Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện một số gen độc lực của nhóm escherichia caoli sản sinh độc tố shiga (stec) phân lập được từ phân bò, heo và thịt bò

LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn đến: Gia đình đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi cả về vật chất lẫn tinh thần, là chỗ dựa vững chắc để tôi học tập tốt. Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. Thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. BSTY Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. BSTY Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi Trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Chân thành cảm ơn Đàm Thị Minh Thơ TÓM TẮT ĐÀM THỊ MINH THƠ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 9/2005. “ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA NHÓM E. COLI SẢN SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN BÒ, HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”. Hội đồng hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân BSTY Bùi Thị Thu Trang Đề tài được thực hiện nhằm phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA, và gen uid của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Quan sát và ghi nhận trên môi trường MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng, trên môi trường SMAC có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng, trên môi trường CT-SMAC cũng có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt. Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau: Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó. 100% mẫu phân tiêu chảy đều có E. coli mang gen gây dung huyết ehxA. Tần số phát hiện gen stx của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 50% ở bò, 44,4% ở heo cai sữa và 100% trên bê. Ở phân bò tiêu chảy: có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen độc lực thuộc nhóm Stx; 10/10 mẫu (100%) phát hiện E. coli mang gen ehxA; 4/10 mẫu (40%) E. coli mang gen stx2, 1/10 mẫu (10%) E. coli mang gen stx1; và không phát hiện được gen uid và eae. Ở phân heo cai sữa tiêu chảy: có 4/9 mẫu (44,4%) phát hiện E. coli mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA. Ở phân bê tiêu chảy: có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện 2 -3 gen độc lực; 8/8 mẫu (100%) phát hiện được gen ehxA; 7/8 mẫu (87,5%) phát hiện được gen stx1; 1/8 mẫu (12,5%) phát hiện được gen stx2. Trong khi đó, không phát hiện được gen uid trong bất kì mẫu nào, 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và stx. 9 mẫu bề mặt thịt bò khảo sát hoàn toàn chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli. Chưa phát hiện được gen uid và eae trong 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo cai sữa; và 9 mẫu bề mặt thịt. SUMMARY “The application of multiplex - PCR in detecting some virulent genes of E. coli isolated from diarrhea faeces of bovine and swine, swabs of beef surface” The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, ehxA and uid genes of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of bovines, calves, piglets, and 9 swabs of the beef surface by multiplex - PCR. There was the observing on each the isolating medium: one kind of pink colony on MAC (HM), white colony on SMAC (TS), pink colony on SMAC (HS), white colony on CT-SMAC (TCT), and pink colony on CT-SMAC (HCT). Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the colony groups and each separate colonies were extracted by the heat method. The results of multiplex - PCR were showed that: The colony group had virulent genes, the separate colony belonging to that group did or did not have those genes. (2) Frequency of ehxA gene of isolated E. coli from diarrhea stools samples was 100%; stx gene was 50% from bovine; 100% from calves; 44.4% from piglets. In diarrhea bovine stools samples: 5 of 10 samples (50%) detected E. coli carrying stx gene, all of 10 samples (100%) were detected E. coli carrying ehxA gene, 4 of 10 samples (40%) were detected E. coli carrying stx2, 1 of 10 samples (10%) were detected E. coli carrying stx1, none of those samples were detected E. coli carrying uid and eae. In diarrhea piglet stools samples: 4 of 9 samples (44.4%) were detected E. coli carrying stx, including of 1 of 4 samples were detected E. coli carrying stx1 (25%) and 3 of 4 samples were detected E. coli carrying stx2 (75%); all of 9 samples (100%) were detected E. coli carrying ehxA, and no sample was detected E. coli carrying uid and eae. In diarrhea calf stools samples: all of 8 samples (100%) were detected no less than one virulent gene, some samples were detected 2-3 virulent genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected stx1 gene; 1 of 8 samples (12.5%) was detected stx1 gene; all of 8 samples (100%) were detected ehxA gene. Meanwhile, no sample was detected uid and eae genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected E. coli carrying both ehxA and stx genes. (3) 9 swabs samples were investigated but no sample contained the E. coli carrying the virulent genes . (4) In the 27 diarrhea bovine, calf, piglet stools samples, uid and eae genes have not been detected yet. MỤC LỤC TRANG Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các bảng x Danh sách các sơ đồ, biểu đồ, hình xi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu – yêu cầu 2 1.2.1. Mục tiêu 2 1.2.2. Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Vi khuẩn E. coli 3 2.1.1 Đặc điểm sinh học 3 2.1.2. Yếu tố kháng nguyên 3 2.1.3. Phân loại E. coli 4 2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC) 5 2.2.1.Thuật ngữ 5 2.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 6 2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx) 6 2.2.2.2. Enterohemolysin 8 2.2.2.3. Yếu tố bám dính 8 2.2.3. Cách sinh bệnh 9 2.2.4. Khía cạnh lâm sàng 10 2.2.5. Dịch tễ học 11 2.2.6. Chẩn đoán 12 2.2.7. Phòng ngừa 12 2.3. Serotype O157:H7 12 2.4. Kỹ thuật PCR 14 2.4.1. Khái niệm 14 2.4.2. Nguyên tắc 14 2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR 15 2.4.4. Phân tích kết quả PCR 16 2.4.5 Multiplex – PCR 16 2.4.6. Ứng dụng 16 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 18 3.1.1. Thời gian 18 3.1.2. Địa điểm 18 3.2. Nội dung thực hiện 18 3.3. Phương pháp thực hiện 18 3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản . 18 3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 19 3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli 19 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy 19 3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính 19 (1) Nuôi cấy và phân lập 19 (2) Chọn khuẩn lạc E. coli 20 (3) Thử sinh hóa 20 3.3.3. Ly trích DNA 20 3.3.4. Qui trình multiplex – PCR 22 3.3.5. Điện di, đọc kết quả 23 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 24 4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảy 26 4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 28 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ bề mặt thịt bò 29 4.5 Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò và heo 31 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1. Kết luận 34 5.2. Tồn tại và đề nghị 34 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 7. PHỤ LỤC 41 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/E Attaching-and-effacing CT - SMAC Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Eae E. coli attaching and effacing FAO Food and Agriculture Organization FDA Food and Drug Administration HC Haemorrhagic colitis HCT Khuẩn lạc hồng trên môi trường CT - SMAC EhxA Haemolysin HM Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC HS Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC HUS Haemolytic uraemic syndrome IMViC Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon Citrate MAC MacConkey NA Nutrient agar PCR Polymerase chain reaction PVC Môi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefixime SMAC Sorbitol MacConkey STEC Shiga toxin-producing E. coli Stx Shiga toxin TBE Tris borate EDTA TCT Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT - SMAC TS Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC UV Ultra violet VSV Vi sinh vật VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic E. coli DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Danh pháp các thành viên trong họ Stx 6 Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng multiplex – PCR 22 Bảng 4.1. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc (HM, TS, và HS) ở phân bò tiêu chảy 25 Bảng 4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực E. coli từng khuẩn lạc riêng lẻ ở phân bò tiêu chảy 26 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân heo cai sữa tiêu chảy 27 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc ở phân bê tiêu chảy 29 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên bề mặt thịt bò 30 Bảng 4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên 36 mẫu khảo sát 32 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ, HÌNH SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập, định tính E. coli và phát hiện gen độc lực 21 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên 36 mẫu khảo sát 32 HÌNH Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR 33