Ứng dụng của enzyme peactinase

LÔØI GIÔÙI THIEÄU PHAÀN I ÑAËC ÑIEÅM CUÛA HEÄ ENZYM PECTINASE I.Cô chaát pectin :[ I ] Pectin laø hôïp chaát cao phaân töû maïch thaúng coù caáu taïo töø söï keát hôïp cuûa caùc acid galacturonic qua caùc lieân keát α–-1,4 glucoside. Tuøy thuoäc nguoàn pectin maø pectin coù khoái löôïng phaân töû 800000-200000. Pectin hoaø tan trong nöôùc, ammoniac, dung dòch kieàm, carbonate natri vaø trong glycerine noùng. Ñoä hoaø tan cuûa pectin trong nöôùc taêng leân khi möùc ñoä ester hoaù trong phaân töû pectin taêng vaø khi khoái löôïng phaân töû pectin giaûm. Pectin laø teân chung ñöôïc goïi cho caùc hoãn hôïp chöùa caùc thaønh phaàn raát khaùc nhau, trong ñoù pectinic acid laø thaønh phaàn chuû yeáu. Caùc pectin töï nhieân ñònh vò trong thaønh phaàn cuûa teá baøo coù theå lieân keát vôùi caùc caáu truùc polyssacharide vaø protein ñeå taïo thaønh caùc protopectim khoâng tan. Coù theå phaân huûy ñeå laøm pectin tan trong nöôùc baèng caùch ñun noùng pectin trong moâi tröôøng acid. Vì theá, caùc pectin tan thu nhaän ñöôïc laø keát quaû cuûa söï phaân huûy phaân töû pectin khoâng tan vaø chuùng khoâng ñoàng daïng vôùi nhau. Trong thöïc vaät, pectin toàn taïi döôùi ba daïng: pectin hoaø tan, pectin acid vaø protopectin. Pectin hoaø tan laø ester methylic cuûa acid polygalacturonic pectin, trong töï nhieân coù khoaûng 2/3 soá nhoùm carboxyl cuûa polygalacturonic acid ñöôïc ester hoaù baèng methanol. Pectin ñöôïc ester hoaù cao seõ taïo gel ñaëc trong dung dòch acid vaø trong dung dòch ñöôøng coù noàng ñoä 65%. Enzyme pectinase taùc ñoäng leân caùc hôïp chaát pectin coù khoái löôïng phaân töû khaùc nhau vaø caáu truùc hoùa hoïc khoâng ñoàng daïng. Caáu truùc hoaù hoïc cô baûn cuûa pectin laø α–– D-galacturonan hay α––D-galacturonoglycan, maïch thaúng coù caáu taïo töø caùc ñôn vò D-galactopyranosyluronic acid (lieân keát theo kieåu α -1,4). Maët khaùc, möùc ñoä oxy hoaù trong caùc phaân töû polymer naøy cuõng khaùc nhau, trong ñoù moät soá nhaát ñònh caùc nhoùm carboxyl bò ester hoaù bôûi caùc nhoùm methoxyl. Trong moät soá tröôøng hôïp, chaúng haïn trong pectin cuû caûi ñöôøng, coù söï ester hoaù giöõa caùc nhoùm carboxyl vaø caùc nhoùm acetyl. Pectinic acid laø polygalacturonic acid coù moät phaàn nhoû caùc nhoùm carboxyl ñöôïc ester hoaù baèng methanol. Pectinase laø muoái cuûa pectinic acid. Pectic acid laø polygalacturonic acid ñaõ hoaøn toaøn giaûi phoùng khoûi moät ñôn vò galacturonic acid. Pectate laø muoái cuûa pectic acid. Protopectin taïo ñoä cöùng cho quaû xanh, khoâng tan trong nöôùc vaø coù caáu taïo hoaù hoïc phöùc taïp. Trong pectin coù caùc phaân töû pectin, caùc phaân töû cellulose vaø caùc ion Ca2+ , Mg2+ , caùc goác phosphoric acid, acetic acid vaø ñöôøng. Protopectin khi bò thuûy phaân baèng acid thì giaûi phoùng pectin hoaø tan. II. Pectinase:[I] Enzyme pectinase laø enzyme xuùc taùc söï phaân huûy cuûa caùc polymer pectin. Söï phaân huûy pectin trong töï nhieân thöôøng xaûy ra khi traùi caây chín. Nhöõng enzyme naøy vì vaäy coù moät vai troø heát söùc quan troïng trong quaù trình baûo quaûn traùi caây vaø rau quaû. Vieäc kieåm soaùt caùc enzyme naøy trong caø chua chuyeån gen laø moät ví duï ñieån hình trong vieäc öùng duïng RNA ñoái maõ ñeå thao taùc söï bieåu hieän gen. Enzyme pectinase cuõng ñöôïc öùng duïng nhieàu trong quaù trình cheá bieán thöïc phaåm, ñaëc bieät laø khaû naêng laøm trong nöôùc quaû. Vieäc kieåm soaùt hoaït ñoäng cuûa enzyme pectinase cuõng coù theå kieåm soaùt ñöôïc ñoä nhôùt cuûa saûn phaåm. Enzyme pectinase coù theå ñöôïc phaân loaïi theo cô cheá taùc duïng cuûa chuùng. Pectinesterase (PE): xuùc taùc söï thuûy phaân cuûa caùc nhoùm methyl ester. Enzyme thöôøng taán coâng vaøo caùc nhoùm ester methyl cuûa ñôn vò galaturonate naèm keà ñôn vò khoâng bò ester hoaù, phaân caét caùc nhoùm methoxy (COOCH3) ñöùng caïnh caùc nhoùm –COOH töï do, taïo thaønh acid pectinic hoaëc acid pectic vaø methanol. Pectinesterase thu ñöôïc töø caùc nguoàn khaùc nhau coù giaù trò pH toái öu khaùc nhau. Neáu thu töø nguoàn VSV thì PH toái öu töø 4,5-5,5, coøn neáu töø nguoàn thöïc vaät thì coù pH toái öu töø 5,0-8,5. Pectinesterase töø naám moác coù nhieät ñoä toái öu laø 30-40oC vaø bò voâ hoaït ôû 55-62oC. Pectinesterase thöôøng ñöôïc hoaït hoaù bôûi caùc ion Ca2+ vaø Møg2+. Polygalacturonase coøn coù teân goïi laø poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xuùc taùc söï phaân caét caùc moái lieân keát α–1,4-glycosid. Caùc exo-PG (exo-poly 1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phaân caét töø caùc ñaàu khoâng khöû, vaø endo-PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, taán coâng ngaãu nhieân vaøo giöõa maïch cô chaát. Polygalacturonase ít gaëp trong thöïc vaät nhöng coù chuû yeáu ôû moät soá naám moác vaø vi khuaån. Polygalacturonase laø moät phöùc heä enzyme goàm coù nhieàu caáu töû vaø thöôøng coù tính ñaëc hieäu cao ñoái vôùi cô chaát. Treân cô sôû tính ñaëc hieäu vaø cô cheá taùc duïng vôùi cô chaát, enzym polygalacturonase ñöôïc chia laøm boán loaïi: Polymethylgalacturonase hay coøn goïi laø α-1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase, taùc duïng treân polygalactorunic acid ñaõ ñöôïc methoxyl hoaù (töùc laø pectin). Enzyme naøy laïi ñöôïc phaân thaønh hai nhoùm nhoû phuï thuoäc vaøo khaû naêng phaân caét ôû trong hay cuoái maïch trong phaân töû pectin, ñoù laø endo-glucosidaùe-polymethyl galacturonase kieåu I vaø exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kieåu III. Polygalacturonase, enzyme taùc duïng treân pectic acid hoaëc pectinic, cuõng ñöôïc chia thaønh hai nhoùm nhoû laø endo-glucosidase-polygalacturonase kieåu II vaø exo-glucosidase-polygalacturonase kieåu IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kieåu I laø enzyme polymethylgalacturonase dòch hoaù pectin coù möùc ñoä methyl hoaù caøng cao thì bò thuûy phaân bôûi enzyme naøy caøng nhanh vaø caøng coù hieäu quaû. Trong dung dòch, khi coù maët cuûa enzyme pectinesterase thì hoaït ñoä cuûa enzyme naøy thöôøng bò giaûm. Enzyme naøy raát phoå bieán trong caùc VSV, ñaëc bieät laø naám moác A. niger, A, awamori. Pectate lyase (PEL): xuùc taùc söï phaân caét caùc ñôn vò galacturonate khoâng bò