Ứng dụng của tế bào gốc da trong chữa bỏng

...............................................................................................41 PHỤ LỤC .............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................44 ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 2 MỞ ĐẦU Nhiều năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy tế bào gốc đã có nhiều bước phát triển mạnh mẽ và mang lại kết quả to lớn trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong y sinh học. Một trong những thành tựu đó phải nói đến các ứng dụng của nuôi cấy tế bào da và tế bào gốc để điều trị bỏng. Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu khoa học tìm kiếm các nguồn tế bào gốc tối ưu và khả năng ứng dụng của tế bào gốc trong cuộc sống. Một trong các ứng dụng lớn trong điều trị bỏng là tạo ra các vật liệu sinh học để làm lớp màng che phủ tạm thời hay tạo các màng biểu bì nhân tạo. Các nghiên cứu mới đã góp phần điều trị các tổn thương do bỏng, như trị sẹo cho người bị bỏng, nuôi cấy và cấy ghép tế bào gốc da cho người bị bỏng... Nhờ thành tựu của công nghệ mới, nhiều bệnh nhân đã được cứu sống và góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân bị bỏng. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 3 I. CƠ SỞ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO GỐC 1.1. Lịch sử nghiên cứu Năm 1800: phát hiện rằng một số tế bào có thể tạo ra các tế bào khác Năm 1956: các nhà khoa học trên thế giới đã có những thành công đầu tiên trong nghiên cứu cấy truyền các tế bào xương. Năm 1968: Marvin Karasek thực hiện nuôi và biệt hóa tế bào của da thỏ thành công. Năm 1978, Marvin Karasek đã tìm thấy sự liên quan giữa tế bào sừng và nguyên bào sợi trong quá trình nuôi cấy. Năm 1980, Marvin Karasek đã thành công khi cấy 1cm2 dây rốn, sau một thời gian nuôi cấy đã đạt 3m2 biểu bì. Với những cống hiến của mình và bằng sự kiện trên, ông được xem là ông tổ của kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng. Tháng 11/2007: James Thomson và Junying Yu thuộc đại học Wusconsin – Madison (Mỹ) đã công bố kết quả nghiên cứu tái tạo tế bào da thành tế bào gốc. Từ đó đến nay, tế bào gốc ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học nhất là cấy ghép tế bào gốc da để chữa bỏng. 1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc da hiện nay Trên thế giới đang phát triển công nghệ tạo tế bào mầm từ các tế bào trưởng thành để phục vụ cho nhiều mục đích. Ở Việt Nam hiện đang có 3 ứng dụng lớn của tế bào gốc trong điều trị bỏng và các vết thương mãn tính; trong thẩm mỹ; trong chỉnh hình,… 1.3. Các phương pháp điều trị bỏng hiện nay Các bác sỹ lấy phần da lành của người bỏng để ghép lên nơi bị bỏng, phương pháp này gọi là ghép da tự thân. Dùng da đồng loại như da của người thân bệnh nhân hoặc da dị loại như ếch, trung bì da heo để ghép lên. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 4 Hiện nay, Viện Bỏng đang áp dụng phương pháp nuôi cấy nguyên bào sợi, loại tế bào có tác dụng tái tạo da, để điều trị cho các bệnh nhân bị bỏng nặng. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 5 II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 2.1.Đại cương về da 2.1.1. Giới thiệu Da là một trong các cơ quan lớn nhất và hoạt động nhiều nhất ở cơ thể người. Gồm ba lớp cấu trúc chính là: lớp biểu bì, lớp trung bì, lớp hạ bì, ở da còn có các tổ chức (tuyến tiết, lông, móng, các thụ quan). Đối với người Việt trưởng thành thì diện tích bề mặt da trung bình chiếm khoảng 15 - 17% trọng lượng toàn cơ thể. Da có chiều dày khoảng 0,07 - 2,5mm, dày nhất ở vùng tay, bàn chân là từ 3 - 4 mm và mỏng nhất ở vùng mi mắt 0,3 mm, môi. Da dày mỏng khác nhau được giải thích bởi các tác động của các yếu tố khác nhau của môi trường vào từng vùng riêng rẽ trên cơ thể. Da là cơ quan của hệ bài tiết, được bao bọc quanh cơ thể, che chở cơ thể khỏi các tác nhân không có lợi của môi trường bên ngoài đối với cơ thể, giữ nhiệt độ cơ thể không đổi. Da có chức năng chính trong điều hòa trao đổi chất, cảm nhận nhiệt độ, chức năng cảm giác, tổng hợp vitamin B, D và có vai trò làm đẹp. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 6 2.1.2. Lớp biểu bì Biểu bì là lớp ngoài cùng của da, tiếp xúc trực tiếp với môi trường ngoài. Và là hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể, mỏng và chia thành năm lớp nhỏ: lớp đáy, lớp sợi, lớp hạt, lớp bóng, lớp sừng. Trong biểu bì không có các mạch máu và mạch bạch huyết điển hình. Biểu bì được nuôi dưỡng nhờ cơ chế khuếch tán các chất dinh dưỡng từ mô liên kết qua màng đáy. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 7 Xen giữ các lớp tế bào biểu mô có các đầu mút tận cùng thần kinh trần, không có vỏ bao quanh. Chúng chia nhánh nhỏ chia nhỏ chạy luồn trong các khoảng gian bào và tiếp xúc với các tế bào biểu bì. Một số đấu mút thần kinh cảm giác này khi tiếp xúc với tế bào biệt hóa thành tế bào cảm giác phụ đống vai trò như một thụ thể tiếp xúc cảm giác của da. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 8 a. Lớp đáy Lớp đáy được tại bởi một tế bào khối vuông hay trụ thấp, nằm trên đáy màng, có khả năng phân chia liên tục và di chuyền ra bề mặt để thay thế dần cho các tế bào già bên trong bong ra, đó là các tế bào sừng. Chủ yếu lớp đáy có chứa khoảng 10% là tế bào sừng, 50% các tế bào khác đang ở thời điểm giao thời của sinh trưởng, 40% còn lại là các tế bào ở hậu kỳ của giảm phân. Những tế bào của lớp đáy đó được gắn kết trên màng cơ bản nhờ các phân tử dính fibronectindo nguyên bào sợi của trung kỳ tiết ra. Ngoài ra nằm rải rác trong lớp đáy còn có một số loại tế bào khác: hắc tố bào, tế bào Langerhans và Merkel. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 9 b. Lớp sợi Lớp sợi ở trên lớp đáy, đó là tập hợp của 5 - 20 tầng tế bào đa diện liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối liên bào phân nhánh, chặt chẽ. Các tế bào này tương đối đặc trưng bởi hình đa diện và nhân hình cầu. c. Lớp hạt Lớp hạt bao gồm từ 3 - 5 lớp tế bào đa diện dẹp, ở trên lớp sợi. Các tế bào này chứa nhiều hạt sắc tố và nhân, chúng tự chết theo chu trình để sẵn sàng chuyển thành dạng tế bào sừng hóa. Lớp hạt gồm các tế bào hình thoi, trong tế bào thường có chứa rất nhiều các hạt keratohyalin bắt màu bazơ khá đậm. d. Lớp bóng Lớp bóng nằm phía trên lớp hạt là một lớp mỏng và đã có sự biến đổi sâu sắc về bản chất của các tế bào của lớp. Tế bào trở nên dài hơn, dẹt hơn, nhân và tất cả các bào quan biến mất dần do bị phân giải. Nói chung, chúng đã thoái hóa không còn hình dạng tế bào. e. Lớp sừng Ở trên bề mặt biểu bì, tế bào biến thành những lá sừng mỏng, trong bào tương chứa rất nhiều sừng nhằm ngăn cản sự thoát hơi nước, cách nhiệt và những nhân tố bất lợi khác từ ngoài môi trường xâm nhập vào cơ thể. Sự đổi mới hoàn toàn của lớp biểu bì tính từ khi sản sinh ra một tế bào gốc mới đến khi rụng thành vảy vào khoảng 45 - 75 ngày. Tuy nhiên quá trình này còn phụ thuộc vào môi trường nội tại của mô có thuận lợi hay không bao gồm các tín hiệu tiếp xúc để tế bào sao chép và di chuyển cùng những nhân tố hóa học của các nhân tố tăng trưởng. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 10 f. Các tế bào thuộc lớp biểu bì Tế bào sừng Là những tế bào có nguồn gốc từ ngoại phôi bì và phân bố khắp biểu bì (chiếm 95% tổng số tế bào của lớp biểu bì) và cũng có hoạt động phân bào. Trong quá trình biệt hóa những tế bào này di chuyển lên phía trên thay cho các tế bào phía trên bị bong ra, nhờ đó lớp biểu bì luôn được thay mới. Quá trình di chuyển lên trên của các tế bào thường xảy ra khoảng 25 - 50 ngày. Tế bào melanin Là các tế bào dạng đuôi gai chứa các sắc tố melanin có màu nâu đen được tìm thấy trong da, mắt, tóc. Phân tử melanin được hình thành khi acid amin bị oxy hóa. Chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 2% số tế bào của lớp biểu bì. Tế bào melanin giúp hình thành nên màu sắc da, hấp thu năng lượng UV và bảo vệ da tránh tác hại của tia UV. Tế bào Langerhans ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 11 Có nguồn gốc từ tủy xương, theo máu xâm nhập vào da. Chúng chiếm tỷ lệ 2 - 8% các tế bào biểu bì. Những tế bào này liên quan đến hệ thống miễn dịch của biểu bì. Chúng phát hiện và xử lý, trình diện kháng nguyên lạ xâm nhập vào biểu bì, kích thích gây nên đáp ứng nhu cầu miễn dịch. Tế bào Merkel Là những tế bào thần kinh nội tiết, chiếm một lượng nhỏ khoảng 1% trong lớp đáy biểu bì, liên kết với nhau bằng cầu nối gian bào. Chúng tiếp xúc với đầu cuối dây thần kinh và có chức năng như một thể cảm thụ cơ học. Ngoài ra, còn một số tế bào khác trong biểu bì như: tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu ưa acid, hồng cầu,… Là những loại sẽ xuất hiện và tăng lên trong trường hợp bệnh lý. g. Hình thái điển hình của các tế bào biểu bì Biểu bì có cấu trúc lát tầng được tạo bởi nhiều lớp tế bào, lớp trên cùng có hình dẹt đa diện, đây có thể coi là loại biểu mô bảo vệ điển hình. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 12 Biểu mô trụ tầng có lớp tế bào trên cùng trên hình trụ, loại mô này có ít. Loại biểu mô vuông tầng có lớp tế bào nằm trên cùng có hình vuông, các tế bào này chứa rất nhiều sắc tố. h. Một số cấu trúc đặc biệt của các tế bào biểu bì Do đặc điểm tiếp xúc với bề mặt ngoài, luôn có một mặt tự do, tế bào biểu bì nói chung và tế bào da có một số cấu trúc liên kết đặc biệt, vì thế khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, màng của các tế bào nằm sát nhau, không chứa các khoảng gian bào. Những khoảng gian bào đó (có khi rộng tới 20 - 30mm) thường được lấp đầy bởi glycocalyx có bản chất glycoprotein tạo thành cấu trúc lớp dải bịt. Lớp này có ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 13 vai trò rất quan trọng trong việc gắn kết các tế bào biểu mô với nhau, ngăn chặn sự ngấm của các chất dịch không cần thiết, nhưng lại rất linh động trong quá trình âm bào và miễn dịch tự nhiên cũng như việc lưu chuyển các chất mà cơ thể hay tế bào cần. Vùng dính nằm sát bên dưới dải bịt do lớp bào tương của tế bào tiếp giáp với lớp trong trở nên đặc, kết hợp với các sợi nhỏ tạo thành một vành liên tục quanh tế bào. Thể liên kết dưới kính hiển vi, quan sát thấy chúng được tạo thành hai mảnh đặc biệt đối diện của hai mảng bào tương thuộc hai tế bào nằm cạnh nhau. Tại đó khoảng gian bào rộng ra và chứa một chất có mật độ điện tử thấp. Từ vị trí thể liên kết, các sợi sừng tỏa đều ra các vùng bào tương xung quanh. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 14 Khe liên kết còn gặp ở nhiều loại tế bào khác: cơ trơn, cơ tim, mô thần kinh,... Khoảng gian bào hẹp lại chỉ khoảng 2mm, có những đơn vị kết nối hình ống nối xuyên ngang hai màng tế bào cạnh nhau. Lòng ống cho phép các ion, phân tử có kích thước nhỏ (dưới 1000 Da) di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. Đây chính là synap điện, cơ sở cấu trúc truyền thông tin giữa hai tế bào biểu bì. Khe liên kết Thể liên kết ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 15 Sự phân cực của tế bào được biểu hiện rất rõ ở các tế bào biểu mô: phần bào tương phía trên hoàn toàn khác với phần phía dưới nhân. Sự phân cực này có liên quan mật thiết tới các chức năng của tế bào biểu bì. Mặt tự do của các tế bào biểu bì thường tạo các khía (giống như bàn chải) để tăng diện tích tiếp xúc và giữa các khía là những xơ actin. 