Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên

ng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại... kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [16]. Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ... Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng XK từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như polixin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium moniliforme... [16]. Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng XK có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [1]. Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được từ đất chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [4]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định. Ngoài công tác bảo vệ thực vật thì CKS còn được sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản, công nghệ thực phẩm… Các loại CKS thường được sử dụng trong chăn nuôi như: biomycin, terranycin, tetracyclin, bacitrcin… để phòng chống, điều trị bệnh và tăng trọng cho gia súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm cho chúng khỏe mạnh tăng trưởng tốt. Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở quy mô 12 tấn /năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng 15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 - 7% [1]. Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng CKS kết hợp với công nghệ làm lạnh có thể làm tăng thời gian bảo quản của thực phẩm mà không gây độc hại cho con người. Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảo quản thực phẩm như: clotetracyclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Các chất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để tác động lên cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị. Vì vậy để khắc phục tồn tại trên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải tuân theo đúng nguyên tắc. 1.5. Khả năng tổng hợp enzym ở vi sinh vật 1.5.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzym Enzym là chất xúc tác sinh học do tế bào tổng hợp nên và chúng có vai trò rất quan trọng, quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào. Việc sản xuất và sử dụng enzym đã có từ lâu ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, chỉ sau khi con người chứng minh được khả năng xúc tác của enzym ngoài tế bào thì việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzym mới thực sự phát triển mạnh mẽ. Ngày nay, nhiều loại enzym đã được sản xuất ra với sản lượng lớn và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con người đã tiến hành sản xuất chế phẩm enzym từ động, thực vật với khối lượng lớn (hàng vạn tấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, do lượng enzym trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế. VSV trái lại có thể tổng hợp được một lượng lớn các enzym khác nhau. Do vậy VSV là đối tượng chính được sử dụng để sản xuất enzym trong vòng 30 năm trở lại đây [22]. Hệ enzym ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầu hết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N2, S, Fe, CO2, CH4… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzym tương ứng [3]. Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm và chọn lựa những phức hệ enzym cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzym không thể khai thác được từ nguồn động vật và thực vật. Enzym VSV có hoạt tính cao hơn enzym từ các sinh vật khác do VSV có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh chóng, hàm lượng enzym trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được lượng lớn chế phẩm enzym. Việc lên men sản xuất enzym có thể triển khai trên quy mô sản xuất công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết, khí hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu đơn giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzym hiện nay chúng thường dùng các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của một số ngành sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzym nhờ VSV có khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh tế cao. VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay điều chỉnh hoạt lực của enzym) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi trường nuôi. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng hay điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có khả năng điều chỉnh phổ các enzym sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng lực sinh tổng hợp enzym hay làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngoài ra, so với nguồn enzym động vật và thực vật, đối với nhóm enzym ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thu enzym ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn. 1.5.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzym cao từ tự nhiên VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzym đa dạng và phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzym như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzym [19]. Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm, lựa chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzym mong muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzym chịu nhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV sinh enzym chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng sinh amylaza thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng sinh enzym chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọn chủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy. Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng trong sản xuất đòi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Tuy hiện nay có nhiều chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người. 