Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của E.coli gây tiêu chảy ở người

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG ----------------- PHẠM THỊ NHÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Người hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Phú Hùng THÁI NGUYÊN - 2010 NỘI DUNG BÁO CÁO 1. Mở đầu 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả và thảo luận 4. Kết luận và kiến nghị 1. MỞ ĐẦU Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Một trong những nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn E.coli. Việc xác định nhanh các nhóm E.coli bằng các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định E.coli gây tiêu chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu nhất. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của E.coli gây tiêu chảy ở người”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện các gen độc lực của 5 nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, làm tiền đề cho việc tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán các nhóm E.coli gây tiêu chảy. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Các chủng E.coli chuẩn Quốc tế do Phòng Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1, EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối chứng không có gen độc lực). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose Hình 2.1. Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu Bảng 2.1. Các trình tự mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ KHUẨN LẠC DNA được tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc E.coli bằng phương pháp của Cebula và cộng sự (1995) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Ưu điểm: - Tổng thời gian tách DNA là 25 phút - Không phải tiêu tốn nhiều hóa chất - Lượng DNA thu được là rất nhỏ, nên nó được sử dụng trực tiếp (3 µl/1 phản ứng) mà không cần tiến hành pha loãng Nhược điểm: DNA thu được không đủ để phát hiện bằng phương pháp điện di thông thường 3.2. KHUẾCH ĐẠI CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA CÁC NHÓM E.COLI 3.2.1. Gen độc lực eae Hình 3.1. Kết quả khuếch đại gen eae M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. ETEC; 3. EHEC1; 4. EAEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. EC 3.2.2. Gen độc lực vt1 Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gen vt1 M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EHEC1; 2. EC; 3. EAEC; 4. EPEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. ETEC 3.2.3. Gen độc lực vt2 Hình 3.3. Kết quả khuếch đại gen vt2 M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EHEC1; 2. EHEC2; 3. EPEC; 4. ETEC; 5. EIEC; 6. EAEC; 7. EC 3.2.4. Gen độc lực elt Hình 3.4. Kết quả khuếch đại gen elt M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1; 3. EHEC2; 4. ETEC; 5. EAEA; 6. EIEC; 7. EC 3.2.5. Gen độc lực IpaH Hình 3.5. Kết quả khuếch đại gen IpaH M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EIEC; 3. EHEC1; 4. EHEC2; 5. ETEC; 6. EAEC; 7. EC 3.2.6. Gen độc lực EAST1 Hình 3.6. Kết quả khuếch đại gen EAST1 M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1; 3. EHEC2;4. EIEC; 5. ETEC, 6. EAEC; 7. EC Bảng 3.1. Kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm của nhóm EHEC + : Dương tính - : Âm tính Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 2. KIẾN NGHỊ Tiếp tục phát triển nghiên cứu, tối ưu hoá các phản ứng PCR để có thể chẩn đoán E.coli trực tiếp trên các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy. 1. KẾT LUẬN Đã tách chiết được DNA tổng số của các nhóm vi khuẩn E.coli bằng phương pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc, tiết kiệm được nhiều thời gian và hoá chất nghiên cứu. Khuếch đại thành công các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli là: eae, vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1. Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi để tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán tác nhân gây bệnh là E.coli.