ester hoaù. Caû hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galacturonide) lyase) vaø endo-PEL (endo-poly(1,4-α-D-galacturonic) lyase) ñeàu toàn taïi. Pectate vaø pectin coù löôïng methoxyl thaáp laø caùc cô chaát thích hôïp hôn caû cho caùc enzyme naøy. Noùi chung, caû hai enzyme naøy ñeàu coù khoaûng pH toái ña naèm trong khoaûng töø 8,0-11, ñeàu caàn ion Ca2+ ñeå hoaït ñoäng. Pectate lyase khoâng ñöôïc tìm thaáy trong caây xanh, nhöng coù ôû vi khuaån vaø naám. Caùc enzyme VSV ngoaïi baøo naøy ñoùng moät vai troø raát quan troïng trong quaù trình gaây beänh ôû thöïc vaät, gaây ra söï phaân huûy moâ cuûa thaønh teá baøo, laøm meàm vaø laøm muïc moâ thöïc vaät. Ngoaøi ra coøn coù: Pectin-transeliminase hay coøn ñöôïc goïi laø poly α–-1,4-galaturonite –methylesteglucanoliase, laø enyme taùc duïng treân pectin vaø pectinic acid. Polygalactorunate-transeliminase coøn ñöôïc goïi laø poly α -1,4D-galaturonite –glucanoliase, laø enzyme taùc duïng treân pectic acid vaø pectinic acid. Pectin lyase (PNL): xuùc taùc söï phaân caét caùc ñôn vò galacturonate ñaõ bò ester hoaù. Taát caû caùc PNL ñeàu laø endo-enzyme III. Ñaëc ñieåm cuûa caùc pectinase töø caùc nguoàn khaùc nhau:[ I ] 1. Pectinesterase: Beân caïnh pectineaterase (PE) VSV, haàu heát caùc loaïi caây cho traùi ñeàu chöùa enyme PE. Enzyme naøy thöôøng toàn taïi döôùi nhieàu hình thöùc khaùc nhau, naèm trong phaàn voû teá baøo. PE ôû thöïc vaät noùi chung coù hoaït ñoä toái öu trong khoaûng pH hôi kieàm. Caùc cation kim loaïi ôû noàng ñoä thaáp, nhö Ca2+ chaúng haïn, coù khuynh höôùng laøm taêng noàng ñoä hoaït ñoäng cuûa enzyme. a.Ñaëc ñieåm cuûa pectineaterase thöïc vaät: Caø chua chöùa ít nhaát hai loaïi PE. Caû PE1 vaø PE2 ñeàu taêng trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình chín. Khi böôùc vaøo giai ñoaïn chín, noàng ñoä enzyme PE1 giaûm xuoáng, nhöng PE2 tích luyõ daàn cho ñeán khi traùi caây coù maøu ñaëc tröng cuûa traùi chín. PE2 coù khoái löôïng phaân töû 23kD, pH toái öu 7,6. Enzyme naøy bò baát hoaït 50% sau 5 phuùt ñun ôû 67oC. Caùc ion Ca2+ vaø Na+ laøm taêng hoaït ñoä cuûa enzyme leân toái ña ôû caùc noàng ñoä 0,005M vaø 0,05M, theo thöù töï. PE cuûa ñaäu naønh laø protein coù khoái löôïng phaân töû 33kD, hoaït ñoäng toái öu taïi pH gaàn 8. Polygalacturonic acid, saûn phaåm hình thaønh do quaù trình ñeå methyl hoaù, laø moät chaát öùc cheá caïnh tranh. Trong thòt quaû chuoái coù hai isoenzyme PE. Caû hai coù cuøng khoái löôïng phaân töû laø 30kD, nhöng coù ñieåm ñaúng ñieän khaùc nhau: 8,8 vaø 9,3. Caùc enzyme naøy hoaït ñoäng ôû pH toái ña laø 7,5. Hoaït ñoä enzyme taêng leân khi theâm vaøo dung dòch NaCl ôû noàng ñoä 0,2M, vaø ñöa pH cuûa dung dòch veà 6,0. Caùc enzyme naøy bò öùc cheá bôûi nhieàu loaïi polyol coù khoái löôïng phaân töû thaáp, nhö glycerol, sucrose, glucose, maltose vaø galactose. PE trong quaû cam coù hai loaïi: ñoù laø hai isoenzyme PE1 vaø PE2 coù khoái löôïng phaân töû 36,kD, nhöng coù ñieåm ñaúng ñieän khaùc nhau laø 10,05 vaø (11,0, theo thöù töï. pH toái öu cuûa PE1 laø 7,6, coøn cuûa PE2 laø 8,0. Thòt quaû cuõng chöùa hai isoenzymem, moät trong hai enzyme naøy coù tính beàn nhieät hôn, coøn enzyme kia thì ít maãn caûm hôn khi bò taùc ñoäng cuûa protease. Ñoä oån ñònh cuûa enzyme coù theå lieân quan ñeán möùc ñoä glycosyl hoaù cuûa caùc phaân töû enzyme. Enzyme beàn nhieät hôn vaø enzyme coøn laïi coù khoái löôïng laø 51kD vaø 36kD, theo thöù töï. Caû taùo vaø kiwi cuõng chöùa hai loaïi isoenzyme. Caùc isoenzyme cuûa kiwi coù cuøng khoái löôïng phaân töû laø 57kD vaø cuøng ñieåm ñaúng ñieän laø 7,3. Tuy nhieân, chuùng khaùc nhau veà möùc ñoä beàn nhieät. b.Ñaëc ñieåm cuûa pectineaterase vi sinh vaät:Moät ñieåm ñaùng löu yù laø taát caû enzyme VSV ñeàu khoâng phaûi laø protein kieàm. PE cuûa Trichoderma reerei coù ñieåm ñaúng ñieän naèm trong khoaûng 8,3-9,5 vaø pH toái öu laø 7,6. Tuy nhieân, PE cuûa Aspergillus coù ñieåm ñaúng ñieän vaø pH toái öu trong khoaûng acid. Hoaït ñoäng cuûa enzyme PE sinh ra bôûi A. niger ñaït toái ña ôû pH 4,5 ôû 40oC. Caùc PE acid vaø kieàm coù theå ñeà methyl hoaù cô chaát pectin theo cuøng moät kieåu. PE kieàm laøm hình thaønh caùc pectin ñöôïc ñeà ester hoaù vaø pectin naøy coù theå taïo gel yeáu vôùi ion calcium; PE acid taïo ra pectin bò ñeà ester hoaù coù khaû naêng taïo gel maïnh vôùi ion calcium. c.Trình töï amino acid: Caáu truùc baäc moät cuûa PE caø chua chöùa 305 amino acid vôùi khoái löôïng phaân töû 33 239. Enzyme naøy coù chöùa hai caàu noái disulfide (Cys98-Cys125 vaø Cys166-Cys200). Cys 166 coù maët trong taát caû caùc enzyme pectinesterase. Trình töï amino acid suy luaän treân cô sôû caùc nucleotide cDNA cho thaáy söï khoâng nhaát quaùn, 18 trong 27 vò trí khaùc nhau, coù theå laøm thay ñoåi ñieän tích cuûa protein. Maët khaùc, chæ coù khoaûng 94% trình töï amino acid trong moät phaàn chuoãi amino acid coù tính ñoàng daïng vôùi toaøn boä trình töï cuûa cDNA. Söï khoâng nhaát quaùn naøy coù theå phaûn aùnh söï toàn taïi cuûa caùc isoenzyme, maëc duø chæ coù hai isoenzyme trong caø chua ñöôïc bieát ñeán. Moät soá gen maõ hoaù cho caùc enzyme PE ñaõ ñöôïc taùch doøng vaø nghieân cöùu ñaëc ñieåm. Gen taùch doøng töø Pseudomonas maõ hoaù cho PE coù chöùa 396 amino acid vôùi khoái löôïng phaân töû laø 41 004. d.Cô cheá ñeå methyl hoaù: PE loaïi boû caùc nhoùm methoxyl trong phaân töû pectin baèng töông taùc aùi nhaân cuûa enzyme leân ester, laøm hình thaønh hôïp chaát trung gian acyl-enzyme vaø phoùng thích methanol. Tieáp theo sau laø phaûn öùng deayl hoaù, laø phaûn öùng thuûy phaân cuûa hôïp chaát trung gian acyl-enzyme, ñeå giaûi phoùng enzyme vaø carboxylic acid(H.6.7). E-N Caùc PE coù nguoàn goác thöïc vaät phaûn öùng theo kieåu laøm hình thaønh caùc khoái pectin chöùa caùc nhoùm carboxylate doïc theo maïch pectin. Enzyme cuûa Trichoderma reesei laø moät protein cô baûn cho kieåu phaûn öùng töông töï. Enzyme cuûa caùc loaøi Asperillus vôùi pH toái ña trong vuøng acid, xuùc taùc phaûn öùng töø beân trong. Aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi khi kích hoaït enzyme pectinesterase coù theå coù lieân quan ñeán töông taùc cuûa noù vôùi cô chaát. Polygalacturonic acid laø moät chaát öùc cheá