Ứng dụng kỹthuật PCR và RT-PCR trong chẩn đoán WSSV (white spot syndrome virus) và GAV (gill-associated virus) trên tôm sú (penaeus monodon) ở đồng bằng Sông Cửu Long

Intelligene Corporation, Đài Loan) a) Ly trích ARN − Cho mẫu (mang hoặc 5, 10 tôm bột) vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 500 µl dung dịch ly trích ARN − Nghiền mẫu trong típ bằng que nghiền và giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút. − Thêm 100 µl CHCl3 sau đó lắc kĩ trong 20 giây. Giữ ở nhiệt độ phòng 2-3 phút, sau đó ly tâm (12.000 vòng/phút) trong 15 phút. − Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang một ống eppendorf 0,5 ml mới có chứa 200µl 2-propanol (isopropanol). − Lắc nhẹ, ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol − Rửa phần viên bằng 0,5 ml ethanol 75% sau đó ly tâm cho lắng xuống trong 5 phút ở 75.000 vòng/phút đến khi xuất hiện phần viên, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô phần viên. − Hòa tan phần viên với 500 µl nước cất tiệt trùng. b. Quy trình khuếch đại Hóa chất phản ứng : Phản ứng RT-PCR 1: 8 µl / Phản ứng Chuẩn bị các chất cần thiết sau: - RT - PCR Pre-Mix reagent 7,0 µl - Iqzyme ADN Polymerase 2UI/µl 0,5 µl - Reverse Transcriptase (RT) Enzyme Mix 0,5 µl Phản ứng nested PCR : 15 µl / Phản ứng Chuẩn bị các chất cần thiết sau: - Nested Pre-Mix reagent 14 µl - Iqzyme ADN Polymerase 2UI/µl 1 µl Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 29 Điều kiện phản ứng: Phản ứng RT-PCR: 420C trong 30 giây 940C trong 2 phút Sau đó 940C trong 20 giây 620C trong 20 giây 720C trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 15 lần 720C trong 30 giây 200C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng PCR bước 2: 940C trong 20 giây 620C trong 20 giây 720C trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 30 lần 720C trong 30 giây 200C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng. Các thao tác thực hiện phản ứng: − Lấy 8 µl RT-PCR cho vào ống eppendorf 0,2 ml đã được đánh dấu. − Thêm 2 µl mẫu ly trích ARN cần xét nghiệm hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng trộn đều. − Thực hiện phản ứng RT-PCR − Sau khi phản ứng kết thúc thêm 15µl hỗn hợp thứ 2 vào ống chứa sản phẩm phản ứng RT-PCR. − Thực hiện phản ứng PCR thứ 2. − Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% có chứa Ethium Bromide để kiểm tra c. Chạy điện di (giống mục 3.3.3 d) d. Đọc kết quả Mẫu dương tính và mẫu đối chứng sẽ hiện những vạch trên gel như ở hình 3.1 • Những mẫu YHV/GAV âm tính chỉ hiện vạch 848 bp là RNA thông tin của tôm • Nếu mẫu hiện lên vạch 277 bp và 777 bp thì mẫu nhiễm YHV nặng. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 30 • Nếu mẫu chỉ hiện vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nhẹ. • Nếu mẫu hiện lên vạch 406 bp và 777 bp thì mẫu nhiễm GAV nặng. • Nếu mẫu hiện lên vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ • Nếu mẫu chỉ hiện vạch 680 bp thì mẫu âm tính YHV/GAV Hình 3.1 Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện YHV/GAV theo kit IQ2000 • Giếng 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng • Giếng 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng • Giếng 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng • Giếng 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng • Giếng 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng • Giếng 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng • Giếng 7: Mẫu nhiễm YHV nặng • Giếng 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ • Giếng 9: Mẫu nhiễm GAV nặng • Giếng 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ • Giếng 11: Mẫu âm tính YHV/GAV • Giếng M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp 3.3.3 Qui trình RT- PCR phát hiện GAV (Theo Cowley et al., 2000) Mẫu tôm dương tính với YHV theo kit IQ2000YHV/GAV sẽ được thực hiện lại bằng qui trình RT-PCR 630bp 848bp 333bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 31 a) Ly trích ARN (Sử dụng Trizol) − Cho 50-100 mg mẫu vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 750 µl trizol (lượng mẫu không vượt quá 10% trizol). − Nghiền mẫu và giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút. − Ly tâm 12000 trong 10 phút để tạo phần viên − Chuyển dịch trong sang một ống eppendorf mới − Thêm 200 µl chloroform/1ml Trizol. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15 giây − Ủ ở 15-300C từ 2-3 phút − Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút. − Chuyển phần trong phía trên sang một ống eppendorf 1.5 ml mới − Thêm 500 µl isopropanol/1ml Trizol − Ủ ở 15-300C trong 10 phút − Ly tâm 12.000 vòng 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol − Rửa phần viên bằng ethanol 75%, 1ml ethanol 75%/1ml Trizol − Trộn đều bằng vortex và ly tâm 7500 vòng trong 5 phút, sau đó làm khô phần viên − Hòa tan phần viên với 40 µl ARN water free, trữ -800C. b) Tạo cDNA: ARN được ly trích từ mẫu tôm bệnh sẽ được tạo cDNA Trộn hỗn hợp A: Bảng 3.4 Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp A tạo cDNA Hoá chất/Dung dịch Thể tích dNTP (10mM) 0,5 mM Mồi RH 50ng/µl) 1 µl ARN (200ng/µl) 5 µl Nước 0,5 µl Hỗn hợp được ủ 650C trong 5 phút Sau đó làm lạnh (20-250C) hỗn hợp cũng trong 5 phút Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 32 Trộn hỗn hợp B: Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp B tạo cDNA Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 5X 2 µl DDT 0,5 µl Supper Reverse transcriptase III 0,5 µl Hỗn hợp được ủ 420C trong 5 phút Sau đó làm lạnh (20-250C) hỗn hợp cũng trong 5 phút Điều kiện phản ứng: 250C trong 7 phút 550C trong 50 phút 700C trong 15 phút Giữ ở 200C c) Khuếch đại ADN PCR bước 1: Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 của qui trình Cowley et al. (2000) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 2,5 µl MgCl2 (50 mM) 2,5 µl dNTP (10mM) 0,5 µl Taq ADN polymerase 2UI/µl 0,25 µl Nước 15,75 µl Mồi GAV 5/6 (25pmol) 2,5 µl Sản phẩm sao mã ngược 1 µl Tổng 25 µl Điều kiện phản ứng: 940C trong 1 phút Sau đó 940C trong 30 giây 580C trong 30 giây 720C trong 40 giây Lặp lại chu kì trên 35 lần 720C trong 7 phút Giữ 200C trong 10 phút Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 33 PCR bước 2: Bảng 3.7 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 của qui trình Cowley et al. (2000) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 2,5 µl MgCl2 (50 mM) 1,5 µl dNTP (10mM) 0,5 µl Taq ADN polymerase 2UI/µl 0,25 µl Nước 14,75 µl Mồi GAV 1/2 (25pmol) 2,5 µl Sản phẩm sao mã ngược 2 µl Tổng 25 µl Điều kiện phản ứng: 940C trong 1 phút Sau đó 940C trong 30 giây 580C trong 30 giây 720C trong 45 giây Lặp lại chu kì trên 35 lần 720C trong 7 phút Giữ 200C trong 10 phút d) Chạy điện di Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1% agarose. Chuẩn bị bản thạch (gel): Đun nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó để dung dịch nguội khoảng 50-600C cho Ethium Bromide vào và đổ agarose vào khay đã chuẩn bị trước. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Thường bề dày của gel không quá 0,8cm. Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược gel và các keo dán 2 bên ra khỏi khay đựng gel. Điện di Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34 Dùng thang ADN cho từng gel, dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X Loading Dye (2,5 – 3 µl) vào từng giếng một. Sử dụng thang ADN để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nối bồn điện di với nguồn điện để chạy. Sử dụng dòng điện từ 100-150V (không vượt quá 150V) để chạy gel. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. e) Đọc kết quả Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang ADN 1 kb ladder để xác định trọng lượng phân tử. Phương thức chẩn đoán: Mẫu hiện lên vạch 317 bp là mẫu dương tính với GAV Hình 3.2: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện GAV theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) M: Thang đo; 1: Đối chứng dương; 2: Đối chứng âm; 3: Mẫu nhiễm GAV 3.3.4 Qui trình RT-PCR phát hiện gen β - actin ở tôm (Oanh, 2007) a) Ly trích ARN (Sử dụng Trizol) giống phần 3.3.3a b) Tạo cADN (giống phần 3.3.3b) c) Khuếch đại ADN Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 35 Bảng 3.8 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 2,5 µl MgCl2 (50 mM) 2,5 µl dNTP (10mM) 0,5 µl Taq ADN polymerase 2UI/µl 0,25 µl Nước 15,75 µl Mối β - actin F (25pmol) 1,25 µl Mồi β - actin R (25pmol) 1,25 µl Sản phẩm sao mã ngược 1 µl Tổng 25 µl Điều kiện phản ứng: 940C trong 1 phút Sau đó 940C trong 25 giây 580C trong 30 giây 720C trong 30 giây Lặp lại chu kì trên 35 lần 720C trong 7 phút Giữ 200C trong 20 phút d) Chạy điện di (giống mục 3.3.3 d) e) Đọc kết quả Kết quả điện di sẽ được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang ADN 1 kb ladder để xác định trọng lượng phân tử. Phương thức chẩn đoán: Mẫu hiện lên vạch 216 bp là ARNtt của tôm Hình 3.3 Minh họa kết quả chạy PCR theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) M: Thang đo; 1: Đối chứng dương; 2: Đối chứng âm; 3: vạch chỉ gen β-actin của tôm M 1 2 216 bp 100 bp 1000 bp 500 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 36 3.3.5 Phát hiện WSSV với kit IQ2000WSSV (thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của nhà sản xuất Farming Intelligene Corporation, Đài Loan) a) Ly trích ADN − Cho 25 tôm bột vào ống eppendorf 1,5 ml. Nghiền kĩ với 500 µl Lysis buffer − Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 950C trong 10 phút, sau đó ly tâm (12.000 vòng/phút) trong 10 phút. − Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới có chứa 400 µl 95% ethanol − Lắc nhẹ, ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô ADN. − Hòa tan phần viên với 500 µl nước cất tiệt trùng. b. Quy trình khuếch đại Hóa chất phản ứng : Phản ứng PCR bước 1: 8 µl/phản ứng Chuẩn bị các chất cần thiết sau: - First PCR Pre-Mix reagent 7,5 µl - Iqzyme ADN Polymerase 2UI/µl 0,5 µl Phản ứng PCR bước 2: 15 µl/phản ứng Chuẩn bị các chất cần thiết sau: - Nested Pre-Mix reagent 14 µl - Iqzyme ADN Polymerase 2UI/µl 1 µl Điều kiện phản ứng: Phản ứng PCR bước 1: 940C trong 30 giây 620C trong 30 giây 720C trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 4 lần 940C trong 15 giây 620C trong 15 giây 720C trong 20 giây Lặp lại chu kỳ trên 14 lần Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 37 PCR bước 2: 940C trong 20 giây 620C trong 20 giây 720C trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 24 lần 720C trong 30 giây 200C trong 30 giây Các thao tác thực hiện phản ứng: − Lấy 8 µl hỗn hợp thứ nhất cho vào ống eppendorf 0,2 ml đã được đánh dấu. − Thêm 2 µl ADN cần xét nghiệm hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng trộn đều. − Thực hiện phản ứng PCR bước 1 − Sau khi phản ứng kết thúc thêm 15µl hỗn hợp thứ 2 vào ống chứa sản phẩm phản ứng PCR bước 1 − Thực hiện phản ứng PCR thứ 2. − Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% có chứa Ethium Bromide để kiểm tra c. Chạy điện di (giống mục 3.3.3 d) d. Đọc kết quả Mẫu dương tính và mẫu đối chứng sẽ hiện những vạch trên gel như ở hình 3.4 • Mẫu hiện lên vạch 296 bp hoặc 550 bp thì mẫu dương tính với WSSV • Mẫu chỉ hiện lên vạch 848 bp thì mẫu âm tính với WSSV • Nếu mẫu không hiện vạch nào là do chất lượng ADN ly trích kém Hình 3.4 Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M 333 bp 680 bp 848 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 38 • Giếng 1: Mẫu nhiễm WSSV nặng • Giếng 2: Mẫu nhiễm WSSV trung bình • Giếng 3: Mẫu nhiễm WSSV nhẹ • Giếng 4: Mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ • Giếng 5: Mẫu không nhiễm WSSV • Giếng 6: Nước cất • Giếng 7: Mẫu chuẩn một, 2000 bản sao/phản ứng • Giếng 8: Mẫu chuẩn hai, 200 bản sao/phản ứng • Giếng 9: Mẫu chuẩn ba, 20 bản sao/phản ứng • Giếng M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp Mẫu acid nucleic (dương tính với IQ2000WSSV) sẽ được đo hàm lượng bằng máy so màu quang phổ 3.3.6 Ly trích mẫu ADN của tôm được ly trích theo qui trình của kit IQ2000WSSV (thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của nhà sản xuất Farming Intelligene Corporation, Đài Loan) (quy trình DTAB - CTAB) Mang tôm sau khi thấm khô ethanol cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 600 µl DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 750C trong 5 phút xong để nguội ở nhiệt độ phòng. Lắc đều bằng máy vortex, ly tâm nhẹ sau đó cho thêm 0,7 ml choloroform, lắc đều trong 20 giây và ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút Chuyển phần nước trong ở trên qua ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm vào 100 µl CTAB Solution và 900 µl dung dịch đệm TE, lắc đều sau đó ủ ở 750C trong 5 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng rồi ly tâm 12000 vòng/phút. Chuyển phần dịch trong sang ống eppendoff 1,5 ml có chứa 300 µl ethanol 95% Lắc đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 µl ethanol 70%, ly tâm nhẹ. Làm khô ADN và hoà tan trong 150 µl dung dịch đệm TE. Bảo quản ADN ly trích ở - 200C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 39 3.3.7 Phương pháp đo hàm lượng ADN và ARN bằng máy so màu quang phổ (BECKMAN-DU-600) Hàm lượng ADN của mẫu được xác định bằng máy so màu quang phổ sử dụng bước sóng 260 nm và 280 nm Đầu tiên, sử dụng 100 µl nước cất để tạo mẫu blank. Thông thường đo mẫu nước cất 3 lần rồi mới bắt đầu đo mẫu ADN ly trích Sau đó đo hàm lượng ADN trong mẫu với 100 µl dung dịch ADN ly trích (pha loãng theo tỉ lệ 1:9) Nhấn nút đo để đọc số trên máy. Khi có kết quả ta tính toán hàm lượng ADN theo công thức: Và ARN theo công thức: 3.3.8 Khuếch đại ADN (theo OIE, 2006) PCR bước 1: Bảng 3.9 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 của qui trình OIE (2006) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 10 µl MgCl2 (50 mM) 3 µl dNTP (10mM) 2 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl 0,4 µl Nước 79,6 µl Mồi 146 F1 (100 pmol) 2 µl Mồi 146 F2 (100 pmol) 2 µl ADN khuôn 1 µl Tổng 100 µl Điều kiện phản ứng: 940C trong 1 phút 550C trong 1 phút 720C trong 2 phút Sau đó: [ADN] (µg/ml) = Giá trị đo ở 260 nm x 50 x độ pha loãng [ARN] (µg/ml) = Giá trị đo ở 280 nm x 40 x độ pha loãng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 40 940C trong 1 phút 550C trong 1 phút 720C trong 1 phút Lặp lại chu kì trên 39 lần 720C trong 7 phút PCR bước 2: Bảng 3.10 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 của qui trình OIE (2006) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 10 µl MgCl2 (50 mM) 3 µl dNTP (10mM) 2 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl 0,4 µl Nước 70,6 µl Mồi 146 F1 (100 pmol) 2 µl Mồi146 F2 (100 pmol) 2 µl Sản phẩm PCR bước 1 10 µl Tổng 100 µl Điều kiện phản ứng: 940C trong 1 phút 550C trong 1 phút 720C trong 2 phút Sau đó: 940C trong 1 phút 550C trong 1 phút 720C trong 1 phút Lặp lại chu kì trên 39 lần 720C trong 7 phút Đọc kết quả Kết quả điện di sẽ được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang ADN 1 kb ladder để xác định trọng lượng phân tử. Phương thức chẩn đoán: Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV bước 1 là 1447 bp và bước 2 là 941 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 41 3.3.9 Xử lí số liệu Tỉ lệ cảm nhiễm vi-rút trên tôm được xác định theo công thức sau: Tỉ lệ cảm nhiễm (TLCN, %) = 100*a/A Trong đó: a: Tổng số mẫu dương tính A: Tổng số mẫu phân tích Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 42 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên GAV, WSSV của tôm sú giống ở một số tỉnh ĐBSCL Kết quả phân tích 169 mẫu tôm giống xét nghiệm tại Khoa Thủy sản từ tháng 02 – 05/2007 bằng phương pháp PCR hai bước sử dụng kit IQ2000 YHV/GAV và WSSV cho thấy có 15 mẫu (8,9%) nhiễm GAV ở mức nhẹ (+), 1 mẫu (0,6%) nhiễm vừa (++) và 2 mẫu nhiễm nặng (+++) 1,2%. Tỉ lệ tôm giống âm tính với GAV là 89,3% (Hình 4.1).Còn về tỉ lệ cảm nhiễm WSSV ở tôm sú giống xét nghiệm là 4,2% trong đó chỉ có 5 mẫu nhiễm nhẹ (+) chiếm 3% và 2 mẫu nhiễm vừa (++) chiếm 1,2%, không có mẫu nào nhiễm nặng (+++) trong 169 mẫu đã kiểm tra. (Hình 4.2) GAV - 89.3% GAV ++ 0.6% GAV +++ 1.2% GAV + 8.9% GAV + GAV ++ GAV +++ GAV - Hình 4.1 Tỉ lệ cảm nhiễm GAV trên tôm sú giống WSSV - 95.8% WSSV + 3.0% WSSV ++ 1.2% WSSV + WSSV ++ WSSV - Hình 4.2 Tỉ lệ cảm nhiễm WSSV trên tôm sú giống Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 43 GAV được phát hiện đầu tiên ở Úc năm 1996 và được xem là tác nhân gây bệnh làm thiệt hại đến nghề nuôi tôm ở Úc (Spann et al, 1995). Mặc dù chưa phát hiện GAV chưa gây chết tôm ở nơi khác nhưng GAV đã được phân lập từ tôm sú trưởng thành khỏe mạnh và được gây cảm nhiễm thành công trong phòng thí nghiệm (Spann et al, 1997). Vì vậy chỉ trong vòng khoảng 2 tháng (03-05/2007) xét nghiệm 169 mẫu tôm giống tại Khoa Thủy sản tỉ lệ nhiễm GAV 10,7% và WSSV 4,2% được xem là có ảnh hưởng đến chất lượng tôm sú giống. 4.2 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV trên tôm sú theo phương pháp của Cowley et al. (2000) Trong thời gian từ tháng 2-5/2007 phân tích 169 mẫu tôm sú giống tại phòng thí nghiệm với kit IQ2000 YHV/GAV đã phát hiện được 18 mẫu tôm nhiễm GAV. 6 mẫu trong số này được chọn ra để ly trích ARN. Hàm lượng ARN ly trích được trình bày ở bảng 4.1. Sau đó pha loãng mẫu ở hàm lượng 200 ng ARN/µl để thực hiện qui trình RT-PCR theo Cowley et al. (2000). Bảng 4.1 Hàm lượng ARN của 6 mẫu phân tích STT Mẫu phân tích Mức độ nhiễm Giá trị đo ở 280 nm Hàm lượng ARN (ng/µl) 1 123 + 0,469 1876 2 124 + 0,451 1804 3 125 + 0,470 1880 4 129 + 0,406 1624 5 152 + 0,416 1664 6 203 + 0,043 1612 Hình 4.3 Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) 500 bp 1000 bp 4 3 2 1 M M 1 2 3 4 5 6 317 bp 100 bp 317 bp (a) (b) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 44 (a) (b) Giếng M: thang đo Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng dương (GAV) Giếng 1: mẫu 125 Giếng 2: đối chứng âm (nước) Giếng 2: mẫu 129 Giếng 3: mẫu 123 Giếng 3: mẫu 152 Giếng 4: mẫu 124 Giếng 4: mẫu 203 Giếng 5: đối chứng dương (GAV) Giếng 6: đối chứng âm (nước) Kết quả RT-PCR cho thấy qui trình