Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (white spot disease – wsd) trên tôm sú (penaeus monodon)

TÓM TẮT Virus WSSV ( White spot syndrome virus), thành viên của một họ virus mới tên là Nimaviridae, là một loại virus nguy hiểm đối với tôm penaeids vì khả năng gây chết cao và nhanh. Đề tài này được tiến hành nhằm phát triển một quy trình kiểm nghiệm mới ổn định, chính xác và có độ nhạy cao để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam. Đó là quy trình hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng. Đại học Gent đã phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh. Quy trình này được nghiên cứu để thay đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam. Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X, 1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X. Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30 mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp. So với 2 phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng. Khác với mô học truyền thống, IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết. Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản, mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả. Chính vì những ưu điểm nổi bật đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ chính xác. MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ .iii TÓM TẮT .iv ABSTRACT .v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .x DANH SÁCH CÁC HÌNH .x DANH SÁCH CÁC BẢNG .xi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Nội dung 2 1.3. Mục đích .2 1.4. Yêu cầu .2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú 3 2.1.1. Phân loại 3 2.1.2. Phân bố 3 2.1.3. Vòng đời .3 2.1.4. Sinh trưởng 4 2.1.5. Dinh dưỡng 4 2.1.6. Môi trường sống 5 2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam .5 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 6 2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam .6 2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng 9 2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng 9 2.2.2.2. Phân loại và tên gọi . 10 2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hoá . 11 2.2.2.4. Độc lực 12 2.2.2.5. Hình thái 12 2.2.2.6. Cấu trúc 12 2.2.2.7. Vật chất di truyền 13 2.2.2.8. Đa dạng di truyền 15 2.2.2.9. Vật chủ . 16 2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm . 17 2.2.2.11. Cơ chế truyền lan . 18 2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích . 19 2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh 19 2.3. Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác .20 2.4. Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) 21 2.4.1. Lịch sử phát triển .21 2.4.2. Nguyên lý 22 2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) .22 2.4.4. Kháng thể (antibody) .23 2.4.5. Các phương pháp nhuộm 25 2.4.6. Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản 28 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 30 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30 3.2. Vật liệu 30 3.2.1. Mẫu xét nghiệm .30 3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC 32 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ 32 3.2.4. Hoá chất .32 3.3. Phương pháp .33 3.3.1. Bố trí thí nghiệm .33 3.3.2. Quy trình thực hiện 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC .41 4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau 41 4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác nhau 44 4.2. Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả .49 4.2.1. So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC 49 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC 57 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1. Kết luận .59 5.2. Đề nghị 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 6.1. Tài liệu tiếng Việt .61 6.2. Tài liệu tiếng Anh .61 PHỤ LỤC .70 Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm. Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC.

pdf83 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 4442 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (white spot disease – wsd) trên tôm sú (penaeus monodon), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC ÁNH MAI Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO TRẦN NGỌC ÁNH MAI ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 - iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TPHCM và quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm qua. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Vì vậy xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: - TS. Nguyễn Văn Hảo. - ThS. Ngô Xuân Tuyến. - BSTY Lê Thị Bích Thủy. - Các anh chị phòng Mô Học và phòng PCR thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. - Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm và toàn thể nhân viên Trại Thực Nghiệm Nuôi Thuỷ Sản - Thủ Đức – TPHCM. Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên. Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của thầy cô và các bạn. iv TÓM TẮT Virus WSSV (White spot syndrome virus), thành viên của một họ virus mới tên là Nimaviridae, là một loại virus nguy hiểm đối với tôm penaeids vì khả năng gây chết cao và nhanh. Đề tài này được tiến hành nhằm phát triển một quy trình kiểm nghiệm mới ổn định, chính xác và có độ nhạy cao để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam. Đó là quy trình hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng. Đại học Gent đã phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh. Quy trình này được nghiên cứu để thay đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam. Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X, 1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X. Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30 mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp. So với 2 phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng. Khác với mô học truyền thống, IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết. Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản, mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả. Chính vì những ưu điểm nổi bật đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ chính xác. v ABSTRACT White spot syndrome virus (WSSV), member of a new virus family called Nimaviridae, is an invertebrate virus causing considerable mortality in penaeid shrimp. This study was undertaken to develop a stable, accurate and sensitive monoclonal antibody (mAb)-based immunohistochemistry (IHC) test process for detection of WSSV in Penaeus monodon in Vietnam laboratories. The standard operating protocol for IHC test using the WSSV VP28 mAb 8B7 on paraffin-embedded and frozen section was developed by Gent University. To be more suitable in Vietnam condition, this protocol was modified in some details. Four different concentrations of mAb (standard - 1X, 0.5X, 1.5X and 2X) and three different ones of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (1X, 1.5X and 2X) were tested on paraffin embedded sections from tissues of infected and uninfected black tiger shrimp Penaeus monodon and the standard concentration of mAb still proved to be efficient with the 1.5X concentration of DAB. To compare IHC method with Polymerase Chain Reaction (PCR) and traditional histology about accuracy, sensitivity and economic efficiency, 25 samples of post-larvae tissues and 30 samples of adult tissues of Penaeus monodon were tested with these three methods. Of the three, in some cases, IHC was considered to be the most reliable technique because of the specificity of the WSSV VP28 mAb 8B7. Unlike the traditional histology, IHC is not too dependent on the professionalism of the technicians to recognize the infected cells as the color signal (brown) is very clear and easily seen. Besides, IHC seldom gives false positive and negative signals because the manipulation is simple, the samples are not easily contaminated by various factors in process like PCR and the mAb is highly sensitive. For all of the advantages of IHC, we suggest using this method for WSSV diagnostics on Penaeids in research experiments in which accuracy is the prerequisite. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... iii TÓM TẮT ................................................................................................................. iv ABSTRACT ............................................................................................................. v MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xi 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Nội dung.................................................................................................... 2 1.3. Mục đích ................................................................................................... 2 1.4. Yêu cầu ..................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú .................................................................. 3 2.1.1. Phân loại ........................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố .......................................................................................... 3 2.1.3. Vòng đời ....................................................................................... 3 2.1.4. Sinh trưởng .................................................................................... 4 2.1.5. Dinh dưỡng .................................................................................... 4 2.1.6. Môi trường sống ............................................................................ 5 2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam ................... 5 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng .......................................... 6 2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 6 2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng ............................................................ 9 2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng .................................. 9 2.2.2.2. Phân loại và tên gọi ........................................................... 10 2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hoá ................................................................................. 11 2.2.2.4. Độc lực .............................................................................. 12 2.2.2.5. Hình thái ............................................................................ 12 2.2.2.6. Cấu trúc .............................................................................. 12 2.2.2.7. Vật chất di truyền .............................................................. 13 2.2.2.8. Đa dạng di truyền .............................................................. 15 2.2.2.9. Vật chủ ............................................................................... 16 2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm ........................................................... 17 2.2.2.11. Cơ chế truyền lan ............................................................. 18 2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích ..................................................... 19 2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh ............................................ 19 2.3. Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác ................. 20 2.4. Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) .......................... 21 2.4.1. Lịch sử phát triển ........................................................................... 21 vii 2.4.2. Nguyên lý ...................................................................................... 22 2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) ..................................... 22 2.4.4. Kháng thể (antibody) ..................................................................... 23 2.4.5. Các phương pháp nhuộm .............................................................. 25 2.4.6. Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản .......................................................................... 28 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 30 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 30 3.2. Vật liệu ...................................................................................................... 30 3.2.1. Mẫu xét nghiệm ............................................................................. 30 3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC ...................................................................... 32 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 32 3.2.4. Hoá chất......................................................................................... 32 3.3. Phương pháp ............................................................................................. 33 3.3.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 33 3.3.2. Quy trình thực hiện ...................................................................... 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 41 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC ................................. 41 4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau .............................................................................................. 41 4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác nhau .............................................................................................. 44 4.2. Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả ............................................................................................... 49 4.2.1. So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC ............................................................................ 49 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC ............................................................................ 57 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 59 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 59 5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 61 6.1. Tài liệu tiếng Việt ..................................................................................... 61 6.2. Tài liệu tiếng Anh ..................................................................................... 61 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 70 Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm. Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC. viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TPHCM : Thành phố Hồ Chí Minh. ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long. DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride. FAO : Food and Agriculture Organization. IHC : Immunohistochemistry. MBV : Monodon Baculovirus. mAb : monoclonal Antibody. PCR : Polymerase Chain Reaction. ppt : parts per thousand ppm : parts per million WSSV : White Spot Syndrome Virus. YHV : Yellow Head Virus. ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG NỘI DUNG TRANG Bảng 2.1. Các bệnh thường gặp trên tôm penaeids ..............................................7 Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng ................................................................11 Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 ....................................................30 Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 ....................................................31 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 ..........................................................34 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 ..........................................................35 Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả ............................................................................40 Bảng 4.1. Kết quả thống kê chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm ..............................................41 Bảng 4.2. Kết quả thống kê chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm ............................................44 Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb ..45 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm ....................................................................................................50 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC ..........51 Bảng 4.6. So sánh ưu khuyết điểm của 3 phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC .......................................................................................57 x DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH HÌNH NỘI DUNG TRANG Hình 2.1. Sơ đồ vòng đời tôm sú ..........................................................................4 Hình 2.2. Sản lượng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng ...........................8 Hình 2.3. Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới ..........................9 Hình 2.4. Virus đốm trắng ....................................................................................12 Hình 2.5. Protein của WSSV ................................................................................13 Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV ....................................................................14 Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV .........................................19 Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng ..........................................23 Hình 2.9. Các phương pháp nhuộm .....................................................................26 Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC ...................................36 Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu ...................................................................................37 Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D .......................................................................................43 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và đối chứng (không có mAb) trên mẫu 103 ............................................48 Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm Sau khi nhuộm IHC ..............................................................................54 Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và Mô học truyền thống ............................................................................55 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm ngày càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận to lớn cho nền kinh tế quốc dân. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây, phong trào nuôi tôm phát triển rất nhanh, đặc biệt là khu vực các tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre …, và tôm sú (Penaeus monodon) là một đối tượng nuôi chủ lực của ngành nuôi trồng thủy sản nước ta. Tuy nhiên, việc phát triển ồ ạt không định hướng, kỹ thuật quản lý ao chưa tốt, không quan tâm đúng mức đến vấn đề môi trường làm phát sinh nhiều yếu tố rủi ro, trong đó chủ yếu là bệnh tật. Trong nhiều năm gần đây, nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam phải đối đầu với dịch bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Disease – WSD) do virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây nên, một loại bệnh nguy hiểm do tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 1994), khả năng lây nhiễm rất cao, dễ thành dịch bệnh và cho đến hiện nay vẫn chưa có biện pháp phòng và trị hiệu quả. Mức thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra đã lên đến hàng trăm tỷ đồng. Vấn đề quan trọng là diễn biến bệnh xảy ra nhanh, khi người dân nhận biết được những biểu hiện bên ngoài của bệnh trên tôm thì chỉ một thời gian ngắn sau tôm sẽ chết hàng loạt mà không thể chữa được. Vì vậy, việc chẩn đoán nhanh và chính xác mầm bệnh ở đầu vào của qui trình nuôi, cũng như xác định sự hiện diện mầm bệnh WSSV trên tôm trong quá trình nuôi là hết sức cần thiết. Điều này sẽ giúp người dân kiểm soát được mối nguy đầu vào và kịp thời triển khai những biện pháp đối phó khi có mầm bệnh WSSV trên tôm đang nuôi. Cho đến nay đã có nhiều phương pháp xác định WSSV trên tôm sú và giáp xác đã được phát triển và ứng dụng như: Phương pháp mô học truyền thống, một số phương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch đặc hiệu (ELISA, Western blot), phương pháp kính hiển vi điện tử, các kỹ thuật PCR (one-step, two-step nested, realtime-PCR), in situ hybridization…Tuy nhiên việc tìm ra một phương pháp tối ưu vừa nhanh, vừa chính xác, đồng thời có độ tin cậy cao hơn luôn là mối quan tâm lớn của các nhà 2 nghiên cứu bệnh thủy sản. Việc kết hợp kết quả xét nghiệm của hai phương pháp IHC (Immunohistochemistry) và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) trên cùng một mẫu tôm sẽ đáp ứng được mục tiêu trên. Trên cơ sở thiết thực này, được sự phân công của khoa Công Nghệ Sinh Học và được sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” 1.2. Nội dung 1.2.1. Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú. 1.2.2. So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và tính hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR. 1.3 Mục đích Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán ổn định, có độ nhạy và độ chính xác cao, thích hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam. So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác, tính hiệu quả và hiệu quả kinh tế với các phương pháp khác. 1.4 Yêu cầu Phương pháp phải đạt độ chính xác theo tiêu chuẩn ngành. Phải được xây dựng trên một cơ sở khoa học xác định. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú 2.1.1. Phân loại Theo hệ thống phân loại của Hothuis (1980) và Barnes (1987) tôm sú thuộc Ngành: Arthopoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Lớp phụ: Malacostraca Bộ: Decapoda (Mười chân) Bộ phụ: Macrura natantia (Bơi lội) Họ: Penaeidae (Tôm he) Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp 2.1.2. Phân bố Theo chiều ngang: Phân bố rộng rãi trên thế giới, ở vùng Ấn Độ Dương, Tây Thái Bình Dương, từ Pakistan tới Nhật, từ quần đảo Malaysia đến Úc, đặc biệt phân bố tập trung ở vùng Đông Nam Á như Việt Nam, Philipines, Indonesia và Malaysia (Trần Minh Anh, 1989). Theo chiều dọc: Ở giai đoạn ấu trùng và ấu niên Penaeus monodon sống nổi, dần thích nghi sống đáy. Ở vùng cửa sông, ấu niên và thiếu niên tôm sống ở tầng mặt trong khi phần lớn tôm trưởng thành sống ở mực nước sâu khoảng 70 m (ngoài khơi Philippines), hay 30 – 39 m (vịnh Thái Lan) , ở nhiệt độ là 340 C và độ mặn là 35 ppt. 2.1.3. Vòng đời: Theo Vũ Thế Trụ (1995) Tôm mẹ họ Penaeidae đẻ trứng ngoài biển sâu. Trứng nở thành ấu trùng, trôi nổi theo dòng nước và được sóng biển đưa vào gần bờ, nơi có nước sông ngòi đổ ra tạo thành môi trường nước lợ với độ mặn 15 – 25 ppt. Ấu trùng trải qua nhiều giai 4 đoạn biến thái để thành post-larvae (Hình 2.1). Tổng thời gian từ khi nở đến post- larvae 1 (PL1) kéo dài khoảng 10 – 12 ngày. Tại môi trường nước lợ post-larvae sống khoảng vài tuần rồi bơi ngược ra biển, tiếp tục tăng trưởng và sinh đẻ, hoàn tất chu trình tăng trưởng của loài tôm. Hình 2.1: Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon 2.1.4. Sinh trƣởng Tôm gia tăng kích thước bằng cách lột bỏ lớp vỏ cũ của cơ thể. Solid (1988) cho biết tôm sú thường lột xác vào ban đêm. Thời gian để vỏ mới của tôm con cứng lại cần một vài giờ, ở tôm trưởng thành phải cần 1 đến 2 ngày (Viladolid và ctv, 1981). 2.1.5. Dinh dƣỡng Tôm sú ăn tạp (Hall, 1962). Giai đoạn ấu trùng tôm bắt mồi thụ động bằng các phụ bộ với các loại thức ăn phù hợp với cỡ miệng. Apud (1984) nhận định tôm sú ở giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với 2 giống tảo Silic thích hợp là Chaetoceros và Skeletonema. Ở giai đoạn Mysis tôm chuyển sang ăn một số loài động vật phù du, luân trùng và ấu trùng Nauplius của Artermia. Giai đoạn post-larvae tôm ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bã hữu cơ. Hall (1962) cho biết tôm trưởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá, Biển Cửa sông Cửa sông Bờ biển Biển 5 côn trùng. Như vậy tập tính ăn và loại thức ăn của tôm sú khác nhau theo giai đoạn sinh trưởng. 2.1.6. Môi trƣờng sống  Nhiệt độ: Theo Vũ Thế Trụ (1995), nhiệt độ tối ưu cho tôm Penaeus spp. tại các ao hồ vùng nhiệt đới khoảng 28 – 300C. Trên 300C, tôm lớn nhanh nhưng dễ nhiễm bệnh, nhất là bệnh MBV (Monodon Baculovirus). Dưới 280C, tôm chậm lớn.  Độ mặn: Theo Valencia (1977) nhiệt độ và độ mặn tạo nên ảnh hưởng kết hợp. Các loài tôm có tỷ lệ sống cao ở nhiệt độ trung bình thấp và độ mặn trung bình cao nhưng sinh trưởng nhanh hơn ở điều kiện ngược lại.  Hàm lượng oxy hoà tan trong nước: Theo Chiu (1992) tôm sú chết khi hàm lượng oxy hoà tan nhỏ hơn 3,5 mg/l. Theo Chanratchakool và ctv (1995) thì khi hàm lượng oxy nhỏ hơn 4 mg/l tôm sử dụng thức ăn kém và dễ nhiễm bệnh.  Độ pH: Độ pH có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi, pH thấp có thể làm tổn thương các phần phụ, mang, quá trình lột xác và cứng vỏ của tôm (Bauman và Jamandro, 1990).  H2S và NH3-N: Theo Lê Xân (1996), H2S dạng tự do hình thành do sự phân huỷ của các vi khuẩn dị dưỡng trong điều kiện yếm khí. Kungvankji và Chua (1986) khẳng định H2S rất độc hại đối với các sinh vật sống đáy và các loài tôm có đặc tính vùi mình như tôm sú.  Độ kiềm: Độ kiềm tổng cộng trong nước liên quan đến những chất baz (chủ yếu là bicarbonate và carbonate), được tính bằng mg calcium carbonate tương đương trong 1 lit. Mặt nước có lượng kiềm tổng cộng 20 – 150 mg/l thì thích hợp cho sự phát triển của phiêu sinh và loài thủy sản trong đó (Vũ Thế Trụ, 1995). 2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Theo FAO (1995), sản lượng tôm khai 6 thác hằng năm trên thế giới là 2 triệu tấn, trong đó có 30% là tôm nuôi. 50% sản lượng tôm sú được cung cấp từ Châu Á (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998). Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nước mặn và nước lợ. Ông Nguyễn Việt Thắng, Thứ trưởng Bộ Thuỷ Sản cho biết nuôi trồng thuỷ sản đang có bước phát triển nhanh, đóng góp quan trọng cho sự tăng trưởng kinh tế chung của ngành thuỷ sản. Diện tích nuôi trồng thuỷ sản liên tục tăng: Từ 887.500 ha năm 2001 lên khoảng 995.400 ha năm 2004. Theo đó, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản tăng từ 879.000 tấn năm 2001 lên 1.420.000 tấn năm 2004, đạt mức tăng bình quân trên 20%/năm. Tỷ lệ giá trị xuất khẩu so với tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản không ngừng tăng, đến nay đạt khoảng 50%. Tỷ lệ sản lượng nuôi trồng trong tổng sản lượng thuỷ sản chiếm 39% năm 2001 đã tăng lên 48% năm 2004 (Kim Oanh, 2005). Nghề nuôi tôm ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), tuy đã xuất hiện từ lâu nhưng chỉ mới thực sự phát triển từ những năm cuối thập niên 80. Hằng năm, ĐBSCL đóng góp trên 80% sản lượng thủy sản chung của toàn ngành. Tại đây, diện tích nuôi quảng canh chiếm 88%, nuôi bán thâm canh và thâm canh không đáng kể (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998). Theo Nguyễn Thanh Phương (2002), hiện nay ở ĐBSCL đã phát triển và ứng dụng các mô hình nuôi tôm chủ yếu sau: Quảng canh (Extensive culture), quảng canh cải tiến (Improved extensive culture), bán thâm canh (Semi-intensive culture), thâm canh (Intensive culture) và nuôi sinh thái. 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam A. Trên thế giới Việc phát triển ồ ạt của nghề nuôi tôm sú trên thế giới là nguyên nhân dẫn đến sự suy thoái môi trường và dịch bệnh xảy ra khắp nơi (từ Đông Bán Cầu sang Tây Bán Cầu) gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng. Trong đó các bệnh do virus gây ra đang là một thách thức lớn cho sự phát triển nghề nuôi tôm toàn cầu. Các bệnh truyền nhiễm do nhóm virus WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus) và 7 MBV là những bệnh điển hình về mức độ gây thiệt hại nghiêm trọng nhưng cho đến nay vẫn chưa có một loại thuốc hay vaccin nào điều trị hiệu quả. Bảng 2.1. Các bệnh thƣờng gặp trên tôm penaeids (Lightner và Redman, 1998). Mầm bệnh virus Vi khuẩn Nấm Kí sinh trùng Loại khác WSSV YHV BMN MBV IHHNV HPV REO TSV Vibriosis: -Septic HP necrosis -Hatchery vibriosis -Luminescent vibrio -‘Syndrome Gaviota’ -Shell disease NHP bacterium Rickettsia Larval mycosis Fusariosis Epicommensals: -Leucothrix mucor -Peritrich protozoans Gregarines Microsporidian Mất cân bằng dinh dưỡng. Bệnh do độc tố Bệnh do môi trường One month death syndrome Zoea II syndrome Do ảnh hưởng của dịch bệnh năng suất tôm toàn cầu trong năm 1993 chỉ đạt 639.000 tấn, giảm 12% so với năng suất của năm 1992 (Lavilla – Pitogo,1996). Trong năm 1994, tổng thiệt hại gây ra do WSD (White Spot Disease) và YHD (Yellow Head Disease) khoảng 1 tỷ USD đối với các nước có nghề nuôi tôm đang phát triển như Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia, Bangladesh, Malaysia, Đài Loan, Việt Nam và Nhật (World Shrimp Farming, 1998). Dịch bệnh do WSSV gây ra thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều quốc gia như: Ấn Độ (1994 – 1995) làm cho nhiều trang trại nuôi lớn phải đóng cửa (Murthy , 1997), Thái Lan (1996 – 1997) với thiệt hại ước tính lên đến 1 tỷ USD, Trung Quốc (1993) làm sản lượng xuất khẩu tôm từ 115.000 tấn năm 1992 giảm xuống còn 50.000 tấn năm 1993 (Flegel, 2000). Trong 10 năm trở lại đây, WSSV đã khiến ngành công nghiệp nuôi tôm tiêu tốn 20 – 30 tỉ USD (Caleb, 2004). 8 Hình 2.2. Sản lƣợng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng (Caleb, 2004). B. Việt Nam: Ở Việt Nam, tình hình cũng diễn ra tương tự. Cuối năm 1993, tôm nuôi đã chết hàng loạt ở các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau và Bạc Liêu. Hiện tượng này tiếp tục xuất hiện trong hai năm 1994 – 1995 và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994). Gần đây, bệnh đốm trắng đã khiến cho nhiều gia đình nuôi tôm mất trắng, gây thiệt hại hàng trăm tỉ đồng. Dịch bệnh nổ ra ở các tỉnh trên khắp đất nước nhất là tại các tỉnh nuôi tôm trọng điểm như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Tiền Giang … Tại ĐBSCL năm 1999 diện tích là 173.510 ha và sản lượng nuôi là 49.624 tấn, đến năm 2001 diện tích tăng lên thành 404.911 ha và sản lượng đạt 143.822 tấn. Tuy nhiên, đến vụ một năm 2002 mức lây nhiễm bệnh là 30 - 60% trên tổng diện tích thả nuôi, mà bệnh đốm trắng do virus đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm và gây tổn thất lớn. Trong 1 – 2 năm trở lại đây nghề nuôi tôm đã phát triển tới miền Bắc và trên những vùng nuôi tôm mới này bệnh đốm trắng vẫn xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng. Năm Sản lượng (tấn) 9 2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng 2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng Hình 2.3: Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới (CSIRO, 2002). Kể từ khi xuất hiện đầu tiên vào năm 1992-1993 tại Đông Bắc Châu Á, bệnh đốm trắng đã lan nhanh, rộng khắp khu vực Châu Á và khu vực Châu Á-Thái Bình Dương, nhất là các nước có nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh được phát hiện trước tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc (1993), sau đó là Nhật Bản (1993), Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) kèm theo sự sa sút nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên (Wang và ctv, 1998). Bệnh xuất hiện bất thường và được xem như là một hiện tượng của năm 1991 và đầu năm 1992 tại một điểm riêng lẻ ở đông bắc Đài Loan. Bệnh được phát hiện đầu tiên trên Marsupenaeus japonicus nhưng sau đó lan rộng đến Penaeus monodon và Fenneropenaeus penicillatus (Walker, 2000). Chưa phát hiện Đã phát hiện Chưa có số liệu 10 Tháng 3/1992, WSSV lần đầu tiên được phát hiện tại Trung Quốc. Có giả thuyết rằng virus được du nhập vào Trung Quốc từ Đài Loan thông qua nhập khẩu nauplius và post-larvae. Trong 5 tháng sau đó bệnh nhanh chóng lan rộng ở nhiều tỉnh dọc theo bờ biển Trung Quốc (Walker, 2000). Tháng 3 năm 1993, WSSV xuất hiện trên tôm nuôi P. japonicus ở Nhật. Ngay đầu tiên, bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối với tất cả các trang trại ở Hiroshima, Yamagushi, Ohita, Kumamoto, Kagoshima và Okinawa (Walker, 2000). Năm 1993, WSSV cũng được phát hiện trên loài P. orientalis ở vùng biển phía Nam và Tây Triều Tiên (Walker, 2000). Vùng Tây bán cầu: Năm 1995, báo cáo đầu tiên về WSSV xảy ra trên ao nuôi tôm Litopenaeus setiferus ở Texas, Hoa Kỳ. Các quốc gia sau đó phát hiện đốm trắng lần lượt là Guatamela, Elsalvador, Panama, Ecuador và Columbia năm 1999, Nicaragua và Mexico năm 2000 (Walker , 2000). 2.2.2.2. Phân loại và tên gọi A. Phân loại WSSV đầu tiên được phân loại thuộc họ Baculoviridae (Francki và ctv, 1991). Tuy nhiên những phân tích trình tự gần đây của hệ gen WSSV cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống protein của Baculovirus như protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2) (van Hulten và ctv, 2000b), protein VP26, VP28 (van Hulten và ctv, 2000c) của WSSV không giống bất kì một protein đã biết nào trong database. Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác (van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001). Sự khác biệt về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho một họ virus mới (van Hulten và ctv, 2000a). Gần đây nhất, M.A.Mayo (2002) công bố phân loại mới nhất được thẩm định trong Hội nghị Quốc tế về phân loại virus (International Committee on Taxonomy of Virus - ICTV), trong đó xếp WSSV là bộ phận của chi Whispovirus trong họ virus mới gọi là Nimaviridae. 11 B. Tên gọi: Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng Tên Vị trí Tài liệu tham khảo Penaeid Hemacytic Rod Shaped Virus (PHRV) Owens và ctv, 1993 China Baculovirus (CBV) Trung Quốc Chamberlain, 1994 Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) Trung Quốc Huang và ctv, 1994 Rod-shaped Virus of Penaeus japonicus (RV- PJ) Nhật Inouye và ctv, 1994 Penaeus chinesis Baculovirus (PCBV) Trung Quốc Zhan và ctv, 1995 Penaeus monodon non-occluded Baculovirus II (PmNOII) Thái Lan Woongteerasupaya và ctv, 1995 Penaeus monodon non-occluded Baculovirus III (PmNOIII) Đài Loan Wang, 1995 Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus (SEMBV) Thái Lan Woongteerasupaya và ctv, 1995 China Baculo-like virus (CBV) Trung Quốc Tapay và ctv, 1996 Penaeid Rod-shaped DNA virus (PRDV) Nhật Inouye và ctv, 1996 White Spot Baculovirus (WSBV) Đài Loan Chang và ctv, 1996 Yellow head disease-like virus Đài Loan Wang và ctv, 1996a Prawn White Spot Baculovirus (PWSBV) Trung Quốc Yang và ctv, 1997 White Spot Syndrome Baculovirus (WSSB) Thái Lan Durand và ctv, 1997 White Spot Syndrome Virus (WSSV) Đài Loan Lo và Kou, 1998 2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hóa Cũng như đa số các virus, virus gây bệnh đốm trắng WSSV có sức chịu đựng yếu với các yếu tố môi trường. Theo Chang và ctv (1998):  Sau 48 –72 giờ sau khi tiếp xúc môi trường nước mà không tìm được vật chủ thì WSSV sẽ bị phân hủy.  Virus mất khả năng gây nhiễm sau 60 phút dưới tia UV (Ultraviolet) 9 x 105 µWs/cm2.  Trong khoảng nhiệt độ 55 – 750C trong 5 – 90 phút, virus mất khả năng gây nhiễm.  Ozone ở nồng độ 0,5 µg/ml sẽ làm bất hoạt WSSV ở 250C. 12 2.2.2.4. Độc lực Thí nghiệm gây nhiễm mầm bệnh đốm trắng trên giáp xác gồm: 5 loài tôm biển (trong đó có tôm sú), 2 loài tôm nước ngọt (có tôm càng xanh), 4 loài cua và 3 loài tôm hùm, bằng cách cho tiêm hoặc cho ăn WSSV được tách chiết từ tôm sú (P.monodon) nhiễm bệnh cho thấy tất cả các loài đều bị nhiễm đốm trắng với nhiều mức độ gây chết khác nhau. Tôm càng xanh sau khi tiêm 20 ngày tỷ lệ chết 20%, nếu cho ăn tỷ lệ này là 10%. Không có dấu hiệu lâm sàng hoặc chỉ nhìn thấy những chấm nhỏ dưới kính hiển vi. Tôm sú bị nhiễm trong thí nghiệm có cùng triệu chứng lâm sàng như tôm tự nhiên bị nhiễm (Rajendran và ctv, 1999). Tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng thường chết hàng loạt, bệnh này có khả năng gây thành dịch trong vòng 2-7 ngày với tỷ lệ chết từ 20-70%. Nếu thu hoạch chậm tỷ lệ chết sẽ lên đến 70 -100% trong vòng 3-7 ngày kể từ khi có dấu hiệu phát bệnh mạnh (Wang và ctv, 1998). Bệnh này có tốc độ lây lan rất nhanh và nhiễm trên mọi giai đoạn trong vòng đời của tôm sú đặc biệt nhạy cảm từ sau 1-2 tháng nuôi (Lightner, 1996) 2.2.2.5. Hình thái Virion có dạng hình que đến elip hay hình trứng, một đầu bẹt (Vlak và ctv, 2002). Virion có kích thước lớn (80-120 x 250 – 380nm). Virion tinh sạch từ tôm sau khi nhuộm cho thấy có một phần phụ giống như đuôi. (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Wang, 1995). Hình 2.4. Virus đốm trắng (Vlak và ctv, 2002) (A) Ảnh hiển vi điện tử của hạt virus WSSV. (B) Ảnh hiển vi điện tử của nucleocapsid. 2.2.2.6. Cấu trúc Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: Bao màng (envelope), nucleocapsid và vật chất di truyền. 13 Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 (trọng lượng phân tử là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa). VP28 và VP19 kết hợp với phần envelope, còn VP26, VP24, VP15 gắn với nucleocapsid của virion (van Hulten, 2002). VP24 – có 41 aminoacid tận cùng bằng đầu N – đã được phân tích sinh hóa và xác định gen mã hóa (vp24) trên genome. Phân tích cho thấy VP24, VP26, VP28 rất giống nhau ở mức aminoacid và nucleotide (van Hulten, 2000a). Trong một phát hiện mới nhất, các nhà khoa học đã công bố một protein cấu trúc khổng lồ của WSSV, protein VP664, có chức năng chưa rõ, có thể là tham gia vào quá trình lắp ráp virion. Nhiều kháng huyết thanh đa dòng kháng protein này được tạo ra và một trong số đó đã được ứng dụng thành công trong phân tích immunoelectron microscopy để định vị protein này trên virion (Leu và ctv, 2005). Hình 2.5. Protein của WSSV (Vlak và ctv, 2002). (A) Điện di protein của WSSV đã được tinh sạch 1: Marker; 2: protein tinh sạch từ tôm sông (P. clarkii) không nhiễm WSSV; 3: WSSV đã tinh sạch; 4: Nucleocapsid của WSSV (B) Mô hình cấu trúc đơn giản của virion WSSV 2.2.2.7. Vật chất di truyền WSSV là virus trên động vật không xương sống biển đầu tiên được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001). Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thước thay đổi tùy theo các mẫu phân lập khác nhau: 305107 bp (GenBank Accession No. AF332093), 292967 bp (GenBank Accession No. AF369029) và 307287 bp (GenBank Accession No. AF440570) tuần tự ứng với virus phân lập từ Trung Quốc, Thái Lan và Taipei China. 14 Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV.(Yang và ctv, 2001) Hình mũi tên (vòng ngoài): Vị trí của 181 ORFs (màu đỏ và màu xanh chỉ hướng dịch mã khác nhau). Hình chữ nhật màu xanh lá chỉ 9 hrs. B: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI (vòng trong, số trong ngoặc đơn chỉ vị trí) Genome virus chứa 184 khung đọc mở (open reading frame – ORFs) (van Hulten và ctv, 2001). Theo Yang và ctv (2001), genome WSSV có 9 vùng đồng dạng chứa 47 tiểu phần lặp lại, gồm lặp trực tiếp (direct repeat), lặp đảo ngược không điển hình (atypical inverted repeat), và những trình tự thuận nghịch không hoàn chỉnh. Tuy WSSV tương tự như Baculovirus về hình thái nhưng hai loại virus này lại không liên hệ đáng kể ở mức amino acid. Vài gen của WSSV lại giống với gen của eukaryote hơn là với gen virus. Phân tích trình tự cho thấy WSSV khác với tất cả những virus đã biết trước đây dù có một số gen tương đồng yếu với gen herpesvirus. Hầu hết các ORFs mã hoá protein không tương đồng với bất cứ protein đã biết nào, cho thấy WSSV đại diện cho một lớp virus mới hay một khoảng tiến hoá quan trọng giữa virus biển và virus mặt đất. Điểm đặc biệt nhất của WSSV là sự hiện diện của một gen mã hoá colagen 15 nguyên vẹn, vốn là gen mã hoá một protein matrix ngoại bào của tế bào động vật chưa bao giờ thấy trong bất cứ virus nào. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện genome của WSSV có một ORF khổng lồ chứa 18.234 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 6.077 aminoacid với chức năng chưa biết. Polypeptide này được gọi là protein VP664 và thuộc nhóm protein cấu trúc của virus (Leu và ctv, 2005). 2.2.2.8. Đa dạng di truyền Theo Marks và ctv (2003) cho đến nay virus WSSV phân lập từ tôm penaeids ở các vùng địa lý khác nhau thì rất giống nhau về hình thái và proteome, chỉ khác nhau một chút trong sự đa hình về độ dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) chủ yếu do có nhiều đoạn chèn nhỏ (insertions) và một đoạn loại bỏ (deletion) lớn (khoảng 12 kbp) (Chen và ctv, 2002). Mark và ctv (2003) đã xác định được trên bản đồ di truyền những khác biệt giữa ba dòng WSSV: Dòng Thái Lan (WSSV – TH), dòng Trung Quốc (WSSV – CN) và dòng Đài Loan (WSSV – TW). Các dòng virus này có nucleotide tổng số giống nhau đến 99,32%. Sự khác biệt chủ yếu là trên cùng một vùng gen tương ứng của 3 dòng có sự loại bỏ khoảng 13 kb ở dòng WSSV – TH, 1 kb ở dòng WSSV – CN và không có gì thay đổi ở dòng WSSV – TW. Sự khác biệt thứ hai liên quan đến một vùng biến đổi di truyền khoảng 750 bp. Tất cả những sai biệt khác > 2 bp giữa 3 dòng đều nằm ở những vùng lặp lại dọc theo genome, chủ yếu ở những ORFs (trừ vùng đồng dạng hr1, hr3, hr8 và hr9). Theo Dieu và ctv (2004), sự khác biệt nói trên đã đưa đến một giả thuyết là đã có một sự phân nhánh virus từ một dòng tổ tiên bắt nguồn từ eo biển Đài Loan đến Thái Lan nhưng cần tiến hành thêm nhiều phân tích khác biệt giữa nhiều dòng ở các vùng địa lý khác nữa mới khẳng định được giả thuyết. Các nhà khoa học này đã phân tích RFLP tám dòng WSSV Việt Nam (VN), trong đó có 6 dòng thu từ bờ biển miền Trung và 2 dòng từ bờ biển miền Nam và cho thấy sự khác biệt trình tự ở các vị trí biến đổi đã được đề cập. Những vị trí này được phân tích chi tiết bằng PCR, tạo dòng và đọc trình tự. Tương ứng với dòng WSSV-TW, tất cả những dòng từ miền Trung đều mất 85 kb ở vùng biến đổi chính ORF23/24, trong khi đó những dòng từ miền Nam thì lại mất 115 hay 122 kb tương tự như sự loại bỏ 12 hay 132 kb ở WSSV-CN 16 và WSSV-TH. Ở vùng biến đổi phụ ORF14/15, so với dòng WSSV-TH, tất cả các dòng Việt Nam đều mất đoạn với kích thước khác nhau. Dữ liệu cho thấy các dòng VN và dòng WSSV-TH có cùng nguồn gốc từ WSSV-TW và WSSV-CN, và WSSV đã xâm nhập vào Việt Nam theo nhiều đường khác nhau. 2.2.2.9. Vật chủ Cho đến nay đã tìm thấy sự hiện diện mầm bệnh đốm trắng (WSSV) trên:  Tôm he :15 loài  Các loài tôm khác :7 loài  Cua :12 loài  Tôm hùm :9 loài  Copepoda Vật chủ chính: P.monodon; P.japonicus; P.penicillatus; P.chinensis Đã có nhiều báo cáo về nhóm vật chủ của virus gây hội chứng đốm trắng WSSV.  WSSV gây nhiễm trên các loài tôm He ở Châu Á như: Penaeus monodon, P. japonicus, P. merguiensis, P. chinensis, P.semiculatus, P. indicus, P. penicillatus, Trachypenaeus cuvirostris, Metapenaeus ensis (Lightner, 1996, 1997).  WSSV hiện diện trên một số bộ phận cơ thể của một số loài cua : Charypdis feriatus, C. natator, Portunus pelagicus, P. sanguilonentus (Kou và ctv, 1998), Scylla serrata (Chen và ctv, 2000).  Qua sử dụng kỹ thuật PCR đã phát hiện có sự hiện diện của WSBV trên các loài tôm: P. monodon ; P. japonicus; P. penicillatus; P. semiculatus; và Metapenaeusensis ( Lo và ctv, 1996).  Một thí nghiệm về tính mẫn cảm đối với WSBV trên một số loài tôm và giáp xác khác của Rajendra và ctv (1999) đã kết luận, 5 loài tôm biển ở vùng Đông Nam Ấn Độ: Penaeus monodon, P. japonicus, P. merguiensis, P. semiculatus, P. indicus, Metapenaeus monoceros, M. 17 dobsoni; hai loài tôm nước ngọt: Macrobranchium rosenbergii và M. idella; 4 loài cua: Sylla serrata, S. tranquebarica, Metapograpus sp., Sesarma sp.; 3 loài tôm hùm: Panulirus homarus, P.ornatus, P. polyphagus đều bị nhiễm WSBV sau khi cho tiêm hoặc cho ăn dịch tôm hoặc tôm bị nhiễm đốm trắng. 2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm Cơ quan đích của WSSV: WSSV xuất hiện ở hầu hết các mô hoặc cơ quan có nguồn gốc ngoại bì hoặc trung bì như biểu mô thành dạ dày, biểu mô dưới lớp vỏ cutin, mô liên kết, mang, buồng trứng, lõi dây thần kinh bụng, mô tạo máu, cơ quan lymphoid, các tế bào máu, tim (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Lightner, 1996; Wang và ctv, 1999). Tuy chưa có báo cáo về đường xâm nhập của WSSV vào tế bào nhưng các nhà khoa học đã xác định sự sao chép, trưởng thành và lắp ráp của virion xảy ra trong nhân. Ở nhân, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, xuất hiện những thể hình sợi, hình hạt (có thể là chất nền của virus), những cấu trúc giống như màng. Sau đó có thể quan sát thấy những ống dài và rỗng. Những ống nhỏ này vỡ ra thành từng mảnh nhỏ, hình thành nucleocapsid (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Durand và ctv, 1997; Wang và ctv, 2000). Có hai giả thuyết về sự phát triển hình dạng WSSV. Theo một số tác giả (Durand và ctv, 1997), trước khi phần lõi đi vào trong thì nucleocapsid đã được bao phủ bởi màng (envelop), để lại một khoảng hở. Protein nhân (nucleopotein) dạng sợi chui vào trong capsid qua khoảng hở này. Khi phần lõi hoàn tất, phần bao thu hẹp đầu hở và tạo thành đuôi của virion trưởng thành. Trái lại, một số tác giả khác lại cho rằng nucleocapsid hoàn chỉnh được lắp ráp đầu tiên, sau đó mới được bao lại (Wang và ctv, 2000). Sau khi lắp ráp, virion trưởng thành có thể kết lại với nhau thành một dãy hoặc phân tán trong dịch nhân. Làm thế nào WSSV virion rời khỏi tế bào chủ vẫn chưa được biết rõ nhưng sau khi virion phá vỡ tế bào nhiễm bệnh thoát ra ngoài, chúng tiếp tục xâm nhập vào các tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra môi trường ngoài. Tôm ăn phải virus tự do trong bùn ao và nước sẽ nhiễm bệnh (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2001). 18 2.2.2.11. Cơ chế truyền lan Quá trình truyền lây xảy ra khi mầm bệnh được truyền từ nguồn bệnh (cá thể bệnh, yếu tố truyền lây, trực tiếp từ môi trường ngoài) vào cơ thể cá thể khỏe, lúc này cá thể đã bị nhiễm bệnh. Mầm bệnh WSSV có thể truyền lan theo hai trục:  Trục ngang: là con đường chủ yếu. Từ nguồn nước, từ thức ăn, từ các giáp xác hoang dã trong ao, đặc biệt là do tôm khỏe ăn tôm chết do bị bệnh đốm trắng trong ao, đây là con đường lây lan rất nhanh gây chết tôm hàng loạt (Tookwinas, 1998). Một số loài tôm hoang dã và giáp xác khác được xem là vật truyền lan gây bùng nổ bệnh đốm trắng trong ao nuôi khi chúng xâm nhập vào thông qua con đường thay nước (Limsuwan và ctv,1997). Bằng xét nghiệm sinh học (bioassay) và mô học cho thấy cua, tôm nước ngọt, tôm hùm có thể đóng vai trò như là vật chủ mang hoặc chuyên chở mầm bệnh không triệu chứng (asymtomatic). Tôm hùm đóng vai trò chính như là vật chủ dự trữ đối với WSSV; nó có thể bị nhiễm từ phân chim, nước thải ra biển và có thể mang WSSV trong thời gian dài mà không bị bệnh, là nguồn lây nhiễm cho nguồn tôm bố mẹ tự nhiên (Rajendran và ctv, 1999). Ngoài ra còn có những tác nhân khác như các loài vật ăn thịt như cá, chim, chó, mèo sẽ đưa mầm bệnh từ ao này sang ao khác làm lan tràn dịch bệnh, những tác động của con người qua thao tác trong quá trình nuôi. Sử dụng phương pháp lai DNA chỉ ra rằng ruột và mang tôm sú là đường xâm nhập của virus đốm trắng vào cơ quan tạo máu, mang là nơi sinh sản ra virus (Chang và ctv, 1996) .  Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con. Tuy nhiên khả năng truyền theo trục dọc vẫn chưa được chứng minh mặc dù SEMBV đã được phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998). 19 2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích Tôm bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Takahashi và ctv, 1994; Wang và ctv, 1998). Bên trong vỏ giáp xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 0,5 – 2 mm, xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp và đốt bụng thứ V, VI. Những đốm này chính là sự tích tụ calcite (Wang và ctv, 1996b), sự tạo thành chúng cần các tế bào biểu bì cutin bị nhiễm virus nặng (Chang và ctv, 1998) và sự bao bọc các sợi trong tế bào chất và các kênh trong biểu bì (Wang và ctv, 1999). Đốm trắng thường xuất hiện cùng với sự đổi màu thành tái hay đỏ hồng (Nakano và ctv, 1994). Tuy nhiên, những biểu hiện như xuất hiện đốm trắng và đổi màu cũng có thể xảy ra do điều kiện môi trường hay bệnh vi khuẩn (Charatchakool và ctv, 1995). Gan tụy trương, có màu trắng hoặc hơi vàng. Tôm bệnh có dấu hiệu trương nhân trong tế bào bị nhiễm do tích tụ hạt virus (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung). Tỉ lệ tôm chết lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 1994). Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV. (Vlak., 2002) (A) Tôm bị nhiễm WSSV. (B) Tế bào bị nhiễm WSSV trong mang của tôm sông. 2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh : Hiện nay chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng trên tôm nên phòng là chủ yếu. Biện pháp phòng trừ tổng hợp được dùng rộng rãi trên thế giới.  Lựa chọn post-larvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (mô học, PCR, sốc formalin). 20  Chẩn đoán chính xác, kịp thời, lập chương trình kiểm soát dịch bệnh đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với WSSV.  Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh: + Sử d

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan van hoan chinh.pdf
Luận văn liên quan