caïnh tranh trong phaûn öùng thuûy phaân nhôø söï xuùc taùc cuûa PE. Pectin chöùa caùc nhoùm cacboxylate ñöôïc saép xeáp nhö hình khoái coù theå taùc duïng theo caùch töông töï. Söï lieân keát cuûa caùc ion kim loaïi vaøo caùc nhoùm carboxylate trong tröôøng hôïp naøy coù khuynh höôùng trung hoaø aûnh höôûng öùc cheá cuûa cô chaát pectin leân enzyme. Tuy nhieân. Löôïng dö caùc ion naøy treân thöïc teá gaây ra söï baát hoaït cuûa PE vì caùc ion kim loaïi bò vaây quanh bôûi caùc nhoùm carboxylate naèm keá caän vôùi caùc lieân keát ester caàn thieát cho phaûn öùng thuûy phaân xaûy ra. 2. Polygalacturonase Haàu heát caùc nghieân cöùu veà PG ñeàu treân cô sôû caùc nguoàn VSV. PG thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong caùc phaàn tieát ngoaïi baøo cuûa caùc loaøi naám vaø vi khuaån gaây beänh, chaúng haïn nhö Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, caùc loaøi Ascomycete, Phizopus arrchizus, vaø Fusarium osyporum. Tuy nhieân, trong thöïc teá, PG cuûa thöïc vaät baäc cao ñöôïc nghieân cöùu raát nhieàu ôû caø chua chín. a.Caùc enzyme trong caø chua chín: Caùc enzyme PG trong caø chua chín toàn taïi döôùi hai daïng, vaø caû hai ñeàu laø endo-enzyme. PG1 coù khoái löôïng phaân töû 84kD vaø coù khoaûng 50% bò baát hoaït ôû nhieät ñoä 78oC. PG2 coù khoái löôïng phaân töû 44kD vaø coù khoaûng 50% bò baát hoaït ôû 57oC. PG1 coù ñoä oån ñònh toái ña ôû pH 4,3, traùi laïi PG2 oån ñònh toái ña ôû pH 5,6. Söï phaân tích söû duïng SDS-PAGE cho raèng PG1 laø moät dimer cuûa PG2, tuy nhieân caùc nghieân cöùu khaùc laïi cho raèng PG1 hình thaønh laø do söï keát hôïp cuûa PG2 vôùi moät (–subunit. Caùc chuoãi polypeptide cuûa PG ñeàu bò glycosyl hoaù. PG2 chöùa 4,6 ñöôøng trung tính (D-mannose, L-gucose, D-xylose) lieân keát vôùi nhau thoâng qua caàu noái N-acetylglucosaminylasparaginyl. Coù söï khaùc nhau chuùt ít veà khoái löôïng phaân töû, chaúng haïn caùc isoenzyme cuûa PG2, PG2A va PG2B coù khoái löôïng phaân töû töông öùng laø 43 vaø 46kD. Söï khaùc nhau naøy coù theå laø do quaù trình söûa sai hoaëc quaù trình glycosyl hoaù sau dòch maõ. Trong thöïc teá, caùc nghieân cöùu sau ñoù cuõng ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng PG2A vaø PG2B laø caùc daïng glycosyl hoaù khaùc nhau cuûa cuøng caùc polypeptide. b. Trình töï amino acid: Caùc trình töï amino acid ñöôïc suy luaän treân cô sôû caùc nucleotic cuûa cDNA phaân laäp khoâng nhöõng töø traùi caø chua maø coøn töø phaán cuûa caùc loaøi Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phaán hoa baép, vaø töø traùi bô. Gen cuûa PG2 phaân laäp töø traùi caø chua maõ hoaù cho protein hoaøn chænh coù 373 amino acid, vôùi khoái löôïng phaân töû laø 40 279. Enzyme naøy ñöôïc toång hôïp töø moät tieàn chaát, sau ñoù ñi qua quaù trình söûa chöûa sau dòch maõ, goàm caû caùc quaù trình loaïi boû caùc peptide tín hieäu, bò glycosyl hoaù taïi boán ñieåm coù khaû naêng glycosyl, vaø söûa chöõa ôû ñaàu C cuoái. Caùc gen PG ñôn maõ hoaù cho caùc loaïi isoenzyme khaùc nhau, daãn ñeán keát luaän raèng PG1 vaø PG2 ñeàu xuaát phaùt töø cuøng moät chuoãi polypeptide, vaø raèng PG1 ñöôïc taïo thaønh nhôø söï keát hôïp cuûa PG2 vôùi (-subunit. (-subunit. Söï chuyeån ñoåi PG2 vaø PG1 trong quaù trình chín cuûa caø chua laø moät vaán ñeà gaây ñöôïc nhieàu chuù yù. (-subunit, moät yeáu toá beàn nhieät, ñaàu tieân ñöôïc phaân laäp töø caø chua xanh, coù khaû naêng chuyeån ñoåi PG2 thaønh PG1 trong oáng nghieäm. Yeáu toá naøy sau ñoù ñöôïc xaùc minh laø moät glycoprotein raát ñaëc tröng vôùi polypeptide PG veà maët mieãn dòch. Phaân töû PG1 ñöôïc taïo thaønh töø moät phaân töû PG2 vaø moät phaân töû (-subunit; tuy nhieân, chæ coù polypeptide PG coù hoaït tính enzyme. cDNA maõ hoaù cho –subunit coù trong caø chua laø moät tieàn chaát coù kích thöôùc phaân töû lôùn (69kD, 630 amino acid). Trong phaân töû naøy, theâm vaøo phaân töû protein hoaøn chænh laø moät trình töï tín hieäu kò nöôùc (30 amino acid), moät polypeptide chöùa ñaàu cuoái N-(78 amino acid), vaø moät tieàn peptide chöùa ñaàu cuoái C-(233 amino acid). Protein hoaøn chænh chöùa glycosyl hoaù laø chöùa 289 amino acid naëng 31,5 kD, ñieåm ñaúng ñieän 4,9. Protein naøy chöùa löôïng lôùn amino acid gly, tyr, phe, vaø moät motif laëp coù caáu truùc lieân öùng FTNYGxxGNGGxxx, trong ñoù “x” phaàn lôùn laø caùc amino acid phaân cöïc. Chöùc naêng cuûa motif naøy trong protein vaãn chöa ñöôïc bieát roõ. c.Vai troø cuûa PG trong quaù trình laøm chín traùi caây. Hoaït ñoä cuûa enzyme trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình laøm chín chuû yeáu laø nhôø PG1. PG1 tieáp tuïc taêng trong quaù trình chín, vaø coù maët trong taát caû caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình chín. PG2 coù khoái löôïng phaân töû thaáp hôn vaø ít beàn nhieät, PG2 xuaát hieän trong giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình, vaø chieám löôïng lôùn trong giai ñoaïn chín. Söï xuaát hieän keá tieáp nhau cuûa hai enzyme naøy laø keát quaû cuûa hoaït ñoäng ñieàu hoaø cuûa –subunit, yeáu toá naøy ñöôïc tìm thaáy vôùi löôïng ít trong caø chua xanh, sau ñoù taêng leân trong giai ñoaïn chín. PG2 ñöôïc coi nhö moät endo-enzyme trong caø chua chín, PG1 ñöôïc hình thaønh trong suoát quaù trình chín khi (–subunit ñöôïc sinh ra ñeå phaûn öùng vôùi PG2. Baèng caùch ñieàu chænh nhöõng thay ñoåi trong caùc phaân töû PG trong caùc dòch chieát khaùc nhau coù caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa NaCl vaø pH ñeäm khaùc nhau. Treân thöïc teá gen maõ hoaù cho polypeptide PG trong moät soá nghieân cöùu tröôùc ñaây ñaõ chöùng minh ñieàu naøy. Gaàn ñaây, caùc nghieân cöùu veà caùc kieåu bieåu hieän gen cuûa (–subunit vaø caùc phaân töû PG cho thaáy mRNA cuûa (–subunit xuaát hieän sôùm trong quaù trình phaùt trieån cuûa traùi caây(10 ngaøy sau khi thuï phaán) vaø taêng ñeán möùc toái ña trong 30 ngaøy, cuõng laø luùc traùi caây chín. Sau ñoù, löôïng mRNA cuûa (-subunit giaûm nhanh choùng, trong khi löôïng mRNA cuûa PG taêng moät caùch ñaùng keå. Vì taát caû caùc keát quaû nghieân cöùu ñaït ñöôïc ôû treân, ta coù theå cho raèng endo-enzyme PG2 ñöôïc hình thaønh trong caùc giai ñoaïn sôùm cuûa quaù trình chín phaûi ñöôïc chuyeån veà PG1 do söï