cho ra kết quả GAV dương tính ở cả 6 mẫu thử, tuy nhiên mẫu 124,125 cho kết không tốt bằng 4 mẫu còn lại. Điều này có thể do (i) pha loãng không đúng (ii) thao tác trộn mẫu không đều nên hàm lượng ARN để chạy PCR không chính xác so với các mẫu khác. Tiếp theo qui trình trên được lặp lại với mẫu 123 là mẫu rõ nhất. Mẫu được pha loãng 5 lần , 10 lần ,15 lần, 20 lần, 25 lần (tương ứng với các hàm lượng ARN là 40 ng/µl, 20 ng/µl, 13,3 ng/µl, 10 ng/µl, 8 ng/µl) để xác định mức độ ảnh hưởng của hàm lượng ARN và khả năng ứng dụng của qui trình. Hình 4.4 Kết quả chạy RT-PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng dương Giếng 2: đối chứng âm Giếng 3: mẫu 123 với hàm lượng gốc M 1 2 3 4 5 6 7 8 500 bp 100 bp 1000 bp 317 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 45 Giếng 4: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 5 lần Giếng 5: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 10 lần Giếng 6: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 15 lần Giếng 7: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 20 lần Giếng 8: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 25 lần Kết quả trên đây cho ta thấy độ sáng của các vạch ADN giảm dần theo độ pha loãng của hàm lượng mẫu gốc. Điều này chứng tỏ rằng với hàm lượng mẫu gốc giảm đi 25 lần thì qui trình vẫn có khả năng phát hiện. Tuy nhiên ở đây ở giếng thứ 6, mẫu có độ pha loãng 15 lần lại không rõ hơn mẫu ở giếng 8 có độ pha loãng 25 lần có thể là do quá trình thao tác trộn mẫu không đều, pha loãng chưa chính xác nên hàm lượng ARN ít nên vạch kém rõ chứ không phải do qui trình. Với kết quả đạt được cho ta thấy qui trình khá ổn định có thể sử dụng phát hiện GAV trong điều kiện phòng thí nghiệm của Bộ môn. 4.3 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện gen β - actin của tôm (Oanh, 2007) Sau khi thực hiện qui trình phát hiện GAV, qui trình phát hiện gen β-actin của tôm được thực hiện bằng cách sử dụng một đoạn mồi β – actin (bảng 3.2). Chọn ngẫu nhiên mẫu 123 và 124 để tiến hành qui trình. Hình 4.5 Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 và 124 M 1 2 3 4 216 bp 100 bp 500 bp 1000 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 46 Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: đối chứng dương Giếng 3: mẫu 123 Giếng 4: mẫu 124 Kết quả cho thấy đã phát hiện được gen β-actin của tôm ở cả hai mẫu thử vị trí 216 bp giống như đối chứng dương, kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả của Oanh, (2007). Cũng tương tự như qui trình RT-PCR phát hiện GAV trên tôm, mẫu gốc được hành pha loãng 5 lần, 10 lần, 15 lần, 20 lần, 25 lần (tương ứng với các hàm lượng ARN là 40 ng/µl, 20 ng/µl, 13,3 ng/µl, 10 ng/µl, 8 ng/µl) để xem khả năng phát hiện cuả qui trình thì ta thấy 6 mẫu cũng đều cho kết quả tốt ngay khi pha loãng mẫu ra 25 lần. Điều này chứng tỏ qui trình có khả năng ứng dụng tốt. Hình 4.8 Kết quả chạy PCR theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 123 với hàm lượng gốc Giếng 2: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 5 lần Giếng 3: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 10 lần Giếng 4: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 15 lần Giếng 5: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 20 lần M 1 2 3 4 5 6 7 216 bp 100 bp 500 bp 1000 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 47 Giếng 6: mẫu 123 với hàm lượng pha loãng 25 lần Giếng 7: đối chứng dương Giếng 8: đối chứng âm 4.4 Thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và β–actin Thông thường phản ứng PCR phải có các đối chứng sau: (i) đối chứng âm để kiểm soát trường hợp tạp nhiễm; (ii) đối chứng ADN/ARNtt cuả vật chủ để chắc chắn acid nucleic của mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen vật chủ và (iii) đối chứng dương chứng tỏ phản ứng PCR có mạch khuôn đặc hiệu với mồi. Trên cơ sở qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) phát hiện GAV trên tôm và qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) của tôm, qui trình mRT-PCR kết hợp 2 qui trình trên được thực hiện để phát hiện đồng thời GAV và β-actin nhằm kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong quá trình phát hiện GAV. Thành phần phản ứng mRT-PCR được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β – actin trên tôm Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 2,5 µl MgCl2 (50 mM) 2,5 µl dNTP (10mM) 0,5 µl Taq ADN polymerase 2UI/µl 0,25 µl Nước 12,25 µl Mồi GAV 1/2 (25pmol) 2,5 µl Mối β - actin F (25pmol) 1,25 µl Mồi β - actin R (25pmol) 1,25 µl Sản phẩm sao mã ngược 2 µl Tổng 25 µl Điều kiện phản ứng: 940C trong 1 phút Sau đó 940C trong 30 giây 580C trong 30 giây 720C trong 45 giây Lặp lại chu kì trên 35 lần 720C trong 7 phút Giữ 200C trong 10 phút Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 48 Hình 4.7: Kết quả chạy PCR theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β – actin trên tôm Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu chạy theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Giếng 3: mẫu chạy theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Giếng 4: mẫu chạy theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β–actin tôm Kết quả điện di (hình 4.9) cho thấy khi chạy với qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và β–actin của tôm thì ở giếng 4 sẽ hiện 2 vạch tương ứng 317bp (GAV) và 216bp (β–actin). Điều này cho thấy qui trình có thể ứng dụng để phát hiện GAV và nhằm kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong quá trình phát hiện GAV thông qua gen nội sinh β-actin. Tuy nhiên vạch ADN β–actin trong qui trình cần được tối ưu hơn nữa thì mới đạt được kết quả mong muốn. 4.3 Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm sú (OIE, 2006) Dựa trên kết quả đạt được đối với qui trình phát hiện GAV, qui trình tương tự đối với WSSV cũng được thực hiện. Trước tiên qui trình phát hiện WSSV theo OIE được tiến hành sau đó, sẽ thực hiện qui trình phát hiện đồng thời WSSV và β–actin. Để xác định khả năng ứng dụng cuả qui trình PCR theo OIE, 3 mẫu ly trích ADN có chất lượng tốt, cho kết quả dương tính với 3 mức độ nhiễm nhẹ (+), trung bình (++) và nặng (+++) được chọn để thực hiện phản ứng 216 bp 100 bp 500 bp M 1 2 3 4 317 bp 1000 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu ọc tập và nghiên cứu 49 Bảng 4.3 Hàm lượng ADN của 3 mẫu phân tích ST T Mẫu phân tích Mức độ nhiễm Giá trị đo ở 260 nm Hàm lượng ADN (µg/ml) 1 68 + 0,5705 713,125 2 203 ++ 0,1387 263,5 3 4 +++ 0,1335 287 Bảng 4.4 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 theo qui trình OIE (2006) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 5 µl MgCl2 (50 mM) 1,5 µl dNTP (10mM) 1 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl 0,2 µl Nước 40,3 µl Mồi 146 F1 (100 pmol) 0,5 µl Mồi 146 F2 (100 pmol) 0,5 µl ADN khuôn 1 µl Tổng 49 µl Bảng 4.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 theo qui trình OIE (2006) Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 5 µl MgCl2 (50 mM) 1,5 µl dNTP (10mM) 1 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl 0,2 µl Nước 31,3 µl Mồi 146 F1 (100 pmol) 0,5 µl Mồi 146 F2 (100 pmol) 0,5 µl Sản phẩm PCR bước 1 10 µl Tổng 50 µl Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 50 Hình 4.8 Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 4 Giếng 2: mẫu 68 Giếng 3: mẫu 203 Giếng 4: đối chứng dương Giếng 5: đối chứng âm Kết quả cho thấy cả 3 mẫu lẫn đối chứng dương đều âm tính. Ta tiếp tục thực hiện lại qui trình một lần nữa cùng với 3 mẫu 4, 68, 203 cùng với mẫu đối chứng dương là mẫu li trích dương tính với IQ2000WSSV nhưng lần này ta tăng hàm lượng ADN khuôn và hàm lượng mồi lên gấp đôi Bảng 4.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng ADN khuôn và hàm lượng mồi tăng gấp đôi Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 5 µl MgCl2 (50 mM) 1,5 µl dNTP (10mM) 1 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl 0,2 µl Nước 38,3 µl Mồi 146 F1 (100 pmol) 1 µl Mồi 146 F2 (100 pmol) 1 µl ADN khuôn 2 µl Tổng 50 µl 5 4 3 2 1 M 100 bp 1000 bp 500 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 51 Bảng 4.7 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 theo qui trình OIE với hàm lượng ADN khuôn và hàm lượng mồi tăng gấp đôi Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X 5 µl MgCl2 (50 mM) 1,5 µl dNTP (10mM) 1 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl 0,2 µl Nước 30,3 µl Mồi 146 F1 (100 pmol) 1 µl Mồi 146 F2 (100 pmol) 1 µl Sản phẩm PCR bước 1 10 µl Tổng 50 µl Hình 4.9 Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng dương Giếng 2: đối chứng âm Giếng 3: mẫu 4 Giếng 4: mẫu 68 Giếng 5: mẫu 203 Để xác định lại chất lượng ADN dùng để thực hiện qui trình PCR (OIE, 2006) phát hiện WSSV trên tôm sú, 38 mẫu ADN được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện đi được trình bày ở hình 4.10. 100 bp 5 4 3 2 1 M 1000 bp 500 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 52 Hình 4.10: K?t qu? ki?m tra ADN trên gel v?i agarose 1% M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình 4.10 Kết quả kiểm tra ADN trên gel 1% agarose Lược trên Lược dưới Giếng M: thang đo Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 1484 Giếng 1: mẫu 56b +++ Giếng 2: mẫu 43 Giếng 2: mẫu 57b +++ Giếng 3: mẫu 200 Giếng 3: mẫu 89b +++ Giếng 4: mẫu 40 Giếng 4: mẫu 92b +++ Giếng 5: mẫu 148 Giếng 5: mẫu 93b +++ Giếng 6: mẫu 203 Giếng 6: mẫu 141 ++ Giếng 7: mẫu 221 Giếng 7: mẫu 142 ++ Giếng 8: mẫu 219 Giếng 8: mẫu 152 ++ Giếng 9: mẫu 195 Giếng 9: mẫu 159 ++ Giếng 10: mẫu 226 Giếng 10: mẫu 15A +++ Giếng 11: mẫu 145 Giếng 11: mẫu 15B +++ Giếng 12: mẫu 1855 Giếng 12: mẫu 15B ++ Giếng 13: mẫu 193 Giếng 13: mẫu 12B +++ Giếng 14: mẫu 225 Giếng 14: mẫu 12A +++ Giếng 15: mẫu 44 Giếng 15: mẫu 15A ++ Giếng 16: mẫu 218 Giếng 16: mẫu 12A ++ Giếng 17: mẫu 223 Giếng 17: mẫu 12B ++ Giếng 18: mẫu 33 Giếng 18: mẫu 37 + Giếng 19: mẫu 220 Giếng 19: mẫu 149 + Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 53 Kết quả phát hiện WSSV bằng kít IQ2000 WSSV với 3 mẫu 56b, 142 và 15A chỉ có mẫu 142 cho kết quả dương tính. Mẫu được chọn để chạy với qui trình của OIE thử với 4 hàm lượng ADN khuôn là 2 µl; 1,5 µl; 1 µl và 0,5 µl. Hình 4.11 Kết quả chạy PCR bước 2 mẫu 142 (với 4 hàm lượng ADN khuôn ) theo qui trình OIE (2006) Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu 142 với hàm lượng ADN khuôn là 2 µl Giếng 3: mẫu 142 với hàm lượng ADN khuôn là 1,5 µl Giếng 4: mẫu 142 với hàm lượng ADN khuôn là 1 µl Giếng 5: mẫu 142 với hàm lượng ADN khuôn là 0,5 µl Kết quả vẫn âm tính nên giải pháp tiếp theo là ly trích ADN từ 3 mẫu tôm thịt bị bệnh đốm trắng sử dụng dung dịch ly trích là DTAB/CTAB. Hàm lượng ADN ly trích được trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8 Hàm lượng ADN cuả 3 mẫu phân tích ly trích bằng DTAB/CTAB STT Mẫu phân tích Mức độ nhiễm Giá trị đo 260 nm Hàm lượng ADN (µg /µl) 1 6’ + 0.521 667,625 2 7’ ++ 0.2672 334 3 8’ + 0.7006 875,75 M 1 2 3 4 5 1000 bp 100 bp 500 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 54 Mẫu tôm thịt 6’, 7’, 8’ được chạy bằng qui trình OIE như trình bày ở bảng 4.4 và bảng 4.5. Hình 4.12 Kết qủa chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) của mẫu ly trích bằng DTAB/CTAB Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 6’ Giếng 2: mẫu 7’ Giếng 3: mẫu 8’ Giếng 4: đối chứng dương Giếng 5: đối chứng âm Kết quả chỉ mẫu 6’ và 7’ là hiện vạch giống như đối chứng dương tuy nhiên chưa thể phát hiện vạch ở vị trí 941 bp. Kết quả trên cho thấy cần thực hiện các bước chuẩn hóa hàm lượng ADN, hàm lượng MgCl2 và điều kiện PCR để có thể tối ưu hóa qui trình. 5 4 3 2 1 M 1000 bp 500 bp 100 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 55 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận 1. Tỉ lệ nhiễm GAV trên tôm sú giống xét nghiệm tại khoa Thủy sản là 10,7% và tỉ lệ nhiễm WSSV là 4,2% được xem có ảnh hưởng đến chất lượng tôm sú giống. 2. Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV theo Cowley et al. (2000), sản phẩm PCR cho kết quả ở 317 bp. 3. Khả năng ứng dụng của qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β-actin rất cao, phát hiện đồng thời GAV (vị trí 317 bp) và β-actin của tôm (ở vị trí 216 bp). 4. Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV theo OIE (2006) cho kết quả giống đối chứng dương tuy nhiên chưa thể phát hiện vạch ở vị trí 941 bp. 5.2 Đề xuất 1. Số mẫu phân tích cần nhiều hơn để có thể xác định chính xác tỉ lệ nhiễm GAV và WSSV trên tôm sú giống. 2. Đã thực hiện thành công qui trình qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và β-actin. Tuy nhiên cần tối ưu hóa lại để tăng khả năng ứng dụng của qui trình. 3. Cần tiến hành tối ưu hoá qui trình OIE phát hiện WSSV trên tôm để thực hiện qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bui Thi Minh Dieu, H. Marks, J.J. Siebenga, R.W. Goldbach, D. Zuidema, T.P. Duong and J.M. Vlak. 2004. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam. Journal of General Viriology 85: 3607-3618 2. Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. NXB nông nghiệp. 187 trang 3. Bodad-reantaso, M.G., S.E. McGladdery, I. East and R.B. Subasinghe. 2001. Asia diagnostic guide to aquatic animl disease. FAO and NACA 4. Chanratchakool, P., D.F. Fegan and M.J. Phillips. 1999. Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture. In: R.P.Subasinge, J.R. Phillips and M.B. Reantaso (Editors). The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture. Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999. Page 85-90 5. Cowley, J.A., C.M. Dimmock, C. Wongteerasypayac, V. Boonsaeng, S.Panyim & P.J. Walker.1999. Yellow head virus from Thailand and gill-associated virus from Australia are closely related but distinct prawn viruses. Dis Aquat Org. 36 : 153-157 6. Cowley, J.A., C.M. Dimmock, K.M. Spann, P.J. Walker. 2000. Detection of Australian gill-associated virus (GAV) and lymphoid organ virus (LOV) of Penaeus monodon by RT-nested PCR amplification. Dis Aquat Org. 39: 159-167 7. Cowley, J.A., M.R. Hall, L.C. Cadogan, K.M. Spann and P.J. Walker. 2002. Vertical transmission of gill-associated virus (GAV) in the black tiger prawn Peanaeus monodon. Dis Aquat Org. 50: 95-104 8. Corrales, H.L., C.L Watson, J Wigglesworth. 1999. Sumary of Latin American national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture. In: R.P.Subasinge, J.R. Phillips and M.B. Reantaso (Editors). The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture. Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999. Page 20-23 9. Dang Thi Hoang Oanh, 2007. RNA interference in Penaeid prawns. PhD thesis, School of Molecular and Microbial Sciences, The University of Queensland, Australia. 10. Flegel, T.W., 2004. Shrimp biology and anatomy for pathology Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 57 11. Graindorge, V.A.D and D. Griffith. 1999. Sumary of Latin American national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture. In: R.P.Subasinge, J.R. Phillips and M.B. Reantaso (Editors). The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture. Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999. Page 17-19 12. Hà Anh. 2004. Bệnh ở tôm nuôi và đôi lời bàn. Tạp chí thuỷ sản. Số 3: 33 – 35 13. Helga, J. 2004. An Overview on the World Shrimp Market. In: World Shrimp Markets. 26-27 October 2004. Marid, Spain 14. Helga, J. 2007. Aquacuture Trade and Price. FEAP meeting, Rom, May 2007 15. Herfort, A. 2004. Viral disease-Gill-associated virus disease. Aquatic Animal Disease to Australian: Idetification Field Guide, Australian Government Department of Agricultur, Fisheries and Forestry, Canberra. Page: 1-4 16. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003. Sinh học phân tử. NXB giáo dục. 301 trang 17. ail/dc_pi_sf_shrimp0202.htm. (Accessed on 26 July 2007) 18. (Accessed on 27 July 2007) 19. html/tintuc. (Ngày truy cập 03/02/2007 ) 20. Hsu, H.C., C.F. Lo, S.C. Lin, K.F. Liu, S.E. Peng, Y.S. Chang, L.L. Chen, W.J. Liu and G.H. Kou. 1999. Studies on effective PCR screening strategies for white spot syndrome virus (WSSV) detection in Penaues monodon brooders. Dis Aquat Org. 39: 13-19 21. Bộ Thủy sản. 2005. Kết quả thực hiện kế hoạch hằng năm của ngành thủy sản. Ngày 6/12/2005. (Ngày truy cập 27/06/2007) 22. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB khoa học và kỹ thuật 23. Khanobdee K., C. Soowannayan, T.W. Felgel, S. Ubol & B. Withyachumnarnkul. 2002. Evidence for apoptodis correlated with Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 58 mortality in the giant black tier shrimp Penaeus monodon infectic with yellow head virus. Dis Aquat Org. 48 : 79-90 24. Lê Văn Khoa, Nguyễn Văn Hảo và Lê Thị Lan Hương. 1999. Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture. In: R.P.Subasinge, J.R. Phillips and M.B. Reantaso (Editors). The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture. Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999.Page 91-94 25. Lightner, D.V. 2003. The Penaeid Shrimp Viral Pandemic due to IHHNV, WSSV, and YHV: History in the American and Current Status. Department of Veterinary science and microbiolory University of Arizona, tucson, AZ 85721 USA 26. Lo, C.F., H.C. Hsu, M.F. Tsai, C.H. Ho, S.E. Peng, G.H. Kou and D.V. Lighner. 1999. Specific genomic DNA fragment analaysis of different geographical clinical sample of shrimp white spot syndrome virus. Dis Aquat Org. 35: 175-185 27. Manual of diagnostic test for aquatic anima, 2003. Yellow head disease. www.oie.int/eng/normes/finnual 28. Manual of diagnostic test for aquatic animal, 2006. Yellow head disease. www.oie.int/eng/normes/finnual 29. Manual of diagnostic test for aquatic animal, 2006. White spot disease. www.oie.int/eng/normes/finnual 30. Mai Phương – Hà Yên, 2003. Báo động đỏ về bệnh tôm nuôi. (Ngày truy cập 27/06/2007). 31. Magbanua, F.O., K.T. Natividad, V.P. Migo, C.G. Alfafara, F.O. de la Peria, R.O. Miranda, J.D. Albaladejo, E.C.B. Nadala Jr, P.C. Loh and L.M. Tapay. 