là da cá là rất lớn, lúc trước nó chỉ dùng làm thức ăn chăn nuôi nên giá trị của nó là không cao do đó trích ly collagen từ da cá tra là 1 hướng đi mới và đầy tiềm năng So sánh collagen giữa da cá tra và gia súc: Collagen từ cá có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong y học và mỹ phẩm. Mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người. Để giải quyết vấn đề này người ta sử dụng biện pháp tiêm collagen vào da, tuy nhiên những bất lợi của phương pháp này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi ro. Do đó việc trích ly collagen từ cá được đưa vào nghiên cứu và sử dụng. Khác với những loại collagen thu được theo các phương pháp trước đây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người. Cá sống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độ sâu và áp suất khác nhau, do đó collagen trích ly từ cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học. Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứng minh là có tốc độ hấp thụ vào máu nhanh gấp 1,5 lần so với collagen từ da heo. Quy trình công nghệ của trích ly collagen từ da cá tra Hiện nay có nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu về vấn đề này với nhiều phương pháp khác nhau tuy nhiên phổ biến hiện này là dùng 2 phương pháp là phương pháp hóa học và phương pháp dùng enzyme Phương pháp hóa học Thường dùng là tách chiết bằng acid acetic tuy nhiên cũng có thể tách chiếc bằng acid khác tuy từng loại nguyên liệu Quy trình công nghệ:
Hình 61: Quy trình chiết collagen bằng acid acetic Chỉ nói về phần da cá, trước tiên là bước tiền xử lý bằng NaOH 1% để loại các chất phi collagen (chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh). Da tiếp tục được xử lý với butyl alcohol 10% để loại tiếp tạp chất. Sau đó là quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 0,5M trong 3 ngày. Ly tâm lấy phần dịch, còn phần bã đem chiết lần 2 cũng với acid acetic 0,5M trong 2 ngày nữa. Ly tâm lấy phần dịch. Cả hai phần dịch chiết thu được là dịch lỏng, hơi sánh, gọi là acid-soluble collagen. Để kết tủa collagen, cho NaCl rắn vào phần dịch chiết này đến nồng độ 0,9M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hòa tan vào acid acetic 0,5M. Thẩm tách thu được collagen sạch. Collagen sạch được làm lạnh khô và cất trữ ở nhiệt độ lạnh. Trong bài báo này, tác giả đã sử dụng phương pháp điện di SDS-PAGE theo phương pháp của Weber và Osborn (1969) để xác định các chuỗi collagen. Trong đó, mẫu collagen được hoà tan vào sodium phosphate 0,02M (pH 7,2) chứa 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) và 3,5 Murea. Điện di được tiến hành trên 3,5% gel với đệm phosphate 0,1M (pH 7,2) chứa 1% SDS. Và tác giả đã đo nhiệt độ biến tính của collagen bằng cách đo độ nhớt của hổn hợp collagen 0,03% hòa tan vào acid acetic 0,1M tại một số nhiệt độ. Nhiệt độ biến tính được xác định là nhiệt độ tại đó độ nhớt giảm đi phân nửa. Các kết quả mà tác giả đạt được trong quá trình nghiên cứu: Về hiệu suất tách chiết: đạt được hiếu suất tương đối cao 51,4% (cá pecca Nhật Bản), 49,8% (cá thu), 50,1% (cá mập) tính trên trọng lượng khô. Về phân tích cấu trúc chuỗi collagen (hình 6-1):
Hình 62: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá. (Điện di trên 5% gel chứa urea 3,5M). (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu Bằng phương pháp điện di như đã nói trên, hình 6-2 cho thấy collagen da của cá pecca và cá mập gồm 2 chuỗi α khác nhau, đó là α1 và α2. Trong đó, α2 có hàm lượng rất nhỏ. Nếu có α3 tồn tại thì cũng không thể tách khỏi α1 trong điều kiện điện di này. Còn đối với cá thu, collagen dạng α chỉ gồm chuỗi α1 mà hoàn toàn không có α2. Trong hình 6-2, chúng ta cũng thấy có sự tồn tại của chuỗi β ở cả 3 loài cá. Về nhiệt độ biến tính nhiệt độ biến tính collagen da cá rất thấp, 26,5oC (cá pecca), 25,6 (cá thu), 25 (cá mập) thấp hơn khoảng 10oC so với collagen da heo (37oC) và cá tra khoảng 380C *Nhận xét: Nhìn chung, tác giả đã đưa ra phương pháp tách chiết đơn giản, dễ thực hiện, chỉ là tách chiết dựa trên các hoá chất thông dụng, không quá đắt tiền, các thiết bị cũng thông dụng trong phòng thí nghiệm. Phương pháp dùng enzyme