2.1.3. Lớp trung bì Trung bì là mô liên kết vững chắc bao gồm các chất nền, các tế bào liên kết, các sợi đàn hồi, nang lông, mạch máu sợi thần kinh và các thụ quan. Bề dày của lớp trung bì phát triển tùy từng vùng, nơi dày nhất có thể lên tới 2mm. Trung bì được chia làm hai lớp tuy nhiên ranh giới không rõ ràng. 2.1.4. Màng cơ bản Là ranh giới chỗ nối giữa trung bì và biểu bì, nếu các tế bào biểu bì bên trên và trung bì bên dưới. Nó có cấu trúc mô xơ liên kết, có chức năng ngăn cản sự thoát các phân tử có trọng lượng phân tử lớn hơn 40 KDa nhưng vẫn cho phép tế bào Langerhans, tế bào Merkel, các tế bào lympho và các hắc tố bào đi qua chúng. Màng cơ bản gồm bốn lớp là: lớp nền của tế bào gốc, lớp lá trong suốt, lớp lá dày và lớp lá dưới. Thành phần của màng cơ bản gồm các chất: kháng nguyên Bullous pemphigoid (là một glyprotein 200.000 Da), Laminin (glyprotein 1x10 Da), Collagen IV và VII. 2.1.5. Sự phân bố mạch và thần kinh Những tiêu động mạch dinh dưỡng cho da đến từ hai đám rối mạch, một khu trí giữa lớp nhú và lớp lưới, đám rối còn lại nằm giữa trung bì và hạ bì. Sự phân bố thần kinh ở da rất đa dạng nhằm tiếp nhận các kích thích của môi trường. Ước tính, mỗi cm da chứa tới 70 cm mạch máu, 55 cm dây thần kinh, 100 tuyến mồ hôi, 15 tuyến nhờn, 230 thụ quan cảm giác và một số tuyến dịch. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 16 Ngoài ra trong lớp da, các đầu mút thần kinh trên đến tiếp xúc với các tế bào biểu mô cũng như các tuyến phụ thuộc da, quanh các nang lông. 2.1.6. Cấu trúc phụ trên da Lông Lông phủ trên toàn bộ cơ thể, chúng có tác dụng như một giác quan phụ, bảo vệ điều hòa thân nhiệt, giúp dể thoát mồ hôi. Lông được phát triển từ các tế bào bị sừng hóa và chiều dài tự nhiên biến động từ vài mm tới hàng mét (tóc), tiết diện từ 0,005 - 0,6 mm tùy theo từng vùng. Cấu tạo chung, lông gồm rễ lông nằm dưới da và được bao bởi bao chân lông. Tại đây, lông phình ra gọi là hành lông, nơi có cơ trơn vận lông bám vào. Phần trên là thân lông và ngọn lông. Trên tiết diện cắt ngang, phần ngoài cùng mỏng bao bọc gọi là màng lông, tiếp ngay đến là vỏ lông, nơi chứa các phân tử sắc tố melanin, trong cùng là tủy lông bị sừng hóa dần từ hành lông tới ngọn lông. Móng Đây là cấu trúc đã hóa sừng của phần thượng bì nằm ở mặt mu của các ngón tay, ngón chân. Chức năng chủ yếu của móng là để bảo vệ ngón. Móng có phần thân lộ ra ngoài và phần rễ ăn sâu trong lớp da. Giữa da và rễ móng có một phần rãnh được gọi là lớp sừng trên móng và một vùng da bị sừng hóa được gọi là lớp sừng dưới móng. Hai bên gờ của móng là lớp sừng quanh móng tiếp xúc với ít da hơn. Quan sát phía trước của lớp sừng trên móng có hình bán nguyệt màu trắng đục, đó là nơi đang trong giai đoạn sừng hóa. Các chấm trắng lốm đốm là sự sừng hóa chưa hoàn toàn. Các tuyến của da Có ba tuyến: ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 17 - Tuyến nhờn: gọi là tuyến bã đổ vào nang tuyến (trừ các khu vực không có lông thì đổ trực tiếp ra da), sản phẩm của tuyến này giúp da luôn có độ ẩm, mềm mại và chống thấm nước nhưng lại thoát hơi nước. - Tuyến mồ hôi: có cấu trúc ống, phần dưới cuộn lại thành búi nằm rất sâu dưới da, phần trên nối ra bề mặt da. Trên toàn bộ diện tích da có khoảng 200 triệu tuyến, mật độ cao nhất ở các lòng bàn tay, bàn chân và hốc nách. Ở phần da môi không có tuyến mồ hôi. Tuyến mồ hôi còn là nơi cư trú chủ yếu của các vi sinh vật sống cộng sinh. Việc tiết mồ hôi liên quan đến điều hòa thân nhiệt. Bình thường mồ hôi tiết liên tục nhưng ít, trung bình một ngày khoảng nửa lít. Khi môi trường nóng bức, hoạt động mạnh, bệnh lý... lượng mồ hôi tiết tăng lên một lượng lớn theo nghiên cứu khoảng 5 - 6 lít một ngày. - Tuyến sữa gồm một đôi tuyến trước ngực, chúng có nguồn gốc biệt hóa từ tuyến mồ hôi. Tuyến này có liên quan mật thiết tới các hoạt động sinh dục của con người. Nó có thể được coi như một bộ phận sinh dục ngoài của cơ thể. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 18 Cơ thể con người được cấu tạo từ tế bào, trong cơ thể có khoảng 100.000 tỷ tế bào với trên 200 loại tế bào khác nhau. Cơ thể con người có khả năng kỳ diệu đó là sự tái tạo, tái sinh của nhiều loại tế bào, mô dạng. Đặc trưng cho khả năng trên là tế bào gốc. 2.2. Tế bào gốc 2.2.1.Khái niệm Tế bào gốc là những tế bào không chuyên biệt hoặc chưa phân hóa trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng sinh lý. Tế bào gốc có khả năng tự làm mới, phân chia không giới hạn, tự khuếch đại và khả năng biệt hóa. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 19 Chúng cấu tạo nên 5 nhóm mô chính trong cơ thể con người, gồm: biểu mô, mô liên kết, máu, mô thần kinh, cơ. Dựa trên góc độ phân chia tế bào (cell division), có 3 nhóm tế bào biệt hoá (types of differentiated cells): - Nhóm một gồm: tế bào lăng kính mắt, tế bào thần kinh, tế bào cơ tim. - Nhóm hai gồm: nguyên bào sợi của da, tế bào cơ trơn, tế bào nội mạc thuộc hệ mạch máu, tế bào biểu mô của đa số các nội tạng như gan, tụy, thận, phổi, tuyến tiền liệt, tuyến vú. - Nhóm ba gồm: các tế bào biểu bì, các tế bào biểu mô ống tiêu hóa. 2.2.2. Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa Tế bào gốc đa năng (totipotent) là: tế bào gốc có khả năng phát triển và phân hóa thành mọi loại tế bào khác, phụ thuộc vào điều kiện phát triển của tế bào và ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Tế bào gốc toàn năng gồm: các hợp tử sau khi thụ tinh, một số tế bào phôi sớm ở động vật và nhiều loại tế bào thực vật. Tế bào gốc toàn năng có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 20 Tế bào gốc đa năng (pluripotent, multipotential): thế hệ kế tiếp được tạo thành từ tế bào gốc toàn năng. Tế bào gốc đa năng có thể biệt hóa và phát triển thành nhiều loại tế bào khác ngoài tế bào toàn năng (totipotent). Tế bào gốc đa năng là những tế bào gốc biệt hóa thành hầu hết các mô trong cơ thể, các tế bào gốc đa năng thu nhận từ phôi sớm, gọi là tế bào gốc pluripoten. Tế bào gốc đa năng thu nhận từ tế bào trưởng thành được gọi là tế bào gốc multipotent. Tế bào gốc đơn năng đơn hướng (unipotent): đây là những tế bào gốc có thể sinh ra một loại tế bào. Tế gốc biệt hóa hình thành hai hay nhiều loại tế bào cùng nhóm gọi là tế bào gốc đơn năng đa hướng (oligopotent) như: tế bào gốc biểu mô biệt hóa hình thành vài loại tế bào biểu mô khác nhau. 2.2.3. Phân loại tế bào gốc dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc Dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc từ các mô, cơ quan của cơ thể có thể chia thành nhiều loại tế bào gốc khác nhau như: Tế bào gốc phôi thu nhận từ các nút phôi ở giai đoạn đầu phát triển phôi. Tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ các mô hoặc cơ quan trong cơ thể trưởng thành. Tế bào gốc trưởng thành có thể tự đổi mới hoặc biệt hóa thành các loại tế bào khác. Tế bào gốc da có thể thu nhận từ tế bào gốc trưởng thành. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 21 2.3. Biệt hóa tế bào Biệt hóa tế bào gốc: là quá trình biến đổi từ tế bào gốc không có chức năng chuyên biệt thành tế bào chuyên hóa. Khả năng biệt hóa của các loại tế bào gốc phụ thuộc vào bản chất của tế bào gốc, tác động của các yếu tố thông tin đến tế bào và điều kiện phát triển của tế bào. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 22 Soma Mầm phôi Tế bào gốc người Thai nhi Trẻ sơ sinh Phôi thai Người lớn Ruột Tuyến tụy Mắt Thần kinh Gan Biểu bì Hemopoietic Trung mô ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 23 2.3. Cơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu bì Da là hàng rào chắc chắn đầu tiên bảo vệ cơ thể khỏi mất nước, ngăn chặn các tổn thương và sự xâm nhiễm. Để đáp ứng những yêu cầu này, da đã có một quá trình biệt hóa khá phức tạp, làm cho da trở lên dai chắc, không thấm nước và luôn tự đổi mới. Tế bào sừng đóng một vai trò khá quan trọng trong quá trình này.Và biệt hóa là quá trình đóng vai trò chủ chốt trong quá trình tự đổi mới của da. Ở lớp đáy các tế bào sừng gốc đi vào một chu trình biệt hóa được gọi là chu trình biệt hóa cuối cùng để tạo thành các tế bào chết hóa sừng, hình thành một lớp màng sừng bảo vệ cơ thể. 2.3.1. Cơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu bì ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 24 Vị trí của các tế bào sừng trong quá trình biệt hóa ở biểu bì: Như đã biết ở trên, biểu bì gồm 5 lớp. Các tế bào gốc và các tế bào sừng có khả năng tăng sinh rất mạnh chỉ có trong lớp sâu nhất của biểu bì (là lớp đáy). Các tế bào gốc bám chặt vào màng nền. Cho đến khi các tế bào ở lớp đáy nhiều lên, một số tế bào bắt đầu di chuyển khỏi lớp này lên bề mặt da. Và chúng mất một khoảng thời gian là 25 - 50 ngày. Sự thay đổi đầu tiên là các tế bào ở lớp đáy ngừng sản xuất chất sừng 5 - 14 ngày sau khi tách khỏi màng nền. Sự chuyển đổi trong biểu hiện gen xuất hiện khi tế bào sừng từ lớp hạt đi lên lớp sợi và chúng bắt đầu tổng hợp protein filaggrin và loicrin. Các tế bào sừng khi ở trong lớp sợi cuối cùng suy yếu đi và hoạt hóa gen transglutaminase ở biểu bì, chúng xúc tác các liên kết chéo của protein màng cho tới khi các tế bào sừng ở lớp sợi chết đi, thì các vảy hay bộ xương tế bào chứa đầy chất sừng do chúng để lại và protein liên kết. Xác của các tế bào chết tạo thành một mảng bảo vệ ở lớp sừng, sau đó màng tạo thành các lớp vảy và dễ bị tróc ra. 2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng a. Ảnh hưởng của môi trường đến biệt hóa tế bào Các chất dinh dưỡng , chất độc, áp suất, nhiệt độ,... ảnh hưởng rõ rệt đến biệt hóa tế bào động vật. Ví dụ, nuôi cấy các tế bào gốc phôi (ES) chuột ở các môi trường có chất dinh dưỡng, nồng độ CO2, và nhiệt độ khác nhau, có thể tạo nên các loại tế bào khác nhau. Trong nuôi cấy mô thực vật,điều kiện chất dinh dưỡng và môi trường quyết định quá trinh tạo calus… Khả năng biệt hóa và tái sinh của da, phụ thuộc vào nồng độ một loại protein đặc hiệu. b.Tác động của tín hiệu tế bào đến quá trình biệt hóa ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 25 Biệt hóa tế bào có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển của mọi sinh vật, từ hợp tử đến cơ thể trưởng thành. Trong quá trình biệt hóa hình thành các mô và hệ cơ quan của cơ thể, mỗi lớp tế bào của phôi sớm có các quá trình biệt hóa khác nhau, chịu ảnh hưởng của nhiều loại tác nhân môi trường. Mọi tế bào có khả năng tiếp nhận và xử lý nhiều loại thông tin từ môi trường như hàm lượng các chất dinh dưỡng, hàm lượng oxy, nhiệt độ, áp suất… Trong quá trình biệt hóa của nhiều loại tế bào khác nhau, tín hiệu tế bào giữ vai trò vô cùng quan trọng. Từ một loại tế bào gốc đa năng hình thành nên nhiều loại tế bào gốc khác nhau nhờ tác động của các loại tín hiệu tế bào (signal) khác nhau. Tế bào trả lời tín hiệu bằng nhiều con đường khác nhau như ức chế hay hoạt hóa gen, thay đổi bề mặt tế bào, thay đổi hoạt hóa enzyme,... Mỗi loại tế bào đều có cơ chế tiếp nhận tín hiệu, truyền tín hiệu và trả lời tín hiệu khác nhau, làm cho từ một loại tế bào gốc có thể biệt hóa các loại tế bào khác nhau. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 26 Quá trình biệt hóa của tế bào gốc tạo da phụ thuộc vào sự tác động và điều chỉnh của hàng loạt tín hiệu tế bào. Các tín hiệu tế bào khác nhau tác động vào tế bào gốc tạo da dẫn đến các quá trình biệt hóa khác nhau, hình thành các loại tế bào khác nhau. c. Vai trò của gen trong quá trình biệt hóa Biệt hóa tế bào là quá trình tất yếu trong quá trình phát sinh và phát triển của mỗi cơ thể sống. Biệt hóa tế bào giúp một hợp tử sau thụ tinh phân hóa thành nhiều lớp tế bào phôi, từ đó biệt hóa thành nhiều loại mô, cơ quan trong mỗi cơ thể. Trong quá trình biệt hóa của mỗi loại tế bào, vai trò của các gen biệt hóa có ý nghĩa quyết định. Cơ chế tác động của từng loại gen đến quá trình biệt hóa của nhiều loại tế bào khác nhau còn chưa được nghiên cứu đầy đủ. d. Cơ chế biệt hóa tế bào còn chịu một số ảnh hưởng của Hormone, các yếu tố tăng trưởng và vai trò của ion Ca2+ - Khi tế bào sừng được nuôi cấy tên môi trường không có huyết thanh được bổ sung Hormone như insulin và protein EGF. EGF là protein được sản xuất từ tá tràng và tuyến nước bọt, DGF có thể thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và kích thích sự tăng trưởng mới ở da cũng như ở bề mặt ruột và màng sừng. Trên màng của tế bào sừng người chứa receptor của insulin, trong suốt sự phát triển của tế bào receptor ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 27 làm tăng khả năng tăng sinh của tế bào. Hydrocorticone và các hormon khác cũng ảnh hưởng đến kích thước quần thể tế bào, nếu thiếu kích thước của quần thể bị ảnh hưởng. - Ion canxi (Ca2+) ảnh hưởng tới sự biệt hóa và tăng trưởng của thế bào sừng, muốn điều chỉnh quá trình tăng sinh và phân tầng của tế bào sừng ta có thể thay đổi nồng độ ion Ca2+ ngoại bào trong nuôi cấy mô invitro. Đây có thể coi là sự điều chỉnh sinh lý bình thường như trong cấu trúc biểu bì, có sự chênh lệch nồng độ ion Ca2+ rõ ràng giữa những tế bào của lớp đáy so với những tế bào ở lớp trên. Nồng độ ion Ca2+ thấp thúc đẩy sự tăng sinh, nồng độ cao làm giảm sự biệt hóa của tế bào sừng. Trong nuôi cấy invitro, lượng tế bào tăng nhanh khi nồng độ Ca2+ khoảng 0,03 – 0,1mM. Trong môi trường DMEM, lượng tế bào tăng khi nồng độ Ca2+ khoảng 0,03 – 0,1mM. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 28 III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ TRIỂN VỌNG Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh học đã điều trị được rất nhiều bệnh nguy hiểm (ví dụ như chữa trị các bệnh liên quan đến tim mạch, thần kinh, ung thư, bỏng,…). 3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hàng loạt kỹ thuật tiên tiến trong điều trị bỏng như ghép da (ghép da sớm, ghép da đồng loại, ghép da mảnh siêu nhỏ,…), siêu lọc máu liên tục, kỹ thuật nano, nuôi cấy nguyên bào sợi, nuôi cấy nguyên bào sừng, nuôi cấy tế bào gốc, sử dụng vạt da siêu mỏng có nối mạch vi phẫu,... 3.1.1. Việc nuôi cấy nguyên bào sợi, nguyên bào sừng biểu bì được thực hiện từ năm đầu thế kỷ XX, với việc sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau. Dưới đây là một số môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào sừng - Môi trường có huyết thanh: Huyết thanh động vật thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như một nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển. Trong môi trường nuôi cấy, huyết thanh hoạt động như một chất đệm pH; cung cấp hormon và các nhân tố tăng trưởng; protein; chất dinh dưỡng; chất ức chế các protease;…cần cho sự tăng trưởng và duy trì chức năng cho tế bào sau này. Nồng độ huyết thanh thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào sừng là 5%, 10%, 20%. Tuy nhiên, huyết thanh không không phải là nguyên liệu tốt nhất để tạo nên một môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng và biểu hiện chức năng của tế bào. Do ta không thể xác định được nguồn gốc tự nhiên của huyết thanh; huyết thanh lại rất dễ bị biến đổi thành phần và dễ bị nhiễm các tác nhân vi nấm, virus,…; một vài nhân tố trong huyết thanh (như HDL, LDL,…) không bền khi bảo quản lâu dài ở nhiệt độ thấp. Mặt khác huyết thanh còn kích thích sự biệt hóa của những tế bào ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 29 tiến tới trạng thái không phân bào nguyên nhiễm làm cho những tế bào này không duy trì như một dòng tế bào bất tử [25]. - Feeder nguyên bào sợi: Phương pháp này đầu tiên được mô tả bởi Rheinwald và Green (1975), dựa trên sự nuôi cấy đồng thời tế bào sừng với nguyên bào bị chiếu xạ. Nguyên bào sợi chuột của dòng tế bào 3T3 lấy từ khối u của chuột nhắt bị chiếu xạ liều cao. Nguyên bào sợi chuột được nuôi trong môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) có nồng độ glucose cao, bổ sung 10% FBS, Penicillin - Streptomycin (100 UI/ml – 100 µg/ml), dung dịch đệm Bicarbonate sodium 1N với một lượng phù hợp tế bào được chiếu xạ (mục đích để các tế bào này không tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giúp cho sự tăng trưởng của tế bào sừng). Khi những tế bào này tạo được 50% mật độ trong đĩa nuôi cấy thì được sử dụng như một giá thể trực tiếp cho cho việc nuôi cấy tế bào sừng. Môi trường nuôi cấy tế bào sừng là hỗn hợp giữa môi trường D’MEM (có nồng độ glucose cao) và môi trường Ham’s F12 (có bổ sung 10% FBS) với tỷ lệ là 3:1. Với tiến bộ kỹ thuật mô hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều loại màng nhân tạo, bán nhân tạo bằng collagen, polymer,…để sử dụng như một lớp nâng đỡ, tạo điều kiện tốt cho sự tăng trưởng cho tế bào sừng[18]. - Môi trường không huyết thanh: Môi trường nuôi cấy không sử dụng huyết thanh và các lớp nâng đỡ đã khắc phục được một số hạn chế của việc nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường có huyết thanh hay lớp nâng đỡ. Mặt khác, do sự thay đổi về cả chất lượng lẫn số lượng các thành phần cơ bản (như các acid amin, vitamin, nguyên tố đa và vi lượng,…) nên cần phải bổ sung vào môi trường các thành phần khác (như EGF, insulin, transferrin, hydrocortisone, dịch trích tuyến yên bò BFE). ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 30 Tuy nhiên môi trường nuôi cấy này có những hạn chế như: số lượng lần cấy chuyển sau khi nuôi sơ cấp trong môi trường này ít hơn so với môi trường có bổ sung huyết thanh, việc bổ sung các chất cần cho sự tăng sinh của tế bào (như BPE,…) cũng gặp khó khăn (như nguồn cung cấp hiếm, dễ bị nhiễm khuẩn, giá thành cao và đặt biệt là không xác định được nguồn gốc ). Hiện nay trên thị trường có nhiều môi trường nuôi cấy chuyên biệt tế bào sừng không bổ sung huyết thanh như môi trường MCDB 151, MCDB 153, MCDB 154, Epilife,… Trong đó, môi trường Epilife là môi trường cơ bản để nuôi cấy tế bào sừng và những tế bào biểu bì khác. Trong môi trường Epilife, tế bào sừng tăng sinh mạnh, khoảng thời gian sống dài và có thể tạo được 45 – 60 thế hệ [19]. 