1.5.3. Một số enzym vi sinh vật chủ yếu Tuy đã biết hơn 1000 loại enzym khác nhau nhưng cũng chỉ các enzym thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau, đó là các enzym amylaza, enzym cellulaza và enzym proteaza. Lượng các enzym sản xuất hàng năm: Proteaza từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, proteaza từ nấm mốc là 10 tấn/năm, pectinaza là 10 tấn/năm [22]. Các enzym này có ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn… Enzym được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên thế giới. - Enzym amylaza: enzym này bao gồm nhiều nhóm men khác nhau, đó là amylaza, glucoamylaza, glucozidaza, dextrinaza… Các enzym này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô, khoai, sắn... Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylaza có thể dùng để sản xuất alcohol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylaza và glucoamylaza, từ các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và sinh học. - Enzym cellulaza: Trong thập kỷ qua, enzym thuỷ phân cellulose ngày càng được quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzym này có khả năng thủy phân chất thải chứa celluloza, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocelluloza và celluloza trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác. Thí dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng ethanol [29]. - Enzym proteaza: Proteaza thuộc nhóm enzym thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và thịt. Proteaza có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Proteaza thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzym lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà proteaza được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối [30]. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Các mẫu đất được lấy ở những địa điểm khác nhau thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên. Từ đó phân lập được 92 chủng xạ khuẩn. 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Xạ khuẩn 92 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên. 2.2.2. Vi sinh vật kiểm định 7 chủng VSVKĐ nhận từ Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam và Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và Khoa Vi sinh vật - Bệnh viện Đa khoa TW - Thái Nguyên. (Bảng 2.1). Bảng 2.1. 7 chủng Vi sinh vật kiểm định Vi sinh vật kiểm địnhCơ quan cung cấpVK G (+)Staphylococcus aureus ATCC 25923Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tếBacillus subtilis VTCC-B-888Viện Bảo tàng giống chuẩn VSVVK G (-)Escherichia coli VTCC-B-883Viện Bảo tàng giống chuẩn VSVPseudomonas aeruginosa VTCC-B-481Viện Bảo tàng giống chuẩn VSVNấm mốcFusarium oxysporum VTCCF-1301Viện Bảo tàng giống chuẩn VSVFusarium solani VTCCF-1302Viện Bảo tàng giống chuẩn VSVAspergillus niger VTCCF-001Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.3.1. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose… của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất. - Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, FeSO4.7H2O… nhập từ Anh, Trung Quốc. - Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck (Đức). - Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)… của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất. 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị - KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan) - Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật) - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton - Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp - Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam… 2.3.3. Môi trường nghiên cứu * Môi trường gause 1 (g/l) (môi trường phân lập xạ khuẩn) - Tinh bột tan - 20 - FeSO4 - 0.01 - NaCl - 0.5 - Thạch - 20 - K2HPO4 - 0.5 - Nước cất vừa đủ 1 lít - MgSO4.7H2O - 0.5 - pH = 6,8 - 7 - KNO3 - 1 * Môi trường MPA (g/l) (môi trường nuôi vi khuẩn) - Cao thịt - 5 - Thạch - 20 - Pepton - 10 - Nước cất vừa đủ 1 lít - NaCl - 5 - pH = 7 -7,2 * Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l) (môi trường phân lập và giữ giống nấm) - Khoai tây - 200 - Nước cất vừa đủ 1 lít - Đường - 20 - pH = 7 - 7,4 - Thạch - 20 * Môi trường xác định hoạt tính enzym ngoại bào - Môi trường tinh bột tan (g/l) + Tinh bột tan - 2 + Thạch - 18 + Nước cất vừa đủ 1 lít. - Môi trường CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) (g/l) + CMC - 2 + Thạch - 18 + Nước cất vừa đủ 1 lít. - Môi trường casein (g/l) + Casein - 2 + Thạch - 18 + Nước cất vừa đủ 1 lít. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu đất Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất ở bề mặt từ 5 - 20 cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) trong 1 vùng 50 m2. Trộn đều các mẫu đất và đựng vào túi nilông đã khử trùng. Ngoài túi ghi rõ loại đất, ngày và nơi lấy mẫu [11]. Đất lấy về được phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ. 2.4.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 2.4.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3… 10-6. Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0,1ml dịch sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy ria 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1 để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause 1, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12]. Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng XK được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm màu trắng, Grey (Gy) nhóm màu xám, Red (R) nhóm màu đỏ, Yellow (Y) nhóm màu vàng, Green (Gn) nhóm màu xanh, Blue (B) nhóm xanh màu da trời, Violet (V) nhóm màu tím, và nhóm màu không xác định (X) [16, 17, 30]. 2.4.2.2. Phương pháp phân lập bằng que cấy vòng Pha đất với nước cất tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy lấy một vòng dịch huyền phù đất. Đặt que cấy vào một góc đĩa, ria thành đường zích zắc thứ 1. Thanh trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội sau đó đặt que cấy bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ 1, ria thành đường zích zắc thứ 2 có chiều khác với đường ria thứ 1. Thanh trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Đặt đầu que cấy bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ 2,ria đường zích zắc thứ 3 có chiều khác với đường ria 1 và 2 trên phần thạch còn lại. Phương pháp phân lập này thuận tiện cho sự phân lập lại để thuần chủng các giống bị nhiễm trong khi cấy giữ giống hoặc nghi ngờ giống chưa thuần chủng. 2.4.2.3. Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, đếm số lượng khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa petri, để từ đó tính số lượng tế bào trong 1 g đất. * Cách đếm: Đếm số khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa petri, trên mặt đáy phía ngoài của đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu các khuẩn lạc đã được đếm. Nếu số lượng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia mặt đáy thành các phần và đếm số khuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại. Không đếm các đĩa khuẩn lạc mọc quá dày không thể đếm được hoặc các đĩa bị nhiễm ảnh hưởng đến sự phát triển của XK. * Cách tính kết quả: Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào. Tuy nhiên trên thực tế khó có thể xác định được chính xác là một khuẩn lạc có thể được hình thành từ 1 hay nhiều tế bào. Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong 1 đơn vị thể tích, người ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 đơn vị thể tích” (CFU - Colony Forming Unit). Như vậy từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) có trong 1 g đất theo công thức sau: CFU/g = A x 1/K x 1/V Trong đó: A: Số lượng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng độ pha loãng. V: Thể tích dịch đất pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch. K: Độ pha loãng của dịch đất được cấy trên thạch. Số CFU/1 đĩa petri được coi là tốt để tính tổng số CFU/1g đất nếu khi cấy 0,1 ml dịch đất pha loãng trên môi trường đếm được từ 30 - 300/1 đĩa. 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh * Phương pháp thỏi thạch Đây là phương pháp nhằm sơ tuyển XK có HTKS. XK được nuôi cấy trên môi trường Gause 1, Gause 2, hoặc ISP4 trong hộp petri sau 5 - 7 ngày. Nuôi cấy VSVKĐ trên các môi trường thích hợp trong các đĩa petri (vi khuẩn nuôi trên môi trường MPA, nấm mốc nuôi trên môi trường PDA). Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có XK được nuôi cấy từ 5 - 7 ngày, sinh trưởng tốt, không bị nhiễm. Đặt các thỏi thạch lên bề mặt môi trường thạch đĩa đã cấy VSVKĐ. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 - 5 giờ để CKS khuếch tán rồi nuôi ở 28 - 300C. Đọc kết quả sau 24 giờ đối với vi khuẩn kiểm định, 48 - 72 giờ đối với nấm kiểm định. HTKS của mỗi chủng XK được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn: D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính của thỏi thạch. * Phương pháp đục lỗ Đây là phương pháp xác định HTKS của XK trong dịch lên men. Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể (bỏ thạch) trên máy lắc 220 vòng/phút sau 5 ÷ 7 ngày thì thu dịch kháng sinh thô từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng khoan nút chai khoan lỗ trên bề mặt thạch đã cấy VSVKĐ trong các đĩa petri. Nhỏ vào môi trường 0,1 ml dịch kháng sinh cần thử. Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch [7, 9, 14]. 2.4.4. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy truyền sang bình nón dung tích 250 ml có chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi trên máy lắc 220 vòng/phút ở 28 - 300C, trong khoảng thời gian từ 5 - 7 ngày. Sau đó thu dịch lên men và xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ. HTKS của các chủng XK được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn [15]. 2.4.5. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống Do mật độ của khuẩn lạc giảm dần theo độ pha loãng của dịch huyền phù nên ở các đĩa thạch có độ pha loãng thấp, các khuần lạc thường mọc tách rời nhau và có khả năng được hình thành từ một tế bào riêng rẽ. Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít tế bào từ các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa cấy vào các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause 1, để vào tủ ấm 28 - 300C trong thời gian từ 4 - 7 ngày, sau đó kiểm tra thật kỹ độ thuần chủng của các chủng giống, loại bỏ các ống bị nhiễm. Giữ các ống giống này trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 40C. Để bảo quản giống cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành cấy chuyển giống định kỳ 3 tháng một lần trên môi trường thạch nghiêng Gause 1, trước khi sử dụng cần cấy chuyển giống sang ống thạch mới [9]. 2.4.6. Phương pháp lên men xạ khuẩn Từ ống thạch nghiêng, giống đã được hoạt hóa được cấy sang các bình nón có dung tích 250 ml chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 300C trong thời gian 5 - 7 ngày. Sau đó thu dịch lên men, li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu riêng sinh khối và phần dịch. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà sử dụng phần dịch hay phần sinh khối: Xác định HTKS trong dịch lên men hay trong sinh khối tế bào [9]. 2.4.7. Xác định hoạt tính enzym của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch * Chiết dịch enzym Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể (bỏ thạch) trên máy lắc 220 vòng/phút sau 5 ngày thì thu dịch enzym từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, chiết dịch trong thì thu được dịch enzym thô. * Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau: - Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza) - Casein (xác định hoạt tính proteaza) - CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza). Chuẩn bị môi trường cơ chất - thạch gồm: 18g thạch, 2 g cơ chất, nước cất vừa đủ 1 lít. Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các đĩa petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3 mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dung dịch enzym cần thử, để ở tủ lạnh 40C khoảng 4 - 5 giờ cho enzym khuếch tán vào trong thạch, sau đó đặt vào tủ ấm 300C trong 24 giờ để enzym hoạt động phân giải cơ chất [14]. Nhuộm màu đĩa thạch bằng dung dịch lugol để kiểm tra khả năng phân giải cơ chất của enzym trong dịch lên men. Vòng cơ chất không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch. Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng thuỷ phân cơ chất, d là đường kính lỗ thạch. 2.4.8. Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzym Dịch nuôi cấy sau khi lọc được đun cách thủy ở 400C, 500C, 600C, 700C, 800C kéo dài 20, 40 và 60 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng được dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức: - Giá trị trung bình (): - Độ lệch chuẩn (): - Sai số m: Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập xạ khuẩn 3.1.1. Phân bố của xạ khuẩn ở trong đất Từ 19 mẫu đất thu từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Trại Cau, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 92 chủng XK thuộc chi Streptomyces. Số lượng và sự phân bố của XK trong đất được trình bày trên bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau Loại đất lấy mẫuSố lượng mẫuTính chất của đất Thảm thực vậtpH của đấtSố lượng XK/g (CFU/g)Số chủng phân lập đượcĐất trồng chè3Cây chè4.152 × 1066Đất trồng keo6Cây keo4.886,83 × 10622Đất trồng màu4Ngô, khoai, mía6.8317 × 10636Đất trồng lúa2Cây lúa5.647,5 × 10610Đất vườn2Cây ăn quả, đất rau6.5312 × 10615Đất đồi trọc2Bụi cỏ4.061,5 × 1063Tổng1992 Từ kết quả trên bảng 3.1 cho thấy sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú và phụ thuộc nhiều vào đặc điểm, tính chất của từng loại đất. Xạ khuẩn thường phân bố nhiều ở các loại đất tơi xốp, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, có pH trung tính và độ ẩm thích hợp. Số lượng XK gặp nhiều nhất ở loại đất trồng màu và đất vườn. Đất trồng màu và đất vườn là những loại đất thường xuyên được cuốc xới, bổ sung nguồn dinh dưỡng và pH thích hợp. Tất cả các đặc tính này là điều kiện rất thuận lợi cho sự phân bố của XK. Vì vậy, số lượng XK phân lập được từ hai loại đất này cũng nhiều nhất. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh học của XK. 3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu Từ 92 chủng XK đã được phân lập và thuần khiết, chúng tôi nhận thấy màu sắc hệ khuẩn ty rất đa dạng. Có 7 nhóm màu xuất hiện với số lượng và tỷ lệ khác nhau, được thể hiện trên bảng 3.2, hình 3.1 và 3.2. Bảng 3.2. Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu Nhóm màuSố lượng chủngTỷ lệ (%)Xám (Grey)5458,7%Trắng (White)1617,4%Hồng (Pink)77,6%Nâu (Brown)77,6%Tím (Violet)44,3%Xanh (Blue)33.3%Vàng (Yellow)11,1%Tổng92100% Từ kết quả trên bảng 3.2 cho thấy như thường lệ, XK thuộc 2 nhóm xám và trắng vẫn chiếm ưu thế. Tỷ lệ các chủng XK thuộc nhóm xám chiếm 58,7%, tiếp đó là nhóm trắng chiếm 17,4%, các nhóm hồng, nâu chiếm 7,6%, nhóm tím chiếm 4,3%, nhóm xanh chiếm 3,3%, và nhóm vàng chiếm 1,1%. Kết quả của chúng tôi cũng rất phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả [6, 9, 20, 24] khi phân lập XK cũng đã nhận thấy nhóm màu xám là chiếm ưu thế. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của tác giả Vũ Hồng Kim khi phân lập XK từ đất Sơn La thì nhận thấy nhóm màu trắng chiếm ưu thế hơn, sau đó mới đến nhóm màu xám và các nhóm màu khác. Sự khác biệt này có thể do tính chất của đất, các vùng đất khác nhau có các điều kiện tự nhiên như: độ ẩm, độ màu mỡ, độ thoáng khí khác nhau nên các VSV nói chung và XK nói riêng có sự đa dạng về màu sắc khác nhau. Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu Hình 3.2. Một số chủng xạ khuẩn thuần khiết Từ kết quả trên cũng cho thấy, tuy các chủng XK phân lập được rất đa dạng về màu sắc, nhưng tỷ lệ các chủng XK thuộc nhóm màu hồng, nâu, tím, xanh thấp hơn nhiều so với các chủng XK thuộc nhóm màu xám và màu trắng. Đặc biệt là nhóm XK màu vàng, trong 92 chủng phân lập được chỉ có một chủng. Sự chênh lệch này cũng có rất nhiều nguyên nhân đáng chú ý như điều kiện tự nhiên của nơi lấy mẫu và cách lấy mẫu đất. Như vậy theo kết quả trên thì không thể đưa ra một quy luật chung nào cho sự phân bố của XK theo nhóm màu. Nhưng nhiều nghiên cứu về XK ở các vùng khác nhau trong cả nước đã cho thấy XK thuộc nhóm màu xám và nhóm màu trắng thường chiếm tỷ lệ cao hơn. 3.2. Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh 3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập Sau khi phân lập và thuần khiết được 92 chủng XK, để tuyển chọn các chủng XK có HTKS cao, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ HTKS của các chủng XK bằng phương pháp thỏi thạch với 7 chủng VSVKĐ như đã nêu trong mục 2.2.2. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.3 và hình 3.3. Nhóm màuXK phân lập đượcXK có HTKSTỷ lệ chủng có HTKS so với tổng số (%)Số lượngTỷ lệ (%)Số lượngTỷ lệ (%)Xám5458,7%2256,4%23,9%Trắng1617,4%410,2%4,3%Hồng77,6%615,4%6,5%Nâu77,6%12,6%1,1%Tím44,3%37,7%3,3%Xanh da trời33,3%25,1%2,2%Vàng11,1%12,6%1,1%Tổng92100%39100%42,4% Bảng 3.3. HTKS của các chủng xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu Theo kết quả ở bảng 3.3 cho thấy số chủng XK có HTKS là 39 chủng trên tổng số 92 chủng phân lập được, chiếm 42,4%. So sánh với các kết quả đã công bố trước đây [15], kết quả nghiên cứu của chúng tôi là tương đối cao. Điều này đã chứng tỏ số lượng XK có khả năng sinh CKS ở đất Thái Nguyên là rất lớn, đặc biệt là đất ở khu vực Trại Cau lại có tỷ lệ XK sinh CKS cao hơn so với đất ở một số khu vực khác của Thái Nguyên [17]. Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có HTKS phân theo nhóm màu Kết quả này cho thấy, sự hình thành CKS của XK phụ thuộc nhiều vào các yếu tố của môi trường, không phải cứ nhiều chất dinh dưỡng thì XK sẽ tổng hợp CKS hay ngược lại. Đây cũng là đặc điểm chung cho quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm bậc 2, trong đó có CKS. Tỷ lệ các chủng XK có HTKS cũng khác nhau giữa các nhóm màu, cụ thể: nhóm màu xám có tỷ lệ các chủng có HTKS là cao nhất (chiếm 56,41%), tiếp theo là nhóm màu hồng (chiếm 15,38%), nhóm màu trắng (chiếm 10,26%), nhóm màu tím (chiếm 7,69%), nhóm màu xanh (chiếm 5,13%), và thấp nhất là nhóm màu nâu, vàng (chiếm 2,56%). Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu của một số tác giả [15, 20, 23, 24]. Song nếu xét riêng từng nhóm màu, chúng tôi nhận thấy các nhóm màu tím, xanh, vàng mặc dù số chủng phân lập được ít nhưng tỷ lệ số chủng có HTKS tương đối cao. 3.2.2. Hoạt phổ của các chủng xạ khuẩn Để xác định hoạt phổ của các chủng XK có HTKS, chúng tôi sử dụng các nhóm VSVKĐ là: nhóm vi khuẩn gram dương, nhóm vi khuẩn gram âm, nấm mốc. Kết quả kiểm tra chúng tôi nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng XK với các nhóm VSVKĐ là khác nhau và được thể hiện trên các bảng 3.4, 3.5 và hình 3.4. Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với các VSVKĐ Vi sinh vật kiểm địnhChủng XK có HTKSSố lượngTỷ lệ (%)VK G (+)S. aureus ATCC 259232666,67%B. subtilis VTCC-B-8882153,85%VK G (-)E.coli VTCC-B-8832051,28%P. aeruginosa VTCC-B-4812051,28%Nấm mốcF. oxysporum VTCCF-13012769,23%F. solani VTCCF-13021025,64%A. niger VTCCF-0011743,6% Bảng 3.5. Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập Số chủng XK có HT kháng VK G+Số chủng XK có HT kháng VK G-Số chủng XK kháng nấm mốcSố chủng XK kháng cả 2 nhóm VK G(+) và VK G (-)Số chủng XK kháng cả 3 nhóm VSVKĐSố lượngTỷ lệ %Số lượngTỷ lệ %Số lượngTỷ lệ %Số lượngTỷ lệ %Số lượngTỷ lệ %3076,922564,103179,492256,411743,60 Kết quả trên bảng 3.4 và 3.5 cho thấy các chủng XK phân lập được có khả năng đối kháng cao với các nhóm VSVKĐ. Đặc biệt, số chủng có khả năng kháng nấm chiếm tỷ lệ khá cao (chiếm 79,49%), số chủng kháng vi khuẩn G (+) chiếm tỷ lệ 76,92%, số chủng XK kháng vi khuẩn G (-) chiếm tỷ lệ 64,10%. Đáng chú ý là trong số đó, có 22 chủng (chiếm 56,41%) có khả năng kháng được cả 2 nhóm vi khuẩn G (+) và G (-), có 17 chủng (chiếm 43,60%) có khả năng kháng được cả 3 nhóm VSVKĐ. Kết quả này một lần nữa cho thấy không chỉ tỷ lệ XK có HTKS cao mà đặc biệt tỷ lệ các chủng có hoạt tính kháng nấm cũng khá cao so với nhiều nghiên cứu trước đây [15, 20]. Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có HTKS 3.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKS cao Căn cứ vào kết quả kiểm tra sơ bộ HTKS, chúng tôi đã chọn ra 5 chủng XK có HTKS mạnh nhất để tiếp tục sàng lọc bước 2. Các chủng này được ký hiệu là: TC12.1, TC13.1, TC13.2, TC15.9, TC16.12. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng của 5 chủng XK trên với các VSVKĐ được trình bày trên bảng 3.6. Bảng 3.6. HTKS của 5 chủng XK lựa chọn trên môi trường thạch Vi sinh vật kiểm địnhHoạt tính kháng sinh (D-d, mm)TC13.1TC13.2TC15.9TC12.1TC16.12VK G (+)S. aureus ATCC 2592310,2±0,4012,8±0,175,0±0,3520,6±0,408,1±0,23B. subtilis VTCC-B-888++19,8±0,1715,6±0,35+VK G (-)E.coli VTCC-B-883++20,4±0,2918,0±0,297,8±0,23P. aeruginosa VTCC-B-48128,2±0,4629,6±0,235,5±0,2914,6±0,2311,1±0,40Nấm mốcF. oxysporum VTCCF-130110,7±0,46+17,6±0,29+10,9±0,23F. solani VTCCF-1302++20,2±0,46++A. niger VTCCF-001+-+-5,7±0,46 Chú thích: (+): Hoạt tính yếu, (-): không có hoạt tính Bước tiếp theo, chúng tôi tiến hành lên men các chủng XK này trên môi trường dịch thể Gause I và tiến hành kiểm tra HTKS của dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.7. Vi sinh vật kiểm địnhHoạt tính kháng sinh (D-d, mm)TC13.1TC13.2TC15.9TC12.1TC16.12VK G (+)S. aureus ATCC 2592322,6±0,2924,5±0,2911,2±0,1727,1±0,2313,1±0,23B. subtilis VTCC-B-88823,5±0,2924,2±0,1715,7±0,2920,7±0,1710,8±0,17VK G (-)E.coli VTCC-B-88324,5±0,2926,4±0,2927,2±0,1726,3±0,3510,8±0,17P. aeruginosa VTCC-B-48128,3±0,2829,8±0,2827,3±0,2320,7±0,218,9±0,28Nấm mốcF. oxysporum VTCCF-130126,4±0,5024,8±0,2118,9±0,2825,1±0,2315,4±0,35F. solani VTCCF-130225,9±0,2126,0±0,2912,1±0,2324,6±0,5016,5±0,35A. niger VTCCF-001-----Bảng 3.7. HTKS của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn Chú thích: (-): không có hoạt tính Kết quả trên cho thấy cả 5 chủng XK đều vẫn giữ được HTKS khi chuyển từ môi trường thạch sang môi trường dịch thể. Tất cả đều có khả năng ức chế được 6 trong số 7 chủng VSVKĐ và hầu như không có hoạt tính với chủng A. niger VTCCF-001. Đặc biệt, trong số đó có 3 chủng TC13.1, TC13.2, và TC12.1 là có hoạt tính khá mạnh với tất cả các VSVKĐ (hình 3.5). Với mục đích chọn ra các chủng có HTKS cao, có hoạt phổ rộng và đặc biệt là có khả năng kháng nấm, 3 chủng trên được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Hình 3.5. HTKS của dịch lên men 5 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 1: TC16.12; 2: TC15.9; 3: TC13.1; 4: TC13.2; 5: TC12.1 Sa ATCC: Staphylococcus aureus ATCC 25923; Bs VTCC: Bacillus subtilis VTCC-B-888; E.coli VTCC: Escherichia coli VTCC-B-883; Pa VTCC: Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 3.3. Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính enzym 3.3.1. Hoạt tính enzym của xạ khuẩn Trong quá trình sinh trưởng, các enzym được hình thành trong tế bào và một số được tiết ra môi trường xung quanh. Trong sản xuất enzym từ xạ khuẩn chủ yếu là thu nhận các enzym ngoại bào. Không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzym như nhau và ngay cả những chủng trong cùng một loài cũng không có hoạt tính như nhau. Vì vậy, khi tuyển chọn chủng giống phải tiến hành phân lập, kiểm tra và lựa chọn các chủng có hoạt tính enzym mạnh, sinh nhiều enzym mong muốn theo từng mục đích. Để tuyển chọn các chủng có hoạt tính enzym cao, trước hết, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ hoạt tính enzym của các chủng. Qua kết quả kiểm tra sơ bộ, chúng tôi đã chọn ra 5 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục sàng lọc bước 2. Các chủng này được kí hiệu lần lượt là: TC13.1, TC15.4, TC16.4, TC12.10, TC19.9. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzym của 5 chủng xạ khuẩn được thể hiện trên bảng 3.8. Bảng 3.8. Hoạt tính enzym của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn Kí hiệu chủngHoạt tính enzym (D - d, mm)AmylazaCMC-azaProteazaTC13.18,1 ± 0,179,9 ± 0,23+TC15.4+10,5 ± 0,2910,1 ± 0,20TC16.49,0 ± 0,1212,1 ± 0,23+TC12.106,1 ± 0,408,0 ± 0,287,3 ± 0,15TC19.914,5 ±0,2918,1 ± 0,2319,0 ± 0,17 Chú thích: (+): Hoạt tính yếu Tiếp theo, 5 chủng XK này được nuôi lắc trên môi trường dịch thể Gause 1 là một trong các môi trường lên men thích hợp cho XK. Sau 4 - 5 ngày thu dịch lên men và tiến hành kiểm tra hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9. Bảng 3.9. Hoạt tính enzym của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn Kí hiệu chủngHoạt tính enzym (D - d, mm)AmylazaCMC-azaProteazaTC13.1+8,2 ± 0,2111,2 ± 0,17TC15.4+12,1 ± 0,2010,3 ±0,17TC16.411,5 ± 0.2914,8 ± 0,2113,4 ± 0,23TC12.1012,7 ± 0.1714,6 ± 0,3512,1 ± 0,23TC19.912,6 ± 0.2317,4 ± 0,3517,2 ±0,17 Chú thích: (+): Hoạt tính yếu Hình 3.6. Hoạt tính enzym của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 1: TC13.1; 2: TC16.4; 3: TC12.10; 4: TC15.4; 5: TC19.9 Từ kết quả trên 2 bảng 3.8 và 3.9 cho thấy 5 chủng xạ khuẩn đều vẫn giữ được hoạt tính enzym khi chuyển từ môi trường thạch sang môi trường dịch thể, khả năng phân giải 3 nguồn cơ chất của 5 chủng xạ khuẩn tương đối ổn định. Chủng TC19.9 có hoạt tính enzym mạnh nhất, tiếp theo là chủng TC16.4, TC12.10, 2 chủng TC13.1 và TC15.4 chỉ có hoạt tính CMC-aza và proteaza, còn hoạt tính amylaza rất yếu (hình 3.6). Căn cứ từ kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn chủng TC19.9 để tiếp tục nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của enzym. 3.3.2. Khả năng chịu nhiệt của enzym Ngày nay, tốc độ ô nhiễm môi trường đang gia tăng, do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc thải chất thải vào môi trường. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzym có khả năng và triển vọng trong giám định và xử lý ô nhiễm môi trường. Khả năng bền với nhiệt độ của enzym là một đặc điểm cần nghiên cứu nhằm ứng dụng trong xử lý môi trường. Để xác định khả năng bền nhiệt của enzym từ chủng TC19.9, chúng tôi tiến hành lên men chủng trong môi trường dịch thể Gause 1, li tâm dịch nuôi cấy để thu dịch enzym thô. Tiến hành xử lý dịch enzym thô ở các nhiệt độ: 400C; 500C; 600C; 700C; 800C trong thời gian 20, 40, và 60 phút. Để nguội và xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả được trình bày trên bảng 3.10, và các hình 3.7, 3.8, 3.9. Bảng 3.10. Hoạt tính enzym ở các nhiệt độ khác nhau Thời gian xử lý (phút)EnzymHoạt tính enzym (D-d, mm)400C500C600C700C800C20Amylaza11,5±0,2312,0±0,4911,5±0,109,2±0,498,9±0,10CMC-aza11,2±0,3011,0±0,1510,8±0,216,5±0,503,2±0,33Proteaza13,5±0,3015,5±0,2014,5±0,5013,1±0,297,7±0,3540Amylaza11,3±0,1711,0±0,1410,5±0,359,1±0.318,5±0,40CMC-aza12,8±0,2013,5±0,4014,5±0,212,5±0,402,0±0,10Proteaza13,5±0,2115,2±0,1415,0±0,302,2±0,17-60Amylaza10,5±0,1410,0±0,219,7±0,233,7±0,35-CMC-aza14,5±0,3013,0±0,2015,5±0,355,1±0,505,0±0,29Proteaza15,0±0,2013,5±0,3015,5±0,293,5±0,42- (Đối chứng: Dịch enzym chưa xử lý với nhiệt độ Amylaza: 20.8 ± 0,50; CMC-aza: 12,6 ± 0,35; Proteaza: 12,7 ± 0,30; (-): không có hoạt tính) Từ kết quả trên bảng 3.10 cho thấy, hoạt tính enzym của chủng TC19.9 tương đối bền vững với nhiệt độ, hoạt tính có sự thay đổi khi tăng dần thời gian xử lý ở cùng một mức nhiệt độ. Khả năng phân giải 3 nguồn cơ chất có sự khác nhau. Đối với enzym CMC-aza, proteaza, trong thời gian 60 phút khi tăng xử lý nhiệt độ, hoạt tính enzym giảm ở 500C sau đó lại tăng ở 600C và bắt đầu giảm ở 700C, hoạt tính mạnh hơn so với đối chứng. Riêng với enzym amylaza, ngay khi xử lý ở nhiệt độ 400 C trong thời gian 20 phút hoạt tính enzym đã giảm còn 55,3% so với đối chứng. Hình 3.7. Khả năng phân giải Tinh bột của dịch lọc sau khi đã xử lý ở các nhiệt độ khác nhau Hình 3.8. Khả năng phân giải CMC của dịch lọc sau khi đã xử lý ở các nhiệt độ khác nhau Hình 3.9. Khả năng phân giải Casein của dịch lọc sau khi đã xử lý ở các nhiệt độ khác nhau CMC-aza Proteaza Hình 3.10. Khả năng phân giải cơ chất của dịch lọc đã xử lý ở các nhiệt độ khác nhau trong vòng 60 phút Như vậy, 2 enzym CMC-aza và proteaza là những enzym có khả năng chịu nhiệt cao, nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của 2 enzym này là 600C. Đây là đặc điểm rất thuận lợi cho việc ứng dụng trong xử lý môi trường. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong các loại đất là khác nhau. Số lượng xạ khuẩn phân bố trong các loại đất dao động từ 1,5 × 106 CFU/g đất - 17 × 106 CFU/g đất. Số lượng xạ khuẩn phân bố trong đất trồng màu là nhiều nhất, có tới 17 × 106 CFU/g đất. 2. Từ 19 mẫu đất thu từ các loại đât khác nhau tại khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 92 chủng xạ khuẩn. Trong đó, nhóm xám chiếm tỷ lệ cao nhất 58,70%, nhóm trắng chiếm 17,4%, các nhóm màu hồng, nâu chiếm 7,6%, nhóm tím chiếm 4,3%, nhóm xanh da trời chiếm 3,3%, và nhóm vàng chiếm 1,1%. 