Hình 63: Quy trình chiết collagen bằng pepsin Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh, trong điều kiện vô trùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt. Cách thức hoạt động của emzyme pepsin: Điểm đẳng điện của pepsin khoảng pH 1, pepsin thuỷ phân mạnh các liên kết peptide nối mạch do các nhóm amin của các acid amin thơm trong phân tử protein và peptide tạo thành, sản phẩm được tách ra là các peptide và các acid amin tự do. Hoạt động trong môi trường acid, pepsin hoạt động thích hợp nhất trong khoảng pH 1,5 - 2; ở điều kiện này pepsin không bền do có sự tiêu hủy enzyme. Pepsin có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạt lực của pepsin thấp; từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease. Dung dịch pepsin trong nước ở dạng pepsinogen và được hoạt hoá bởi H+ với pH = 1,5 - 2,0. Chúng phân giải gần 30% mạch peptide và biến protein thành polypeptide. PEPSINOGEN H+ → PEPSIN PROTEIN Pepsin→ POLYPEPTIDE Trong quy trình này ta cần quan tâm tới vấn đề tinh sạch collagen Phương pháp tinh sạch Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loại chúng phải sử dụng nhiều biện pháp khác nhau. Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp có phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc kí trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel. Phương pháp thẩm tích: Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấm đối với các dung dịch các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp...). Các tinh thể có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấp hơn. Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông thường người ta hay dùng túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua vào các dung dịch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Bằng cách thay thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein. Có thể làm giảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch. Phương pháp này thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt. Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên. Muối hòa tan trong nước và bị loại dần. Có thể tăng tốc độ thẩm tích bằng cách khuấy trộn dung dịch rửa. Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh. Sắc ký gel: Trong sắc kí gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng, các lỗ rỗng này được phủ đầy bởi dung môi làm pha động. Kích thước của lỗ rỗng phải đồng nhất, bởi vì kỹ thuật sắc kí gel dùng để tách các chất theo trọng lượng phân tử. Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ rỗng sẽ không lọt vào bên trong lỗ rỗng và sẽ bị dòng chảy của dung môi đuổi ra khỏi cột. Còn phân tử nào có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng sẽ chui vào nằm bên trong lỗ nên bị giải ly ra khỏi cột chậm hơn. Sắc kí gel được ứng dụng trong việc tách một hổn hợp thành các nhóm chất riệng rẽ, ứng dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử của một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn, và ứng dụng để loại muối ra khỏi một hợp chất. *Nhận xét: việc tách chiết collagen bằng phương pháp sử dụng enzyme. Da cá không tan hoàn toàn trong acid acetic nhưng tan hoàn toàn trong enzyme pepsin proteolysis. Hiệu suất chiết bằng enzyme (44,7%) cao hơn chiết bằng acid acetic (10,7%). Có thể cho rằng việc bổ sung enzyme giúp cho sự phá vỡ các màng tế bào nhanh hơn và mạnh hơn. Vì thế collagen càng dễ dàng được tách ra và cho hiệu suất tách chiết cao. Các ứng dụng của collagen Trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, cũng như y học, dược phẩm, collagen thường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân. Collagen thủy phân gọi là collagen hydrolysate. Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen có các ứng dụng khác nhau. Trong công nghiệp thực phẩm Collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng (hình 7-1).