3.1.2. Công nghệ sử dụng tế bào gốc Hiện nay, các sản phẩm thay thế da có chứa tế bào gốc không chỉ tạm thời ngăn chặn sự mất nước của cơ thể và nhiễm trùng do vi khuẩn, mà còn đạt được hiệu quả sửa chữa đạt yêu cầu. Giúp tối ưu quá trình chữa lành vết thương do bỏng cũng như các yêu cầu. Trị liệu tế bào gốc có thể nâng cao chất lượng chữa lành vết thương bỏng, làm giảm sự hình thành các vết sẹo và thiết lập lại chức năng bình thường của da và phần phụ của nó. Các nguồn chính của các tế bào gốc có thể được sử dụng để sửa chữa và tái sinh cho các tế bào da bị tổn thương là những tế bào gốc phôi (ESCs) và các tế bào gốc trưởng thành. Trong năm 2007, Yamanaka và các đồng nghiệp sản xuất thành công tế bào gốc toàn năng từ nguyên bào sợi da người lớn, các tế bào soma của người khác và có những đặc điểm tương tự như ESCs. Khuyến khích việc sử dụng tế bào gốc trưởng thành, các tế bào gốc trung mô đặc biệt (MSC) đang được hiện thực hóa trong điều trị bỏng. MSC có thể được phân lập từ tủy xương và các mô khác, chẳng ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 31 hạn như mô mỡ, máu dây rốn và tế bào da. Các tế bào gốc từ máu dây rốn có thể biệt hóa thành keratinocytes, tế bào gốc-mỡ (ADSCs) có thể thúc đẩy sự phát triển nguyên bào sợi da và tái biểu mô của vết thương da[1]. Hiện nay, có một số phương pháp để sử dụng tế bào gốc, bao gồm cả tiêm treo tế bào ( tấm di động hoặc da mô thiết kế. 3.1.3. Theo nghiên cứu mới nhất của các nhà khoa học thuộc Trung tâm điều trị bỏng, Đại học quốc gia Utah (Mỹ) vừa hoàn thành thí nghiệm liệu pháp điều trị phun tế bào gốc vào vị trí vết thương cục bộ của bệnh nhân. Liệu pháp điều trị trên được tạo ra bằng cách kết hợp giữa tiểu cầu không có khả năng làm đông máu ở bệnh nhân bỏng với tế bào gốc chứa canxi và thrombin. Thí nghiệm cho thấy ngoài việc điều trị vết bỏng cục bộ, liệu pháp trên còn có thể giúp cải thiện quá trình làm lành da được cấy ghép. Liệu pháp điều trị phun tế bào gốc vào vết bỏng cục bộ của bệnh nhân không những điều trị hiệu quả vết bỏng cục bộ, mà còn có ý nghĩa quan trọng ứng dụng trong các loại hình phẫu thuật cấy ghép khác[2]. 3.1.4. Phương pháp trị liệu tế bào gốc có là một phương pháp tối ưu trong điều trị bỏng hay không? Mặt khác, sự bất ổn định trong điều kiện và môi trường nuôi cấy dẫn đến sự suy thoái về cấu trúc và các mô. Cơ chế điều khiển quá trình lão hóa tế bào gốc vẫn là một bí ẩn lớn đối với các nhà khoa học. Hiện nay còn rất nhiều vấn đề cần phải giải quyết trước khi tế bào gốc được áp dụng rộng rãi trong thực tế. 3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong việc điều trị bỏng diện rộng phổ biến hiện nay đang được áp dụng ở nhiều bệnh viện trong cả nước là kỹ thuật sử dụng nguồn da ghép tự thân nhưng rất hạn chế, thì phương pháp trị liệu tế bào là một giải pháp khả thi. Ở một vài bệnh viện chuyên khoa bỏng đang áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi và cấy ghép ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 32 nguyên bào sợi, tế bào sừng,… trong điều trị tổn thương do bỏng (Viện bỏng Quốc gia Việt Nam). 3.2.1. Công nghệ nuôi cấy tế bào da hiện nay Các tế bào da (tế bào sừng, nguyên bào sợi …) sau khi được tách từ mẫu da sẽ được đưa vào môi trường nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy, sau một thời gian (khác nhau tùy từng loại tế bào) từ một số tế bào ban đầu, các tế bào sẽ phát triển, nhân lên và liên kết với nhau để tạo nên các “màng” tế bào nuôi cấy. Do sự liên kết giữa các tế bào rất mong manh, dễ vỡ, dễ đứt rách, hơn nữa việc đưa các màng tế bào này để ghép lên nền vết bỏng rất khó khăn, nên tỉ lệ thành công khi ghép các màng nuôi cấy trên lâm sàng thường không cao. Các màng này rất dễ bị tiêu hủy do nhiễm khuẩn và chất lượng liền sẹo cũng hạn chế. Mặt khác việc phối hợp giữa nuôi cấy và lâm sàng cũng nhiều bất cập (ví dụ khi tế bào da có thể ghép được thì vết thương lại chưa đủ điều kiện để ghép, và ngược lại khi vết thương đủ điều kiện để ghép thì các tế bào chưa đủ tuổi hay mật độ cần thiết hoặc đã quá già để ghép). Để khắc phục những nhược điểm trên hiện nay đã có những thay đổi lớn trong công nghệ nuôi cấy tế bào da, đó là việc tìm ra các giá đỡ để cho tế bào phát triển, nhân lên trên đó trong quá trình nuôi cấy. Thay vì chỉ nuôi cấy các tế bào trong môi trường nuôi cấy, trên đĩa nuôi cấy đơn thuần thì người ta cấy các tế bào trên một loại màng nền như một giá đỡ cho tế bào. Các giá đỡ này phải đảm bảo là có thể sử dụng để đắp lên vết thương và cho phép các tế bào phát triển bình thường trên đó. Khi mật độ và tuổi của tế bào phù hợp ghép, người ta đưa cả tấm giá đỡ này cùng với các tế bào trên đó để ghép lên vết thương, vết bỏng. Nhờ phát minh này cùng với việc sử dụng các màng sinh học, các vật liệu che phủ vết thương tạm thời để chuẩn bị nền ghép mà tỉ lệ thành công và giá thành điều trị đã có những bước đột phá. Các giá đỡ được sử dụng là các màng collagen, một số màng tổng hợp, bán tổng hợp sử dụng trong điều trị vết thương… ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 33 Các nhà khoa học đã thành công trong công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi da đồng loại để điều trị vết thương, vết bỏng. Bằng việc sử dụng tấm TegadermR (một loại điều trị vết thương thông thường) để làm giá đỡ cho tế bào đã tạo ra các tấm nguyên bào sợi nuôi cấy có chất lượng tương đương sản phẩm tương tự của các trung tâm trên thế giới nhưng giá thành chỉ thấp bằng 1/4. Một bước tiến trong công nghệ nuôi cấy, đó là công nghệ nuôi cấy tế bào sừng da tự thân để điều trị bỏng nặng và các trường hợp chấn thương mất da lớn. Không chỉ có các bước tiến trong công nghệ nuôi cấy, việc sử dụng các sản phẩm nuôi cấy cũng có nhiều thay đổi. Thay vì sử dụng đơn thuần các màng nguyên bào sợi, tế bào sừng nuôi cấy ghép lên vết thương thì ngày nay người ta đã kết hợp việc nuôi cấy tế bào sừng để tạo lớp biểu bì lên chất nền trung bì là lớp nguyên bào sợi nuôi cấy – đó là công nghệ da nhân tạo do kết hợp lớp biểu bì nuôi cấy với một màng collagen, màng silicon hay một loại màng tổng hợp khác. 3.2.2. Công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi trong điều trị bỏng Nguyên bào sợi được phóng đại 400 lần. Nguyên bào sợi là loại tế bào của trung bì được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy điều trị vết thương, vết bỏng. Vì tính sinh miễn dịch thải ghép thấp cho nên có thể sử dụng nguyên bào sợi da đồng loại. Tác dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy là thúc đẩy thời gian liền vết thương bỏng nông (do nó cung cấp một số yếu tố tăng trưởng như TGF-b, PDGF, KGF). Trên vết bỏng sâu, nó có tác dụng làm liền ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 34 vết bỏng hẹp, cải thiện chất lượng nền ghép cho việc ghép da hay ghép tế bào sừng nuôi cấy, cải thiện chất lượng liền sẹo,…(do nguyên bào sợi tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hóa và cung cấp các sợi laminin, elastin, fibronetin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hóa che phủ vết thương) Kỹ thuật nuôi cấy nguyên bào sợi gồm các bước chính sau: Bước 1: Chọn, sàng lọc người cho mẫu da Mẫu da được lấy ở những người tình nguyện, mạnh khỏe không mắc các bệnh lây nhiễm qua đường máu và các bệnh mạn tính khác. Người càng trẻ càng tốt. Những người cho mẫu da đều được xét nghiệm toàn bộ để loại trừ các bệnh lý nói trên. Bước 2: Lấy mẫu da và bảo quản mẫu da Vùng dự kiến lấy mẫu da được vệ sinh sạch sẽ, sát trùng trước khi lấy. Mẫu da lấy có toàn lớp biểu bì, trung bì, hạ bì, kích thước khoảng 1 - 1,5cm2, thường lấy ở trong đùi sát nếp bẹn. Sau khi lấy mẫu da được bảo quản trong ống nghiệm chứa 5ml dung dịch DMEM (Dulbecos Modiffied Eage Media) chứa 1% kháng sinh, bảo quản ở 40C trong vòng 8h, sau đó chuyển mẫu da về labô nuôi cấy. Bước 3: Xử lý mẫu da Các mẫu da được cắt lọc hết mỡ sau đó ngâm vào cồn 70% thể tích trong vòng 30 giây, lấy ra rửa sạch 3 lần bằng PBS rồi cắt nhỏ thành các mẩu da kích thước 0,1mm. Bước 4: Cấy mẫu da Các mẫu da được cấy trong chai nuôi cấy với mật độ một mẩu da 0,1mm cho diện tích 2,5cm2. Cho môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi vào chai rồi đặt vào tủ ấm 370C với 95% thể tích khí trời và 5% thể tích CO2. Tiến hành bổ sung môi trường nuôi cấy sau 24h và sau 48h tiếp theo. Thay môi trường sau 4 ngày, theo ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 35 dõi tế bào mọc và di cư ra khỏi mẫu da. Khi nguyên bào sợi phát triển và nhân lên đạt > 50% diện tích che phủ đáy chai nuôi cấy thì tiến hành tách tế bào. Bước 5: Tách nguyên bào sợi Lấy bỏ mẫu da và rửa tế bào PBS (phosphate Buffered Salines), thêm dung dịch có 0,05% trypsin và 0,35mM EDTA trong PBS rồi đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 370 trong 5 phút. Sau đó kiểm tra mức độ tế bào tách khỏi đáy chai, khi các tế bào co tròn thì cho thêm môi trường nuôi cấy vào và lấy hỗn dịch nuôi cấy đó tiến hành ly tâm với tốc độ 1200v/phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu lấy tế bào. Các tế bào này được đưa vào chai nuôi cấy với mật độ 5 × 103 tế bào/cm2. Bước 6: Nhân rộng nguyên bào sợi Sau một thời gian các tế bào nhân lên trong đĩa nuôi cấy sẽ được cấy chuyển sang các chai khác với mật độ 5000 tế bào/cm2, quy trình cấy chuyển cần theo dõi chặt chẽ tình trạng ô nhiễm, mật độ tế bào, pH môi trường. Các tế bào nuôi cấy và nhân rộng trong môi trường nuôi cấy và đặt trong tủ ấm CO2, cần thay môi trường nuôi cấy cho tế bào sau 3 - 4 ngày. Bước 7: Thu hoạch nguyên bào sợi Lựa chọn thế hệ tế bào từ P5-P10, các tế bào đó phải sống và phát triển bình thường. Kiểm tra vi khuẩn và nấm trước khi thu hoạch. Tiến hành thu tế bào từ chai nuôi cấy bằng cách dùng trypsin và ly tâm. Bước 8: Chuẩn bị giá đỡ tế bào Giá đỡ tế bào có thể là collagen, các màng sinh học hay tổng hợp. Tại viện bỏng sử dụng tấm vật liệu điều trị vết thương là TegadermR. Giá đỡ được cắt tròn có diện tích đĩa nuôi cấy (75cm2) khử trùng giá đỡ và đặt vào đĩa nuôi cấy, sau đó cho môi trường nuôi cấy vào sao cho láng ngập đều giá đỡ. Bước 9: Cấy tế bào lên giá đỡ ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 36 Đếm tế bào và tính mật độ tế bào rồi dàn đều hỗn dịch tế bào vừa thu được lên giá đỡ đã chuẩn bị. Đặt đĩa nuôi cấy có giá đỡ và tế bào vào tủ nuôi cấy 370C có 5% CO2 trong khoảng 1h rồi bổ sung môi trường nuôi cấy cho đủ 5ml. Bước 10: Theo dõi và đánh giá tấm tế bào nuôi cấy Các nguyên bào sợi sẽ nhân lên và phát triển trên giá đỡ trong môi trường nuôi cấy. Theo dõi mật độ tế bào đủ lớn và không có tình trạng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm thì tiến hành ghép tấm tế bào nuôi cấy đó lên vết thương, vết bỏng đã được chuẩn bị. Thông thường thời gian từ khi lấy mẫu da đến khi có thể ghép tấm nguyên bào sợi nuôi cấy lên vết bỏng khoảng 2 tuần[7]. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 37 3.2.3. Công nghệ nuôi cấy tế bào sừng da tự thân trong điều trị bỏng Tế bào sừng cũng là loại tế bào được sử dụng nhiều trong điều trị vết thương, vết bỏng sâu diện rộng (do thiếu nguồn da ghép tự thân) và phục vụ nhiều nghiên cứu khác. Tế bào sừng là tế bào thuộc biểu bì có tính sinh miễn dịch thải ghép cho nên phải sử dụng tế bào của da tự thân. Hiện nay, có thể thu nhận tế bào sừng từ nhiều nguồn tế bào khác nhau (ví dụ từ mảnh da, vùng tế bào ở chân lông, vùng phồng của nang lông,…). Kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng biểu bì (một số bước có thể thay đổi tùy thuộc vào phương pháp và môi trường nuôi tế bào sừng): Bước 1: Chọn, sàng lọc người cho mẫu da Bước 2: Lấy mẫu da và bảo quản mẫu da Bước 3: Xử lý mẫu da Bước 4: Tách biểu bì đơn Một một bệnh nhân được điều trị bằng ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 38 Một số phương pháp phổ biến tách biểu bì ra khỏi trung bì và thu tế bào biểu bì đơn: + Mẫu sinh thiết da khoảng 5cm2 rửa trong dung dịch muối và ủ bằng Dispase ở 370C trong 30 – 40 phút, sau đó chuyển biểu bì vào dung dịch Trypsin và ủ ở 370C trong 10 phút [9]. + Mẫu da đặt trong dung dịch Dipase, ủ ở 2 – 80C trong 18h. Tách biểu bì ra khỏi trung bì cho vào ống ly tâm chứa 2 ml Trypsin-EDTA (0,25% - 0,02 mM) ủ ở 370C trong 10 - 12 phút. + Ủ mẫu da trong dung dịch Trypsin – EDTA (0,25% - 0,02%) tỷ lệ 1:4 ở 40C trong khoảng 16 – 20h [10]. Bước 5: Nhân rộng tế bào sừng biểu bì. Bằng cách nuôi tế bào sừng trong môi trường. Ban đầu môi trường được sử dụng để nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp tế bào sừng trên lớp nâng đỡ nguyên bào sợi có bổ sung huyết thanh động vật. Trong hệ thống này, tế bào sừng có thể được cấy chuyển cho đến khi chúng được 20 - 50 thế hệ [4]. Tuy nhiên, hiện nay đã có những cải tiến để khắc phục một số hạn chế của các môi trường nuôi cấy đã sử dụng trước đó, như sử dụng môi trường nuôi cấy không huyết thanh hoặc có bổ sung nhân tố từ thực vật. Ngoài ra có thể còn một số bước khác tùy thuộc vào môi trường nuôi tế bào sừng, như: chuẩn bị lớp nâng đỡ nguyên bào sợi, cấy tế bào lên lớp nâng đỡ (hay giá đỡ), theo dõi và đánh giá tấm tế bào nuôi cấy. Công nghệ nuôi cấy tế bào sừng khá phức tạp, một trong những ứng dụng quan trọng của nó là góp phần điều trị để cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện tích lớn thiếu nguồn da ghép tự thân. Tuy nhiên, trước đây các tế bào biểu mô được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh, cần có chi phí rất cao, quy trình nuôi cấy phức tạp. Vì thế, các bác sĩ Viện bỏng Quốc gia đã thử nghiệm phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào sừng ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 39 trong môi trường không huyết thanh với mục tiêu tạo tấm tế bào sừng tự thân nuôi cấy để điều trị bỏng. Đây là biện pháp đơn giản, rẻ tiền hơn rất nhiều so với phương pháp khác. 3.2.4. Sử dụng tế bào gốc trong công nghệ nuôi cấy tế bào ứng dụng trong điều trị bỏng Tế bào gốc (stem cell) đã được nhắc đến nhiều trong những năm gần đây. Công nghệ tế bào gốc ngày càng có nhiều ứng dụng trong y học, như tạo ra được các vật liệu che phủ, vật liệu thay thế da khi da bị tổn thương lớn. Việc sử dụng tế bào gốc từ dây rốn trẻ sơ sinh (bản quyền của PGS.TS. Phan Toàn Thắng và cộng sự - Đại học quốc gia Singapore, là người đầu tiên trên thế giới tìm ra công nghệ tách tế bào gốc từ cuống dây rốn) đã mở ra một triển vọng to lớn về ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào. Khác với các tế bào đã nói ở trên là những tế bào đã biệt hóa cao, tế bào gốc (mầm) dây rốn trẻ sơ sinh là những tế bào biệt hóa thấp, khả năng sinh sản phát triển mạnh, thời gian nuôi cấy nhanh, có thể chủ động trong việc thu nhận sản phẩm ở nhiều giai đoạn, nhiều thời kỳ khác nhau. Do đó khả năng thành công sẽ cao hơn khi áp dụng trên lâm sàng. Từ các tế bào gốc dây rốn trẻ sơ sinh người ta có thể tạo ra các sản phẩm để điều trị vết bỏng (tế bào sừng, nguyên bào sợi),… Hiện nay, Viện bỏng quốc gia đang hợp tác với PGS.TS Nguyễn Toàn Thắng và các đồng nghiệp Singapore để triển khai kỹ thuật này. 3.3. Triển vọng ứng dụng của tế bào gốc Hiện nay trên thế giới đang có nhiều công trình nghiên cứu về tìm kiếm, tạo ra tế bào gốc từ các nguồn tế bào tối ưu và khả năng ứng dụng của tế bào gốc trong điều trị và thẩm mỹ. Liệu pháp điều trị tế bào gốc là một công cụ hấp dẫn trị liệu để điều trị nhiều bệnh nan y trong tương lai. Ở Việt Nam, hiện đã có 4 ngân hàng tế bào gốc được thành lập thuộc các đơn vị: Bệnh viện Quân y 103, Công ty cổ phần Mekophar, Công ty cổ phần Ngọc ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 40 Tâm, Bệnh viện Truyền máu và Huyết học TP. Hồ Chí Minh. Ngân hàng tế bào gốc MekoStem mới được thành lập và là ngân hàng đầu tiên trên thế giới lưu trữ hai loại tế bào gốc cùng một lúc, đó là tế bào gốc từ máu và màng dây rốn. Ngân hàng cung cấp các dịch vụ về thu thập, phân tích, xử lý tách tế bào, bảo quản các loại tế bào gốc từ máu và màng dây rốn cho cộng đồng và cá nhân. Tiềm năng phát triển công nghệ tế bào gốc rất lớn. Hy vọng trong những năm sắp tới công nghệ tế bào gốc được ứng dụng phổ biến hơn nữa. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 41 KẾT LUẬN Thu nhận được nguyên bảo sợi, tế bào sừng, tế bào gốc da từ tế bào da. Việc ứng dụng công nghệ tế bào gốc trong điều trị bỏng cho tỷ lệ thành công cao. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 42 PHỤ LỤC [1] [2] [3] Hồ Thị Thanh Hồng (2005), Tách và nuôi biểu bì da quy đầu người, Khóa luận tốt nghiệp – Đại học Khoa học Tự nhiên. [4] Nguyễn Phan Xuân Lý (2006), Thiết lập quy trình nuôi nguyên bào sợi từ da quy đầu người, Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. [5] Phan Kim Ngọc (2002), Giáo trình thực tập cơ sở Công nghệ sinh học động vật. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [6] Đỗ Lưu Hoài Niệm (2003), Thiết lập quy trình tách và nuôi cấy tế bào da người, Khóa luận cử nhân khoa học – Đại học Khoa học Tự nhiên. [9] Abd el-A iz Hanafy A.Ahmad, M.D., Mostafa Hemieda, M.D.; Hassan A Badran, M.D.; F.R.C.S and Ikram I.Seif, MD – Culture allogenic keratinocyte grafts in the treatment of burn: Preliminary Report – The Department of Plastic and Reconstructive surgery, Faculty of medicine, Ain Shams University. [10] Bruce Wilson – DDW – Epidermal Grow Facture Enemas for Left – Side Ulcerative Colitis – ATLANTA, GA – May 21, 2001. [11] Alfredo Gragnani; Jeffrey R. Morgan; Lydia Masako Ferreira (2001) Experimental model of culture kerratinocyte – Animals of Burns and Fire Disaster – vol.XIV – n.2 – USA and Brazil. [18] Mr Jerry G Johnson – Essentials of human anatomy and physiology, Chapter 6 – Skin and the integmentary. [19] Taylor JR, Lockwood AP, Taylor AJ – The prepuce: specialized mucosa of the penis and its loss to circumcision – British Journal of Urology (1996), 77, 291 – 295. [20] National Organization of Circumcision – Information Resource Centers. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 43 [25] Hume WJ. Keratinocyte proliferative hierarchies confer protective mechanisms in surface epithelia. Br J Dermatol. 1985; 112 : 493 – 502. [PubMed] [31] Morris RJ, Fischer SM, Slaga TJ. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 1986; 46 : 3061 – 3066. [PubMed]. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. PGS.TS. Khuất Hữu Thanh. 2008. Sinh học tế bào. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 2. Tạp chí hoạt động khoa học Một số trang web: