Ứng dụng hplc ghép đầu dò điện hóa và diode array (hplc-Ecd-dad) để xác định hệ số hấp thu phân tử và định lượng anthocyanin trong dịch trích thực vật

y ra hệ số góc (phụ lục bảng 5). y = 31.891x + 32.895 R2 = 0.9933 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 [cat] x104 (M) Diện tích ECD (mV.min) Bảng 5: Đồ thị biểu diễn nồng độ catechol theo diện tích ECD Hệ số góc ECD =  × n × Vtiêm × F  hệ số góc = 3,19 105 53 Với n = 2; Vtiêm = 10uL; F = 96500.   = 0.165  Xác định hệ số  Hệ số  chính là tốc độ dòng chuyển qua một thể tích của chất, được xác định bằng phương pháp HPLC/UV-Vis. Ta có: Diện tích peak UV=     l  [catechol]  hệ số góc =     l   Trong đó giá trị  được xác định bằng cách dùng máy quang phổ đo chất chuẩn catechol với nồng độ xác định ở  = 266nm với cuvet bề dày 1cm. Theo định luật Lamber- Beer: A =   l  [catechol] Với catechol nồng độ 0.483mM hòa tan trong hệ dung môi HCOOH 5% + MeOH tỉ lệ 80:20, độ hấp thu đạt được A = 1.2347   = 2556,4 (L/mol.cm) Chuẩn bị các nồng độ catechol tăng dần và đo trên sắc ký lỏng đầu dò UV, ta thu được các diện tích peak tăng dần, từ phương trình hồi quy có thể suy ra hệ số góc (phụ lục bảng 6). y = 0.3074x + 1.044 R2 = 0.9997 0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 200 [Cat] x 105 (M) Diện tích UV (mAu) Bảng 6: Đồ thị biểu diễn nồng độ catechol theo diện tích UV 54  hệ số góc =     l = 30740   = 12,02. 7.1.2 Xác định  và  theo chất chuẩn là cyanidin-3-glu: Về lý thuyết, hệ số  và  của máy là giống nhau dù khảo sát trên bất kì chất chuẩn nào, để kiểm tra lại, chúng tôi tiến hành trên chất chuẩn cyanidin-3-glu (phụ lục bảng 7):  Xác định : y = 2.8059x 0 5 10 15 20 2 3 4 5 6 7 8 [ c y a - 3 - gl u ] x 10 ^ 5 ( m/ L ) A r e a EC D Bảng 7: Đồ thị nồng độ of cyanidin-3-glu theo diện tích ECD. Hệ số góc ECD = 280590 =  × n × Vtiêm × F → = 0.15  Xác định : y = 1.3344x 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 4 5 6 7 8 [cya-3-glu] x10^5(m/L) Area UV (mAu) 55 Bảng 8: Đồ thị nồng độ cyanidin-3-glu theo diện tích UV. Diện tích peak UV =     l  [cat]  hệ số góc =     l = 133440 Giá trị  của cyanidin-3-glu ở nồng độ 2.1210-5 M trong hòa tan trong hệ dung môi HCOOH 5% + MeOH tỉ lệ 80:20 được tính theo định luật Lamber-Beer đo ở  = 520nm trong cuvet bề dày 1cm với A = 0.28296 là 13400 (L/mol.cm). Đầu dò UV có flow cell chứa mẫu bề dày 10mm = 1cm nên ta có l = 1cm.   = 10.0 7.1.3 So sánh các giá trị ,  được xác định từ 2 chất chuẩn catechol và cyanidin-3-glu với đơn vị diện tích peak UV là mAu: Catechol Cyanidin-3-glu   12.12 0.165 10.00 0.15 Nhận xét:  Giá trị  xác định theo 2 chất chuẩn hầu như không sai khác nhau. Vì catechol được xem là một polyphenol chuẩn đặc trưng, có số điện tử trao đổi trên bề mặt điện cực được xác định là n = 2, do đó chúng tôi chọn giá trị  = 0.165 cho các tính toán về sau.  Giá trị  tính theo thực nghiệm giữa 2 chất chuẩn khá khác nhau, do đó chúng tôi dùng phương pháp vi phân toán học để tính: 310 10 10 0.010 1 / 1 / tiemV L mL phut f mL phut mL phut      Nếu đổi đơn vị diện tích peak (Au) sang mAu thì  = 10.00 56 → Giá trị  tính theo phương pháp toán học gần với giá trị tính được từ chất chuẩn cya-3-glu nên chúng tôi chọn  = 10 cho các tính toán về sau. 7.2 KHẢO SÁT THẾ ÁP TỐI ƯU CỦA CÁC POLYPHENOL: Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu khoảng thế áp tối ưu của anthocyanin và các polyphenol có cấu trúc giống với vòng B của chúng trên sắc ký lỏng HPLC/UV-Vis/ECD để đảm bảo các chất tham gia phản ứng điện cực được oxi hóa hoàn toàn và đạt được diện tích ECD tối ưu (phụ lục bảng 10). Để khảo sát, chúng tôi chọn quét thế trên đầu dò ECD từ 150mV tới 1000mV đối với các chất chuẩn: catechol, propyl galate, 3-methoxy catechol, guaiacol, 2,6-dimethoxy phenol, cyanidin-3-glu, delphinidin-3-glu, petunidin-3-glu, peonidin-3-glu, malvidin-3-glu, pelargonidin-3-glu (hình 22). 57 Hình 22: Công thức các anthocyanin chuẩn và polyphenol ứng với vòng B của chúng Dưới đây là các đồ thị biểu diễn thế quét theo nồng độ các chất chuẩn khảo sát: cat echo l 4 .6 4 x10 - 4 ( M ) 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 1200 E( mV) Ar e a ECD ( mV. mi n) 58 cyanidin-3-glu 6.816x10-5 (M) 0 10 20 30 40 0 200 400 600 800 1000 E ( mV) Ar e a ECD ( mV. mi n) Malvidin-3-glu 2.363x10-5 M 0 10 20 30 40 50 60 0 200 400 600 800 1000 E(mV) Area ECD (mV.min) Pelagonidin-3-glu 7.02x10-4 M 0 100 200 300 400 500 600 0 200 400 600 800 1000 E ( mV) Ar e a ( ECD) 59 Delphinidin-3-glu 3.732x10-5 M -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 200 400 600 800 1000 E (mV) Area ECD (mV.min) Petunidin-3-glu 4.144x10-5 M -5.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 0 200 400 600 800 1000 E ( mV ) A r ea EC D ( mV .min) Peonidin-3-glu 3.07 x10-5 M 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 200 400 600 800 1000 E ( mV ) A rea EC D ( mV .min) 60 3-methoxi catechol 0.721mM 0 100 200 300 400 500 600 0 200 400 600 800 1000 1200 E (mV) Area ECD (mV.min) Guaiacol 2.82mM -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 200 400 600 800 1000 1200 E (mV) Area ECD (mV.min) 2-6 dimethoxy phenol 0.408mM 0 50 100 150 200 0 500 1000 1500 E (mV) Area ECD (mV.min) 61 Propyl galate 0.764mM -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 200 400 600 800 1000 1200 E (mV) Area ECD (mV.min) Hình 23: Đồ thị biểu diễn thế quét theo nồng độ các chất chuẩn. Nhận xét: Đối với các chất chuẩn khảo sát, khi áp thế lớn hơn 700mV, nước sẽ bị oxi hóa; từ 400mV đến 700mV là khoảng thế tối ưu để chất phân tích hoạt động điện cực. Để đảm bảo cho các chất được oxi hóa hoàn toàn ta chọn thế áp 600mV cho tất cả các thí nghiệm về sau. 7.3 XÁC ĐỊNH SỐ ĐIỆN TỬ TRAO ĐỔI n: 7.3.1 PHƯƠNG PHÁP HPLC/ECD 7.3.1.1 Xác định chính xác nồng độ các polyphenol chuẩn: Vì các anthocyanin rất dễ hấp thu nước trong quá trình bảo quản nên không thể dùng khối lượng cân để tính nồng độ của chúng mà phải dựa vào định luật Lamber - Beer để xác định nồng độ thực tế của chúng trong mẫu chuẩn. Phương pháp tiến hành như sau: cân một lượng chính xác mẫu chuẩn, từ khối lượng phân tử của chúng, ta sẽ tính được nồng độ mol/l. Đo mật độ quang của dung dịch này, dựa vào giá trị  chuẩn để tính nồng độ thực của chúng trong mẫu cân theo công thức: do thuc chuan AC l  Với chiều dài cuvet l = 1cm 62 đo (nm) Polyphenol Khối lượng phân tử g/mol chuẩn C1 cân (M) A Cthực1 (M) Cthực 2 dùng trong thí nghiệm (M) 510 Cya-3-glu 449,24 23861 5.34x10-5 0.8035 3.37x10-5 6.8210-5 520 Del-3-glu 465,38 22913 10.32x10-5 0.8552 3.73x10-5 3.7310-5 515 Pela-3-glu 433,24 23862 2.8810-5 0.6489 2.72x10-5 7.0210-4 515 Mal-3-glu 493,43 23128 9.41x10-5 0.5465 2.36x10-5 2.3710-5 520 Petu-3-glu 479,27 24000 6.56x10-5 0.9701 4.04x10-5 4.0410-5 510 Peo-3-glu 463,27 24000 7.01x10-5 0.7273 3.03x10-5 3.0310-5 277 Catechol 110,12 2359 2.8110-4 0.6632 2.8110-4 4.7310-4 276 Propyl gallate 212,20 10983 3.6310-5 0.3992 3.63x10-5 7.6410-4 270 2,6-dimethoxyphenol 154,16 969.7 4.5810-4 0.4443 4.5810-4 4.0810-4 270 3-methoxy cathechol 140,23 679 2.8610-4 0.1946 2.8610-4 7.2310-4 278 Guaiacol 124,14 2154 9.1610-5 0.1973 9.16E-05 2.8210-3 Bảng 5: Nồng độ thực của các anthocyanin trong mẫu cân 7.3.1.2 Xác định n bằng phương pháp HPLC/ECD (đường cong thủy động lực học_ hydrodynamic curve) Khi đã biết khoảng thế áp tối ưu của mỗi polyphenol, ta dễ dàng suy ra được diện tích peak ECD tối ưu, từ đó suy ra số điện tử trao đổi của mỗi chất. Chất chuẩn catechol với 2 nhóm -OH sẽ có n = 2, ứng với nồng độ Ccatechol theo đầu dò ECD sẽ cho diện tích peak tương ứng. Như vậy, một polyphenol bất kỳ đã biết trước nồng độ Cx, đầu dò ECD cũng cho diện tích peak tương ứng, từ đó ta có thể suy ra: 2 2 catechol catechol catechol catechol x x x x x x catechol x catechol x dientichECD n C C dientichECD n C n C dientichECD Cn dientichECD C        Từ nồng độ chính xác của polyphenol, dựa vào kết quả khảo sát thế tối ưu ở mục 7.2, thu được diện tích ECD ở 600mV. Như đã biết, catechol có khả năng trao đổi 2 điện tử nên n = 2 từ đó tính được n của các polyphenol còn lại dựa vào công thức: 63  Diện tích peak ECDcatechol = F    Vtiêm C  ncatechol  Diện tích peak ECDpolyphenol = F    Vtiêm  C  npolyphenol Chia 2 phương trình cho nhau:  2polyphenol catecholpolyphenol catechol polyphenol DientichECD C n DientichECD C   Hình 24: Cấu trúc chung của anthocyanin (trái) từ số 1 đến 6 và của polyphenol (phải) từ số 7 đến 10 STT Chất Vị trí 1 2 3 X Nồng độ mol/L Diệntích ECD n 1 Cya-3-glu OH OH H H 6.82x10-5 21.23 1.51 2 Mal-3-glu OCH3 OH OCH3 H 2.36x10-5 24.19 4.97 3 Pela-3-glu H OH H H 7.02x10-4 335.75 2.32 4 Del-3-glu OH OH OH H 3.73x10-5 21.03 2.73 5 Petu-3-glu OCH3 OH OH H 4.14x10-5 16.67 1.95 6 Peo-3-glu OCH3 OH H H 3.07x10-5 17.20 2.71 7 3-methoxy catechol OCH3 OH OH H 7.21x10 -4 140.51 0.94 8 Guaiacol OCH3 OH H H 2.82x10-3 502.22 0.86 9 2,6-dimethoxy phenol OCH3 OH OCH3 H 4.08x10 -4 81.36 0.97 10 Propyl gallate OH OH OH COOC3H7 7.64x10-4 155.81 0.99 Bảng 10: Giá trị n của các polyphenol được xác định bằng phương pháp đường cong thủy động lực học Từ bảng 10, ta nhận thấy với những chất có cấu trúc tương đương nhau, số điện tử trao đổi n không hề bằng nhau như dự kiến. Chẳng hạn cấu trúc vòng B của các cặp chất sau tương đương nhau nhưng có n khác nhau: 64  Cya-3-glu (n = 1.5)  catechol (n = 2)  Mal-3-glu (n = 4.9)  2,6-dimethoxyphenol (n = 0.97)  Pela-3-glu (n = 2.3)  phenol (n = 1)  Del-3-glu (n = 2.7)  propyl galate (n = 0.99)  Petu-3-glu (n = 1.95)  3-methoxy catechol (n = 0.94)  Peo-3-glu (n = 2.7)  Guaiacol (n = 0.86) Nhận xét: Như vậy việc xác định n bằng cách tiêm chất qua HPLC/ECD cho kết quả sai lệch nhiều so với giả thiết, điều này có thể được giải thích là do các chất chưa đủ thời gian tiếp xúc với bề mặt điện cực. Vì các chất khảo sát có hoạt tính điện hóa nên chúng tôi sử dụng phương pháp thứ hai là vol-ampe để xác định số electron trao đổi của chúng với mong muốn xác định được đúng số electron trao đổi trên bề mặt điện cực. 7.3.2 PHƯƠNG PHÁP ĐƯỜNG DÒNG THẾ (CHRONOAMPEROMETRY) Đây là một phương pháp điện hóa mà thế của điện cực làm việc biến đổi, dòng sinh ra trên bề mặt điện cực là một hàm số theo thời gian. Giống như kỹ thuật xung, phương pháp đường dòng thế tạo ra dòng tụ cao mà trong trường hợp này sẽ giảm theo hàm mũ với thời gian. Để có thể đo dòng faraday (là dòng ứng với nồng độ của chất) cần tích hợp dòng ở khoảng 80% của mỗi lần quét. Bảng 11 dưới đây là kết quả xác định n của các polyphenol bằng phương pháp đường dòng thế, vì quá trình khảo sát polyphenol ở các nồng độ khác nhau, để dễ so sánh các giá trị cường độ dòng của từng chất (i2), ta tính 2 [ ] trungbinhii polyphenol  . Việc khuếch đại dòng là rất cần thiết trong trường hợp hệ số khuếch đại  dòng peak (A) bé hơn 500A, còn khi peak khử bị mất phần đỉnh, cần giảm hệ số khuếch đại. Thường với dòng Cottrell luôn được bão hòa ở các khoảng thời gian ngắn nên cần lập lại thí nghiệm ở hệ số khuếch đại bé hơn (chọn hệ số khuếch đại = 10) để có thể thu được hoàn toàn khoảng thời gian từ 1ms đến 1000ms. 65 Đồ thị đường cong biểu diễn cường độ i tuân theo phương trình Cottrel trong đó dòng i giảm theo 1 t theo phương trình: 1/2 o transient n D F A ci cT      , đặt X = 1/2 on D F A c      = itransient  cT , do đó trong bảng biểu diễn giá trị i2  cT (phụ lục 11) Với Tc: thời gian khảo sát riêng từng chất. A: diện tích bề mặt điện cực. F: hằng số Faraday = 96500. D: hệ số khuếch tán bề mặt. Như đã biết số điện tử trao đổi của catechol n = 2, nên số điện tử của polyphenol được tính theo công thức: 2( ) 2( ) 2polyphenolpolyphenol catechol i n i   Do cường độ đo được của mỗi polyphenol tùy thuộc vào nồng độ đo nên ta cần giản lược giá trị cường độ itb cho nồng độ của polyphenol đó: 2 [ ] trungbinhii polyphenol  Catechol