Tuyển non dòng vô tính cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) kháng bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora Leaf Fall Disease)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN VĂN CẢNH NGUYỄN NGỌC THANH TRANG ThS. PHAN THÀNH DŨNG TS. PHAN PHƢỚC HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS. Trần Văn Cảnh, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Phan Phước Hiền đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Ban Giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi, KS. Nguyễn Ngọc Mai và ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp. Các cô, chú, anh, chị tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn bè thân yêu của lớp DH03SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và giáo dục. Bố mẹ và anh chị luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2007 NGUYỄN NGỌC THANH TRANG iv TÓM TẮT NGUYỄN NGỌC THANH TRANG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. “TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease)”. Thực hiện từ 03/03/2007 đến 30/07/2007 tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN. Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Văn Cảnh, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Phan Phƣớc Hiền. Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá cao su (10 – 12 ngày tuổi) của một số dvt bị nhiễm CLFD và mẫu lá hoàn toàn sạch bệnh. Nội dung nghiên cứu: Đánh giá tính kháng CLFD trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo; Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su; Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. Kết quả đạt được: Đánh giá tính kháng: + Là phương pháp tin cậy. + 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng, 12/60 dvt nhiễm nặng, 22/60 dvt nhiễm trung bình và 11/60 dvt nhiễm nhẹ. Khảo sát hoạt tính POD: Dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau; Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh; Không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính mẫn cảm với CLFD của các dvt.  Khảo sát mật độ khí khổng: Dvt khác nhau có số lượng khí khổng khác nhau; Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều càng dễ bị nhiễm bệnh. v SUMMARY NGUYEN NGOC THANH TRANG, Nong Lam University. “SCREENING RUBBER CLONES (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) RESISTANT TO CORYNESPORA LEAF FALL DISEASE”. The research was carried out from 03/03/2007 to 30/07/2007 at the laboratoy of Crop Protection Division, Molecular biology laboratory, laboratory of Experiment’s Rubber Technology Center – Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV). Supervisors: PhD. Tran Van Canh, Msc. Phan Thanh Dung and PhD. Phan Phuoc Hien. Materials and Methods: + Corynespora disease rubber leaflets (10 – 12 days old) used for estimation of POD activity. + Free – diseased leaflets (10 – 12 days old) used for artificial inoculation with Corynespora cassiicola and estimation of the number of stomas. + 60 rubber clones were screened for resistance to Corynespora leaf fall disease using detached leaflets technique and droplets of spore suspension. Results: + Screening rubber clones resistant to CLFD using detached leaflets technique is a reliable method. + 100% clones investigated were infected to CLFD at various susceptible levels. Among 60 clones, 15 clones are very severely infected; 12 clones are severely infected; 22 clones are moderately infected and 11 clones are lightly infected. + POD activities and the number of stoma are different from various clones. Generally, the more susceptible clones are, the more the number of stoma they have. The more POD activities the clones have, the less they are susceptible to the disease. But there is no linear correllation found between POD activity or the number of stoma and the disease severity. vi MỤC LỤC TÊN MỤC TRANG LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii TÓM TẮT .................................................................................................................. iv SUMMARY ................................................................................................................ v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. x DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ xi DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. xii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ ......................................................................................... xiii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ...................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ............................................................................................... 3 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 2.1. Sơ lược về cây cao su .................................................................................... 4 2.1.1. Cây cao su và tầm quan trọng của nó ...................................................... 4 2.1.2. Tình hình bệnh hại trên cây cao su .......................................................... 5 2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola ........................................................................ 6 2.2.1. Phân loại học ............................................................................................ 6 2.2.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 7 2.2.3. Đặc điểm sinh lý ...................................................................................... 7 2.2.4. Khả năng tồn tại ....................................................................................... 7 2.2.5. Khả năng phát tán .................................................................................... 