Hình 71: HANAMAI COLLAGEN: sản phẩm dạng bột, được trộn chung với đậu hủ hay natto dùng trong bữa ăn của các phụ nữ Nhật. Trong các sản phẩm phomat, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate nhằm ngăn chặn sự mất nước. Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm này. Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản phẩm độ dẻo, dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường. Các sản phẩm như vỏ kẹo có chứa 0,5 ÷ 1% hàm lượng collagen hydrolysate với vai trò làm giảm sự tan chảy. Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng. Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội… Collagen hydrolysate chiếm từ 1 ÷ 5% giúp giữ hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời cũng là một chất kết dính giúp cho việc tạo hình sản phẩm dễ dàng hơn. Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate sử dụng làm chất làm trong với tỉ lệ 0,002 ÷ 0,15%. Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có màu sắc trong suốt và óng ánh. Collagen có khả năng hấp thụ nước gấp 5 ÷ 10 lần thể tích của nó nên được sử dụng trong công nghiệp sản xuất đồ hộp để tránh hiện tượng rỉ nước. Trong mỹ phẩm Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung. Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào. Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng màu da. Sự suy giảm về chất lượng, số lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nên khô, mất độ căng, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể. Collagen đóng vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị tổn thương. Chính vì vậy mà collagen được dùng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như: kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm… Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da chúng kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu oliu , tinh dầu hoa hồng… có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại, khói bụi, hóa chất… Vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn. Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc… tóc dễ bị tổn thương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bóng mượt. Trong các sản phẩm chăm sóc tóc thường có bổ sung một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục hồi hư tổn (hình 7-2).
Hình 72: Tóc bị hư tổn và phục hồi sau khi sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen hydrolysate. Collagen còn được dùng điều trị phục hồi: thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổn thương hay trong giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu da thừa sau khi giảm béo. Trong y học và dược phẩm Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành những dạng khác nhau, là một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học. Màng collagen được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như làm chất bịt kín sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối với những mô cấy. Collagen được sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, kháng sinh, insulin, hormone tăng trưởng… Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị phỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác thuộc nha khoa, phẫu thuật, chỉnh hình. Collagen còn được dùng trong việc xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng (hình 7-3).