Propyl gallate 2,6- Dimethoxy phenol 3- Methoxy cathechol Guai acol Cya-3- glu Del-3- glu Mal-3- glu Pel-3- glu i tb (A) 64.33 56.69 65.00 68.81 14.65 14.78 13.72 55.71 65.853 i2 53.61 54.38 51.33 68.81 14.30 64.27 72.23 118.53 334.28 n 2.00 2.03 1.92 2.57 0.53 2.40 2.70 4.42 12.47 Bảng 11: Giá trị n của các polyphenol được xác định bằng phương pháp đường dòng thế. Nhận xét: Việc xác định số điện tử trao đổi của các polyphenol có cấu trúc tương đương với vòng B của cyanidin-3-glu bằng phương pháp đường dòng thế cũng không cho kết quả giống với giả thiết ban đầu. 66 Như vậy, kết quả nghiên cứu số điện tử trao đổi n của các polyphenol theo 2 phương pháp điện hóa ở trên đều khác với giả thiết, vì phản ứng điện hóa là một quá trình phức tạp nên cần phải có nhiều nghiên cứu khác thích hợp hơn mới hiểu rõ được. Vì thời gian thực hiện đề tài tại trường Đại học Roskidle (Đan Mạch) có hạn nên chúng tôi chưa khảo sát được mức độ bị oxi hóa của các polyphenol. Tuy nhiên chúng tôi sử dụng thêm một phương pháp xác định n bằng cách kết hợp 2 diện tích peak theo đầu dò UV và ECD như sau: 7.3.3 PHƯƠNG PHÁP KẾT HỢP 2 DIỆN TÍCH PEAK UV VÀ ECD:  Diện tích peak ECD =  × nx × Vtiêm × F × [polyphenol]  Diện tích peak UV =     l  [polyphenol] Chia 2 công thức trên cho nhau: → ECDx tiem UV l Dientichn V F Dientich          Quy theo số điện tử trao đổi của catechol thì ' 2 2 4.38 x x catechol n nn n     Polyphenol Diện tích UV Diện tích ECD  nx n' Cya-3-glu 7.50 21.23 23861 4.37 2.00 Del-3-glu 11.34 21.03 22913 2.75 1.26 Mal-3-glu 99.22 335.75 23862 5.23 2.39 Pela-3-glu 10.90 24.19 23128 3.33 1.52 Peo-3-glu 9.28 16.67 23128 2.69 1.23 Petu-3-glu 7.83 9.86 23128 1.89 0.86 Catechol 6.66 191.00 2359 4.38 2.00 Propyl gallate 35.78 155.81 10983 3.10 1.41 2,6-dimethoxyphenol 1.26 80.62 970 4.03 1.84 3-methoxy cathechol 2.03 140.53 679 3.04 1.39 Guaiacol 27.25 110.06 2154 0.56 0.26 Bảng 12: Số điện tử trao đổi của các polyphenol được xác định theo phương pháp đo diện tích peak đầu dò ECD và UV. 67 7.3.4 TÓM TẮT CÁC GIÁ TRỊ n XÁC ĐỊNH THEO 3 PHƯƠNG PHÁP: Số điện tử trao đổi n Polyphenol Phương pháp HPLC/ECD Phương pháp vol-ampe Phương pháp HPLC/UV/ECD Cya-3-glu 1.51 2.39 2.00 Del-3-glu 2.72 2.69 1.26 Mal-3-glu 4.97 4.42 2.39 Pela-3-glu 2.32 12.47 1.52 Peo-3-glu 2.71 √ 1.23 Petu-3-glu 1.95 √ 0.86 Catechol 2.00 2.00 2.00 Propyl gallate 0.99 2.03 1.41 2,6-dimethoxyphenol 0.97 1.92 1.84 3-methoxy cathechol 0.94 2.57 1.39 Guaiacol 0.86 0.53 0.26 Bảng 13: Tóm tắt các giá trị n từ các phương pháp Nhận xét: Giá trị n trao đổi được xác định theo 3 phương pháp trên không giống nhau. Nếu giả thiết số electron trao đổi của cyanidin-3-glu (có vòng B giống với catechol) là n = 2 thì theo phương pháp HPLC/ECD giá trị n tính được < 2. Điều này có thể giải thích là do thời gian phản ứng trên bề mặt điện cực quá ngắn nên phản ứng chưa xảy ra hoàn toàn. Còn theo phương pháp vol-ampe, các giá trị n xác định được gần như lớn hơn theo giả thiết (trường hợp cya-3-glu), chúng tôi vẫn chưa có cách lý giải về kết quả xác định theo phương pháp này. Khi kết hợp 2 đầu dò HPLC/UV/ECD thì thấy n của cya-3-glu giống như dự đoán vì có 2 nhóm OH ở vòng B như cấu trúc catechol, còn các chất khác chúng tôi vẫn chưa biết kết quả thu được có đủ độ tin cậy không. Rất ít các tài liệu đề cập tới các giá trị n và việc xác định cũng khó khăn. Tuy nhiên chúng tôi chọn cách xác định n theo phương pháp HPLC/UV/ECD cho các thí nghiệm về sau. 68 Nếu có điều kiện tiến hành thực nghiệm, chúng tôi sẽ nghiên cứu thêm về mức độ trao đổi điện tử trên bề mặt điện cực của các polyphenol bằng cách tiêm trực tiếp chất khảo sát vào đầu dò ECD mà không cần qua cột và quan sát sắc ký đồ của mũi polyphenol so với mũi sản phẩm đã bị oxi hóa, từ đó việc xác định số electron trao đổi sẽ chính xác hơn. 7.4 XÁC ĐỊNH HỆ SỐ HẤP THU PHÂN TỬ CỦA CYA-3-GLU. Hệ số hấp thu phân tử có thể được xác định bằng nhiều cách, chấp nhận giá trị  của công ty Norweigan là chuẩn để so sánh kết quả theo 2 phương pháp xác định sau: phương pháp quang phổ kế và phương pháp HPLC kết hợp đầu dò UV/Vis và đầu dò ECD. Ở 2 phương pháp này, cya-3-glu được chuẩn bị trong dung môi HCOOH 5% và dung môi MeOH với tỉ lệ tương ứng 80:20. 7.4.1 Phương pháp dùng máy quang phổ: Áp dụng định luật Lamber-Beer để xác định  ở bước sóng  = 512nm. A =   l  C  A l C    Cya-3-glu (M) Mật độ quang A  5.29x10-5 0.8305 15701 2.64x10-5 0.4148 15685 8.46x10-5 1.2422 14678 7.4.2 Phương pháp kết hợp diện tích peak UV và ECD trên máy Dionex Đo ở bước sóng  = 512nm, áp dụng công thức sau để tính : tiemF n VDientichUV DientichECD l        Với Vtiêm = 10uL,  = 10,  = 0.165, F = 96500, l = 1cm, do cyanidin-3-glu có vòng B giống với catechol nên n = 2. Nồng độ Cya-3-glu (M) Diện tích UV Diện tích ECD  69 1.05x10-4 20.14 27.39 23415 8.46x10-5 16.19 22.01 23424 Trong đó hệ số hấp thu mol của cyanidin-3-glu chuẩn của công ty Norgwegian là 23861. Nhận xét: Ta thấy phương pháp HPLC kết hợp 2 đầu dò UV và ECD cho kết quả  gần với giá trị chuẩn hơn phương pháp chỉ sử dụng quang phổ kế. Sở dĩ có sự khác biệt giá trị  ở phương pháp đo quang so với giá trị chuẩn là do anthocyanin rất dễ hấp thụ nước, làm cho khối lượng anthocyanin tăng dẫn đến  nhỏ hơn so với thực tế, điều này cho thấy ưu điểm của việc kết hợp 2 đầu dò UV-vis và ECD trong phương pháp HPLC để xác định giá trị . 7.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ CHẤT CỦA CÁC MẪU CAO BẰNG LC/MS/MS. Mẫu dịch trích được tiêm qua HPLC sẽ xuất hiện nhiều mũi. Vì tính chất phức tạp của việc xác định cấu trúc nên chúng tôi chỉ chọn xác định cấu trúc của những mũi có hàm lượng lớn. 7.5.1 Xác định cấu trúc các chất từ cao MeOH của cây Hydrophila Polysperma. 