Ứng dụng công nghệ di truyền tạo giống chất dinh dưỡng chức năng - Tăng cường FOLATE trong các loại cây

* NỘI DUNG Nguyễn Kiều Oanh * KẾT LUẬN NGHIÊN CỨU TỔNG QUAN GIỚI THIỆU Phương pháp bổ sung vitamin trước đây: Chi phí cao Khó thực hiện ở các nước kém phát triển Nguyễn Kiều Oanh * 1. GIỚI THIỆU Viên vitamin Thực phẩm bổ sung vitamin Bổ sung vitamin Nguyễn Kiều Oanh * 1. GIỚI THIỆU Phương pháp bổ sung vitamin mới: thực phẩm có chứa vitamin Có sẵn trong các cây lương thực chính Dễ tiếp cận với những vùng kém phát triển Nguyễn Kiều Oanh * Folate là gì? Vitamin B có tự nhiên trong thực phẩm (vitamin B9), tan trong nước. Folic acid là dạng folate trong viên vitamin và được bổ sung vào các loại thực phẩm (các loại mì, nui, ngũ cốc ăn sáng…) Phân tử folate chứa pteridine, p-ABA và glutamate. 2. TỔNG QUAN Nguyễn Kiều Oanh * Folate là gì? 2. TỔNG QUAN Nguyễn Kiều Oanh * Vai trò của folate đối với CON NGƯỜI: Ngăn ngừa một số bệnh Thai nhi: Dị tật ống thần kinh: thiếu một phần não (anencephaly), nứt đốt sống (spina bifida) Bệnh thiếu máu (megaloblastic anemia) Người trưởng thành: Rối loạn thoái hóa thần kinh (Alzheimer) Nguy cơ bệnh tim mạch Ung thư Đột quỵ 2. TỔNG QUAN Nguyễn Kiều Oanh * Nhu cầu folate 1μg DFE=1μg folate trong thực phẩm =0.6μg acid folic từ thuốc hoặc thực phẩm bổ sung =0.5μg acid folic từ thuốc hoặc thực phẩm bổ sung uống khi bụng đói. 2. TỔNG QUAN Nguyễn Kiều Oanh * Những loại cây chứa folate 2. TỔNG QUAN Nguyễn Kiều Oanh * Cà chua chuyển gen giàu folate 1 1 Cà chua chuyển gen giàu folate 2 2 Lúa chuyển gen giàu folate 3 3. NGHIÊN CỨU Nguyễn Kiều Oanh * Nguyên lý tác động GTP cyclohydrolase I (GCHI) biến mất lúc quả bắt đầu chín, cắt đứt nguồn cung cấp pteridine. → duy trì liên tục hoạt động của GCHI. 3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1 Nguyễn Kiều Oanh * Qui trình nghiên cứu 3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1 Nguyễn Kiều Oanh * Thí nghiệm 1 Bước 1: Thiết kế vector tái tổ hợp có chứa GCHI Vector pMON10086: promoter E8 của cà chua, terminator, gen kháng kanamycin npt II. cDNA GCHI của động vật có vú (mã số GenBank BE136861). cDNA này được chèn vào vector pMON10086. Bước 2: Kỹ thuật biến nạp di truyền Vector pMON10086 được đưa vào chủng Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp tạo lỗ bằng dòng điện. Biến nạp Agrobacterium tumefaciens vào cây cà chua. Bước 3: Chọn lọc và đánh giá Cây cà chua sau khi biến nạp được đưa vào môi trường chứa 100μg/ml kanamycin. Sàng lọc các cây có khả năng phát triển trên môi trường chứa kanamycin. Chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu. Tiến hành Westhern blot với kháng thể. Phân tích hàm lượng pteridine, PABA và folate. 3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1 3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1 Nguyễn Kiều Oanh * Trước khi chèn GCHI Sau khi chèn GCHI Nguyễn Kiều Oanh * Thí nghiệm 1 – Kết quả 3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1 Folate (nmol/g khối lượng tươi) Hàm lượng folate tổng trong quả red-ripe của 12 thể biến nạp GCHI+ và 10 thể biến nạp đối chứng Tích lũy pteridine làm tăng hàm lượng folate. Mức folate cao nhất đạt được (≈4nmol mỗi g khối lượng tươi) tương đương với 180μg mỗi 100g. Mức này sẽ cung cấp cho toàn bộ chế độ folate đề nghị đối với một đứa trẻ và gần một nửa cho người lớn. 3.98 nmol Nguyễn Kiều Oanh * Thí nghiệm 2 Bổ sung 2μmol PABA qua cuống ở giai đoạn breaker Kết quả: PABA ngoại sinh làm tăng hàm lượng folate (2.5 đến 9 lần) 3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1 Ảnh hưởng của PABA ngoại sinh đến hàm lượng folate Folate (nmol/g khối lượng tươi) Nguyễn Kiều Oanh * Nguyên lý tác động 