(a) (b) (c) Hình 73: Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng ((a): vết bỏng mới trước khi sử dụng collagen, (b): sau 3 ngày sử dụng, (c): sau 10 ngày sử dụng) Đôi khi chúng được sử dụng kết hợp với silicone, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các tác nhân tăng trưởng và các hợp chất khác. Collagen cũng được bán trên thị trường như một chất bổ sung, cải thiện tính linh hoạt của khớp. Ngoài ra, collagen còn là phần nền giúp tích tụ calcium trong xương. Nếu hàm lượng collagen giảm đáng kể, calcium không thể tích tụ làm cho xương giòn và dễ gãy, sụn dễ bị hao mòn tạo nên các cơn đau ở khớp gối và hông. Như vậy, để xương cứng cáp hơn, ngoài calcium ta cần bổ sung một lượng lớn collagen. Collagen là một polyme tự nhiên, nó được dùng trong phẫu thuật tạo hình như bơm môi, căng da mặt… Collagen dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết rạch trong phẫu thuật. Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùng làm những sản phẩm y học cho gân và dây chằng. Những ống collagen được sử dụng thay thế cho các cấu trúc như thực quản, dây thần kinh ngoại biên, niệu quản. Nó cũng được sử dụng trong việc nuôi cấy tế bào. Collagen dạng màng và lớp mỏng được sử dụng để giữ cố định các vật chất sinh học chẳng hạn như nhân tố XI 11 trong máu, dùng trong sự tái tạo các mô, nối kết lại võng mạc, làm màng thẩm tích máu, làm vật thay thế lớp màng cứng của não. Nó còn được dùng cho việc tái tạo dây thần kinh, khôi phục màng nhĩ, sụn và xương, kiểm soát sự chảy máu cục bộ, khôi phục tổn thương của gan, là lớp màng chắn bảo vệ não, có tác dụng phục hồi các vết thương. Dung dịch và huyền phù collagen được sử dụng dưới dạng có thể tiêm được làm thông sự tắc nghẽn động mạch, chữa gãy xương, tái tạo tủy sống, trị đái dầm, phục hồi chức năng trượt của gân. Sự phát triển của tế bào với sự hỗ trợ của collagen trong việc nuôi cấy tế bào vừa được nghiên cứu gần đây. Việc sử dụng chất nền collagen cho sự phát triển của tế bào da đã được công bố một cách rộng rãi. Những tế bào nuôi cấy trên collagen được kích thích, làm vết thương mau lành. Những nghiên cứu rộng rãi về sự phát triển của tế bào da tự sinh và khác loại trên nền collagen chứng minh tính khả thi để tạo ra nhiều chủng loại mô và các cơ quan trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng nguồn nguyên liệu tế bào nuôi cấy thuộc nhiều chủng loại khác nhau có tác động to lớn đến việc điều trị cho những bệnh nhân bị tổn thương về mô hoặc các cơ quan. Collagen còn được sử dụng trong sản xuất bao con nhộng cứng và mềm. Nó có tác dụng bảo vệ thuốc chống những tác nhân có hại như ánh sáng và oxi. Thành phần chính của vỏ bao là collagen và các tá dược khác như: glycerol hay sorbitol, những chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu. Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho bệnh nhân có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng. Collagen còn được sử dụng để làm ra các gạc vô trùng sử dụng trong giải phẩu… Trong phẫu thuật nội soi, collagen hydrolysate được ứng dụng để bôi vào các ống nội soi, có tác dụng bôi trơn, vì thế các bác sĩ dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gây đau. Sau thời gian từ 40 ÷ 60 phút, collagen sẽ tan hủy trong cơ thể bệnh nhân mà không gây hại gì. Trong nha khoa, collagen được chế tạo thành các mảnh bọt biển (sponges), chúng là một tác nhân cầm máu. Những mảnh bọt biển này có khả năng hấp thụ một lượng chất lỏng gấp 50 lần khối lượng của chúng, vì thế chúng có khả năng cầm máu nhanh chóng (hình 7-4). Một ứng dụng khá hay trong nha khoa là các bác sĩ tạo ra một lớp men răng nhân tạo bằng collagen hysrlysate có chứa các ion calcium, phosphate, fluoride áp lên bề mặt răng thật , vì thế răng được bảo vệ khỏi các tác nhân gây sâu răng.