70 Hình 25: Sắc ký đồ HPLC-UV của cao MeOH cây Hygrophilia Polysperma. Rt (min) Ion mẹ M+ (m/z) Các mảnh ion ở lần bắn phá MS2 (m/z)a Bước sóng hấp thu cực đại (nm) 12.38 595.1 287.3; 449.1 279; 516 Ta thấy trên phổ đồ chỉ xuất hiện một mũi có diện tích lớn ở Rt = 12.38 phút, từ máy LC-UV-ECD cho ta phổ hấp thu của mũi này ở 279nm và 516nm. Mũi này khi dùng He bắn phá có ion mẹ (m/z = 595.1), ion mẹ tạo ra ion con (m/z = 449), ion bị mất có khối lượng 595.1 – 449.1 = 146.0. Đường rhamnose và cumarol có cùng khối lượng m/z = 146.0, bởi vì phổ hấp thu của đường cumarol ở bước sóng 314nm mà Hygrophilia polysperma không có khoảng hấp thu này, nên khối lượng 146 mất đi chính là đường ramhnoze C6H12O5 (có m/z=164 nhưng bị mất 1 phân tử nước nên 164 – 18=146). Bắn phá tiếp m/z = 449.1 thu được m/z = 287.3, đây chính là phần aglycon. Mũi có m/z = 287.3 này được xác định tương ứng là cấu trúc của cyanidin, lượng mất đi 449.1 – 287.3 = 161.8 chính là đường hexose (phụ lục 12). C:\Users\SONY\Desktop\Hygrophila 5/20/2009 3:25:37 PM RT: 0.00 - 69.98 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 55000 60000 65000 uA U 32.72 64.47 50.2828.58 49.322.53 54.92 57.1710.40 11.40 34.62 44.65 NL: 6.82E4 Spectrum M aximum nm=500.0- 540.0 PDA Hygrophila RT: 0.00 - 69.99 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R el at iv e Ab un da nc e 1.66 52.9345.04 54.2930.85 43.3241.6935.285.44 20.21 54.91 58.3728.12 6.58 61.15 7.72 19.36 13.07 68.37 NL: 2.59E8 m/z= 400.0-800.0 F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] M S Hygrophila Hygrophila #1900-2003 RT: 31.65-33.37 AV: 104 NL: 2.16E4 microAU 200 300 400 500 600 700 800 wavelength (nm) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab so rb an ce 279.0 516.0 244.0 438.0 391.0 592.0 641.0 681.0 Hygrophila #1456-1567 RT: 31.66-33.89 AV: 72 NL: 1.83E5 F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] 400 600 800 1000 1200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 595.1 287.3 517.4 354.4 471.5 753.0602.3 823.5 873.4 926.5 1074.8 1177.9 Hình 26: Phổ MS và UV của cao MeOH cây Hygrophilia polysperma. Sau khi phân tích phổ MS, chúng tôi đề nghị cấu trúc của mũi có Rt = 12.38 phút là: 71 O+ OH OH O O HO OH OH O O OH HO CH3OH HO OH B A C 1 2 3 45 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' Tên thường: 3-O-(6’-O-rhamnopyranosid)-β-glucopyranosidcyanidin. 7.5.2 Xác định cấu trúc các chất từ cao MeOH của cây Oxalis Natans Hình 27: Sắc ký đồ LC-UV của cao MeOH cây Oxalis Natans. Thứ tự các mũi oxalis Rt (phút) Ion mẹ M+ (m/z) Các mảnh ion ở lần bắn phá MS2 (m/z)a Bước sóng hấp thu cực đại (nm) 1 24.45 801.1 639.1, 493.1, 331.3 526, 275 2 37.77 887.1 725.1, 331.3, 493.1 529, 275 Giải thích: 72 Ta thấy trên phổ đồ UV-ECD xuất hiện hai mũi có diện tích lớn ở Rt = 12.49 và Rt = 17.01 phút. Từ máy LC-UV-ECD cho ta phổ hấp thu của mũi này ở 275nm và 526nm. Mũi 1: Ion mẹ có m/z = 801.1, khi He bắn phá vào ion mẹ tạo ra ion con m/z = 639.1, ion bị mất có khối lượng 801.1 – 639.1 = 162.0 chính là đường hexose. Bắn phá tiếp m/z = 493.1 thu được m/z = 331.3 chính là aglycon malvidin, lượng mất đi 493.1 – 331.3 = 161.8 chính là đường hexose (phụ lục 14). Mũi 2: ion mẹ có m/z = 887.1, khi bắn phá tạo ra ion con 725.1 lượng mất đi 887.1 – 725.1=162.0 là đường hexose. Bắn phá tiếp 725.1 được ion 493.1 lượng mất đi là 725.1 – 493.1 = 232.0 có công thức chung là C9H14O8 (m/z=250) khi mất nước thì khối lượng C9H14O8 còn lại 250 – 18 = 232 (gồm đường hexose mất nước khi kết hợp với malonyl = 162 – 18 = 144 + ion malonyl C3H3O3 = 87), bắn ion 493 tạo ion 331.3 chính là ion aglycon malvidin, lượng mất đi 493.1 - 331.3 = 161.8 là đường hexose (phụ lục 15). E:\LC-MS_denmark\OR_090619223043 6/19/2009 10:30:43 PM RT: 0.00 - 69.99 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) 0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000 700000000 800000000 900000000 In te ns ity 23.70 23.20 49.03 3.05 55.02 55.6326.06 59.9221.99 36.6326.70 37.2021.46 60.89 37.7229.38 46.087.42 20.6115.178.82 69.83 NL: 9.55E8 TIC F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] M S OR_090619223 043 RT: 0.00 - 69.98 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min) 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 120000 uA U 23.70 48.85 1.78 54.95 37.03 26.235.40 53.6043.7218.83 56.5332.306.67 NL: 1.29E5 To tal Scan PDA OR_090619 223043 OR_090619223043 #1334-1486 RT: 22.22-24.75 AV: 153 NL: 3.69E5 microAU 200 300 400 500 600 700 800 wavelength (nm) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bs or ba nc e 526.0 275.0 247.0 343.0 647.0 675.0 794.0 OR_090619223043 #1018-1153 RT: 22.55-24.75 AV: 45 NL: 2.42E7 F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] 400 600 800 1000 1200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 801.1 331.3 639.1 841.3493.0 899.5 1037.0308.7 450.5 714.2 1151.7 Hình 28: Phổ MS và UV peak 1 của cao MeOH cây Oxalis Natans. 73 E:\LC-MS_denmark\OR_090619223043 6/19/2009 10:30:43 PM RT: 0.00 - 69.99 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) 0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000 700000000 800000000 900000000 In te ns ity 23.70 23.20 49.03 3.05 55.02 55.6326.06 59.9221.99 36.6326.70 37.2021.46 60.89 37.7229.38 46.087.42 20.6115.178.82 69.83 NL: 9.55E8 TIC F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] M S OR_090619223 043 RT: 0.00 - 69.98 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min) 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 uA U 23.70 48.85 37.03 26.23 55.2043.73 50.372.08 19.35 57.2033.58 61.683.50 NL: 5.39E5 nm=500.0- 550.0 PDA OR_090619 223043 OR_090619223043 #2181-2258 RT: 36.33-37.62 AV: 78 NL: 8.43E4 microAU 200 300 400 500 600 700 800 wavelength (nm) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab so rb an ce 529.0 275.0 245.0 344.0 611.0 OR_090619223043 #1346-1417 RT: 28.07-29.63 AV: 45 NL: 1.12E5 F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] 400 600 800 1000 1200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 308.9 887.1 