8 2.2.6. Con đường xâm nhập, phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh của nấm C. cassiicola ................................................................................. 8 vii 2.3. Giới thiệu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ............................... 9 2.3.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 9 2.3.2. Triệu chứng của bệnh Corynespora trên cây cao su .............................. 10 2.3.2.1. Trên vườn ươm .............................................................................. 10 2.3.2.2. Trên vườn khai thác ....................................................................... 11 2.3.3. Khả năng hình thành nòi mới ................................................................ 12 2.3.4. Nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp tuyển non dvt ......... 13 2.4. Sơ lược về enzyme ...................................................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa ............................................................................................. 13 2.4.2. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 13 2.4.3. Cơ chế tác động ..................................................................................... 14 2.4.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme ................................ 14 2.4.5. Một số phương pháp xác định hoạt tính của enzyme ............................ 14 2.4.6. Sơ lược về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật .............. 16 2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su ....................... 17 2.4.8. Peroxidase .............................................................................................. 17 2.4.8.1. Sơ lược về peroxidase .................................................................... 17 2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su ..................................... 18 2.5. Sơ lược về khí khổng ................................................................................... 18 2.5.1. Cấu tạo ................................................................................................... 18 2.5.2. Sự phân bố ............................................................................................. 19 2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật .................................................. 20 2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng ............................................ 20 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .................................................................. 21 3.1.1. Thời gian ................................................................................................ 21 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 21 3.2. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 21 viii 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu lá ........................................................................ 21 3.2.2. Phương pháp phân lập nấm C. cassiicola .............................................. 22 3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ ....................................................................... 22 3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm .......................................................................... 22 3.2.2.3. Nhân số lượng bào tử ..................................................................... 22 3.2.3. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo ................................................................. 23 3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ ........................................................................ 23 3.2.3.2. Phương pháp .................................................................................. 23 3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện .................................................... 25 3.2.4. Phương pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt ....... 25 3.2.4.1. Mục đích ........................................................................................ 25 3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất ......................................................... 25 3.2.4.3. Phương pháp .................................................................................. 25 3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................. 27 3.2.5. Phương pháp đếm số lượng khí khổng trên lá của một số dvt cao su ... 27 3.2.5.1. Mục đích ........................................................................................ 27 3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ ....................................................................... 27 3.2.5.3. Phương pháp .................................................................................. 27 3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................. 28 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 29 4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê ........................................ 29 4.2. Kết quả phân lập .......................................................................................... 31 4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên ................................................................................. 32 4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng bệnh CFLD trên một số dvt cao su ............................................................. 36 4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng .. 36 4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính POD giữa các dvt ................................... 38 ix 4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su ..................................................... 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 43 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 43 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 45 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 x DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo Vệ Thực Vật C. cassiicola Corynespora cassiicola CLFD Corynespora Leaf Fall Disease CRD Completely Randomized Design Dvt Dòng vô tính H. brasiliensis Hevea brasiliensis NT Nghiệm thức PDA Potato Dextrose Agar POD Peroxidase PR proteins Pathogenesis Related Proteins PSA Potato Sucrose Agar UV Ultra Violet VNCCSVN Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam xi DANH SÁCH BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên ................... 24 Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vườn sơ tuyển 03 và 04 tại Lai Khê ................ 31 Bảng 4.2: Phân hạng mức độ nhiễm CLFD của 60 dvt cao su ................................. 33 Bảng 4.3: Phân bố phổ hệ ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm của con lai di truyền từ mẹ .............................................................................................................................. 34 Bảng 4.4: Phân bố phổ hệ ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm của con lai di truyền từ bố ............................................................................................................................... 34 Bảng 4.5: Bảng kết quả đo hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng .......... 37 Bảng 4.6: Bảng kết quả đo POD trên mẫu lá bệnh ................................................... 38 Bảng 4.7: Bảng kết quả đếm số lượng khí khổng ..................................................... 41 xii DANH SÁCH HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Cấu tạo khí khổng ..................................................................................... 19 Hình 2.2: Cấu tạo mở và đóng của khí khổng........................................................... 20 Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên ........................................... 24 Hình 4.1a: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá non ...................... 30 Hình 4.1b: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá già ..................... 30 Hình 4.2a: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PSA ....... 32 Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường PSA ....... 32 Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trường nhân tạo PSA ................................. 32 Hình 4.4: Dvt LH 94/612 sau 5, 7 và 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD.......... Error! Bookmark not defined. Hình 4.5: Khí khổng của một số dvt cao su .............................................................. 41 xiii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1: Hoạt tính POD trên mẫu đối chứng và mẫu bệnh của 12 dvt cao su ... 38 Biểu đồ 4.2: Mối tương quan giữa hoạt tính POD và mức nhiễm bệnh CLFD ........ 39 Biểu đồ 4.3: Mối quan hệ giữa số lượng khí khổng và tính mẫn cảm với CLFD của 12 dvt cao su .............................................................................................................. 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm chính từ chúng là mủ. Mủ cao su đứng thứ 3 trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta sau lúa và cà phê, đóng góp không nhỏ vào nền kinh tế quốc gia. Cũng như nhiều loại cây trồng khác, cây cao su bị nhiều loại mầm bệnh tấn công, một trong những loại bệnh hại trên cây cao su được quan tâm là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei. gây ra. Bệnh xuất hiện đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (Châu Phi) năm 1949, nhưng đến năm 1985 mới bùng phát thành đại dịch. Cho đến nay bệnh càng trở nên nghiêm trọng cả về mức độ, phạm vi gây bệnh và số lượng các dòng vô tính (dvt) cao su cao sản nhiễm bệnh ngàng càng tăng. Tuy nhiên, khi xây dựng chiến lược quản lý CLFD thì lại gặp những khó khăn do nấm C. cassiicola có khả năng gây bệnh quanh năm trên mọi tuổi lá và mọi giai đoạn sinh trưởng của cây; ngoài ra, nó còn gây bệnh trên cả cuống lá và chồi. Tác hại của bệnh rất lớn, cây thực sinh trong giai đoạn vườn ươm bị nhiễm bệnh làm cây chậm phát triển và không đạt được đường kính gốc ghép theo đúng thời điểm (Jacob, 2006). Trên vườn khai thác, trường hợp bệnh nghiêm trọng có thể làm cho cây bị chết và giảm sản lượng mủ từ 20 – 25%. (Nguồn: Report/Report2000.htm#Corynespora). Ở nước ta, CLFD được ghi nhận vào năm 1999, Cho đến nay bệnh chưa bùng phát thành đại dịch nhưng mức độ và phạm vi tác hại của bệnh đã gia tăng đáng kể. Nếu không có biện pháp quản lý và ngăn chặn kịp thời thì bệnh có thể bùng phát thành đại dịch sẽ gây thiệt lớn về kinh tế. Hiện nay, trên thế giới đã sử dụng nhiều chiến lược quản lý CLFD như kiểm soát về mặt di truyền, hoá học, sinh học... Phương pháp hóa học tương đối tốn kém 2 hiệu quả lại không cao. Những năm gần đây biện pháp kiểm soát sinh học đang được nghiên cứu ứng dụng ở một số nước trồng cao su nhằm hạn chế những tác hại của biện pháp hóa học. Phương pháp tuyển chọn các dvt có khả năng kháng hoặc ít mẫn cảm với bệnh đang được sử dụng ở môṭ số nước trồng cao su và Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN) là một trong những phương pháp chi phí thấp nhưng có độ tin cậy cao nhằm xác định sớm các dvt kháng và dễ mẫn cảm với bêṇh. Phương pháp này có ý nghĩa trong công tác tuyển chọn giống cao su nói chung và kháng CLFD nói riêng. Với sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và được sự hướng dẫn, giúp đỡ của ThS. Phan Thành Dũng, TS. Trần Văn Cảnh, TS. Phan Phước Hiền và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam, tôi thực hiện đề tài: “Tuyển non dòng vô tính cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) kháng bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora Leaf Fall Disease)”. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo. Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su. Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. 1.2.2. Yêu cầu Nhận dạng được các triệu chứng đặc trưng của bệnh và phân biệt được bệnh gây ra bởi nấm C. cassicola với một số bệnh khác trên cây cao su; Phân lập nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng. Nắm vững phương pháp lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá cắt rời bằng cách nhỏ giọt bào tử nấm và phương pháp đánh giá mức độ cảm nhiễm của mẫu lá sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm. 3 Nắm vững phương pháp ly trích, đo hoạt tính POD và cách vận hành các thiết bị và máy móc phục vụ cho thí nghiệm. Nắm vững phương pháp đếm khí khổng. 1.3. Giới hạn đề tài Thời gian thực tập ngắn (từ tháng 03/03/2007 – 30/07/2007), cũng như hạn chế về điều kiện thí nghiệm nên một số thí nghiệm chỉ tiến hành ở mức độ khảo sát. Mặt khác, các nghiên cứu về mối quan hệ giữa enzyme và tính kháng cũng như mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với bệnh trên cây cao su đã được nghiên cứu ở một số nước. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên phương pháp này được áp dụng tại VNCCSVN. Do đó, phương pháp chỉ được thực hiện trên một số lượng ít dvt. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây cao su 2.1.1. Cây cao su và tầm quan trọng của nó Cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là cây công nghiệp nhiệt đới thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae) và là loại cây sản xuất cao su thiên nhiên chính hiện nay trên thế giới (Nguyễn Văn Trương và Trịnh Văn Thịnh, 1991). Ngay từ khi Columbo, nhà thám hiểm người Bồ Đào Nha, khám phá ra châu Mỹ đã thấy người thổ dân bản xứ sử dụng mủ cao su trong một số hoạt động sinh hoạt hàng ngày của họ. Đến năm 1736, Charles de Condamine – người Pháp phát hiện cây cao su ở lưu vực sông Amazon – Nam Mỹ. Năm 1939, Charles Goodyear đã phát hiện phương pháp “lưu hóa” mủ cao su làm tăng tính năng tác dụng của cao su rất lớn (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Sau nhiều lần cố gắng du nhập cây cao su từ Nam Mỹ sang các nước Á và Phi đều thất bại. Năm 1876, Henry Wickham, nhà thám hiểm người Anh, đã thành công trong việc đưa cao su phát triển ở nhiều vùng trên thế giới, chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như một loại cây trồng độc canh. Cho đến nay nó đã và đang góp phần rất lớn vào nguồn xuất khẩu và tạo công ăn việc làm cho người lao động, đặc biệt là ở khu vực Đông Nam Á (Phan Thành Dũng, 2004). Từ năm 1910, cây cao su phát triển rất mạnh và nhanh ở nhiều nơi, tập trung chủ yếu ở các nước như Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc… (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Cây cao su được đưa vào trồng ở nước ta nhờ công của Bác sĩ Yersin. Vào năm 1897, những hạt cao su đầu tiên đưa về được trồng tại Suối Dầu, Nha Trang. Đến đầu thế kỷ 20, những đồn điền cao su được thiết lập tại Gia Định và một số nơi ở Đông Nam Bộ. Đến thập niên 50, một số diện tích cao su cũng định hình tại 5 Tây Nguyên. Diện tích cao su nước ta đạt khoảng 492.000 ha vào năm 2006 và dự kiến đạt 700.000 ha vào năm 2010 (Phan Thành Dũng, 2004). Sản lượng cao su thiên nhiên của Việt Nam đã tăng vượt bậc, từ 220.000 tấn năm 1996 lên 560.000 tấn năm 2006 (Nguồn: Xuất khẩu cao su Việt Nam dự báo sẽ tăng 7 – 10% đạt 750.000 – 780.000 tấn trong năm 2007 (Nguồn: Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày cho sản lượng mủ cao, phẩm chất mủ tốt nhất trong các loại cây có nhựa mủ. Cao su là một trong bốn nguyên liệu cơ bản của nền công nghiệp hiện đại (than đá, gang thép, dầu hỏa, cao su). Cao su vốn là hydratcacbon cao phân tử (C5H8), là chất dẻo có độ bền cơ học cao, tính đàn hồi lớn. Gỗ cao su được dùng làm ván ép, đồ gia dụng, bàn ghế và nguyên vật liệu chế biến giấy. Hạt cao su có chứa tinh dầu, tỷ lệ khoảng 47% trọng lượng hạt, được dùng làm sơn mài, xà phòng, chế biến nhựa dán gỗ. Ngoài ra, nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ đất và làm cân bằng hệ sinh thái, phủ xanh đồi núi trọc, tăng độ ẩm không khí, chắn gió và qua quang hợp làm sạch bầu không khí... (Tổng Công ty Cao su Việt Nam, 2005). 2.1.2. Tình hình bệnh hại trên cây cao su Cây trồng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công như virus, nấm, côn trùng… Trong đó, khoảng hơn 250.000 loài nấm có khả năng gây bệnh cho cây (Nguồn: .daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_collec tions_vietnamese.pdf). Cây cao su được trồng chủ yếu trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa phong phú nên bị rất nhiều loại bệnh gây hại, nhất là những loại bệnh do nấm gây ra. Chúng có thể gây hại trên tất cả các bộ phận của cây như lá, cành, thân và rễ. Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công. Nguyễn Hải Đường (1997), ở Việt Nam, cây cao su bị 24 loại bệnh hại (Phan Thành Dũng dẫn nhập, 2004). Đến năm 2006, P. T. Dung và ctv cho biết có 8 loại bệnh cao su chính gây ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và sản lượng cây cao su trong nước bao 6 gồm bệnh phấn trắng, bệnh héo đen đầu lá, bệnh rụng lá mùa mưa, bệnh Corynespora, bệnh nấm hồng, bệnh loét sọc mặt cạo, bệnh nứt vỏ, bệnh rễ nâu. Trong các loại sinh vật và vi sinh vật gây bệnh cho cây cao su, bệnh lá do nấm gây ra được xem là một trong những tác nhân gây thiệt hại lớn nhất. Chúng không chỉ làm giảm sản lượng mà còn làm giảm cả chất lượng mủ. Đặc biệt là bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz) gây ra, bệnh phấn trắng do nấm Odium hevea Steinm gây ra. Nghiêm trọng nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei. gây ra. Loài nấm này có khả năng gây hại quanh năm trên mọi tuổi lá, mọi giai đoạn sinh trưởng của cây. Là một trong những nguyên nhân làm cây chậm phát triển, kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản thêm 1 – 2 năm và ảnh hưởng trực tiếp làm giảm sản lượng mủ từ 20 – 30% đối với vườn khai thác (Bộ môn BVTV, 2006). 2.2. Sơ lƣợc về nấm C. cassiicola 2.2.1. Phân loại học Đặc điểm chung của nấm gây hại cho cây trồng là tế bào có nhân thực (Eucaryotae), cơ quan sinh trưởng có cấu tạo dạng sợi, sinh sản bằng bào tử, sống dị dưỡng, không có diệp lục. Nấm có thành phần loài rất phong phú (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Nấm gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su có hệ thống phân loại như sau: Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Dothideomycetes Lớp phụ: Pleosporomycetidae Bộ: Pleosporales Họ: Corynesporascaceae Giống: Corynespora Loài: Corynespora cassiicola (Nguồn: 7 2.2.2. Đặc điểm hình thái Chee (1988), kích thước trung bình của đính bào tử phân lập từ cây cao su (H. brasiliensis) là 64,4 x 5,52 µm (23,42 – 132,6 x 2,60 – 7,80 µm). Bào tử nảy mầm tạo ra một hoặc nhiều ống mầm giữa các vách ngăn, nhưng các ống mầm thường mọc nhiều ở các tế bào tận cùng của bào tử. P. T. Dung (1995; 2004), đã ghi nhận sự biến thiên về kích thước và hình dạng của đính bào tử phân lập từ lá cao su bị nhiễm bệnh ngoài tự nhiên và nuôi cấy trên môi trường Potato Sucrose Agar (PSA). Chiều rộng trung bình của đính bào tử và cuống bào tử lớn hơn và số vách ngăn trung bình nhiều hơn. Đính bào tử phân lập từ lá cao su thường dài, thon và có hình que trong môi trường nuôi cấy nhưng có đáy hơi rộng. Theo Spencer và Walters (1969), sự khác nhau về hình thái học một phần phụ thuộc vào sự sống khác nhau ở mức độ loài. Các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các ký chủ khác nhau có sự khác biệt rất lớn về đặc điểm nuôi cấy. 2.2.3. Đặc điểm sinh lý Theo Sarma và Nayudu (1970), C. cassiicola phát triển và hình thành bào tử tốt trên môi trường PSA. Vào năm 1974, Onesirosan và ctv đã tìm thấy điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của C. cassiicola là 28ºC. Ở 32 – 36ºC nấm phát triển chậm và khuẩn lạc hình thành không đều. P. T. Dung (1995), C. cassiicola phân lập từ cây cao su nảy mầm trên môi trường PSA nhiều hơn trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và Rubber Leaf Extract Agar và điều kiện nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 28ºC. Chee (1988) cho rằng C. cassiicola phân lập từ cây cao su (H. brasiliensis) nuôi trên môi trường PSA được đặt trong bóng tối 3 ngày sau đó đặt dưới ánh sáng 3 ngày ở 26ºC thì bào tử đính hình thành nhiều hơn. Ẩm độ thích hợp nhất để phân lập C. cassiicola là 90%. Tuy nhiên, sự hình thành bào tử vẫn xảy ra ở ẩm độ 80, 90 và 100% (Mushrif, 2006). 2.2.4. Khả năng tồn tại Pernezny và Simone (1993), C. cassiicola là tác nhân gây ra bệnh đốm lá trên các loại cây trồng bằng cách sống và lan truyền mầm bệnh trên đồng ruộng. Nó có thể sống tới 2 năm trên xác bã cây trồng phổ ký chủ rộng. Ở các vườn trồng cao 8 su, sự có mặt của các loại cỏ giúp tăng sự sống của mầm bệnh và kiểm soát các loại cỏ có thể giảm bớt được sự tác động của bệnh. Tuy nhiên, chúng có thể sống trên tất cả các bộ phận của cây cao su bị nhiễm bệnh và xác bã cây trồng tiềm tàng dưới dạng sợi nấm có màu nâu đậm. Đặc điểm này góp phần quan trọng trong thiết lập hệ thống bảo vệ và điều chỉnh việc kiểm soát nhằm giảm sự tích lũy nguồn bệnh. Năm 2004, Anonymous đã công bố rằng C. cassiicola có thể sống trên xác bã và hạt đậu nành trên đất bỏ hoang hơn 2 năm. Nấm có thể sống trên các loại cây trồng còn sót lại trên đồng ruộng cũng như trên xác bã cây trồng và xác bã giun tròn (trích dẫn bởi Mushrif, 2006). Bào tử có khả năng tồn tại trong đất với thời gian dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng (Phan Thành Dũng, 2004). P. T. Dung (1995), C. cassiicola phân lập từ cây cao su là loại gây bệnh chuyên biệt trên cây cao su và không gây bệnh trên lá cây tiêu, đu đủ và cà chua. 2.2.5. Khả năng phát tán Theo Peries và Liyanage (1987), trên cây cao su, C. cassiicola tạo số lượng bào tử lớn với các vách ngăn nằm ngang (trung bình là 2 – 16 vách ngăn) và xác định chu kỳ ngày đêm của sự phóng thích bào tử, bắt đầu vào lúc 6 giờ sáng, dễ nhận thấy nhất là vào khoảng 10 – 11 giờ, vào ban đêm thì bào tử phóng thích ít hoặc không có sự phát tán (trích dẫn bởi Mushrif, 2006). Theo Phan Thành Dũng (2004), bào tử phóng thích cao điểm vào lúc 8 – 11 giờ. Thời gian sau khi mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất. Sự phóng thích bào tử và sự lan truyền mầm bệnh từ nguồn đã biết, đã chỉ ra rằng bào tử không có khả năng di chuyển xa; có thể do kích thước của chúng lớn và tương đối nặng. Đây có thể là nguyên nhân mà bệnh lan truyền chậm giữa các khu vực cách xa nhau (Mushrif, 2006). 2.2.6. Con đƣờng xâm nhập, phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh của nấm C. cassiicola Vi sinh vật xâm nhập vào cây trồng qua 3 con đường chủ yếu: qua "lỗ mở" tự nhiên, qua vết thương, vết trầy xước trên cây và do chính vi sinh vật tự có cơ chế 9 để xuyên thủng tầng cutin, cellulose vào tế bào thực vật. Rất nhiều vi sinh vật xâm nhập vào cây chủ qua lỗ khí, khí khổng, qua các lỗ mở trên hoa hay xâm nhập vào hạt phấn (hạt phấn thụ tinh sẽ đem theo cả vi sinh vật vào hợp tử mới). Một số vi sinh vật như nấm bệnh Magnaporthe grisea hay Botrytis cinerea sử dụng cơ chế riêng với appressorium để xuyên thủng lớp bảo vệ cutin, cellulose và xâm nhập vào tế bào chủ (Nguồn: Theo Phan Thành Dũng (2004), nấm C. cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra enzyme (cellulase) giúp phân hủy màng tế bào. Ngoài cây cao su, nấm còn là ký sinh của trên 150 loại cây trồng thuộc nhiều họ khác nhau trên 80 nước thuộc nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và có khả năng gây hại trên tất cả các bộ phận của cây từ lá đến rễ. Chưa có ghi nhận nấm từ cây cao su gây hại cho cây khác và ngược lại (Phan Thành Dũng, 2000). 2.3. Giới thiệu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su 2.3.1. Lịch sử phát hiện Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su gây ra bởi nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei., xuất hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (Châu Phi) năm 1949, tiếp theo lần lượt ghi nhận tại Ấn Độ năm 1958; Malaysia năm 1961; Nirgeria năm 1968; Thái Lan, Sri Lanka và Indonesia năm 1985; Brazil và Bangladesh năm 1988 (Phan Thành Dũng, 2004), gần đây nhất tại Trung Quốc năm 2007 (Jinji và ctv, 2007). Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào tháng 8 năm 1999 tại Trạm thực nghiệm Cao Su Lai Khê – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (P. T. Dung và N. T. Hoan, 2000). Tuy thời gian xuất hiện tại Việt Nam chưa lâu và được xem là loại bệnh mới nhưng có tầm quan trọng vì nấm có khả năng gây hại quanh năm trên mọi tuổi lá, mọi giai đoạn sinh trưởng của cây. Là một trong những nguyên nhân làm cây chậm phát triển, kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản thêm 1 – 2 năm và ảnh hưởng trực tiếp làm giảm sản lượng mủ từ 20 – 30% đối với vườn khai thác. Ở nước ta, mức độ và phạm vi tác hại của bệnh đã gia tăng đáng kể. Năm 2005 và 10 2006, bệnh rụng lá Corynespora gây hại trên một số dvt cao sản được trồng tại nhiều công ty cao su ở vùng Đông Nam Bộ như Đồng Nai, Phú Riềng, Phước Hoà… Nếu không được quan tâm đúng mức, ngăn chặn kịp thời thì bệnh có nhiều khả năng sẽ bùng phát trở thành mối nguy hại cho ngành cao su trong tương lai không xa (Phan Thành Dũng, 2006). 2.3.2. Triệu chứng của bệnh Corynespora trên cây cao su 2.3.2.1. Trên vƣờn ƣơm Triệu chứng bệnh trên cây con thường gặp là các đốm tròn, rất hiếm khi có sự bất thường về hình dạng và kích thước vết bệnh trên phiến lá có đường kính biến thiên từ 1 – 8 mm. Ở tâm của các vết bệnh mỏng như giấy có màu trắng nâu hoặc nâu nhạt, có viền màu nâu đậm và được bao quanh bởi quầng vàng, sự phân hủy lục lạp tại trí trung tâm đôi khi dẫn đến hình thành lỗ (Jacob, 2006). Ở cây con, hầu hết các lá non mới hình thành đều bị mầm bệnh này tấn công và chúng làm cho đầu lá bị quăn lại do các đốm bệnh và gây ra sự rụng lá. Bệnh xảy ra vào cuối mùa khô và gây rụng lá nghiêm trọng (Rajalakshmy và Kothandaraman, 1996). Đối với cây thực sinh, mầm bệnh tấn công trên các lá non và gây rụng lá. Quá trình rụng lá liên tục và ra lá mới ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Cây thực sinh trong giai đoạn vườn ươm bị nhiễm bệnh thường chậm phát triển và không đạt được đường kính gốc ghép đúng thời hạn. Đối với cây thực sinh phát triển trong bầu, vết bệnh có hình tròn hoặc không có hình dạng nhất định và chúng có kích thước rất biến thiên (Jayasinghe, 2000). Các triệu chứng đốm lá đã mô tả thường gặp ở cây con bị nhiễm bệnh nhẹ đến trung bình. Dạng bệnh nặng là nguyên nhân làm cho lá non bị rụi trên cây thực sinh và bầu đã ghép. Sự nhiễm bệnh xảy ra trong suốt thời gian từ cuối thời kỳ lá có màu nâu rủ đến đầu thời kỳ lá có màu xanh nhạt, nếu điều kiện thời tiết khô hạn thì sẽ xảy ra hiện tượng cháy lá vài ngày. Nếu bệnh xảy ra ở cuống lá và đế cuống lá sẽ làm cho lá non bị khô. Lá bị rụi vẫn có thể ở lại trên cây vài ngày trước khi rụng. Những lá non khô mỏng như giấy bị rụi vẫn có thể nhìn thấy được từ xa và dễ dàng xác định 11 được những cây bị ảnh hưởng nặng trong vườn ươm. Trên vườn cây gỗ ghép, triệu chứng bệnh thường gặp là các đốm trên lá. Tuy nhiên, thỉnh thoảng vẫn bắt gặp triệu chứng cháy rìa lá hay rụng lá. Trên lá bánh tẻ bị nhiễm bệnh, thường gặp các vết bệnh có đường tròn điển hình hoặc không theo quy luật với tâm vết bệnh mỏng như giấy có viền nâu và quầng vàng bao quanh. Ngay cả lá già cũng bị nhiễm bệnh nhưng các vết bệnh thường rất nhỏ. Ngoài triệu chứng cháy rìa lá và các vết thương, triệu chứng thường gây rụng lá là các gân lá chuyển sang màu nâu đậm được mô tả như đường ray xe lửa hay xương cá. Những triệu chứng này xuất hiện do nấm tiết ra độc tố tại vị trí nhiễm, độc tố lan dọc theo các gân lá và làm đổi màu của gân lá. Vì độc tố lan nhanh hơn sợi nấm nên nó phá hủy mô và hạn chế sự phát triển của nấm. Nếu bị nhiễm nấm trên gân chính, lá non bị biến dạng và sau đó rụng đi, nếu nhiễm trên gân phụ thì sự tồn tại của lá non tùy thuộc vào mức độ nhiễm và tạo ra hình dạng đường ray xe lửa (hay xương cá). Bệnh nặng làm cho chồi ngọn bị chết, chồi ở giai đoạn hóa nâu dễ bị tấn công hơn. Chồi ở giai đoạn xanh nhạt thỉnh thoảng mới bị nhiễm bệnh nhưng khi chồi đã xanh đậm hoặc nâu và trưởng thành thì ít nhiễm bệnh hơn và triệu chứng bệnh chỉ có dạng đốm. Cây con bị nhiễm bệnh thường yếu và còi cọc. Nấm phát triển mạnh trên vùng đất có ẩm độ cao và có thể tồn tại đến mùa mưa năm sau. Cây bị nhiễm nặng có thể không đủ dinh dưỡng dự trữ để ra lá mới và do đó làm cho cây chết khô (Jacob, 2006). 2.3.2.2. Trên vƣờn khai thác Bệnh Corynespora trên vườn khai thác được biết đến như một đại dịch từ hai thập kỷ trở lại đây. Trong suốt mùa bệnh, vùng bị bệnh được ghi nhận là các lá non bị khô với nhiều vết tròn làm cho cây bị rụi lá tới rụng toàn bộ lá. Cành bị rụng lá có dạng tương tự như các sừng hươu (stag – horn). Mùa bệnh bắt đầu với sự xuất hiện của nhiều vết tròn hoặc không tuân theo quy luật trên các lá non có màu xanh nhạt mọc sau mùa đông. 12 Bệnh nhiễm trên lá bánh tẻ tạo ra các vết bệnh lớn xuất hiện trên phiến lá như các vết màu nâu nhạt có viền màu nâu đậm và được bao quanh bởi quầng màu vàng. Đôi khi ta có thể thấy ở tâm của vết bệnh có các vòng tròn đồng tâm. Trên gân lá, chúng ta dễ nhận thấy dạng xương cá có chiều dài từ vài mm đến cm. Gân chính và gân phụ đều có thể bị nhiễm. Nếu các cuống lá, gân phụ hoặc gân chính ở đế lá non bị nhễm bệnh thì lá bị rụng chỉ trong vòng 2 ngày. Trong một số trường hợp, lá non vẫn có thể tồn tại lâu hơn và nếu bệnh không nặng thì trên lá sẽ xuất hiện nhiều lỗ (do sự chết của mô bệnh). Khi nhiễm trên lá trưởng thành, triệu chứng dễ nhận thấy là xương cá. Khi bệnh nặng sẽ tạo ra nhiều đốm và lá chuyển thành màu vàng, sau đó chuyển sang màu nâu đồng và cuối cùng có thể bị rụng. Một số lá biến dạng tạo lỗ trên vết bệnh trong một khoảng thời gian dài và cuối cùng là bị rụng. Lá trưởng thành với các vết bệnh rất nhỏ thì có thể tồn tại đến khi rụng lá qua đông. Ngoài phiến lá, cuống lá và chồi của cây trưởng thành cũng bị nhiễm bệnh. Trên cuống lá vết bệnh xuất hiện dạng đường sọc màu nâu có chiều rộng và dài rất khác nhau. Ở phần thân còn xanh, nấm tấn công làm nứt vỏ cây. Bệnh nặng làm cho chồi bị khô. Chồi khô vẫn có thể tồn tại trên cây, dạng triệu chứng như vậy gọi là dạng sừng hươu. Nấm có thể tồn tại trên chồi đến năm sau và bắt đầu gây bệnh trên lá mới mọc. Thân cây gãy rơi xuống đất cũng là nguồn gây bệnh (Jacob, 2006). 2.3.3. Khả năng hình thành nòi mới Nấm hình thành nhiều nòi nên vượt qua tính kháng của một số dvt cũng như đáp ứng khác nhau với thuốc trừ nấm (Jayasinghe và Silva, 1996; Jayasinghe, 2000). Nòi mới hình thành dựa trên 3 yếu tố sau: Đáp ứng với điều kiện địa lí. Đáp ứng với cây ký chủ khác. Đáp ứng với dvt cao su. Trong đó yếu tố đầu và cuối có vai trò quan trọng bằng mức độ gây hại của nấm với cao su tại từng vùng (Phan Thành Dũng dẫn nhập, 2000). Theo Phan Thành Dũng (2004), đã có 6 nòi nấm gây hại cho cây cao su. 13 2.3.4. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về phƣơng pháp tuyển non dvt cao su Theo Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật (2006), cho đến nay đã có một số phương pháp tuyển non như sau: Wastie (1973), đề ra phương pháp xây dựng vườn kiểm định bệnh đánh giá mức độ mẫn cảm của các dvt mới với bệnh lá. Lim (1972), giới thiệu kỹ thuật lây nhiễm bệnh trên lá cắt rời được thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm mục đích đánh giá tính mẫn cảm của các dvt cao su đối với nấm Oidium heveae Steinm, dựa trên mật độ ra bào tử. Đây là một phương pháp nhanh, có hệ thống trong việc tuyển chọn giống in vitro kháng bệnh. Năm 1988, Chee xây dựng phương pháp đánh giá bệnh rụng lá Corynespora bằng cách điều tra, theo dõi chặt chẽ bệnh trên vườn kiểm định bệnh và lá cắt rời. Hiện nay các phương pháp tuyển non dvt với các bệnh lá được áp dụng phổ biến ở các nước trồng cao su. Phan Thành Dũng và ctv sử dụng phương pháp in vivo kết hợp với điều tra 86 dvt trên vườn kiểm định bệnh tại An Lộc – Đồng Nai từ năm 2000 – 2005. Kết quả cho thấy có sự tích lũy bệnh vì tỷ lệ và mức độ bệnh của các dvt trên tăng dần theo thời gian. 2.4. Sơ lƣợc về enzyme 2.4.1. Định nghĩa Enzyme là chất xúc tác sinh học, do tế bào sống tổng hợp nên, có tác dụng điều chỉnh tốc độ và tính đặc hiệu của phản ứng hoá học xảy ra trong tế bào, mà không làm ảnh hưởng đến hướng phản ứng và sự cân bằng phản ứng. Enzyme làm giảm năng lượng hoạt hoá cần cho phản ứng thực hiện (Lê Ngọc Thông và HuỳnhTiến Dũng, 2003). 2.4.2. Tính đặc hiệu Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2001). 14 2.4.3. Cơ chế tác động Bản chất của cơ chế tác động bởi enzyme trong phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn. Cơ chất tương tác với nhau do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme và cũng nhỏ hơn so với các phản ứng được xúc tác bởi các chất xúc tác khác. Quá trình xúc tác xảy ra qua 3 giai đoạn: E + S → ES → P +E Trong đó: + E: enzyme. + S: cơ chất. + P: sản phẩm. Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết quả là tạo thành một phức hợp ES, phức hợp này không bền. Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng. Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị. Ở giai đoạn thứ 3: sản phẩm tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do (Nguyễn Đức Lượng, 2001). 2.4.4. Các nhân tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme Enzyme rất nhạy cảm với nhiều nhân tố: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, các anion. 2.4.5. Một số phƣơng pháp xác định hoạt tính của enzyme Theo Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2006), để phân tích hoạt độ enzyme có thể tiến hành bằng một trong hai cách là phân tích liên tục và phân tích gián đoạn. Tuy nhiên, dù phân tích theo cách nào thì cũng phải dựa trên nguyên tắc 15 chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme đó là phân tích sự biến đổi theo thời gian trong những điều kiện phản ứng xác định của cơ chất còn lại, hoặc sản phẩm tạo thành, hoặc cả cơ chất và sản phẩm. Phân tích liên tục Là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian. Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng của cơ chất ở bước sóng , người ta có thể tiến hành phản ứng trong một cuvette và đo sự biến đổi của cơ chất bằng quang phổ kế theo thời gian ngay từ khi bổ sung enzyme vào dung dịch phản ứng có chứa sẵn cơ chất, hay bổ sung cơ chất vào hỗn hợp đã chứa sẵn enzyme. Phương pháp đo liên tục thường hay áp dụng khi không có chất, hay cách làm ngừng phản ứng thích hợp hoặc được áp dụng đối với một số enzyme dễ bị mất hoạt tính xúc tác ở điều kiện phân tích. Ngoài ra, các phương pháp phân tích liên tục còn được dùng phổ biến với các nghiên cứu động học enzyme. Tuy nhiên, yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt để phản ứng có thể được thực hiện ở các nhiệt độ mong muốn. Đây cũng là một hạn chế của phương pháp. Ngoài ra, phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó có thể thực hiện phân tích hoạt độ của nhiều mẫu enzyme trong cùng một lúc. Phân tích gián đoạn Là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian nhất định thì làm ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Đây là cách được sử dụng phổ biến nhấttrong các phân tích hoạt độ enzyme hiện nay. Để làm ngừng phản ứng enzyme có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt như nhiệt độ cao, thay đổi pH (bổ sung acid hoặc kiềm), dùng chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng… Phương pháp này khắc phục được những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể ổn nhiệt, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu… Tuy vậy, vấn đề là phải tìm ra cách làm ngừng phản ứng thích hợp. 16 Dựa trên nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme bằng cách đo liên tục hay gián đoạn, hoạt độ enzyme có thể xác định theo một hay một số phương pháp chính sau đây: Phương pháp đo độ nhớt. Phương pháp phân cực kế. Phương pháp đo áp suất hay áp kế. Phương pháp quang phổ kế. Phương pháp chuẩn độ. Phương pháp sắc ký. Phương pháp hoá học. Phương pháp phóng xạ. Phương pháp huỳnh quang. Tuỳ theo các đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp phân tích, yêu cầu về độ chính xác của phép đo cũng như điều kiện của phòng thí nghiệm mà có thể lựa chọn cách xác định nào là thích hợp nhất. Tuy vậy cách đáng tin cậy nhất trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian, bởi vì có các trường hợp, hoạt độ enzyme cần xác định có thể rất thấp, sự chuyển hoá cơ chất vốn phải có ở mức bão hoà có thể xảy ra nhưng rất khó đo được một cách chính xác. Khi đó, sự xuất hiện của sản phẩm phản ứng được xác định bằng những cách đo đặc hiệu, cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách đáng tin cậy. 2.4.6. Sơ lƣợc về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật Để hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh do nấm gây ra thì các loại thực vật cũng tạo ra nhiều cơ chế để chống lại các mầm bệnh đó. Ký chủ có thể gia tăng thành tế bào của chúng bằng cách hình thành thêm thành tế bào, lignin… và tạo ra các hợp chất kháng vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp như phenol, quinone, alkaloid. Tăng cường tạo các enzyme và hoạt tính của chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng của thực vật. Các enzyme này thường xuất hiện dưới các dạng đồng hình khác nhau và thường liên quan đến quá trình tổng hợp các chất phòng vệ hoặc có tác động trực tiếp đến sự kháng khuẩn. Nhiều loại PR proteins (Pathogenesis Related Proteins) được xem như là enzyme. Khi không có sự xuất hiện của các chất từ sự nhiễm bệnh thì sự hoạt động của các enzyme này sẽ bị ức chế. PR proteins có thể chỉ xuất hiện sau khi đã phát sinh bệnh thì chúng mới có biểu hiện kháng. Một số PR proteins điển hình là -1,3-glucanase, chitinase, peroxidase, polyphenol oxidase… (Joseph, 2006). 17 2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su Breton và ctv (1996), hoạt tính -1,3-glucanase khác nhau giữa các dòng vô tính khác nhau: GT 1, PB 235 và PB 260. Đồng thời ông cũng nhận thấy hoạt tính peroxidase cao hơn trong dòng kháng GT 1 và hoạt tính của chitinase của dvt GT 1 cũng tăng lên trong khi lây nhiễm nhân tạo bệnh Corynespora. Hoạt tính của enzyme -1,3-glucanase của dvt GT 1 cũng được ghi nhận là tăng lên sau 24 tới 96 giờ lây bệnh Corynespora nhân tạo (Philip và ctv, 2001). Năm 2006, Kurma và Jacob đã nghiên cứu sự thay đổi của các enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ trên cả dvt cao su cảm nhiễm (RRII 105 và PB 260) và kháng (RRIM 600 và GT 1) khi chủng bệnh Corynespora và thấy rằng hoạt tính của enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ ở các dòng kháng cao hơn ở các dòng cảm nhiễm. 2.4.8. Peroxidase 2.4.8.1. Sơ lƣợc về peroxidase Dunford và Stillman (1976); Gray và Montgomery (1997) đã cho rằng peroxidase (POD) là enzyme oxy hoá khử phân bố rộng khắp mà sử dụng hydrogen POD hoặc các hydroperoxide hữu cơ như là các chất oxy hoá. Phần lớn POD là các glycoprotein chứa liên kết N – oligosaccharide (Miranda và ctv dẫn nhập, 2003). Theo Chatchamon Daengkanit và Wallie Suvachittanont (2005), peroxidase là một hemeprotein xúc tác oxy hoá electron của các cơ chất khác nhau (phenol, các amine thơm) bởi H2O2. Heme peroxidase tồn tại ở nhiều nơi trong tự nhiên với nhiều chức năng sinh lý học và đã được phân thành 3 lớp dựa vào trình tự amino acid của chúng. Lớp I bao gồm các peroxidase nội bào, đó là cytochrome c peroxidase, ascorbate peroxidase. Lớp II chứa các enzymes kích thích sự bài tiết của nấm, như là manganese peroxidase và lignin peroxidase. Lớp thứ III bao gồm các peroxidase kích thích bài tiết của thực vật. Johann Putter (1974), thuật ngữ peroxidase (POD) trong nó mang một ý nghĩa rộng lớn bao gồm một nhóm enzyme chuyên biệt như NAD – POD, NADP – POD, acid béo – POD, cytochrome – POD và glutathione – POD cũng 18 như một nhóm enzyme không chuyên biệt từ các nguồn khác nhau, mà chúng được biết đến nhiều nhất là POD. POD xúc tác phản ứng khử hydro của một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ như phenol và các amine thơm, các hydroquinone, các amine dehydroquinone, các dẫn xuất của benzidine. Đặc biệt là o-toluidine, guaiacol... 2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su Theo Geiger và ctv (1989), hoạt tính peroxidase tăng lên khi cây chịu nh