Hình 74: Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa Thành tựu Nghiên cứu trích ly collagen bằng enzyme collagenase kết hợp với acid Mở đầu Hai vi khuẩn sản xuất collagenolytic protease (collagenase), một Gram dương Bacillus cereus và CNA1 một Gram âm Klebsiella pneumoniae CNL3, đã được cô lập tương ứng trong điều kiện kiềm và acid. Việc sản xuất collagenase của hai loại vi khuẩn đã được tối ưu. Glycerol là nguồn carbon phù hợp để sản xuất collagenase cho cả hai chủng. Các giá trị pH ban đầu tối ưu cho collagenase sản xuất bởi CNA1 và CNL3 tương ứng là 7,5 và 6,0, và nhiệt độ tối ưu là 37oC cho cả hai chủng. Hoạt tính tối đa của collagenase tinh chế một phần từ CNA1 là ở pH 7,0 và 45oC. Sự ổn định của pH và nhiệt trong khoảng 6-8 và dưới 40oC. Hoạt tính tối đa của collagenase tinh chế một phần từ CNL3 là ở pH 6,0 và 40oC. Sự ổn định của pH và nhiệt trong khoảng 5-7 và dưới 37oC. Các collagenase từ CNL3 ổn định ở pH thấp hơn so với từ CNA1. Collagenases từ cả hai giống được sử dụng để chiết xuất collagen từ da cá hồi. Việc sử dụng collagenases từ CNA1 và CNL3 kết hợp với xử lý acid mang lại lượng collagen cao, 54,6% và 53,0% trọng lượng khô da cá, tương ứng. Cách tiến hành Chuẩn bị da cá cho khai thác collagen Da cá được chuẩn bị theo phương pháp của Jongjareonrak và cộng sự với một sửa đổi chút ít. Tất cả các thủ tục chuẩn bị được thực hiện tại 4oC và khuấy liên tục. Để loại bỏ protein không collagen, da lần đầu tiên được trộn với dung dịch NaOH 0,1 N với tỉ lệ mẫu/dung dịch kiềm (w/v) là 1:10. Hỗn hợp được khuấy trong 24 giờ. Dung dịch kiềm đã được thay đổi mỗi sáu giờ. Sau đó, các mẫu đã loại bỏ protein được rửa sạch bằng nước lạnh cho đến khi nước rửa được đạt pH trung tính hoặc base yếu. Da bị khử protein được khử chất béo bằng butyl alcohol 10%với tỉ lệ rắn/dung môi (w/v) là 1:10 trong 24 giờ, dung môi được thay đổi mỗi sáu giờ. Xử lý da cá bằng acid Da cá đã khử chất béo được rửa sạch bằng nước lạnh, sau đó ngâm acid acetic 0,5 M với tỉ lệ rắn/dung môi (w/v) là 1:15 trong 24 giờ. Hỗn hợp này sau đó được ly tâm 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Các chất gạn được thu thập và lưu giữ tại 4oC. Các kết tủa được tái chiết xuất trong acid acetic 0,5 M với tỉ lệ mẫu/dung dịch (w/v) là 1:30 trong 16 giờ và khuấy nhẹ nhàng, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Các chất gạn thu được kết hợp với chiết xuất đầu tiên. Bã được được sử dụng để khai thác hơn nữa với enzyme. Các chất chiết xuất kết hợp được kết tủa bằng cách cho thêm NaCl để đạt nồng độ cuối cùng 2,6 M trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5). Các kết tủa được thu thập bằng ly tâm 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC và sau đó hòa tan trong 10 thể tích acid acetic 0,5 M. Dung dịch thu được được thẩm tách với 10 thể tích acid acetic 0,1 M trong một màng thẩm tách với phân tử trọng lượng cho qua là 8000 Da trong 12 giờ ở với sự thay đổi dung dịch mỗi bốn giờ. Sau đó, dung dịch đã được thẩm tách với 10 thể tích nước cất và thường xuyên thay đổi nước cho đến khi đạt pH trung tính. Các trích xuất đã thẩm tách được đông khô và được gọi là collagen acid hòa tan (ASC – Acid Soluble Collagen). Chiết xuất collagen bằng collagenases Da cá khử protein và khử chất béo và bã không tan thu được sau khi xử lý acid được rửa sạch triệt để với nước cất, hòa trong 2 thể tích dung dịch 0,1 M của loại đệm pH thích hợp và xử lý với collagenase (CNA1 và CNL3) 100 U/mg chất khô trong 48 giờ ở 4oC và khuấy nhẹ nhàng. Dung dịch nhớt được ly tâm 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC. Để chấm dứt các phản ứng enzyme, chất gạn thu được đã được thẩm tách với đệm phosphate natri 0,02 M (pH 7,2) trong một màng thẩm tách với trọng lượng phân tử cho qua là 8000 Da trong 24 giờ ở 4oC với sự thay đổi dung dịch sau mỗi bốn giờ. Dung dịch thẩm tách thu được đã được ly tâm 8000 vòng/phút trong 30 phút. Các viên thu được đã được hòa tan trong 10 thể tích acid acetic 0,5 M. Dung dịch sau đó được kết tủa bằng cách cho thêm NaCl để nồng độ cuối cùng là 2,6 M trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5). Kết tủa được thu thập bằng cách ly tâm tại 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC và tái hòa tan trong 10 thể tích acid acetic 0,5 M. Dung dịch này được thẩm tách với nước cất và đông khô theo cách tương tự như đối với chuẩn bị ASC. Phân tích điện di của các chiết xuất collagen Dạng protein của collagen được phân tích bằng cách sử dụng gel điện di sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli. Mẫu collagen đông khô bị hòa tan trong đệm natri phosphate 0,02 M (pH 7,2) có chứa 1% (w/v) SDS và ure 3,5 M. Hỗn hợp mẫu được khuấy nhẹ nhàng ở 4oC trong 12 giờ. Chất gạn được thu thập sau khi ly tâm 3000(g trong 3 phút ở 4oC. Mẫu collagen hòa tan được trộn lẫn với mẫu đệm (Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 có chứa 4% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol) có và không có 10% (v/v) β-mercaptoethanol (β-ME), sử dụng tỉ lệ mẫu/mẫu đệm (v/v) là 1:1. Mẫu được nạp vào gel đúc sẵn PAGEL-Compact (5% gel) và bị điện di với dòng điện không đổi 20 mA/gel sử dụng thiết bị Compact PAGE. Sau khi điện di, gel được nhuộm màu với 0,05% (w/v) Coomassie xanh R-250 trong 15% (v/v) methanol và 5% (v/v) acid acetic và tẩy màu với 30% (v/v) methanol và 10% (v/v) acid acetic. Đánh dấu phân tử khối lượng lớn được được sử dụng để ước tính trọng lượng phân tử của protein. Collagen tan trong acid loại I từ da bê đã được sử dụng làm collagen chuẩn. Kết quả Collagen được chiết xuất trực tiếp từ da cá đã khử protein và khử chất béo của cá hồi bằng collagenases từ CNA1 và CNL3 (bảng 2). Sản lượng của collagen tương ứng chiết xuất được rất thấp ở 3,7% và 2,3% (theo khối lượng chất khô). Tuy nhiên, khi collagenase được áp dụng cho các cặn không tan thu được sau khi xử lý acid, sản lượng của collagen trích xuất bởi collagenase từ CNA1 và CNL3 tương ứng là 18,1% và 16,5% (theo khối lượng chất khô). Vì vậy, sự kết hợp của collagenase từ CNA1 và CNL3 với acid tạo ra năng suất collagen cao hơn (54,6% và 53,0% tương ứng) so với chỉ sử dụng acid (36,5%). Các mẫu điện di của collagen được chiết xuất từ ​​da cá hồi của collagenases từ CNA1 và CNL3 được phân tích trong β-ME và không có β-ME (hình 8-26). Không có sự khác biệt về kích cỡ của collagen chiết xuất của acid acetic và collagenase. Từ hình 8-26, ta thấy chuỗi α1 và α2 là các thành phần chính của collagen trích xuất bởi cả hai collagenases. Phần có khối lượng phân tử cao (có MW cao), bao gồm thành phần β và (( cũng như các phân tử liên kết ngang của chúng, cũng đã được quan sát thấy trong cả hai phần. Phân tử liên kết ngang có MW cao trong collagen tăng với tuổi động vật và cá đói có nhiều collagen liên kết ngang hơn so với cá được ăn no. Dạng của chuỗi α1 và α2 tương tự với những loại collagen chuẩn loại I từ da bê (lane 2). Collagen loại I có thành phần chính gồm hai chuỗi α1 và một chuỗi α2 ([α1]2α2). Người ta cho rằng collagen loại I là collagen chính trong collagen chiết xuất bởi cả hai collagenases từ CNA1 và CNL3. Quan sát này tương đồng với các kết quả báo cáo cho collagen của da cá rô sông Nile, cá blackdrum, cá sheephead seabream và cá bigeye snapper. Vì chuỗi α3 có khối lượng phân tử không thể phân biệt với α1 và vì nó không thể tách khỏi α1 bằng điện di, các sự hiện diện đồng thời của α3 với α1 cũng có thể là có thể.
 Hình 826: Hình ảnh điện di của mẫu collagen từ da cá hồi trong điều kiện khử và không khử. Đường 1: protein có MW cao; đường 2: collagen loại I; đường 3-5:; đường 6-8: collagen chiết xuất bằng acid acetic, collagenase từ CNA1 và CNL3 trong điều kiện khử Bảng 811: Lượng collagen chiết xuất bằng acid và collagenase