517.3 340.5 471.4 372.3 439.8 588.3 615.5 829.3802.2 920.9 975.9 1127.7 Hình 29: Phổ MS và UV peak 2 của cao MeOH cây Oxalis Natans. Sau khi phân tích phổ MS, chúng tôi đề nghị cấu trúc của mũi có Rt = 23.7 và Rt = 37.03 phút là: Cấu trúc mũi 1: Tên thường: 3-O-[(6’-O-rhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β- glucopyranosidmalvidin. A C B Rhamsnose Glucose 3 5 6' Glucose ion malvidin O O O+ OCH3 OH OCH3HO O OO HO HO OH HO HO OH OH O H3C HO OH OH 1 2 4 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 74 Cấu trúc mũi 2: O O O+ OCH3 OH OCH3HO O O O HO HO OH HO HO OH OH O H3C O OH OHOH O O A C B Rhamnose malonyl ion Glucose 6' 3 5 1 2 4 6 7 8 1' 2 ' 3' 4' 5' 1'' 2'' 4'' 5'' 3'' Tên thường: 3-O-[6’-O-(4’’-O-malonylrhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β- glucopyranosidmalvidin 7.5.3 Xác định cấu trúc các chất từ cao MeOH của cây Lobelia Cardinalis Hình 30: Sắc ký đồ LC-UV của cao MeOH cây Lobelia Cardinalis. 75 Rt (phút) Ion mẹ M+ (m/z) Các mảnh ion ở lần bắn phá MS2 (m/z)a Các mảnh ion ở lần bắn phá MS3 (m/z)a Bước sóng hấp thu cực đại (nm) 48.7 903.1 741.1, 449.1, 287.1 595.3, 579, 287.3 522, 280 C:\Xcalibur\data\Lobelia_20_5_abSCX 5/20/2009 2:06:09 PM RT: 0.00 - 69.98 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min) 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 uA U 48.70 51.1027.50 54.6745.1217.572.22 56.90 61.3341.2019.30 28.17 38.98 NL: 4.54E5 Total Scan PDA Lo belia_20 _5_abSCX RT: 0.00 - 69.98 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 70000000 80000000 90000000 100000000 110000000 120000000 In te ns ity 49.78 32.70 49.20 57.99 48.79 52.50 53.18 39.72 61.70 6.433.07 35.93 40.84 41.38 31.8027.61 45.14 24.4622.0016.7410.27 62.74 NL: 1.20E8 m/z= 400.0-500.0 M S Lobelia_20 _5_abSCX Lobelia_20_5_abSCX #2905-2962 RT: 48.40-49.35 AV: 58 NL: 8.30E5 microAU 200 300 400 500 600 700 800 wavelength (nm) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab so rb an ce 282.0 309.0 522.0 247.0 388.0 Lobelia_20_5_abSCX #2265-2321 RT: 48.48-49.46 AV: 20 NL: 2.14E7 T: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] 400 600 800 1000 1200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 903.1 287.3 741.2 449.0 925.3517.3318.9 604.8 1002.7763.1668.6 867.4 1077.5 Hình 31: Phổ MS và UV của cao MeOH cây Lobelia Cardinalis. Sau khi phân tích phổ MS, chúng tôi đề nghị cấu trúc của mũi có Rt = 48.7 phút là: 76 Tên thường: 3-O-[6’-O-(4’’-O-E-p-hidroxycinamoylrhamnopyranosid)-β- glucopyranosid]-5-O-β-glucopyranosidcyanidin. Giải thích cơ chế bắn phá: Ta thấy trên phổ đồ chỉ xuất hiện một mũi có diện tích lớn ở Rt = 48.7 phút, mũi này khi bắn phá ion mẹ (m/z = 903.2) tạo ra ion con (m/z = 741.1) chứng tỏ mũi mẹ mất phân tử đường (903.2 – 741.1 = 162.1) glucose. Tiếp tục bắn phá ion con này (m/z = 741.1) sẽ tạo ra ion có m/z = 595.3, điều này chứng tỏ đã mất phân tử cumarin (741.1 – 595.3 = 145.8). Ngoài ra khi bắn ion 741.1 còn tạo ra ion 449.1 và ion 287.1, ion 449.1 chính là phần còn lại sau khi mất phân tử coumarin và đường rhamnose (741.1 – 449.1 = 292.0 = 2  146), còn ion 287.1 chính là phần aglycon được xác định tương ứng với cấu trúc của cyanidin (phụ lục 13). m/z = 741.1: mũi mẹ mất phân tử đường (903.2 – 741.1 = 162.1). m/z = 595.3: mất tiếp phân tử p-coumarin (741.1 – 595.3 = 145.8). 77 m/z = 449.2: mất phân tử coumarin và đường ramnose (741.1 – 449.1 = 292.0 chính là 2 phân tử 2146). m/z = 287.1: aglycon là cyanidin. 7.6 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỦA CÁC ANTHOCYANIN TRONG MẪU CAO MEOH Áp dụng các công thức chung sau đây để tính toán nồng độ của các anthocyanin : Diện tích peak UV =     l  C Diện tích peak ECD = F    Vtiêm C  n Với F = 96500;  = 10;  = 0.165; flow cell của đầu dò UV có l = 1cm; n tùy vào mỗi anthocyanin trong mẫu cao  tiemF n VDientichUV DientichECD l        1( / ) DientichUVC mol L l     Quy về lượng mẫu ban đầu:  Nồng độ        nh muc2 c n C mol / L M g / mol V mL ( / ) m g đi â C mg g   7.6.1 Mẫu cao MeOH của cây Hygrophilia polyspecma (n = 2): Cân mẫu 4 lần, sau đó cho qua cột SCX để làm sạch và định mức tới thể tích nhất định, tiêm V = 10uL vào máy, dịch trích này có chứa anthocyanin 3-O-(6’-O- rhamnopyranosid)-β-glucopyranosidcyanidin phân tử lượng 595,3 g/mol. Xét cấu trúc của 3-O-(6’-O-rhamnopyranosid)-β-glucopyranosidcyanidin trong cây Hygrophilia polysperma, ta thấy cấu trúc anthocyanin có mạch aglycon là cyanidin 78 với 2 nhóm OH ở vòng B, dựa vào các khảo sát về số điện tử trao đổi, ta có thể suy ra n = 2 (theo phương pháp HPLC/UV/ECD). Lượng cân (g) V(mL) sau khi qua cột SCX Diện tích UV Diện tích ECD  C1 (M) C2 (mg/g) 0.4143 3.00 5.6171 16.9564 10594 5.3010-5 0.228 0.4194 5.00 3.1782 9.5635 10582 3.0010-5 0.213 0.4157 4.00 4.1860 12.7274 10474 3.9910-5 0.229 0.4174 2.00 7.7652 22.7387 10875 7.1410-5 0.204 Định luật Student cho các lần đo lặp lại: 4, 4 0.95;3 4 c x S C C t  Với t0.95;3 = 3.18 ; S4,c = 0.012 →CHygrophilia Polysperma = 0.218  0.019 (mg/g) 7.6.2 Mẫu cao MeOH của cây Oxalis Natans (n = 2.39): Cân mẫu 2 lần, sau đó cho qua cột SCX để làm sạch và định mức tới thể tích nhất định, tiêm 10uL vào máy, V(mL) sau khi qua cột SCX còn lại = 2mL, dịch trích này có chứa 2 anthocyanin chính: 3-O-[(6’-O-rhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β- glucopyranosidmalvidin phân tử lượng 801,1 và 3-O-[6’-O-(4’’-O- malonylrhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β-glucopyranosidmalvidin phân tử lượng 887,1g/mol. Xét cấu trúc của 3-O-[(6’-O-rhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β- glucopyranosidmalvidin và 3-O-[6’-O-(4’’-O-malonylrhamnopyranosid)-β- glucopyranosid]-5-O-β-glucopyranosidmalvidin trong cây Oxalis Natans, ta thấy cấu trúc anthocyanin có mạch aglycon là malvidin với 2 nhóm OCH3 và 1 nhóm OH ở vòng B, dựa vào các khảo sát về số điện tử trao đổi, ta có thể suy ra n = 2.39 (theo phương pháp HPLC/UV/ECD). 79 m cân (mg) tR Diện tích UV Diện tích ECD  C1 (M) M+ C2 (mg/g) 27.28 t1 = 12.40 24.46 56.036 16611 1.47x10-4 801.1 8.65 t2 = 16.90 13.56 28.442 18142 7.47x10-5 887.1 4.86 Nồng độ tổng các anthocyanin (mg/g) 13.51 7.6.3 Mẫu cao MeOH của cây Lobelia cardinalis (n = 3): Cân mẫu 3 lần, sau đó cho qua cột SCX để làm sạch và định mức tới thể tích 3mL, tiêm 10uL vào máy, dịch trích này có chứa anthocyanin: 3-O-[6’-O-(4’’-O-E-p- hidroxycinamoylrhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β-glucopyranosidcyanidin, phân tử lượng 903 g/mol. Xét cấu trúc của anthocyanin: 3-O-[6’-O-(4’’-O-E-p- hidroxycinamoylrhamnopyranosid)-β-glucopyranosid]-5-O-β-glucopyranosidcyanidin trong cây Lobelia cardinalis, ta thấy cấu trúc anthocyanin có mạch aglycon là cyanidin với 2 OH ở vòng B nên n = 2 và 1 nhóm OH ở vị trí mạch gắn với đường rhamnose nên n =1, dựa vào các khảo sát về số điện tử trao đổi, ta có thể suy ra n = 3. Lượng cân (mg) Diện tích UV Diện tích ECD  M + C1 (mol/L) C2 (mg/g) 23.64 6.0926 15.1568 19201 903.2 3.173 10-5 3.64 23.50 4.4455 12.4220 17095 903.2 2.601 10-5 3.00 23.14 4.8435 12.4012 18656 903.2 2.596 10-5 3.04 Định luật Student cho các lần đo lặp lại: 3, 3 0.95;2 3 c x S C C t  Với t0.95;2 = 4.3 ; S3,c = 0.36 →CLobelia Cardinalis = 3.23 0.89 (mg/g) 80 7.7 KHẢ NĂNG LÀM SẠCH MẪU TỪ CỘT SCX-1MEQ/1GM/6ML- VARIAN PART #12256011 V 1 HCl 0.1M = 8.0 mL V 2 HCl 0.1M = 8.3 mL V 3 HCl 0.1M = 8.1 mL → khả năng trao đổi ion của cột SCX được bão hòa với ion Na+ là V1 = 12.0 mL 12.0  0.1 = 1.2mmol/g V2 = 11.7 mL Tương đương với 11.7  0.1 = 1.17mmol/g V3 = 11.9 mL 11.9  0.1 = 1.19mmol/g Kết luận: Khả năng tách lớn nhất của cột SCX là 1meq (mili equivalent) tương đương với 1.19mmol/g, tức là ta có thể làm sạch 1.19mmol/g  500g = 595mg anthocyanin với cột SCX. Trong thí nghiệm làm sạch mẫu cao, thường hàm lượng anthocyanin từ cây là rất bé, nên đảm bảo các anthocyanin trong cao MeOH không vượt quá khả năng trao đổi ion của cột. 7.8 HIỆU SUẤT THU HỒI DỰA TRÊN NỘI CHUẨN CYA-3-GLU: a. Để đánh giá quá trình làm sạch mẫu, sau khi cân mẫu Hygrophilia Polysperma một lượng chính xác, 1mL Cyanidin-3-glu 0.0475g/L được thêm vào, tiếp tục thêm 8mL MeOH, lúc này nồng độ Cyanidin-3-glu 0.0475g/L tính theo công thức: 5 3 3 6 3 6.81x10 1.0 7.57 x10 ( ) 1.0 8.0 cya glu cya glu truoc cya glu MeOHthemvao C V C M V V             Lấy hỗn hợp này thực hiện quá trình đánh siêu âm, để lắng, cô quay đuổi dung môi, làm sạch bằng cột SCX, sau đó định mức đến 1 thể tích chính xác và chạy LC-UV-ECD, cuối cùng đo diện tích và tính nồng độ của mũi cya-3-glu theo công thức: 81 ( / )sau DientichUVC mol L l     Hiệu suất thu hồi: % 100%sau truoc CH C   Với  cyanidin-3-glu = 23861 (dữ liệu từ công ty Norwegian),  = 10, l = 1cm. mcân (g) Nồng độ cya-3- glu (M) Ctrước (M) Diện tích UV Csau (mol/L) Hiệu suất thu hồi % cya-3-glu 0.41941 1.6579 6.95 x 10-6 91.83 0.41577 1.5432 6.47 x 10-6 85.47 0.42416 6.81x10-5 7.57 x10-6 1.5304 6.41 x 10-6 84.76 Hình 32: Sắc ký đồ LC-UV của cao MeOH cây Hygrophilia Polysperma và cya-3-glu nội chuẩn cho vào trước khi qua cột làm sạch SCX. 82 Hình 33: Sắc ký đồ LC-ECD của cao MeOH cây Hygrophilia Polysperma và cya-3-glu nội chuẩn cho vào trước khi qua cột làm sạch SCX. b. Mẫu Hygrophilia Polysperma sau khi được đánh siêu âm, để lắng, cô quay đuổi dung môi, làm sạch bằng cột SCX, định mức đến 1 thể tích chính xác, rồi lấy ra 1mL Hygrophilia Polysperma cho thêm 0.1mL cyanidin-3-glu chuẩn vào, lúc này nồng độ Cyanidin-3-glu 0.0475g/L tính theo công thức: 5 3 3 6 3 _ 6.81x10 0.1 6.19 x10 ( ) 0.1 1.0 cya glu cya glu truoc cya glu Hydrophilia polysperma C V C M V V             Sau khi chạy sắc ký lỏng, đo diện tích và tính nồng độ của mũi cya-3-glu theo công thức: ( / )sau DientichUVC mol L l    % 100%sau truoc CH C    Với  cyanidin-3-glu = 23861 (dữ liệu từ công ty Norwegian),  = 10, l = 1cm. mcân (mg) Nồng độ cya- 3-glu (M) Ctrước (M) Diện tích UV Csau (M) Hiệu suất thu hồi % cya-3-glu 419.41 6.81x10-5 6.19 x10-6 1.2465 5.22x10-6 84.38 83 414.29 1.3514 5.70x10-6 91.48 415.77 1.3587 5.70x10-6 91.98 Hình 34: Sắc ký đồ LC-UV của cao MeOH cây Hygrophilia Polysperma và cyanidin-3-glu nội chuẩn cho vào sau khi qua cột làm sạch SCX. Nhận xét: Trong cả 2 cách thêm nội chuẩn trên, cya-3-glu có hiệu suất thu hồi tương đối cao nhưng cách cho cyanidin-3-glu vào trước khi tinh chế mẫu là có ý nghĩa hơn vì nó đánh giá được quá trình tách chiết của mẫu Hygrophilia Polysperma không bị mất nhiều trong các bước của quy trình, còn cách cho cyanidin-3-glu vào sau khi tinh chế mẫu phần nào chỉ đánh giá được độ chính xác của máy so với một chuẩn đã biết trước nồng độ. Tuy nhiên do cấu trúc khá khác nhau của cyanidin-3-glu so với anthocyanin trong mẫu cao Hydrophilia polysperma nên sự tương tác với cột cũng sẽ khác nhau, dẫn đến việc đánh giá hiệu suất thu hồi chỉ mang tính tương đối. 84 CHƯƠNG 8: KẾT LUẬN Trong luận văn này chúng tôi đạt được một số kết quả như sau:  Xác định được hàm lượng anthocyanin trong dịch trích hoa quả khi sử dụng 2 thiết bị LC-UV-ECD và LC-MS mà không dùng đến chất chuẩn. Một số bài báo trước đây thủy phân đường để thu anthocyanin dưới dạng aglycon, tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và hiệu suất thu hồi không cao, các chất chuẩn aglycon thì có sẵn nhưng aglycon mới tạo ra từ dịch trích lại kém bền. Quy trình của chúng tôi bỏ qua bước thủy phân nên giảm lượng anthocyanin mất mát, hơn nữa đáp ứng được sự hạn chế vốn có về chất chuẩn.  Xây dựng được quy trình xác định hệ số hấp thu phân tử bằng phương pháp HPLC kết hợp 2 loại đầu dò UV và ECD.  Xây dựng được quy trình trích ly và làm sạch mẫu sau khi chiết. Xác định được hiệu suất thu hồi anthocyanin bằng cách dùng nội chuẩn cyanidin-3- glu, cho thấy quy trình này có hiệu suất thu hồi tương đối cao. Phương pháp đánh siêu âm giúp trích ly tốt anthocyanin ra khỏi dịch hoa quả.  Phương pháp điện hóa xác định được số điện tử trao đổi trên các anthocyanin, từ mối liên hệ giữa cấu trúc và số n, giúp ta suy đoán được số electron trao đổi của một cấu trúc bất kì. Hạn chế của đề tài:  Đề tài sử dụng LC/MS/MS chủ yếu để tiên đoán cấu trúc aglycon, khi biết n của phân tử ta có thể định lượng anthocyanin trong mẫu, tuy nhiên cấu trúc chính xác của đường và những phân tử khác gắn vào aglycon thì không thể dự đoán, vì vậy cần đi sâu nghiên cứu cấu trúc bằng phương pháp NMR. 85  Mặc dù đề tài đưa ra nhiều cách xác định n nhưng vẫn chưa tìm được phương pháp khả thi có thể xác định n một cách chính xác. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo: Vì những thông tin về sản phẩm oxi hóa của anthocyanin ít được đề cập tới trong các tài liệu, do đó việc nghiên cứu để xác định chính xác n là vấn đề cần thiết. Chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo như sau: Khi dịch trích truyền tới đầu dò ECD và phản ứng trên bề mặt điện cực chúng ta chấp nhận 100% chất chống oxi hóa trao đổi điện tử, tuy nhiên nếu thời gian tiếp xúc không đủ lâu thì chất chống oxi hóa vẫn còn trong pha động, ảnh hưởng tới kết quả thu được. Cần thiết lập quy trình kiểm soát sự oxi hóa-khử trên bề mặt điện cực. Có thể ghép đầu dò ECD trước cột theo thứ tự HPLC – ECD – cột – đầu dò UV – đầu dò MS, sau khi tiêm, mẫu sẽ được oxi hóa ở đầu dò ECD, sản phẩm oxi hóa và anthocyanin ban đầu chưa phản ứng kịp trên bề mặt điện cực sẽ được cột phân tách và nhận danh bằng đầu dò UV/Vis + đầu dò MS. Bằng cách nghiên cứu sản phẩm oxi hóa trên, ta có thể tính được chính xác số điện tử n. 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. LINDA S. EINBOND, KURT A. REYNERTSON, XIAO-DONG LUO, MARGARET J. BASILE, EDWARD J. KENNELLY. Anthocyanin antioxidants from edible fruits. Food Chemistry 84 (2004) 23-28. 2. CATHERINE A. RICE- EVANS, NICHOLAS J. MILLER, and GEORGE PAGANGA. Structure antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology  Medicine 20 (7) (1996) 933- 956. 3. PATRICIA JANEIRO, ANA MARIA OLIVEIRA BRETT. Catechin electrochemical oxidation mechanisms. Analytica Chimica Acta (2004) 109- 115. 4. NIELSEN, S.L., NIELSEN, H.D. Pigments, phytosynthesis and photoinhibition in two amphibious plants: consequences of varying carbon availability. New Phytosynthesis. 170 (2006) 311- 319. 5. METIVIER, R. P., FRANCIS, F. J& CLYDESDALE, F. M. Solvent extraction of anthocyanin from wine pomace. Journal of Food Science 45 (4) (1980) 1099-1100. 6. JING WANG, POUL ERIK HANSEN. Isolation and identification of Anthocyanins from Nesaea Crassicaulis. Master Thesis-Department of Life Science and Chemistry 2008. 7. FLESCHLHUT, J., KRATXER, F., RECHKEMMER, G., & DULING, S. E. Stability and biotransformation of various dietary anthocyanin in vitro. European Journal of Nutrition 45 (1) (2006) 7-18. 8. COOPER-DRIVER G. A. Contribution of Jeffrey Harborne and co-workers to the study of anthocyanin. Phytochemistry 56 (3) (2001) 299-236. 9. HAIBO WANG, EDWARD J. RACE AND ANIL J. SHRIKHANDE. Characterization of Anthocyanins in Grape Juices by Ion Trap Liquid Chromatography- Mass Spectrometry. Journal of Agricultural and food chemistry 51 (2003) 1839-1844. 10. 87 11. IVANA NOVAK, MARIJAN SERUGA, SEBOJKA KOMORSKY- LOVRIC. Square-wave and cyclic voltammetry of epecatechin gallate. Journal of Electroanalytical Chemistry 631 (2009) 71-75. 12. DANIEL C. HARRIS. Quantitaive chemical analysis. Seven Edition. W.H Freeman and Company 41 Madison Avenue, New York NY 10010. 13. UWE D. NEUE, HPLC columns, Wiley- VCH (1997) 14. RAYMOND P.W.SCOTT. Liquid chromatography detectors. Chromatography. Ed Book Series 2003. 15. PAUL A. KILMARTIN. Forum Method Communication: Electrochemical Detection of Natural antioxidants: Principles and Protocols. Antioxidants & Redox signaling 3 (6) (2001). 16. KENNETHY HENSLEY, KELLY S. WILLIAMSON, MICHAEL L. MAIDT, S. PRASAD GABBITA, PAULA GRAMMAS, ROBERT A. FLOYD. Determination of Biological Oxidative Stress Using HPLC with Electrochemical Detection. Journal High Resolution Chromatorgraphy 22 (8) (1999) 429-437. 17. FINNIGAN LC Qdeca, hardware (2005). 18. MONICA JORDHEIM, KJERSTI AABY, TORGILS FOSSEN, FRETE SKREDE, and YVIND M. ANDERSEN. Molar Absorptivities and Reducing Capacity of Pyranoanthocyanins and Other Anthocyanins. Agricultural and food chemistry 55 (2007) 10591-10598. 19. C. AMATORE, M. AZZABI, P. CALAS, A. JUTAND, C. LEFROU and Y. ROLLIN. Absolute determination of electron consumption in transient or steady state electrochemical techniques. Journal of Electroanalytical Chemistry 288 (1990) 45-63. 20. IVANA NOVAK, PATRICIA JANEIRO, MARIJAN SERUGA, ANA MARIA OLIVEIRA- BRETT. Ultrasound extracted flavonoids from four varieties of Portuguese 88 red grape skins determined by reverse-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Analytical chimica acta 630 (2008) 107-115. 21. PETER T. KISSINGER, LAWRENCE J. FELICE, RALPH M. RIGGIN, LAWRENCE A. PACHIA, and DAVID C. WENKE. Electrochemical Detection of Selected Organic Components in the Eluate from HPLC. Clinical Chemistry 20 (8) (1974) 992-997. 22. CRITINA ALCALDE-EON, GLORIA SAAVEDRA, SONIA DE PASCUAL- TERESA, JULIAN C. RIVAS-GONZALO. Liquid chromatography-mass spectrometry identification of Anthocyanins of isla oca tubers. Journal of chromatography A 1054 (2004) 211-215. 23. PATRICIA JANEIRO, ANA MARIA OLIVEIRA BRETT. Redox behavior of anthocyanins present in Vitis vinifera L. Electroanalysis 19 (17) (2007) 1779-1786. 24. LEE ET AL. Determination of Total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential method: Journal of AOAC International 88 (5)1269-1279. 25. MARRIT REIN. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanin. university of Helsinki, Academic Dissertation, Department of Applied Chemistry and Microbiology (2005) 88-122. 89 Phụ lục các bảng: Phụ lục 5: Nồng độ catechol theo diện tích ECD Nồng độ Catechol (g/L) Nồng độ Catechol (M) Diện tích peak (ECD) 2.06 x10-2 1.87x10-4 88.73 2.58 x10-2 2.34 x10-4 109.88 3.09 x10-2 2.81 x10-4 125.50 5.15 x10-2 4.68 x10-4 180.88 Phụ lục 6: Nồng độ catechol theo diện tích UV Phụ lục 7 và 8: Đồ thị nồng độ cyanidin-3-glu theo diện tích UV và ECD Cyanidin-3-glu (M) Diện tích peak ECD Diện tích peak UV 2.1210-5 5.6627 2.4276 4.2310-5 12.5473 5.5845 5.2910-5 15.2231 7.1362 6.5010-5 17.5780 8.7784 Nồng độ Cat (g/L) Nồng độ Cat (M) Diện tích peak (UV) 0.0085 7,72x10-5 3.1584 0.0170 15,44 x10-5 5.8667 0.0340 30,88 x10-5 10.4419 0.0850 77,20 x10-5 25.2778 0.1700 154,39 x10-5 48.2730 90 Phụ lục 10: Thế khảo sát các polyphenol và diện tích ECD thu được Diệntích ECD Thế E (mV) Catechol 4.6410-4 M 3-metoxi catechol 0.721mM Guaiacol 2.820mM 2,6-dimetoxiphenol 0.408mM propyl galate 0.764mM 200 0.74 2.35 0.069 0.36 3.32 300 76.14 144.75 0.029 0.45 6.08 400 190.58 141.16 0.088 2.67 141.74 500 191.53 140.54 110.06 80.62 155.81 600 210.11 142.49 536.35 81.38 163.14 700 274.46 146.82 502.55 82.59 171.61 800 387.11 162.82 517.57 83.02 176.07 900 576.22 232.09 602.98 91.27 176.72 1000 1014.32 543.10 906.49 175.63 184.18 1100 1064.21 91 Diện tích ECD E (mV) Cya-3-Glu 6.81610-5 M Mal-3-Glu 2.36310-5 M Pelar-3-Glu 7.0210-4 M Delp-3-Glu 3.73210-5 M Petu-3-Glu 4.14410-5 M Peo-3-Glu 3.0710-5 M 150 2.91 0.20 1.01 0.81 0.22 0.30 250 2.28 0.14 6.54 0.63 0.37 0.22 350 4.76 0.61 18.91 11.88 10.43 0.27 450 10.41 4.75 232.61 18.41 14.74 3.13 550 21.23 24.19 335.75 21.04 17.85 9.86 650 21.29 25.35 342.95 22.40 16.67 17.20 750 26.30 33.53 378.42 23.92 22.9 19.38 850 33.48 47.40 542.38 34.64 33.89 27.84 950 33.69 53.07  33.57 34.66 39.85 92 Phụ lục 11: Cường độ các polyphenol khi đo bằng phương pháp đường dòng thế X = i*T1/2 T/ms Cat Propyl gallate 2,6- dimethoxy phenol 3-methoxy cathechol Guai acol Cya-3- glu Del-3- glu Mal-3-glu Pel-3-glu 1 77.22 5.77 77.06 92.82 30.11 49.63 54.9 55.58 83.46 2 59.99 12.77 67.94 77.36 23.93 28.51 3.44 61.64 90.82 5 53.41 29.21 65.44 70.84 19.22 16.81 19.06 72 101.69 10 53.41 50.97 64.73 68.05 15.82 12.29 13.01 80 104.71 20 55.08 73.54 65.18 66.05 13.22 9.12 9.85 84 97.67 50 59.90 84.71 64.31 64.54 10.74 7.96 7.96 75.44 70.19 100 63.35 82.83 64.34 63.68 9.28 5.67 6.98 57.45 46.31 200 68.31 80.49 62.27 61.81 8.02 4.32 6.17 35.84 29.35 500 73.52 75.33 60.33 62.52 7.56 3.89 8.29 19.28 18.55 Khuếch đại 10 lần 1000 79.10 71.24 58.37 60.44 8.61 9.65 7.58 15.87 15.87 i tb(A) 64.33 56.69 65.00 68.81 14.65 14.78 13.72 55.71 65.85 i2 53.61 54.38 51.33 68.81 14.30 64.27 72.23 118.53 334.28  n: 2.00 2.03 1.92 2.57 0.53 2.40 2.70 4.42 12.47 93 Phụ lục 12: Phổ MS của mẫu cao MeOH cây Hygrophilia Polysperma: C:\Users\SONY\Desktop\Hygrophila 5/20/2009 3:25:37 PM Hygrophila #1456-1567 RT: 31.66-33.89 AV: 72 NL: 1.83E5 F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 595.1 287.3 517.4 254.6 354.4308.7 471.5363.9 391.0 753.0602.3527.3 626.7 683.5587.4 823.5768.0 873.4 904.3 926.5 1074.8995.0 1177.91045.5 1143.7 Hygrophila #1456-1567 RT: 32.39-33.10 AV: 12 NL: 6.37E5 F: + p d Full ms2 595.07@28.00 [ 150.00-610.00] 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 287.3 449.1 433.0241.3 289.7 576.3268.9213.3 538.3195.2 373.1 548.7399.7 522.5360.2 Phụ lục 13: Phổ MS của mẫu cao MeOH cây Lobelia Cardinalis: C:\Xcalibur\data\Lobelia_20_5_abSCX 5/20/2009 2:06:09 PM Lobelia_20_5_abSCX #2253-2317 RT: 48.29-49.37 AV: 18 NL: 1.43E7 F: + p d Full ms2 903.20@28.00 [ 235.00-915.00] 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 741.1 449.1287.3 611.1579.4431.2299.3 757.3723.0 885.0269.1 819.3413.0383.3 783.0514.8329.3 842.3640.6353.2 560.9 Lobelia_20_5_abSCX #2576 RT: 54.79 AV: 1 NL: 6.45E5 F: + p d Full ms3 741.07@28.00 287.26@28.00 [ 65.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 287.3 259.2 94 Phụ lục 14: Phổ MS peak 1 của mẫu cao MeOH cây Oxalis Natas: E:\LC-MS_denmark\OR_090619223043 6/19/2009 10:30:43 PM OR_090619223043 #1189 RT: 25.38 AV: 1 NL: 3.11E5 F: + p d Full ms2 801.07@35.00 [ 210.00-815.00] 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 639.1 331.2 493.1 315.4298.5 692.9655.1270.1 702.4475.1241.9 567.7 OR_090619223043 #2045 RT: 43.03 AV: 1 NL: 1.64E5 F: + p d Full ms3 639.27@35.00 331.33@35.00 [ 80.00-345.00] 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 331.2 315.9299.4269.9245.2 287.4253.5242.0179.3 317.1 OR_090619223043 #1927 RT: 40.36 AV: 1 NL: 9.56E4 F: + p d Full ms3 493.13@35.00 331.27@35.00 [ 80.00-345.00] 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 331.3 315.7 299.1 280.2270.3 298.1177.9 315.2 Phụ lục 15: Phổ MS peak 2 của mẫu cao MeOH cây Oxalis Natas: E:\LC-MS_denmark\OR_090619223043 6/19/2009 10:30:43 PM OR_090619223043 #1317 RT: 27.51 AV: 1 NL: 1.12E6 F: + p ESI Full ms [ 250.00-1200.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 887.1 331.4 1085.9705.7654.8 327.6 493.4256.7 945.9708.7674.9560.5517.2 973.1587.4434.8 647.1351.1 1158.3365.5 412.1 620.7265.7 870.9 1001.6744.3303.7 482.1468.5 700.7 835.2547.9 896.3 943.8775.4 1071.7803.6 983.4957.1 OR_090619223043 #1335 RT: 27.86 AV: 1 NL: 3.83E5 F: + p d Full ms2 887.07@35.00 [ 230.00-900.00] 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 725.0 331.3 493.2 315.0 681.0639.1277.6 299.1 655.2563.0 843.0475.3385.0269.1 804.8253.3 439.3 707.1 OR_090619223043 #1927 RT: 40.36 AV: 1 NL: 9.56E4 F: + p d Full ms3 493.13@35.00 331.27@35.00 [ 80.00-345.00] 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e Ab un da nc e 331.3 315.7 299.1 280.2270.3 298.1177.9 315.2 95 Các giá trị thế (mV) của polyphenol theo phương pháp vol-ampe (Chronoamperometry) 1. 2,6-dimethoxy phenol: 96 2. 3-methoxi catechol: 97 3. Cya-3-glu: 98 4. Del-3-glu: 99 5. Guaiacol: 100 6. Mal-3-glu: 101 7. Pela-3-glu: 102 8. Propyl galate: