Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nông nghiệp

Trường DH Nông Lâm Tp.HCM Khoa Ngoại ngữ- Sư phạm Lớp DH10SP Báo cáo chuyên đề môn: Di truyền ứng dụng trong thủy sản Chủ đề: Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nông nghiệp Thực hiện: Nguyễn Minh Dung_10132031Võ Thị Thùy Như Nguyễn_10132042Phạm Ngọc Vinh_10132019 Nội dung chính I. Kĩ thuật di truyền - Kĩ thuật tổ hợp DNA  (Kĩ thuật chuyển gen) - Kĩ thuật PCR II. Ứng dụng của kĩ thuật di truyền trong nông nghiệp - Cây chuyển gene - Một số ví dụ cụ thể I. Kĩ thuật di truyền Kĩ thuật tổ hợp DNA Định nghĩa: - Là kĩ thuật thao tác và tổ hợp DNA từ hai nguồn khác nhau (thường là của hai loài khác nhau). - Kĩ thuật tổ hợp DNA còn gọi là kĩ thuật chuyển gen gồm 7 bước. Các bước của kĩ thuật chuyển gen 1. Ly trích DNA (Thu nhận gen) 2. Cắt DNA (Chọn vector) 3. Trộn DNA và nối (Tạo DNA tái tổ hợp) 4. Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào đích 5. Chọn dòng tế bào có DNA tái tổ hợp 6. Tạo dòng tế bào có DNA tái tổ hợp 7. Biểu hiện gen Sơ đồ kĩ thuật chuyển gen Vi khuẩn tái tổ hợp Biểu hiện gen Các nghiên cứu ứng dụng khác Vi khuẩn tái tổ hợp Các nghiên cứu ứng dụng khác Các enzym giới hạn Vi khuẩn tự bảo vệ chống lại sự xâm nhiểm của virus bằng cách tạo ra các enzym giới hạn (RE: restriction enzymes). - RE cắt liên kết phosphodiester làm cho phân tử DNA của virus bị đứt thành nhiều đoạn nhỏ. - DNA của kí chủ không bị cắt bởi nhờ các vị trí cắt đã được metyl hóa. Enzym giới hạn bảo vệ vi khuẩn chống xâm nhiểm của virus Tên gọi, hoạt động RE Gọi theo tên loài vi khuẩn mà enzym được ly trích. Chữ I viết hoa (tên chi), chữ II, III viết thường (chữ cái đầu tên loài), chữ IV viết hoa (tên chủng), nếu cùng loài vi khuẩn có nhiều RE thì thêm số La mã chỉ thứ tự RE. VD: enzym EcoRI là RE đầu tiên được phát hiện ở Escherichia coli, chủng RY 13. Có nhiều Enzym giới hạn, mỗi loại nhận biết và cắt ở một vị trí xác định của trình tự nhận biết (recognition sequence). - Mỗi trình tự có từ 4 – 6 cặp base. - Trình tự có tính đối xứng nghịch đảo (hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi đọc theo cùng một chiều 5’→3’. Đầu tà (blunt end) Đầu dính (stickey end) Kĩ thuật chuyển gen Thu nhận gen: 3 phương pháp - Thu nhận từ bộ gen (genom): dùng các enzym cắt RE cắt genom thành những gen nhỏ rời rạc và trích gen mong muốn ra khỏi genom. - Từ con dường tổng hợp hóa học. + Xác định trình tự gen. + Tổng hợp các đoạn oligonucleotide (3 – 16 nucleotide) + Nối các đoạn oligonucleotide bằng enzym ligase - Thu nhận gen từ mRNA với enzym phiên mã ngược 2. Chọn vector chuyển gen - Vector là phân tử DNA có khả năng tự nhân đôi, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gen cần thiết. - Vector cần có các đặc điểm: + có trình tự khời đầu sự nhân đôi Ori + có trình tự nhận biết (nơi cắt của RE) + có trình tự điều hòa ( có promotor giúp phiên mã gen lạ) + có gen đánh dấu đảm bảo nhận biết sự tồn tại của DNA tái tổ hợp trong tế bào a. Plasmid - Là những đoạn DNA ngắn (2 – 5kp), dạng vòng nằm ngoài NST tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn - Đặt điểm: + có khả năng tự nhân đôi + có điểm khởi đầu Ori + có mang các gen kháng kháng sinh hay gen dùng đánh dấu + chuyên chở đoạn gen có kích thước 5 – 10kp - Vd: pBR322, pVT46, pUC18,… Plasmid pBR322 Phagemid - Là những virus xâm nhiểm và làm phân giải vi khuẩn. - Đặc điểm: + hiệu quả xâm nhiểm cao (có hệ thống xâm nhập vi khuẩn và sinh sản nhanh) + chuyển đoạn gen có kích thước lớn (10 – 20kp) - VD: phageλ, phage M13 - Nhược điểm: khó khăn trong nhận biết, thao tác phức tạp Cosmid - Là những vector nhân tạo được nối giữa plasmid và trình tự cos của phageλ - Đặc điểm: + các trình tự này đóng gói DNA tái tổ hợp vào phần đầu của phage. Sau đó phage xâm nhập vào vi khuẩn. Trong tế bào vi khuẩn, phage hoạt động như một plasmid và không phá vỡ tế bào vi khuẩn (tạo khuẩn lạc) + chuyển đoạn gen 20 – 50kp d. NST nhân tạo - Là những vector mới cho phép chuyển đoạn gen có kích thước 200 – 1000kp. Gồm NST nhân tạo cìa nấm men (YAC (Yeast Artificial Chromomsome)) và NST nhân tạo của động vật hữu nhủ (MCA). Vector là NST nhân tạo của nấm men Kĩ thuật chuyển gen Kĩ thuật chuyển gen Tạo DNA tái tổ hợp - Từ gen và vector phù hợp người ta tạo các DNA tái tổ hợp bằng các enzym công cụ - VD: sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt gen và plasmid tạo hai đầu dính tương ứng, sau đó dùng DNA ligase nối gen và plasmid tạo DNA tái tổ hợp. 4. Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào đích Biến nạp. - Bắn gen. Dung hợp. - Vi tiêm. Sử dụng vi khuẩn Agrobacterrium. Chọn dòng tế bào có DNA tái tổ hợp - Chọn dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng ta tiến hành nuôi cấy tế bào trong môi trường thích hợp, nhờ vào gen đánh dấu có thể tìm được tế bào có DNA tái tổ hợp. - Nhân dòng tế bào tái tổ hợp trong tế bào đích: các Dna tái tồ hợp trong tế bào vi khuẩn được phân chia ngẫu nhiên trong tế bào vi khuẩn ở thế hệ tiếp theo. Vì vậy cần nhân dòng các bản sao DNA tái tổ hợp (shock nhiệt ở 420C trong 2 phút) 6. Tạo dòng tế bào có DNA tái tổ hợp - Sau khi chọn lọc được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng ta tiến hành nuôi cấy tế bào bằng môi trường thích hợp - DNA tái tổ hợp có thể được nuôi cấy bằng phương pháp vsv, hay phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật, tế bào động vật,… Đối với thực vật phải tạo được cây chuyển gen như bắp chuyển gen, đậu nành chuyển gen 7. Biểu hiện gen - Sau khi tạo được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng ta phải biểu hiện được gen mong muốn. - VD: Chuyển gen Insulin của người vào tế bào E.coli thì E.coli phải sản xuất được Insulin của người; chuyển gen kháng thuốc trừ sâu vào thực vật thì cây con phải có tính kháng thuốc trừ sâu Kĩ thuật PCR - Kĩ thuật này có thể được tiến hành nhờ sự phát hiện ra enzym Taq polimerase, một loại DNA polimerase có trong vi khuẩn Thernuis aquaticer ở vùng suối nước nóng. - Các nguyên liệu cần thiết: + các nucleotide tự do: dNTP + DNA khuôn + một cặp mồi (mồi ngược và mồi xuôi) + Taq polimerase + dung dịch đệm + máy luân nhiệt PCR được thực hiện từ 20 – 40 chu kì, mỗi chu kì gồm 3 bước: - Biến tính - Gắn mồi - Tổng hợp Một số hình ảnh của cây chuyển gen Bắp cải chuyển gene chống virus Cây chuyển gene II. Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nông nghiệp Thế nào là một cây chuyển gen? - Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay vì thông qua lai tạo. - Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có  quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. - Thực vật tạo ra  được gọi là “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hoá, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài.   Tại sao phải tạo cây chuyển gen? - Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. - Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài hoặc có họ hàng gần. Phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và thường là những đặc tính quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần. - Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thực vật những gen mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không chỉ giữa các loài cây lương thực hay những loài có họ gần. - Phương pháp hữu  hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật đưa ra giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của tạo giống truyền thống. Tại sao phải tạo cây chuyển gen? Cây chuyển gen được tạo ra như thế nào? - Cây chuyển gen được tạo ra thông qua kỹ thuật di truyền. Các gen quan tâm được chuyển từ cá thể này sang cá thể khác. Hiện có hai phương pháp chính để chuyển một gen vào bộ gen thực vật. + Phương pháp thứ nhất: cần dùng một dụng cụ có tên là “súng bắn gen”. Gen chuyển được bao bọc ra ngoài những hạt kim loại vô cùng nhỏ, những hạt này sau đó được đưa vào tế bào thực vật theo phương pháp lí học. Một vài gen có thể bị thải loại và không gắn vào bộ gen của cây được biến nạp. + Phương pháp thứ hai: là sử dụng vi khuẩn để đưa gen mong muốn vào bộ gen của thực vật. Cây chuyển gen được tạo ra như thế nào? Cây chuyển gen được trồng ở đâu? - Hầu hết những nghiên cứu về cây chuyển gen đều được tiến hành ở các nước phát triển, chủ yếu là Bắc Mỹ và Tây âu. Tuy nhiên gần đây nhiều nước đang phát triển cũng đang bắt đầu những nghiên cứu về kỹ thuật di truyền. - Ở các nước phát triển, các công ty Công nghệ sinh học đã đi đầu trong việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào nông nghiệp (như Aventis, Dow AgroSciences, DuPont/Pioneer, Monsanto và Syngenta). Cây chuyển gen được trồng ở đâu? - Năm 1994, giống cà chua Calgene chuyển gen chín trở thành cây chuyển gen đầu tiên được sản xuất và tiêu thụ ở các nước công nghiệp. Từ đó tới nay đã có thêm một số quốc gia trồng cây chuyển gen làm tăng hơn 20 lần diện tích cây chuyển gen trên toàn thế giới tăng hơn 47 lần. - Diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha (1996) lên 90 triệu ha (2005), có 14 nước được coi là có diện tích trồng cây chuyển gen thuộc loại lớn (mega-countries) với diện tích trồng từ 50.000 ha trở lên, trong đó có 10 nước đang phát triển và 4 nước công nghiệp. các nước có diện tích trồng lớn (xếp theo thứ tự từ lớn tới bé): Hoa Kỳ, Achentina, Brazil, Canada, Trung Quốc, Paraguay, Ấn độ, Nam Phi, Urugoay, Ôxtralia, Mexico, Rumani, Philippine và Tây Ban Nha (Theo James, 2005) Những lợi ích tiềm tàng của cây chuyển gen - Ứng dụng cây chuyển gen trong nông nghiệp đã có những lợi ích rõ rệt: + Tăng sản lượng  + Giảm chi phí sản xuất  + Tăng lợi nhuận nông nghiệp  + Cải thiện môi trường - Những cây chuyển gen thế hệ thứ nhất làm giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng dẫn tạo ra những cây chuyển gen thế hệ thứ hai có đặc điểm tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Những lợi ích tiềm tàng của cây chuyển gen Những nguy cơ tiềm  ẩn của cây chuyển gen - Bao giờ cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm: + Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm  + Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại  + Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen  + Nguy cơ cây có gen kháng sâu bệnh tiết chất độc tác động tới sinh vật không phải sinh vật cần diệt. Những nguy cơ tiềm  ẩn của cây chuyển gen Kết luận về cây chuyển gene - Người ủng hộ cho rằng cây chuyển gene sẽ cho sản phẩm với các chức năng, hương vị, màu sắc, hình dạng mới; người phản đối thì cho rằng cây chuyển gene làm mất đi yếu tố tự nhiên vốn có trong sản phẩm và họ có quyền được biết thực phẩm của họ có nguồn gốc thế nào, chứa những chất gì. - Bên cạnh những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gene nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy, có cơ sở khoa học. - Cuối cùng vì tầm quan trọng của lương thực thực phẩm cho con người, nên các chính sách liên quan tới cây chuyển gene sẽ phải dựa trên những cuộc tranh luận cởi mở và trung thực có sự tham gia của mọi thành phần trong xã hội. Kết luận về cây chuyển gene Một số ví dụ cụ thể Cà chua chuyển gen bảo quản được lâu hơn Một số ví dụ cụ thể Cà chua chuyển gen bảo quản được lâu hơn - Các nhà nghiên cứu đã kéo dài “cuộc sống” của cà chua thêm 60 ngày bằng cách ức chế các loại men gây ra quá trình chín của quả. - Các nhà khoa học đã xác định được hai loại men, phát triển trong cà chua trong giai đọan quả đã trưởng thành để xúc tiến sự chín của quả. Tuy nhiên các men này cũng làm thịt quả mềm ra và đó chính là lý do không giữ được lâu, gây tổn thất lớn, thường lên tới 40% sau khi thu hoạch. - Họ đã dùng kỹ thuật gen để bắt các gen này “ngủ yên”, khiến cho thịt quả vẫn rắn, độ cứng tăng lên được gấp đôi, nhờ vậy kéo dài được một thời gian mới bị thối nhũn. Công trình này do Viện nghiên cứu hệ gen của Ấn Độ thực hiện và công bố trên Proceedings of the National Academy of Sciences (Thông báo của Viện hàn lâm khoa học quốc tế). - Cây cà chua chuyển gen vẫn mọc bình thường và cung cấp rau quả tươi có giá trị dinh dưỡng cao, không có gì khác biệt đối với cà chua thường. Công nghệ xử lý men chín đối với cây cà chua hoàn toàn có thể áp dụng với các loại rau quả khác. Theo LiveSciences Các mức độ chín của cà chua - Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM vừa nghiệm thu đề tài “Nghiên cứu chuyển gen IPT tạo cytokinin vào cây bắp cải cấy mô và khả năng tái sinh cây chuyển gen” do ThS. Bùi Đình Thạch (Viện Sinh học nhiệt đới) thực hiện nhằm chuyển gen IPT tạo cytokinin vào cây bắp cải cấy mô bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen. (10/06/2008) Bắp cải cấy môvà khả năng tái sinh cây chuyển gen - Trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro, cytokinin có vai trò rõ rệt trong việc giữ cho mô lá tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố. Thực tiễn sản xuất giống cây trồng nói chung, cây rau ăn lá cho thấy việc xử lý cytokinin ngoại sinh mang ý nghĩa thương mại rất cao vì cytokinin giúp duy trì xanh tươi lâu hơn của rau sau thu hoạch và kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành. - Nghiên cứu đã tiến hành: + Khảo sát tính chống chịu của tử diệp bắp cải nuôi cấy in vitro 7 ngày tuổi đối với hygromycin(5-40mg/l), chất được dùng làm tác nhân chọn lọc cho cây chuyển gen. + Chuyển gen IPT tạo cytokinin vào cây bắp cải cấy mô bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens và kiểm tra cây chuyển gen nhờ phương pháp chọn lọc với hygromycin, nhuộm Gus, PCR. + Tái sinh cây chuyển gen (thiết kế tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật cho quá trình tạo chồi, tạo rễ và phát triển thành cây trưởng thành)... Bắp cải cấy môvà khả năng tái sinh cây chuyển gen - Cây bắp cải chuyển gen IPT có hàm lượng cytokinin cao hơn so với cây đối chứng. Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh đối với cây bắp cải chuyển gen IPT là môi trường MSS3 (MSS3 có khoáng đa lượng và vi lượng MS, 2 lần vitamin B5, Ag(NO)3 4mg/l, đường 30 g/l, BA 3 mg/l và AIB 0.3mg/l) Theo đó nghiên cứu sẽ: - Khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa của cây chuyên gen như hoạt tính của enzym ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, nitrate reductase để có kết luận chính xác. - Tìm hiểu nhiều hơn về vai trò của gen IPT trong cây chuyển gen. - Nghiên cứu mối liên hệ giữa tác động của gen IPT trên cây bắp cải chuyển gen với ethylene nội sinh và ngoại sinh trong quá trình lão suy… Bắp cải chuyển gene IPT Bắp cải cấy môvà khả năng tái sinh cây chuyển gen Lợi ích của cây thuốc lá chuyển gen - Một nhóm nghiên cứu lớn thuộc một vài tổ chức nghiên cứu Châu âu đã tham gia vào một phần của dự án Pharma-Planta. Dẫn đầu nhóm nghiên cứu là giáo sư Mario Pezzotti của đại học Verona, nhóm bắt đầu tạo cây thuốc lá chuyển gen có khả năng sản xuất ra interleukin có hoạt tính sinh học (IL-10), một loại cytokine có khả năng chống viêm. - Thuốc lá từ lâu đã được biết là không có lợi cho sức khỏe, nhưng hiện nay các nhà khoa học vừa thành công trong một nghiên cứu thử nghiệm sử dụng cây thuốc lá chuyển gen để tạo thuốc trị các bệnh tự miễn dịch và dễ bị viêm bao gồm luôn cả bệnh tiểu đường. Lợi ích của cây thuốc lá chuyển gen - Họ thử 2 loại IL-10 có nguồn gốc khác nhau (một từ virus và 1 từ chuột) và cuối cùng là tái sinh cây chuyển gen để xem loại nào hoạt động hiệu quả nhất. Thuốc lá chuyển gene Lợi ích của cây thuốc lá chuyển gen - Nhóm thu được một số lượng lớn các tự kháng nguyên – đồng dạng 65kDa của enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD65)- đều là sản phẩm được do thuốc lá chuyển gen tạo ra. - Kết quả là cây thuốc lá chuyển gen có thể sản xuất tất cả các dạng của IL-10, tạo ra cytokine có hoạt tính ở nồng độ đủ cao - Điều này chứng tỏ là chúng ta có thể sử dụng lá thuốc lá mà không cần phải thông qua các quá trình tách chiết hay tinh sạch - Bước kế tiếp trong dự án là sẽ tiến hành thử nghiệm tác dụng thuốc lá chuyển gen sản sinh IL-10 trên chuột: cho chuột bị nhiễm bệnh tự miễn dịch ăn thuốc lá chuyển gen với mục đích là tìm hiểu xem hiệu quả tác động của chúng ra làm sao. - Sử dụng thực vật để xem xét nếu liều lượng thuốc cần dùng mỗi lần ở lượng thấp và dùng lặp đi lặp lại liệu có giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường mellitus loại 1 (T1DM) (cùng sử dụng phối hợp với các tự kháng nguyên khác) hay không. Cừu DoliNhân bản vô tính bằng kĩ thuật chuyển gene Cừu DoliNhân bản vô tính bằng kĩ thuật chuyển gene Công nghệ tạo cừu Dolly bao gồm các bước sau: - Tách tế bào tuyến vú cừu và nuôi trong phòng thí nghiệm. - Tách tế bào trứng của cừu, sau đó loại bỏ nhân của tế bào trứng này. - Chuyển nhân của tế bào tuyến vú vào tế bào trứng đã bị bỏ nhân. - Nuôi cấy trên môi trường nhân tạo cho trứng phân cắt thành phôi. - Chuyển phôi vào tử cung của một cừu mẹ để nó mang thai. Sau thời gian mang thai giống trong tự nhiên, cừu mẹ này đã đẻ ra cừu con (cừu Dolly) giống y hệt cừu cho nhân tế bào. - Cừu Dolly, động vật có vú đầu tiên được nhân bản vô tính. Cô cừu ra đời năm 1996 và qua đời vào đầu năm 2003. - Các thí nghiệm mới nhất phần nào được thực hiện để kiểm tra xem những cải tiến mới trong công nghệ có cắt giảm được các nguy cơ từ lúc trong bào thai đến khi được sinh ra hay không. Cừu Doli - Giáo sư Keith Campbell, người đã cho phép "các Dolly" trở thành vật nuôi tại ĐH Nottingham (Anh) cho biết: “Các Dolly" đã sống và khỏe mạnh. Đây đúng là các bản sao di truyền của cừu Dolly trước đây”. - Trước đây, sự ra đời Dolly là một quá trình dài phức tạp. Trong tất cả 277 quả trứng được sử dụng chỉ có 29 phôi được tạo thành, 3 con cừu được sinh ra và cuối cùng chỉ có duy nhất Dolly còn sống sót. Bây giờ, chỉ cần tới 5 phôi để tạo ra mỗi Dolly mới. Cừu DoliNhân bản vô tính bằng kĩ thuật chuyển gene - Các mẫu mô của Dolly được lưu giữ trong một máy làm lạnh cho đến khi nó được rã đông để tạo ra các Dolly mới. Điều đó có nghĩa là 4 Dolly mới có di truyền giống hệt nhau, giống với cả Dolly và con cừu cái đã cung cấp mô cho Dolly. Bốn bản sao chính xác về gene của cừu Dolly hiện đang được chăm sóc và theo dõi tại Đại học Nottingham. Cảm ơn cô và các bạn đã chú ý lắng nghe! Thực hiện: Nguyễn Minh Dung_10132031Võ Thị Thùy Như Nguyễn_10132042Phạm Ngọc Vinh_10132019