Kết luận Hai vi khuẩn sản xuất collagenase, Gram dương B. cereus CNA1 và Gram âm K. pneumoniae CNL3, được phân lập tại tương ứng pH kiềm 7,5 và pH acid 4,8. Các collagenases từ hai chủng cho thấy sự khác nhau về pH và nhiệt độ tối ưu. Các collagenase từ CNL3 đã được phân lập tại pH acid đã cho thấy sự ổn định cao hơn ở pH thấp so với CNA1 mà được phân lập tại pH kiềm. Collagenases từ cả hai giống được sử dụng để chiết xuất collagen từ da cá hồi. Sự kết hợp của các collagenase từ CNA1 và CNL3 với xử lý acid mang lại sự thu hồi collagen từ các chế phẩm da cá cao hơn, đó là 54,6% và 53,0% tương ứng so với sử dụng acid một mình. Ngoài ra, nghiên cứu về collagen cho thấy chiết xuất collagen từ da cá hồi bao gồm hai chuỗi khác nhau (α1 và α2), được mô tả như là loại collagen tôi không có liên kết disulfur. Nghiên cứu ứng dụng của collagen trong lĩnh vực y khoa: Tổng hợp polymer-collagen hydrogel để làm chất tải thuốc và dùng trong công nghệ mô Mở đầu Hydrogel tạo bởi polymer tổng hợp hoặc polymer tự nhiên có khả năng biến đổi cấu trúc thuận nghịch bởi nhiệt độ hoặc pH đã thu hút được sự chú ý do sự đơn giản trong việc trộn dung dịch, tương thích sinh học và ít xâm lấn đến sự quản lý. Chính vì vậy chúng được khảo sát rộng rãi như là một vật liệu sinh học tiềm năng để làm chất tải thuốc hoặc dùng trong công nghệ mô. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng colagen nhạy cảm pH và copolymer tri-block PEO-PPO-PEO có thể biến đổi thuận nghịch bởi nhiệt để tạo ra hydrogel. Hydrogel này kết hợp những tính chất cơ học thích hợp của vật liệu tổng hợp với khả năng tương thích sinh học của vật liệu sinh học. Từ đó thấy được khả năng của vật liệu này trong việc làm chất tải thuốc hoặc dùng trong công nghệ mô. Copolymer với EO (ethylene oxide)30 – 80% được sử dụng với những nồng độ khác nhau. Dữ liệu từ động học phóng thích của FITC-dextran thực hiện ở PBS pH 7,4, 37oC cho thấy cả hydrogel từ colagen F108 và L103 đều có sự phóng thích mạnh giống nhau vào lúc đầu, sau đó sự phóng thích giảm dần khi còn ít thuốc hơn collagen gel. Cả hai dần dần trở lại cùng tốc độ ở ngày 6. Tuy nhiên, lượng thuốc phóng thích ra ít hơn trong cả hai gel hỗn hợp khoảng 3-4% ở loại đầu và 8% ở loại thứ hai. Sử dụng kính hiển vi quét eletron cho thấy sự bổ sung polymer ở nồng đồ thấp (dưới 5% và 10% lần lượt với F108 và L103) làm giảm số lỗ nhưng không làm xáo trộn cấu túc sợi. Tế bào K562 được nuôi cấy trong gel hỗn hợp như lớp màng ma trận để ứng dụng trong công nghệ mô. Sự phát triển nhanh của tế bào thể hiện qua sự tăng thời phát huỳnh quang cho C-F108, tuy nhiên nồng độ polymer cao (5%) lại làm ức chế tế bào. Kết quả của chúng tôi đề nghị rằng loại vật liệu sinh học này có khả năng tiềm tàng để sử dụng trong cả làm chất tải thuốc và làm chất mang tế bào. Một loại gel khác là xerogel cũng được phát triển trong nghiên cứu này bằng cách tạo liên kết kị nước giữa colagen với polymer PPG dglycidyl ether. Loại gel khô này có thể trương nở trong nước. Nhiều thí nghiệm sử dụng thiết bị như NMR và DSC hoặc thuốc thử như TBNS đã được sử dụng để cho thấy phạm vi liên kết thành công. Dữ liệu từ kiểm tra TBNS cho thấy giảm 24% nhóm amino tự do làm polymer tăng từ 61% lên 86%. Từ đó chỉ ra rằng nhiều nhóm amino tự do sẽ phản ứng với thuốc bắt màu làm polymer rối lên. Nghiên cứu về góc liên kết nước và sự độc hại đối với tế bào cũng được thực hiện để kiểm tra độ hòa hợp sinh học của vật liệu này. Loại gel này có khả năng hút nước cao hơn so với mẫu chuẩn như colagen với 41,6o cho loại đầu và 61,1o cho loại thứ hai. Ngoài ra, sợi nguyên bào của tế bào trong ma trận có khả năng phát triển và khả năng sống được tốt hơn so với mẫu chuẩn, đặc biệt là khi nồng độ polymer sử dụng dưới 10 mg. Điều này cho thấy khả năng của colagen-PPG diglycidyl ether xerogel để làm loại polymer chính sử dụng trong l