3. Trong tổng số 92 chủng xạ khuẩn phân lập được có 39 chủng có hoạt tính kháng sinh, chiếm 42,4%. Trong tổng số các chủng phân lập được có: - Tỷ lệ kháng vi khuẩn G (+) là 76,92% - Tỷ lệ kháng vi khuẩn G (-) là 64,10% - Tỷ lệ kháng nấm là 79,49% - Tỷ lệ kháng cả 2 nhóm vi khuẩn G (+) và vi khuẩn G (-) là 56,41% - Tỷ lệ kháng cả 3 nhóm VSVKĐ là 43,60% 4. Đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao để tiếp tục nghiên cứu ký hiệu là TC13.1, TC13.2, và TC12.1. 5. Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzym cao ký hiệu là TC19.9 và TC16.4, đồng thời đã nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của enzym chủng TC19.9. KIẾN NGHỊ 1. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, phân loại và khả năng tổng hợp chất kháng sinh của 3 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn: TC13.1, TC13.2, TC12.1. 2. Nghiên cứu tính chất lý hóa của chất kháng sinh từ 3 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Đình Quang Bính, Vi sinh vật học công nghiệp, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr. 53 - 71, 2005. Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội, 2004. Nguyễn Văn Cách, Lê Văn Nhương, Cơ sở công nghệ sinh học, tập 4 - công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục Viêtj Nam, 2009. Nguyễn Hoàng Chiến, Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Hà Nội, 2000. Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội, 2000. Nguyễn Thị Kim Cúc, Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ khu vực Trại Cau tỉnh Thái Nguyên, Luận văn tốt nghiệp, Thái Nguyên, 2007. Nguyễn Lân Dũng (dịch), Thực tập vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1983, Tr. 73 - 81. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1978. Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, 1972. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội, 2002. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006. Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB Đại học sư phạm, 2007. Nguyễn Thành Đạt, Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, 2000. Nguyễn Thành Đạt, K.A.Vinogradova, V.A.Poltorac, Tính biến dị bề mặt màng bào tử xạ khuẩn sinh chromomycin. Act. Aburaviensis, Microbiologia, TXL III, N05, NXB Academia cccp, 1974, Tr. 857 - 863. Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006. Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2004. Trịnh Ngọc Hoàng, Nghiên cứu tính đối kháng của xạ khuẩn với một số VSV gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009. Lê Mai Hương, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập ở Hà Nội và các vùng lân cận, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993. Lê Gia Hy, Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, NXB Giáo dục Việt Nam, 2010. Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội, 1994. Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học, Hà Nội, Tr. 7 - 21, 2005. Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục, 2007. Lê Tiến, Nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ một số mẫu đất ở khu vực Hồ Núi Cốc - Tỉnh Thái Nguyên, Luận văn tốt nghiệp, Thái Nguyên, 2007. Nguyễn Đình Tuấn, Nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập tại Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp, Viện Đại học mở, Hà Nội, 2004. Trần Thị Cẩm Vân, Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 2001. B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH Adhikari T. B, Identification of biovars and races of Pseudomonas solanacearum and source of resistance in tomato in Nepa, Plant disease, vol 77, p. 905 - 907, 1993. Agrios, G. N, Plant Pathology, 4th Edition. Academic Press. San Diego, USA, 1997. Geschva, A. Shurk and W. Romer, Phosphate inhibition of secondary metabolism in Streptomyces hygroscopicus and its reversal by cyclic AMP, Arch. Microbiol.121, p. 91 - 96, 1979. M.A. Elberson, F. Malekzadeh, M.T. Yazdi, N. Kameranpour, M.R. Noori - Daloii, M.H. Matte, M. Shahamat, R.R. Colwell, K.R. Sowers, Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soils, J. Syst. Evol. Microbiol 50, p. 993, 2000. R. Gupta, O.K Beg, P. Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59 (1) ,p. 15, 2002. Ramasamy Vijaykumar, Chinnasamy Muthukumar, Nooruddin Thajuddin, nnamalai Panneerselvam, and Rengasamy Saravanamuthu, Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk Strait region of Bay of Bengal, India, Actinomycetologica, 2007, 21: 59 - 65. Ronal M. Atlas, Microoganism in our world, Publish by Mosby-year book, Inc, 1995. Trerner, H.D, Buckus, E.J, System of color wheels for streptomyces taxonomy, Appl. Microbiol.11, p. 335 - 338, 1963. Waksman, S.A. The Actinomycetes. Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, 1961, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA. William S.T and Davies F.L., Use of antibiotics for selective isolation and enumeration of actinomycetes in soil, J. Gen, Microbiol, 1965, 38: 251 - 261. Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007/4, 17 (3): 162 - 170. C. MỘT SỐ TRANG WEB  HYPERLINK "" .News.Bacsi.com/y dược/những điều cần biết dùng thuốc kháng sinh thế nào cho đúng MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị Tóm tắt kết quả nghiên cứu của đề tài  TOC \o "1-3" \h \z \u  HYPERLINK \l "_Toc307137632" MỞ ĐẦU  PAGEREF _Toc307137632 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc307137633" 1. Lý do chọn đề tài  PAGEREF _Toc307137633 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc307137634" 2. Mục tiêu nghiên cứu  PAGEREF _Toc307137634 \h 2  HYPERLINK \l "_Toc307137635" 3. Nội dung nghiên cứu  PAGEREF _Toc307137635 \h 2  HYPERLINK \l "_Toc307137636" Chương 1.  