3.2 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 2 Nguyễn Kiều Oanh * Kết quả 3.2 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 2 Folate (nmol/g khối lượng tươi) Hàm lượng folate trong các quả G+ x A+ (GCHI+/AtADCS+) Hàm lượng folate gấp 19 lần quả đối chứng. Mức folate đạt được (840 μg mỗi 100g khối lượng tươi) có thể cung cấp đủ nhu cầu folate hằng ngày của một người trưởng thành. Nguyễn Kiều Oanh * Phân tích Northern blot. Thiết kế vector tái tổ hợp. Kỹ thuật biến nạp di truyền Phân tích hàm lượng pteridine, PABA và folate của gạo trước và sau khi nấu. 3.3 LÚA GIÀU FOLATE Qui trình nghiên cứu Nguyễn Kiều Oanh * 3.3 LÚA GIÀU FOLATE Thiết kế vector tái tổ hợp * 3.3 LÚA GIÀU FOLATE Kết quả Mức tối đa của folate là 38,3 nmol / g tương đương với 1.723 μg/100 g khối lượng tươi. Nó vượt quá ngưỡng folate đề nghị hàng ngày cho người lớn gấp 4 lần (400 μg) và cũng trên 2,5 lần lượng folate cho phụ nữ mang thai (600 μg). Mức PABA, pterin và folate tổng trong những dòng A, G và GA Nguyễn Kiều Oanh * 3.3 LÚA GIÀU FOLATE Kết quả Sau 30 phút đun sôi thì 45% folate thất thoát. Giả sử rằng mức khả dụng sinh học trung bình của folate tự nhiên khoảng 50%, 100g gạo tăng cường folate có khả năng đáp ứng yêu cầu folate hàng ngày cho một người trưởng thành. Nguyễn Kiều Oanh * Tồn tại: Hàm lượng pteridine và PABA tích lũy quá nhiều: Cà chua 2: folates / PABA / pterins = 1/2.5/0.75 Lúa: folates / PABA / pterins = 1/0.5/0.013 Trong đó: p-ABA : không gây hại tới sức khỏe pteridines: vẫn chưa được làm rõ và cần được khảo sát. tetrahydrobiopterin (H4B): tham gia vào quá trình tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh. dihydroneopterin và neopterin: kích thích hệ miễn dịch, tham gia vào phản ứng stress. Do đó tình trạng xáo trộn của pteridine có thể có ảnh hưởng đến sức khỏe con người Cần nghiên cứu thêm nhiều năm mới có thể đưa ra thị trường. 3. NGHIÊN CỨU Nguyễn Kiều Oanh * Hướng phát triển Tăng cường folate trên các cây lương thực khác Nghiên cứu ảnh hưởng của pteridine lên sức khỏe con người Kết hợp với giống địa phương và tính trạng năng suất cao để phát triển rộng rãi 3. NGHIÊN CỨU Nguyễn Kiều Oanh * 4. KẾT LUẬN 1. Cây trồng biến đổi gen tăng năng suất, từ đó giảm sử dụng thuốc trừ sâu, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. 2. Chất dinh dưỡng và mùi vị được cải thiện, có hiệu quả cho sức khỏe người tiêu thụ. 3. Thực phẩm biến đổi gen có chức năng vaccine sẽ làm tăng cường khả năng miễn dịch của con người đối với bệnh tật nan y như viêm gan siêu vi B... 4. Rau sản xuất kháng thể, có thể ăn để trị bệnh nhiễm trùng. Ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người. 2. Sự tổng hợp ra các loại protein gây dị ứng có hại đến sức khỏe lâu dài của con người. 3. Mất tính đa dạng sinh học. Mất đi khả năng thích nghi của các sinh vật. 4.Từ cây thực phẩm GM, các gen GM thụ phấn chéo lên cỏ dại sẽ ra sao ?!?.. Nguyễn Kiều Oanh * Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô và các bạn đã lắng nghe Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 1: Con đường tổng hợp folate ở thực vật Nguyễn Kiều Oanh * Nguyễn Kiều Oanh * Vai trò của folate Cofactor tham gia vào chu trình chuyển hóa 1 nguyên tử carbon: Sinh tổng hợp nucleotide Sinh tổng hợp amino acid: methionine Chu trình methyl hóa Điều hòa nồng độ formaldehyde và formate trong tế bào Phụ lục 2: Vai trò của folate Phụ lục 3 : C1 metabolism Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 4 : Plasmid pMON10086 Nguyễn Kiều Oanh * Trước khi chèn GCHI Sau khi chèn GCHI Phụ lục 5: Các GĐ chín của cà chua Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 6: Chuyển gen bằng Agrobacterium tumfaciens Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 7: Xác định cây chuyển gen Mồi PCR (5’-CTTTCTTGTTCCCATTTCTC-3’) (5’-ATGCACATGTGTGTCGCTTC-3’) Cây dương tính với cấu trúc GCHI được chuyển qua đất và phát triển đến trưởng thành trong buồng tăng trưởng (16-h ngày; 23°C; mật độ dòng quang hợp: 200 μmol photon/m2.s mỗi 8h đêm; 20°C) và tưới với dung dịch dinh dưỡng. Trong thí nghiệm bổ sung PABA vào, trái cây giai đoạn breaker đã được cắt tại gốc của cuống, bổ sung PABA (2μmol PABA trong 100μl nước) hoặc nước trong 1 ngày (đối với mẫu đối chứng), sau đó bỏ cuống và cho chín thêm trong 6 ngày ở 23°C. Nguyễn Kiều Oanh * Protein được chiết xuất từ mô vỏ quả bằng cách nghiền trong Tris HCl 0.1M (pH 8,0) có chứa ascorbate 15 mM, DTT 2 mM, và Polyvinylpolypyrrolidone 3% (wt/vol). Sau khi được làm sạch bằng cách ly tâm, các mẫu (80 μg protein) được tách trên gel SDS-polyacrylamide, sau đó được chuyển qua màng nitrocellulose, và khảo sát với kháng thể pha loãng 1:2,000. Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 8: Phân tích Western blot với kháng thể Phụ lục 9: Phân tích pteridine và PABA Nghiền 0,70g quả trong N2 lỏng và đồng nhất với 7 ml methanol (dd A) Phân tích pteridine: Trộn 600μl dd A với 250μl CHCl3, 50μl nước, lắc trong 40 phút. Sau đó thêm 225μl CHCl3 và 340μl nước, lắc trong 20 phút. Ly tâm, hòa tan phần cặn vào 200μl nước. Mẫu được oxi hóa bằng cách thêm 0,1 thể tích của một dung dịch gồm I2 1% và KI 2% (wt/vol) trong HCl 1 M và ủ trong bóng tối trong 1h, I2 dư được loại ra bằng cách thêm 10μl Na-ascorbate 5% (wt/vol) (dd B). Phân tích pteridine tổng trong dd B bằng phương pháp HPLC với cột Ultremex C18 IP (Phenomenex, Belmont, CA) 5 - μm, 250 x 4,6-mm, hoặc cột Synergi Fusion-RP 80 (Phenomenex) 4 - μm, 4,6 x 250-mm. Phase động là Na-phosphate 10 mM (pH 6,0) 1,5 ml/min. Các peak được phát hiện bằng detector huỳnh quang Waters 2.475 (350 nm - 450 nm). Để kiểm tra các trạng thái ôxi hóa pteridine, 2-mercaptoethanol 10 mM và Na-ascorbate 2% (wt /vol) được thêm vào dd A, và bước oxi hóa được bỏ qua. Đỉnh pteridine liên hợp đã được thu hồi từ phase động nhờ phương pháp trao đổi ion (2 đơn vị trong 40 μl dung dịch Na-phosphate 10mM, pH 6,0, 37°C, 5-120 phút) và được xử lý bằng HCl (1M, 100°C, 1 h) hoặc với α-glucosidase hoặc β-glucosidase. Phân tích PABA: trong 5-ml dd A bằng phương pháp HPLC. Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 10: Phân tích folate Nghiền 0,5-1,0 g quả, đồng nhất polytron trong 10 ml Na-Hepes 50 mM / 2 – (N-cyclohexylamino) ethanesulfonic acid 50 mM điều chỉnh đến pH 7,9 với HCl có chứa CaCl2 1 mM, Na-ascorbate 2% (Wt /vol), và 2-mercaptoethanol 10 mM. Đun sôi trong 10 phút và ly tâm (13.000 x g) trong 10 phút. Xử lý bằng 1ml huyết thanh chuột thẩm tách ở 37°C trong 2 h để khử glutamyl hóa folate. Đun sôi trong 15 phút, ly tâm như trên, lọc qua sợi thuỷ tinh, và đặt vào cột ái lực folate. Rửa sạch với 5 ml K-phosphate 25mM (pH 7,0)/ Na-ascorbate 1% (đệm 1) có chứa NaCl 1M. Rửa lại với 5 ml dung dịch đệm 1. Rửa cột với 5 ml HPLC phase động A có chứa acid ascorbic 1%. Phân tích folate tổng: Mẫu tách rửa (400μl) được đưa phân tích HPLC với detector điện hóa, sử dụng một cột Prodigy ODS2 (Phenomenex) 5 –μm, 150 x 3,2 mm với điện thế đặt ở 0, 300, 500, và 600 mV. Phase động là một hỗn hợp 2 cấu tử của K2HPO4 28 mM và H3PO4 0,59 mM (pH 2,5) (đệm A) và hỗn hợp của đệm A 75% (vol/vol) và CH3CN 25% (đệm B) với một chương trình tách rửa phi tuyến trong 55-phút từ 90% đệm A đến 100% đệm B ở mức 1 ml/min. Phân tích chiều dài đuôi polyglutamyl: quá trình xử lý huyết thanh chuột được bỏ qua. Nguyễn Kiều Oanh * Phụ lục 11: Sơ đồ hệ thống HPLC Nguyễn Kiều Oanh *