coù maët cuûa (–subunit. Söï tích luõy cuûa PG2 trong caùc giai ñoaïn sau cuûa quaù trình chín laø do (–subunit bò caïn kieät. Vai troø cuûa quaù trình chuyeån ñoåi naøy laø nhaèm ñieàu hoaø hoaït ñoäng cuûa PG trong caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình chín. (–subunit phaûn öùng vaø neo phaân töû PG2 vaøo thaønh teá baøo, taïo ra phaân töû PG1 döôùi daïng hoaït ñoäng ñeå phaân huûy pectin. Moät soá nghieân cöùu khaùc cuõng chöùng minh ñöôïc raèng PG1, chöù khoâng phaûi PG2 coù chöùc naêng trong vieäc laøm phaân huyû vaø oån ñònh polyuronide, coù nghóa laø söï phaân huûy cuûa polyuronide döôùi taùc ñoäng cuûa enzyme PG laø nguyeân nhaân daãn ñeán quaù trình meàm cuûa caø chua.Tuy nhieân, khi nghieân cöùu veà söï xen ñoaïn vaø bieåu hieän cuûa gen PG trong caø chua chuyeån gen thì keát quaû cho thaáy polyuronide bò phaân huûy nhöng khoâng laøm cho traùi caø chua meàm ñi. d.Cô cheá vaø kieåu taùc duïng: Exo-PG thuûy phaân caùc ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi polygalacturonic, taïo ra galacturonic acid laø saûn phaåm thuûy phaân chieám öu theá(H.6.8). Söï thuûy phaân polymer naøy bò giaùn ñoaïn cuûa söï toàn taïi cuûa caùc maïch nhaùnh trong cô chaát. Möùc ñoä thuyû phaân taêng tæ leä vôùi kích thöôùc cô chaát, ñaït toái ña vôùi möùc polymer hoaù 20 ñoái vôùi caùc exo-PG ôû caø roát vaø ñaøo. Hoaït ñoäng cuûa caùc exo-enzyme laøm taêng nhanh söï taïo thaønh caùc nhoùm khöû vaø laøm taêng chaäm ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát. Söï phaân huûy polyuronide trong quaù trình chín khoâng gaây ra söï tích luõy galacturonic acid, vaø chæ coù endo-enzyme PG laø coù lieân quan. Caùc endo-PG phaân huûy pectic acid töø beân trong maïch, laøm giaûm nhanh ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát. Tính ñaëc hieäu vaø kieåu taùc duïng cuûa endo-enzyme ñöôïc xaùc ñònh bôûi traïng thaùi cuûa ñieåm hoaït ñoäng. Möùc ñoä thuûy phaân cuûa endo-PG ôû naám men giaûm cuøng vôùi söï giaûm ñoä daøi maïch cô chaát. Vò trí lieân keát cuûa endo-PG ôû Aspergillus niger ñöôïc caáu thaønh töø 4 ñieåm vaø söï phaân caét xaûy ra giöõa caùc ñieåm 1 vaø 2(H.6.9). Moät cô chaát tetramer chòu söï phaân caét(3+1) thaønh trigalacturonic acid galacturonic. Moät cô chaát pentamer cho ra hai saûn phaåm phöùc taïp hôn, caû hai ñeàu ñaùp öùng söï chieám giöõ hoaøn toaøn cuûa 4 ñieåm lieân keát, taïo söï phaân caét (4+1) vaø (3+2). Cuõng töông töï, ñoái vôùi cô chaát laø hexagalacturonic acid, saûn phaåm seõ taïo thaønh loái phaân caét (5+1), (4+2) vaø (3+3). Trigalacturonic acid baùm vaøo ñieåm hoaït ñoäng ñeå taïo thaønh caùc phöùc hôïp höõu ích hoaëc khoâng höõu ích. Lieân keát höõu ích trong tröôøng hôïp naøy laøm sinh ra söï phaân caét (2+1). Lieân keát khoâng höõu ích ñöôïc taïo thaønh khi ba ñôn vò ñôn leõ baùm vaøo ba ñieåm 2, 3 vaø 4 laø khoâng heà töông taùc vôùi caùc nhoùm xuùc taùc ñònh vò beân trong ñieåm 1 vaø 2. Cô chaát trong tröôøng hôïp naøy ñoùng vai troø laø moät chaát öùc cheá caïnh tranh (K = 0,67mM). 3.Pectate lyase: Pectate lyase (PEL) laø caùc enzyme VSV ngoaïi baøo. Caùc enzyme cuûa gioáng Erwina vaø Bacillus ñöôïc bieát ñeán laø taùc nhaân gaây ra trieäu chöùng soft-rod ôû thöïc vaät. Tuy nhieân, chuùng cuõng ñöôïc tìm thaáy phoå bieán ôû Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus vaø Fusarium. Erwinia chrysanthemi sinh ra caùc enzyme pectate lyase ôû daïng isoenzyme coù theå ñöôïc phaân thaønh caùc nhoùm treân cô sôû ñieåm ñaúng ñieän cuûa chuùng: acid (pH 4-5), trung hoaø (pH 7-8,5) vaø kieàm (pH 9-10). Soá löôïng caùc isoenzyme trong moãi nhoùm coù theå thay ñoåi tuøy theo loaøi. Ña soá caùc loaøi ñöôïc nghieân cöùu cho naêm hay ít nhaát boán isoenzyme: moät acid (PELA), hai trung hoaø (PELA vaø C), hai kieàm (PELD vaø E). Taát caû caùc isoenzyme naøy ñeàu caàn Ca++ ñeå laøm taêng ñoä hoaït ñoäng vaø coù pH toái öu 8-10. Caùc nghieân cöùu treân chuûng EC16 cho thaáy raèng taát caû 4 isoenzyme treân ñeàu laø endo-enzyme (PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), vaø PELD (pI 10,0)). Caùc PEL kieàm raát ñaëc hieäu trong vieäc gaây ra söï giaàm nöôùc cuûa caùc moâ thöïc vaät, tieáp theo laø caùc isoenzyme trung hoaø, traùi laïi caùc PEL acid khoâng gaây aûnh höôûng gì. ÔÛ caùc chuûng Erwinia carotovara, coù ít nhaát ba PEL ñöôïc tieát ra, taát caû ñeàu coù ñieåm ñaúng ñieän ôû pH kieàm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), vaø PELIII (pI 10,35). Caû ba isoenzyme naøy ñeàu coù pH toái öu laø 9,0. Nhieät ñoä toái öu cho hoaït ñoäng cuûa PELII vaø PELIII laø 50 vaø 60oC, theo thöù töï. PELI coù ñoä beàn nhieät thaáp. ÔÛ chuûng GIR726, coù boán loaïi endo-PEL isoenzyme vôùi caùc ñieåm ñaúng ñieän ôû caùc pH raát kieàm (10,0, 10,6, 10,3 vaø 10,9) vaø khoái löôïng phaân töû naèm trong khoaûng töø 28-33 kD. pH toái öu cho hoaït ñoäng laø 9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV vaø 9,7 cho PEL I vaø III. Cuõng nhö vôùi caùc PEL töø caùc nguoàn khaùc, nhöõng isoenzyme naøy ñöôïc kích hoaït bôûi Ca++. Hoaït ñoä enzyme taêng 50-70% khi coù maët cuûa Ca++ oàng ñoä 0,5mM. Isoenzyme vôùi pI>10 chöùa 2,5-4.8% ñöôøng trung tính. Caùc PEL töø moät soá loaøi Bacillus cuõng coù khaû naêng gaây ra söï giaûm nöôùc ôû moâ thöïc vaät. IV. Caùc ñaëc tính kyõ thuaät quan troïng cuûa enzyme pectinase:[ I ] 1. Pectinesterase: Caùc PE ôû thöïc vaät taán coâng vaøo hoaëc ñaàu khoâng khöû hoaëc gaàn vôùi nhoùm carboxyl töï do vaø tieán doïc theo phaân töû baèng cô cheá chuoãi ñôn, taïo ra caùc khoái galacturonic acid khoâng bò ester hoaù raát maãn caûm vôùi calcium. Caùc caáu truùc khaùc nhau cuûa chuoãi galacturonan, chaúng haïn nhö caùc monomer acetyl hoaù, caùc nhoùm ester bò chuyeån ñoåi thaønh amide hay bò khöû ñeán röôïu baäc moät, hay söï toàn taïi cuûa caùc vuøng coù nhieàu maïch nhaùnh, öùc cheá hoaït ñoäng cuûa PE. PE coù tính ñaëc hieäu cao ñoái vôùi nhoùm methylester cuûa polygalacturonic acid. Caùc ester khaùc chæ bò taán coâng raát chaäm, coøn caùc nhoùm methylester cuûa polymanuronic acid thì khoâng heà bò taán coâng. Toác ñoä ñeà ester hoaù treân maïch pectin phuï thuoäc vaøo ñoä daøi cuûa maïch; trimethyl trigalacturonate khoâng bò taán coâng. Caùc PE cuûa naám khaùc vôùi PE cuûa thöïc vaät theo cô cheá ña maïch, caùc nhoùm mehtoxyl bò laáy ñi moät caùch ngaãu nhieân. 