HYPERLINK \l "_Toc307137637" TỔNG QUAN TÀI LIỆU  PAGEREF _Toc307137637 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc307137638" 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137638 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc307137639" 1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên  PAGEREF _Toc307137639 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc307137640" 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137640 \h 4  HYPERLINK \l "_Toc307137641" 1.2. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137641 \h 7  HYPERLINK \l "_Toc307137642" 1.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137642 \h 8  HYPERLINK \l "_Toc307137643" 1.3.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống  PAGEREF _Toc307137643 \h 8  HYPERLINK \l "_Toc307137645" 1.3.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại  PAGEREF _Toc307137645 \h 9  HYPERLINK \l "_Toc307137646" 1.4. Ứng dụng của chất kháng sinh  PAGEREF _Toc307137646 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc307137647" 1.4.1. Ứng dụng trong y học  PAGEREF _Toc307137647 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc307137648" 1.4.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y  PAGEREF _Toc307137648 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc307137649" 1.5. Khả năng tổng hợp enzym ở vi sinh vật  PAGEREF _Toc307137649 \h 13  HYPERLINK \l "_Toc307137650" 1.5.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzym  PAGEREF _Toc307137650 \h 13  HYPERLINK \l "_Toc307137651" 1.5.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzym cao từ tự nhiên  PAGEREF _Toc307137651 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc307137652" 1.5.3. Một số enzym vi sinh vật chủ yếu  PAGEREF _Toc307137652 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc307137653" Chương 2.  HYPERLINK \l "_Toc307137654" ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  PAGEREF _Toc307137654 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137655" 2.1. Vật liệu nghiên cứu  PAGEREF _Toc307137655 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137656" 2.2. Đối tượng nghiên cứu  PAGEREF _Toc307137656 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137657" 2.2.1 Xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137657 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137658" 2.2.2. Vi sinh vật kiểm định  PAGEREF _Toc307137658 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137659" 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị  PAGEREF _Toc307137659 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137660" 2.3.1. Hóa chất  PAGEREF _Toc307137660 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc307137661" 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị  PAGEREF _Toc307137661 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc307137662" 2.3.3. Môi trường nghiên cứu  PAGEREF _Toc307137662 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc307137663" 2.4. Phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc307137663 \h 19  HYPERLINK \l "_Toc307137664" 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu đất  PAGEREF _Toc307137664 \h 19  HYPERLINK \l "_Toc307137665" 2.4.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137665 \h 19  HYPERLINK \l "_Toc307137666" 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh  PAGEREF _Toc307137666 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc307137667" 2.4.4. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh  PAGEREF _Toc307137667 \h 22  HYPERLINK \l "_Toc307137668" 2.4.5. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống  PAGEREF _Toc307137668 \h 22  HYPERLINK \l "_Toc307137669" 2.4.6. Phương pháp lên men xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137669 \h 22  HYPERLINK \l "_Toc307137670" 2.4.7. Xác định hoạt tính enzym của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch  PAGEREF _Toc307137670 \h 23  HYPERLINK \l "_Toc307137671" 2.4.8. Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzym  PAGEREF _Toc307137671 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc307137672" 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu  PAGEREF _Toc307137672 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc307137673" Chương 3.  HYPERLINK \l "_Toc307137674" KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  PAGEREF _Toc307137674 \h 25  HYPERLINK \l "_Toc307137675" 3.1. Phân lập xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137675 \h 25  HYPERLINK \l "_Toc307137676" 3.1.1. Phân bố của xạ khuẩn ở trong đất  PAGEREF _Toc307137676 \h 25  HYPERLINK \l "_Toc307137677" 3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu  PAGEREF _Toc307137677 \h 26  HYPERLINK \l "_Toc307137678" 3.2. Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh  PAGEREF _Toc307137678 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc307137679" 3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập  PAGEREF _Toc307137679 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc307137680" 3.2.2. Hoạt phổ của các chủng xạ khuẩn 29  HYPERLINK \l "_Toc307137681" 3.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKS cao  PAGEREF _Toc307137681 \h 31  HYPERLINK \l "_Toc307137682" 3.3. Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính enzym  PAGEREF _Toc307137682 \h 34  HYPERLINK \l "_Toc307137683" 3.3.1. Hoạt tính enzym của xạ khuẩn  PAGEREF _Toc307137683 \h 34  HYPERLINK \l "_Toc307137684" 3.3.2. Khả năng chịu nhiệt của enzym  PAGEREF _Toc307137684 \h 36  HYPERLINK \l "_Toc307137685" KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  PAGEREF _Toc307137685 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc307137686" TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _Toc307137686 \h 42