2. Polygalacturonase: Vieäc xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme naøy baèng caùch ño ñoä nhôùt cuûa dung dòch pectic acid goàm methylester vaø glycolester cho thaáy söï giaûm nhanh toác ñoä vaø möùc ñoä thuyû phaân, ñoàng thôùi taêng möùc ñoä ester hoaù. Caùc nhoùm acetyl coù maët laøm giaûm möùc ñoä thuûy phaân baèng caùch giaûm aùi löïc cuûa caùc phaân töû cô chaát qua caùc khoái chöùa caùc ñieåm lieân keát. Söï thuûy phaân bò haïn cheá do söï coù maët cuûa caùc nhoùm acetyl coù theå ñöôïc xaùc minh baèng caùch söû duïng pectin cuû caûi ñöôøng laøm cô chaát. PG taïo bôûi naám coù theå thuûy phaân ñeán 70% pectin bò acetyl hoaù. Tuy nhieân, kieåu taùc duïng leân cô chaát cuûa caùc PG coù töø caùc nguoàn khaùc nhau thì khaùc nhau. Cô chaát toát nhaát cho söï phaân huûy cuûa endo-pectin-lyase ôû pH>7 laø pectin hoaøn toaøn bò ester hoùa. Tuy nhieân,ôû caùc giaù trò pH nhoû hôn, enzyme naøy vaãn hoaït ñoäng ñoái vôùi pectin bò ester hoùa ít hôn, ñoàng thôøi caàn Ca++ ñeå kích hoaït. Ñieàu naøy coù yù nghóa thöïc söï ñoái vôùi caùc quaù trình cheá bieán traùi caây. Nhöõng enzyme naøy caàn caùc nhoùm methylester ñeå hoaït ñoäng, traùi laïi chuùng bò baát hoaït khi coù maët caùc nhoùm glycolester vaø caùc pectate bò amidate hoùa. 3.Endo-pectate lyates: Traùi laïi, endo-pectate lyates khoâng phaân bieät methylester vaø glycolester cuûa pectic acid. Ñieàu thuù vò laø pectate khoâng phaûi laø cô chaát toát nhaát cho vi khuaån PAL töø vi khuaån. Chuùng coù hoaït ñoä cöïc ñaïi (toác ñoä ban ñaàu vaø möùc ñoä phaân huûy) neân pectin coù haøm löôïng methoxyl thaáp. 4.Rhamno-galacturonase: Gaàn ñaây, rhamno-galacturonase laø enzyme ñöôïc phaùt hieän coù khaû naêng phaân caét lieân keát glucoside trong caùc vuøng phaân nhaùnh nhieàu cuûa phaân töû galacturonic rhamnose acid coù trong pectin cuûa quaû taùo vôùi hoaït tính raát cao khi nhöõng phaân töû naøy bò ñeà ester hoaù vaø arabinose bò laáy ñi do bò thuûy phaân bôûi acid (vuøng phaân nhaùnh nhieàu bò söûa chöõa). Enzyme naøy coù maët trong caùc cheá phaåm thöông maïi cuûa pectinase vaø chaéc chaén phaûi ñöôïc phaân loaïi laø pectinase. Saûn phaåm cuoái laø caùc oligomer coù caùc ñôn vò rhamnose vaø galacturonic acid, trong ñoù rhamnose laøm hình thaønh ñaàu khoâng khöû. 5. Pectinase thöông maïi: Enzyme thöông maïi laø caùc cheá phaåm enzyme cuûa naám moác, ñöôïc ñieàu cheá chuû yeáu töø caùc loaïi Aspergillus. Chuùng thöôøng laø hoãn hôïp cuûa caùc PE, PG vaø Pl, hemicellulase vaø endo-( -glucanase (C-x-cellulase). Hoaït tính cuûa ba cheá phaåm thöông maïi khaùc nhau ñöôïc trình baøy ôû baûng 6.13. Caùc enzyme ñeàu ñöôïc thu nhaän töø naám moác ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát cheá phaåm pectinase, tröø enzyme C-1-dellulase (cellobiohydrolase) laø ñöôïc theâm vaøo ñeå cheá phaåm ñaït ñöôïc muïc ñích kyõ thuaät. Enzyme arabinanase ñoùng vai troø raát quan troïng trong quaù trình cheá bieán nöôùc eùp traùi caây. Baûng 1:Hoaït tính rieâng cuûa caùc phöùc hôïp ña enzyme trong caùc cheá phaåm pectinase ñöôïc saûn xuaát töø naám Hoaït tính enzyme  Cô chaát  A  B  C   PG PL PE Combined pectolytic C-(-cellulase C-l-cellulase Arabanase: lineararabinan Arabanase: branched arabinan (-L-Arabinofuranosidase Galactomannanase Mannanase Galactanase Xylanase  Polygalacturonic acid Pectin DE 90 Pectin DE 65 Pectin DE 75 CMC A vicel 1-5-(-L-arabinan 1,3; 1,2; 1,5-(-L-arabinan PNP-Arabinofuranoside Galactomannan 1,4-(-D-Mannan 1,4-(-D-Galactan 1,4-(-D-Xylan  1982 43 548 498 998 99 9 14 35 3 7 11 4  3314 53 448 290 180 1 10 14 37 4 0 58 0  1878 74 227 274 1228 22 16 16 333 9 0 91 2   Coù moät ñieàu chaéc chaén laø kyõ thuaät gen seõ ñöôïc söû duïng nhaèm muïc ñích saûn xuaát caùc cheá phaåm enzyme, môû ra nhöõng khaû naêng môùi cho caùc öùng duïng coâng nghieäp cuûa caùc cheá phaåm enzyme naøy. V. Thu nhaän:[ I ] Hieän nay, ngöôøi ta thu nhaän pectinase chuû yeáu töø VSV. Coù hai phöông phaùp saûn xuaát pectinase: Thu nhaän cheá phaåm pectinase töø canh tröôøng beà maët: Moâi tröôøng söû duïng ñeå nuoâi caáy VSV ñeå thu nhaän pectinase thöôøng laø caùm gaïo, hay caùm mì, baõ cuû caûi hoaëc thoùc maàm. Nguoàn dinh döôõng boå sung thöôøng laø caùc muoái ammonium, phosphoric… Ñoä aåm moâi tröôøng phaûi naèm trong khoaûng 60%. Naám moác A.awamori thöôøng ñöôïc nuoâi caáy ôû 30oC vaø trong thôøi gian 40h, sau ñoù giaûm xuoáng 24oC vaø nuoâi trong 48-52h. Saûn phaåm leân men ñöôïc saáy khoâ thaønh cheá phaåm enzyme thoâ vaø ñem tinh cheá. Ñeå thu ñöôïc cheá phaåm pectinase tinh khieát thì cheá phaåm enzyme thoâ phaûi ñöôïc trích ly baèng phöông phaùp keát tuûa nhôø dung moâi höõu cô hay muoái ammonium sulfate. Dung moâi höõu cô söû duïng ñeå keát tuûa enzyme pectinase coù theå laø röôïu ethanol (72,5-75%) hoaëc isopropanol (55-57%). Muoái ammonium sulfat söû duïng coù ñoä baûo hoaø 0,79. Khi keát tuûa baèng röôïu ethanol, cheá phaåm enzyme thu ñöôïc coù ñoä tinh khieát khoaûng 90%, coøn neáu baèng muoái thì ñoä tinh khieát ñaït khoaûng 75%. Nhieät ñoä keát tuûa toái öu vôùi röôïu laø 2-5oC, thôøi gian tieáp xuùc vôùi röôïu caøng ngaén caøng toát. Sau ñoù, ly taâm ñeå taùch keát tuûa khoûi dung dòch, saáy keát tuûa trong thieát bò saáy chaân khoâng hay saáy thaêng hoa roài nghieàn nhoû vaø ñem baûo quaûn. Thu nhaän cheá phaåm enzyme töø canh tröôøng beà saâu: Phöông phaùp hieáu khí: Söï tích tuï enzyme trong moâi tröôøng ñöôïc baét ñaàu khi söï phaùt trieån cuûa VSV gaàn ñaït ñeán pha oån ñònh, khi moâi tröôøng bò acid hoaù maïnh vaø khi löôïng phospho voâ cô ñöôïc söû duïng hoaøn toaøn. pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng ñaït töø 6-7,2 laø thích hôïp. Ñoái vôùi naám moác, pH kieàm kìm haõm söï toång hôïp sinh khoái vaø söï tích luõy enzyme pectinase. pH=4 öùc cheá hoaøn toaøn söï tích luõy enzyme pectinase. Khi pH dòch veà phía acid, ngay caû khi pH naèm trong khoaûng 4,5-5,0, tuy söï taïo thaønh sinh khoái khoâng bò aûnh höôûng nhöng söï taïo thaønh enzyme pectinase bò kìm haõm. Tuy nhieân, pH cuûa caùc tröôøng nuoâi caáu A. niger vaø A. awamori 16 coù theå dòch veà 3,5-3,8 vaø 2,9-3,2, theo thöù töï. Vaät lieäu gieo caáy coù theå laø sôïi naám 24, 32 vaø 48h tuoåi vaø vôùi haøm löôïng töø 2-10%. Ñoái vôùi A. niger vaø A. awamori, vaät lieäu gieo caáy laø sôïi naám ñöôïc uû sô boä trong moâi tröôøng dinh döôõng cho ñeán khi baét ñaàu nöùt nanh baøo töû. Thôøi gian uû sô boä thöôøng laø38-42h. Löôïng sôïi naám ñem gieo caáy thöôøng laø 2%. Trong quaù trình nuoâi caáy, haøm löôïng caùc chaát hoaø tan trong moâi tröôøng thöôøng giaûm töø 6% xuoáng coøn 1,5-1,8%. Ñeå thu cheá phaåm khoâ, caàn taùch sôïi naám ra khoûi canh tröôøng loûng. Coâ ñaëc chaân khoâng canh tröôøng loûng ñeán khi haøm löôïng chaát khoâ ñaït 5-8% roài saáy khoâ treân thieát bò saáy phun. Ñieàu kieän saáy phun laø nhieät ñoä chaát taûi nhieät ñi vaøo phaûi ñaït 165-180oC vaø ñi ra ñaït 60-70oC. Thôøi gian löu cuûa cheá phaåm enzyme trong thieát bò saáy phun phaûi khoâng quaù 7 giaây vaø nhieät ñoä cheá phaåm sau khi saáy phaûi khoâng quaù 40oC. Cheá phaåm thu ñöôïc caàn phaûi ñöôïc ñoùng goùi kín ñeå traùnh huùt aåm. Coù theå thu cheát phaåm pectinase tinh khieát baèng caùch keát tuûa enzyme trong dòch loïc canh tröôøng vôùi ethanol theo tæ leä 4:1, vôùi aceton theo tæ leä 2:1 vaø isopropanol thöo tæ leä 1,3:1, hoaëc vôùi muoái ammonium sulfate (50-80% trong muoái keát). Neáu keát tuûa baèng ethanol, hoaït ñoä pectinase trong keát tuûa seõ vaøo khoaûng 88-90% so vôùi hoaït ñoä cuûa dòch canh tröôøng ban ñaàu. Neáu keát tuûa baèng muoái ammonium sulfate, caàn taùch muoái ra khoûi enzyme baèng phöông phaùp thaåm tích (vôùi nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm), sau ñoù saáy khoâ. Khi ñoä baõo hoaø cuûa (NH4)2SO4 baèng 0,5 thì seõ keát tuûa ñöôïc ñoaïn coù hoaït ñoä pectinase thaáp (ñoaïn naøy chieám 0,25% troïng löôïng khoâ), nhöng neáu keát tuûa baèng (NH4)2SO4 coù ñoä baõo hoaø 1.0 thì seõ keát tuûa ñöôïc ñoaïn chæ chieám 0,11% nhöng laïi coù hoaït ñoä pectinase cao. Phöông phaùp yeám khí Moâi tröôøng: Baõ cuû caûi:2%; (NH4)2HPO4 0,75% KH2PO4:0,1%; CaCO3: 0,3%; nöôùc chieát ngoâ: 0,5% Clostridium pectinopermentants 15 coù khaû naêng toång hôïp pectinase moät caùch maïnh meõ ôû pha taêng tröôûng cuûa quaù trình sinh tröôûng vaø taêng ñoàng thôøi vôùi söï tích luõy sinh khoái. Söï tích luõy enzyme seõ toái ña töông öùng vôùi pha oån ñònh cuûa söï sinh tröôûng qua 55-60h. pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng dinh döôõng laø 6,5-7,0. Vaät lieäu gieo caáy ban ñaàu ñöôïc chuaån bò ôû daïng canh tröôøng chöùa baøo töû vaø ñöôïc caáy vôùi löôïng 4% theo theå tích. Quaù trình nuoâi caáy ñöôïc tieán haønh ôû nhieät ñoä 35oC. Cl. Felsineum cuõng coù theå ñöôïc nuoâi caáy yeám khí ñeå thu pectinase. Thaønh phaàn moâi tröôøng goàm coù: Lactose:2%; pectin cuû caûi:1%; (NH4)2HPO4: 0,4%; K2HPO4: 0,7%; KH2PO4:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO4: 0,025%; FeSO4: daïng veát; CaCO3: 0,5%; dòch naám men töï phaân: 0,05%; ascorbic acid: 0,5%. Coù theå tieán haønh thu cheá phaåm töø dòch loïc canh tröôøng baèng caùch keát tuûa enzyme vôùi dung moâi höõu cô hoaëc vôùi muoái ammonium sulfate. Neáu keát tuûa baèng dung moâi höõu cô, pH cuûa dung dòch ñaõ xöû lí laø: 6,5-6,8. Neáu keát tuûa baèng 2-2,5 theå tích aceton thì hoaït ñoä cuûa enzyme trong keát tuûa ñaït 93-95% so vôùi hoaït ñoä ban ñaàu. Khi keát tuûa baèng ammonium sulfate coù ñoä baõo hoaø baèng 0,2 thì seõ thu ñöôïc cheá phaåm chæ chöùa pectinesterase vaø pectintranseliminase; khi ñoä baõo hoaø laø 0,9-1 thì seõ thu ñöôïc cheá phaåm chæ chöùa pectintranseliminase vaø exopolygalacturonase. Phöông phaùp hieän ñaïi trong chuaån bò cheá phaåm enzyme pectinase thöôøng theo caùc böôùc cô baûn sau ñaây: Khöû muoái baèng phöông phaùp loïc gel(Biogel P100) Taùch protein baèng phöông phaùp trao ñoåi anion (DEAE Biogel A), hay trao ñoåi cation (CM Biogel A) Taùch enzyme pectinase baèng alginate lieân keát ngang Tinh saïch baèng FPLC. Alginate lieân keát ngang hoaït ñoäng baèng caùch keát hôïp aùi löïc, aûnh höôûng tónh ñieän vaø thay theá pectate lieân keát ngang. YÙ nghóa veà maët kyõ thuaät cuûa caùc endo-enzyme 3.1-Pectinesterase: Ethanol coù maët trong phaàn chöng caát ñöôïc töø thòt quaû leân men laø do pectin methylester bò phaân caét bôûi endo-enzyme PE. Trong suoát quaù trình leân men, ethanol ñöôïc sinh ra vaø caùc ñôn vò saûn xuaát caàn phaûi thanh truøng thòt quaû tröôùc khi leân men ñeå noàng ñoä ethanol coù maët trong saûn phaåm khoâng vöôït quaù giôùi haïn cho pheùp. Söï coù maët cuûa PE trong traùi caây hoï citrus laø nguyeân nhaân gaây ra caùc vaán ñeà caàn ñöôïc giaûi quyeát trong coâng nghieäp thöïc phaåm, töùc laø söï maát ñi cuûa caùc veát vaãn ñuïc trong dòch eùp. Neáu PE khoâng bò öùc cheá tröïc tieáp sau khi taùch chieát dòch quaû baèng caùch baát hoaït bôûi nhieät hay laøm ñoâng, caùc phaân töû pectin seõ bò ñeà ester hoaù vaø seõ bò ñoâng tuï bôûi söï coù maët cuûa caùc ion Ca++ trong dòch eùp. Ñeå ngaên ñieàu naøy, nöôùc eùp ñöôïc taùch thaønh phaàn caën vaø phaàn trong. Neáu nöôùc eùp quaù ñaëc, gel pectate seõ ñöôïc hình thaønh vaø do ñoù nöôùc eùp seõ khoâng ñöôïc hoaøn nguyeân laïi nöõa. Nhöõng vaán ñeà naøy laøm giaûm chaát löôïng saûn phaåm moät caùch nghieâm troïng. Caùc chaát taïo höông cuûa traùi caây hoï citrus cöïc kyø maãn caûm vôùi nhieät, vì theá caùc phöông phaùp saûn xuaát saûn phaåm traùi caây ñoâng laïnh ñang raát caàn thieát. Phöùc hôïp cuûa ion Ca++ coù theå ngaên ngöøa söï bieán maát cuûa caùc ñaùm maây vaãn ñuïc do hoaït ñoäng cuûa PE, nhöng laïi laøm phaùt sinh caùc vaán ñeà mang tính chaát phaùp lyù. Polyphenol coù theå öùc cheá hoaït ñoäng cuûa PE nhöng lai gaây aûnh höôûng ñeán vaán ñeà caûm quan, chaúng haïn veà vò trí vaø tính ñoàng nhaát cuûa saûn phaåm. PE ñoàng thôøi laø moät chaát öùc cheá saûn phaåm cuoái, nhöng neáu theâm pectic acid vaøo laïi laøm nöôùc eùp bò phaân lôùp, theá laø laïi taïo ra moät vaán ñeà khoâng mong muoán khaùc. Tuy nhieân, vieäc thuûy phaân pectic acid, ñeán möùc polymer hoaù 8-10, coù aûnh höôûng öùc cheá cuûa caùc cheá phaåm polymer cao phaân töû nhöng laïi khoâng ñoâng tuï vôùi Ca++. Vieäc theâm caùc cheá phaåm nhö theá seõ khoâng ngaên ngöøa ñöôïc nhöng seõ trì hoaõn ñöôïc quaù trình töï phaân lôùp, coù leõ ñuû laâu ñeå phaân phoái nhanh caùc loaïi nöôùc eùp traùi caây töôi ñöôïc laøm tan giaù. Moät khaû naêng khaùc laø vieäc theâm caùc exo-enzyme (H.6.10): PG laøm phaân huûy pectin coù möùc ester thaáp hình thaønh tröôùc khi söï ñoâng tuï vôùi Ca++ xaûy ra, hay PL phaân huûy caùc pectin trong nöôùc eùp traùi caây ñeán caùc saûn phaåm coù khoái löôïng phaân töû thaáp hôn, laø caùc hôïp chaát khoâng maãn caûm vôùi Ca++, duø laø ñeà ester hoaù vaø thöïc teá cuõng coù theå hieän chöùc naêng öùc cheá PE. Hoaït ñoäng phaân huûy pectin bôûi enzyme nhö theá ñaõ ñöôïc öùng duïng trong vieäc laøm giaûm ñoä nhôùt trong nöôùc traùi caây, vì theá laøm taêng noàng ñoä cuûa caùc thaønh phaàn chaát chieát ñeán caùc giaù trò Brix cao hôn nhö bình thöôøng coù theå. Cuõng caàn phaûi löu yù vieäc söû duïng caùc giai ñoaïn bay hôi nhieàu laàn nhaèm toái öu hoaù quaù trình xöû lyù nhieät vaø khoâi phuïc höông vò saûn phaåm, keát hôïp vôùi vieäc baûo quaûn trong ñieàu kieän ñoâng laïnh vaø vaän chuyeån saûn phaåm nöôùc eùp coâ ñaëc giuùp traùnh ñöôïc phaàn lôùn PE bò baát hoaït do taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä.Tuy nhieân, ñoái vôùi caùc nöôùc ñang phaùt trieån, vaãn ñang toàn taïi vaán ñeà naøy trong coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc eùp traùi caây hoï citrus vaø caùc loaïi nöôùc eùp vaån ñuïc khaùc coù hoaït löïc PE cao vaø caùc chaát taïo höông raát maãn caûm vôùi nhieät, chaúng haïn nhö oåi vaø xoaøi. Caùc PE ñöôïc phaân laäp töø cam coù hình thöùc khaùc nhau vaø coù aùi löïc khaùc nhau ñoái vôùi pectin vaø pectate. Maët khaùc, chuùng cuõng khaùc nhau veà ñoä beàn nhieät, vaø cuõng deã hieåu raèng chuùng ñoùng vai troø khaùc nhau trong hieän töôïng laøm trong dòch quaû eùp. Moät loaïi ñöôïc phaân bieät bôûi khoái löôïng phaân töû cuûa noù raát cao, chæ chieám khoaûng 5% hoaït tính toaøn phaàn vaø mang moät soá ñaëc ñieåm noåi baät. Loaïi naøy beàn nhieät vaø vì theá ñoùng vai troø chính yeáu trong vieäc laøm trong dòch quaû eùp ñaõ thanh truøng vôùi löôïng nhieät khoâng ñuû. Enzyme naøy cuõng hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä thaáp vaø pH thaáp vaø do ñoù ñöôïc coi laø coù vai troø quan troïng trong quaù trình töï taùch lôùp cuûa nöôùc chanh trong vaø nöôùc eùp töø quaû chanh thu ñöôïc baèng caùch ñeå laéng nöôùc eùp trong tank coù chaát baûo quaûn laø sulfur dioxide. Nhöõng dòch trong töø quaû eùp nhö theá vaãn ñang laø nhöõng saûn phaåm coù giaù trò thöông maïi ñöôïc saûn xuaát vôùi vieäc öùng duïng caùc cheá phaåm pectinase thöông maïi. Trong soá hai isoenzyme trong baûng 6.13, chæ coù isoenzyme PE loaïi I coù khaû naêng laøm taùch lôùp. PE loaïi II khoâng coù khaû naêng naøy; löôïng methanol töï do ñöôïc thoaùt ra ít hôn so vôùi methanol taïo ra bôûi caùc enzyme taùch lôùp. Baûng 6 cho thaáy khaû naêng öùc cheá raát cao cuûa pectate coù leõ ñaõ öùc cheá söï hoaït ñoäng cuûa enzyme ôû moät möùc nhaát ñònh trong quaù trình ester hoaù. Aûnh höôûng naøy ñöôïc taêng leân bôûi söï ñoùng goùp cuûa caùc nhoùm acid taïo thaønh. Hình 6.11 cho thaáy, neáu theâm PG vaøo thì khoái pectate laïi bò phaân huûy tieáp vaø treân thöïc teá toác ñoä phaûn öùng maø taïi ñoù methanol töï do hình thaønh trong nöôùc cam eùp coù PE hoaït ñoäng ñöôïc taêng leân bôûi PG. Caùc söï khaùc nhau veà maët ñoäng hoïc nhö theá cuõng coù theå giaûi thích tính öùc cheá khoâng hoaøn toaøn bôûi oligogalacturonate. Moät loaïi PE khaùc trong nöôùc cam eùp khoâng gaây ra söï töï phaân lôùp, thaäm chí ngay caû sau khi giaûi phoùng moät löôïng methanol baèng vôùi löôïng methanol maø PE phoùng thích. Caùc kieåu taán coâng cuûa enzyme phaûi ñöôïc giaû ñònh sao ñoù ñeå pectin vôùi haøm löôïng ester thaáp ñöôïc sinh ra maø coù tính maãn caûm vôùi Ca++ giaûm ñi, coù leõ bôûi söï phaân boá ngaãu nhieân cuûa caùc nhoùm carboxyl töï do. Cô cheá naøy thöôøng thaáy ôû caùc PE cuûa naám, chaúng haïn nhö ôû A. japonicus, enzyme naøy ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát pectin coù möùc ester hoaù thaáp duøng trong cheá bieán möùc ít ñöôøng. Nhöõng pectin nhö vaäy thöôøng ñöôïc saûn xuaát nhôø quaù trình thuûy phaân nhôø acid. Pectinesterase cuûa naám cuõng ñöôïc söû duïng ñeå taùch lôùp röôïu taùo Phaùp. Hai isoenzyme vôùi ñaëc tính laøm taùch lôùp nöôùc cam naøy ñöôïc tìm thaáy trong taát caû caùc thaønh phaàn cuûa quaû cam. Coù ñeán 12 loaïi PE ñöôïc tìm thaáy trong quaû cam troàng vaø caùc loaïi quaû hoï citrus khaùc vaø chuùng ñöôïc taùch treân cô sôû aùi löïc cuûa chuùng ñoái vôùi pectate. Ñieàu caàn chuù yù laø hoaït ñoäng cuûa caùc PE bò öùc cheá bôûi noàng ñoä cao cuûa ñöôøng ñeå taïo nöôùc eùp coâ ñaëc ñeán 60oBx, taïi ñoù caùc enzyme naøy khoâng hoaït ñoäng nhöng laïi coù theå hoaït ñoäng sau khi hoaøn nguyeân (pha loaõng trong nöôùc). Hieän töôïng ñoâng tuï vôùi calcium cuûa pectin bò ñeà ester hoaù bôûi PE ñöôïc khai thaùc khi saáy khoâ voû traùi caây hoï citrus sau khi eùp laøm thöùc aên cho gia suùc. Chaát vöõa calcium hydroxide ñöôïc theâm vaøo khoái voû trong khi nghieàn ñeå ñöa pH ve giaù trò trung tính hay cao hôn. pH cao, vaø noàng ñoä ion Ca++ cao, laøm kích hoaït PE, quaù trình ñeà ester hoaù xaûy ra nhanh vaø söï ñoâng tuï cuûa pectate vôùi calcium xaûy ra. Chaát loûng ñöôïc tieát ra vaø ñöôïc eùp, ñeå chæ coù moät phaàn ít nöôùc coøn laïi caàn ñöôïc loaïi boû nhôø quaù trình saáy bôûi nhieät. Phaàn nöôùc eùp coù thaønh phaàn töông töï nhö nöôùc eùp töø quaû ñöôïc coâ thaønh maät vaø cuõng ñöôïc laøm thöùc aên cho gia suùc. Dó nhieân, voû traùi caây hoï citrus khoâ ñöôïc söû duïng laøm nguyeân lieäu thoâ ñeå trích chieát pectin, do ñoù caàn phaûi ngaên chaên hoaït tính cuûa PE baèng caùch taåy traéng voû ngay laäp töùc, neáu khoâng, pectin ñöôïc chieát ra, cho duø bò ñeà ester hoaù ít thoâi, seõ chöùa caùc khoái galacturonic acid töï do vaø seõ raát maãn caûm vôùi Ca++ vaø vì vaäy khoâng söû duïng ñöôïc ñeå laøm yeáu toá taïo ñoâng. Endo-PE cuõng ñöôïc khai thaùc ñeå baûo veä vaø caûi taïo keát caáu vaø ñoä chaéc cuûa nhieàu loaïi rau quaû cheá bieán, nhö taùo caét laùt, caø chua ñoùng hoäp, suùp lô, caø roát, khoai taây vaø ñaäu. Quaù trình laøm traéng ôû nhieät ñoä thaáp, thôøi gian daøi kích hoaït PE, laøm cho pectin bò ñeà ester hoaù moät phaàn, sau ñoù pectin bò ñeà ester hoaù naøy phaûn öùng vôùi Ca++, taïo neân söï keát dính noäi baøo maïnh hôn. Söï kích thích maïnh hôn ñoái vôùi PG vaø maïnh hôn trong thí nghieäm b, trong ñoù enzyme, esterase bò öùc cheá maïnh hôn bôûi saûn phaåm cuoái so vôùi trong thí nghieäm a. Roõ raøng PL (----) khoâng phaân huûy ñöôïc caùc vuøng öùc cheá ñeà ester hoaù neân khoâng coù aûnh höôûng gì. 3.2-Pectinesterase vaø polygalacturonase: Hai enzyme naøy coù maët cuøng nhau raát nhieàu trong caø chua, coù aûnh höôûng raát lôùn trong quaù trình cheá bieán caø chua. Vieäc gaây baát hoaït caùc enzyme naøy bôûi nhieät ngay laäp töùc laø caàn thieát ñeå coù ñöôïc nöôùc eùp coù ñoä nhôùt cao nhö ngöôøi tieâu duøng mong muoán hay nöôùc eùp daïng paste, söû duïng laøm nöôùc chaám, soup, nöôùc soát caø chua naám vaø moät soá saûn phaåm töông töï. Nhöõng loaïi nöôùc quaû naøy ñöôïc xöû lyù nhieät trong moät thieát bò ñaëc bieät maø trong ñoù caø chua ñöôïc nghieàn tröïc tieáp thaønh caø chua noùng daïng nhaõo. Roõ raøng, quaù trình xöû lyù nhieät taïo ra moät soá caùc höông vò ñaëc tröng cho saûn phaåm caø chua cheá bieán. Trong tröôøng hôïp caùc thaønh phaàn caø chua ñöôïc söû duïng ñeå taïo maøu vaø höông vò, coøn phaàn chính cuûa saûn phaåm laø do caùc thaønh phaàn khaùc, nhö tinh boät taïo neân thì nguyeân lieäu nöôùc eùp phaûi ôû traïng thaùi nguoäi hôn, ñoàng thôøi phaûi coù moät thôøi gian nghæ giöõa hai giai ñoaïn nghieàn eùp vaø xöû lyù nhieät ñeå pectin coù theå bò phaân huûy nhieàu hôn nhôø taùc ñoäng keát hôïp cuûa PG vaø PE. Coøn trong nhöõng traùi caø chua ñöôïc caûi taïo gen ñeå giaûm haøm löôïng PG, phaàn raén vaø ñoä chaéc cuõng nhö ñoä nhôùt cuûa quaû ñöôïc taêng leân. 3.3-Hoaït tính pectinase töø nguoàn VSV gaây nhieãm PG töø naám men vaø PAL töø vi khuaån cuøng vôùi caùc endo-PE ñeàu coù lieân quan ñeán quaù trình laøm chín döa chuoät vaø oâ liu ngaâm trong nöôùc muoái. Söï hao huït veà chaát löôïng naøy coù theå traùnh ñöôïc baèng caùch söû duïng caùc chaát öùc cheá, chaúng haïn nhö caùc polyphenol roø ræ ra töø laù nho vaøo trong nöôùc muoái. Nöôùc muoái coù theå ñöôïc söû duïng ñeå thanh truøng naám moác beàn nhieät Byssochlamys fulva. Naám moác naøy sinh enzyme laøm hoûng daâu taây trong siroâ (syrup) hay möùt. Moät loaïi PG beàn nhieät coù töø loaøi Rhizobium coù theå laøm hoûng keát caáu cuûa thòt quaû mô ñoùng hoäp. Söï nhieãm naám coù theå gaây ra hieän töôïng taùch lôùp cuûa nöôùc cam voâ khuaån vaø ñaõ ñoùng chai, khoâng roõ laø do taùc ñoäng cuûa PE, PG hay caû hai, nhöng moät löôïng lôùn methanol töï do ñöôïc tìm thaáy trong loaïi nöôùc quaû phaân lôùp naøy. PG naám men coù theå phaân huûy pectin trong quaù trình leân men boät taùo nghieàn, laøm cho baõ taùo bò maát ñi moät löôïng lôùn pectin neáu ñöôïc ñem laøm nguyeân lieäu thoâ ñeå saûn xuaát pectin. Leân men caø pheâ vaø cacao laø moät lónh vöïc öùng duïng nhieàu trieån voïng cuûa enzyme pectinase coù töø nguoàn VSV. Trong quaù trình len men, lôùp chaát nhaày xung quanh caùc haït naøy bò phaân huûy nhanh hôn vaø bò röûa khoûi haït tröôùc khi haït ñöôïc saáy khoâ. Moät öùng duïng khaùc laø söï taïo höông ñaëc bieät cho saûn phaåm röôïu do söï hình thaønh caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa naám moác nhieãm vaøo traùi nho chín coù haøm löôïng ñöôøng cao baèng caùch ñaâm thuûng voû traùi nho vaø ñeå nöôùc trong nho bay hôi, vaø ñeå nho bò nhieãm naám. PHAÀN II ÖÙNG DUÏNG CUÛA HEÄ ENZYM PECTINASE I. Tình hình öùng duïng enzym trong coâng nghieäp treân theá giôùi :[I ] Töø khi phaùt hieän ra enzym vaø khaû naêng chuyeån hoùa cuûa enzym loaøi ngöôøi ñaõ taêng nhanh quaù trình saûn xuaát vaø öùng duïng enzym trong coâng nghieäp. Soá löôïng enzym phaùt hieän ngaøy caøng nhieàu vaø soá löôïng enzym ñöôïc öùng duïng vaøo coâng nghieäp cuõng ngaøy caøng nhieàu. Caùc enzym quan troïng, ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong coâng nghieäp ñöôïc trình baøy trong baûng sau: Baûng 2:Möùc ñoä öùng duïng cuûa moät soá enzym quan troïng hieän nay treân theá giôùi Stt  Loaïi enzym  Tyû leä öùng duïng(%)   1 2 3 4  Enzym protease Trypsine Rennet Protease acid Protease trung tính Protease kieàm yeáu Protease kieàm maïnh duøng trong chaát taåy röûa Carbohydrase Pectinase Isomerase Cellulase ( - amylase ( - amylase Lipase Caùc enzym khaùc söû duïng trong y hoïc vaø trong phaân tích  59% 3% 10% 3% 12% 6% 25% 28% 3% 6% 1% 13% 13% 3% 10%   Qua baûng treân ta thaáy caùc enzym thuoäc nhoùm protease hieän ñang ñöôïc öùng duïng nhieàu nhaát. Trong ñoù enzym protease kieàm ñöôïc öùng duïng trong chaát taåy röûa vôùi soá löôïng lôùn nhaát so vôùi caùc loaïi emzym khaùc. Trong soá caùc enzym ñöôïc saûn xuaát vaø öùng duïng treân theá giôùi, caùc nöôùc chaâu AÂu saûn xuaát vaø baùn ra thò tröôøng theá giôùi soá löôïng nhieàu nhaát. Stt  Loaïi enzym  Giaù trò buoân baùn enzym (trieäu USD)   1 2 3 4 5 6  Carbohydrase Protease Lipase Pectinase Nhöõng loaïi enzym ñaëc bieät Caùc loaïi enzym khaùc  83,2 187,2 31,6 41,6 20,8 41,6   Baûng 3:Thò tröôøng enzym chaâu Aâu Rieâng trong coâng ngheä thöùc phaåm, löôïng enzym ñöôïc tieâu thuï nhieàu nhaát. Soá löôïng enzym ñöôïc öùng duïng trong coâng nghieäp thöùc phaåm chuû yeáu ôû caùc nöôùc chaâu Myõ, chaâu AÂu Stt  Lónh vöïc coâng nghieäp vaø enzym  Giaù trò buoân baùn enzym (trieäu USD)  Stt  Lónh vöïc coâng nghieäp vaø enzym  Giaù trò buoân baùn enzym (trieäu USD)   1 2 3  Chuyeån hoaù tinh boät Amylo glucosidase ( - amylase Glucose isomerase Cellulase, hemicellulase Enzym naám sôïi Pullulanase ( - amylase Coâng nghieäp söõa Rennet ñoäng vaät Rennet vi sinh vaät Lipase-esterase Lysozym Röôïu, bia, nöôùc giaûi khaùt Pectinase Papain ( - glucanase Cellualse-hemicellulase ( - amylase Amyloglucosidase Glucose oxidase  140 55 40 20 5 3 1 1 110 75 20 8 6 46 10 8 4 3 – 4 2 – 3 1 – 2 0,5  4 5 6 7  Coàn ( - amylase Amyloglucosidase Pullulanase ( - glucanase Cellulase-hemicellulase Coâng nghieäp baùnh keïo Amylase naám sôïi ( - amylase Protease Cellulase-hemicellulase Thöïc phaåm hoãn hôïp Invertase LipaseBromelin Glucose oxidase Thöùc aên gia suùc ( - glucanase Cellualse-hemicellulase ( - amylase Glucose oxidase Protease vi khuaån  32 15 10 – 12 1 – 2