2000. White spot syndrome virus (WSSV) in cultured Penaeus monodon in the Philippines. Dis Aquat Org. 42: 77-82 32. Nguyễn Minh Hậu. 2006. Bước đầu nghiên cứu về vi-rút gây bệnh đầu vàng trên tôm sú (Penaeus mondon) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn cao học 33. Otta, S.K., G. Shubha, B. Joseph, A. Chakraborty, I. Karunasagar and I. Karunasagar. 1999. polymerase chain reation (PCR) detection of white Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 59 spot syndrome virus (WSSV) in cultured and wild crustaceans in India. Dis Aquat Org. 38: 67-70 34. Phạm Thành Hổ. 2003. Di truyền học. NXB Giáo dục .613 trang 35. Phạm Đình Đôn. 2006. Bảo vệ môi trường trong nuôi trồng thủy sản - Vấn đề và giải pháp. 20.htm. (Ngày truy cập 27/06/2007) 36. Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạn Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2003. Phát hiện vi-rút gây bệnh đầu vàng bằng phương pháp RT-PCR. Tạp chí di truyền và ứng dụng. Số 2 : 1-4 37. Phan Thi Ngoc Thuy, P.J. Walker, R.A.J. Hodgson and B.R.J. Lester. 2003. Detection of yellow head virus (YHV) and gill-associated virus (GAV) on tiger shrimp (Peneaus monodon) in Vietnam. Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp. 4: 103-105 38. Rajendran, K.V., K.K Vijayan, T.C. Santiago and K.M. Krol. 1999. Experimental host range and histopathology of white spot syndrome virus (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobters from India. Journal of Fish Disease. 22: 183-191 39. Spann K.M., R.A. Donaldson, J.A. Cowley, P.J. Walker. 2000. Differences in the susceptibility of some penaeid prawn species to gill- associated virus (GAV) infetion. Dis. Aquat. Org. 42 : 221-225 40. Spann K.M., J.A. Cowley, P.J. Walker and R.J.G (1997). A Yellow head like virus from Penaeus mondon culture in Australia. Dis. Aquat. Org 31: 169-179 41. Subashinghe R.P., M.G. Bondad-Reantaso, S.E. McGladdery. 2001. Aquaculture development, health and wealth. In: Subashinghe R.P., P. Bueno, M.J. Phillip, C. Hough, S.E. McGladdery and J.R. Arthur. Technical proceeding of the Conference on Aquaculture in the Third millennnium, Bangkok, Thailand, 20-25 February 2000. NACA, Bangkok and FAO, Rome 42. Thakul, P.C., F. Corsin, J.F. Turnbull, K.M. Shankar, N.V Hao, P.A. Padiyar, M. Madhusudhan, K. L. Morgan and C.V. Mohan. 2002. Estimation of prevalence of white spot syndrome virus (WSSV) by polymerase chain reation in Penaues monodon postlarvae at time of stocking in shrimp farms of karnataka, India: a population-based study. Dis Aquat Org. 49: 235-243 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 60 43. Tạp chí Thủy sản. Số 1, 2006 44. Theo báo Bình Định. 2007. Bình Định: Toàn tỉnh có 109 ha tôm nuôi bị dịch bệnh. 53246.(Ngày truy cập 27/06/2007) 45. Theo báo Long An. Ngày 05/04/2007. Các giải pháp ngăn ngừa dịch bệnh trên tôm sú trong vụ tôm năm 2007 ở vùng hạ. ày truy cập 27/06/2007) 46. Theo Lao Động, ngày 13/03/2003. Tôm chết hàng loạt, ngành thủy sản bó tay (Ngày truy cập 27/06/2007) 47. Theo báo Hà Tĩnh, ngày 18/05/2007. Toàn tỉnh gần 60 ha tôm sú bị dịch bệnh 6. (Ngày truy cập 27/06/2007) 48. Thêm một vụ tôm sa lầy. (Ngày truy cập 27/06/2007) 49. Theo khuyến ngư Kiên Giang. 2003. Một số bệnh thường gặp khi nuôi tôm sú 3 50. Toshiaki, I. 2003. Disease problems in prawn farming. 51. Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan. 2005. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật 52. Trần Thị Tuyết Hoa. 2004. Bài giảng sinh học phân tử 53. Trần Thị Tuyết Hoa. 2004. Bài giảng bệnh virus 54. Bộ Thủy sản. 2006. Vai trò và vị trí của ngành Thuỷ sản trong nền kinh tế quốc dân. Ngày18/1/2006. 170767. (Ngày truy cập 03/02/2007) 55. Van Hulten, M.C.W., M. Reijns, A.M.G. Vermeesch, F. Zandbergen, and J.M. Vlak. 2002. Identification of VP 19 and VP 15 of white spot Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 61 syndrome virus (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structural protein. Journal of General Viriology 83: 257-265 56. Vlak, J.M., J.R. Bonami, T.W. Flegel, G.H. Kou, D.V. Lightner, C.F. Lo, P.C. Loh, and P.J. Walker. 2002. NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates. ICTV, Paris, 2002 57. Võ Thị Thương Lan. 2006. Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng. NXB giáo dục 58. Walker, P.J. 1999. Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture. In: R.P.Subasinge, J.R. Phillips and M.B. Reantaso (Editors). The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture. Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999. Page 39-44 59. Wongteerasupaya, C., W Tongchuea., V Boonsaeng., S Pamyim., A Tassanakajon., B Withyachumnarnkul., T.W Flegel. 1997. Detection of yellow head virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification. Dis Aquat Org. 3: 181-186 60. Wongteerasupaya, C., P. Pungchai, B. Withyachumnarnkul, V. Boonsaeng, S. Panyim, T.W. Flegel and P.J. Walker. 2003. High variation in reptitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolate in Thailand. Dis Aquat Org. 54: 253-257 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 62 PHỤ LỤC Nguồn gốc và kết quả phân tích GAV và WSSV trên tôm sú giống tại phòng xét nghiệm - Khoa Thủy sản Mã PTN Ngày thu Nơi Thu Ngày tuổi GAV WSSV 1 5/2/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 2 26/2/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 3 26/2/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 4 26/2/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 5 26/2/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 6 26/2/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 7 26/2/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 8 2/3/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 9 2/3/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 10 2/3/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 11 2/3/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 12 6/3/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 13 6/3/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 14 6/3/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 15 9/3/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 16 21/3/2007 Vũng Tàu Post 12-15 - - 17 21/3/2007 Vũng Tàu Post 12-15 + - 18 21/3/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 19 21/3/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 20 21/3/2007 Cần Thơ Post 12-15 + - 21 23/3/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 22 23/3/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 23 23/3/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 24 26/3/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 25 26/3/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 26 26/3/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 27 29/3/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 28 29/3/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 29 29/3/2007 Vũng Tàu Post 12-15 - - 30 29/3/2007 Vũng Tàu Post 12-15 - - 31 1/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 32 2/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 + - 33 2/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 34 2/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 35 2/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 + - 36 2/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 + - 37 3/4/2007 Post 12-15 38 4/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 39 4/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 40 4/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 63 41 5/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - + 42 5/4/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 43 5/4/2007 Bạc Liêu Post 12-15 + - 44 5/4/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 45 9/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 46 9/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 47 9/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 48 9/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 49 9/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - ++ 50 9/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 51 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 52 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 53 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 54 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 55 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 56 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 57 10/4/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 58 11/4/2007 Công ty CP Post 12-15 - - 59 11/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 60 11/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 61 11/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 62 11/4/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 63 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 64 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 65 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 66 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 67 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 68 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 69 12/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 70 16/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - + 71 16/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 72 16/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 73 16/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 74 16/04/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 75 17/04/2007 Công ty tòan cầu Post 12-15 - - 76 17/04/2007 Công ty tòan cầu Post 12-15 - - 77 18/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - + 78 19/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 79 19/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 80 19/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 81 20/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 82 20/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 83 20/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 84 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 85 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 86 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 87 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 88 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 64 89 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 90 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 91 23/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 92 24/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 93 24/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 94 24/4/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 95 25/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 96 25/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 97 25/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 98 25/04/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 99 1/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 100 1/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 101 1/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 102 2/5/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 103 2/5/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 104 2/5/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 105 2/5/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 106 2/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 107 2/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 108 2/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 109 2/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 110 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 111 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 112 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 113 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 114 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 115 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 116 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 117 3/5/2007 Bạc Liêu Post 12-15 - - 118 3/5/2007 Bến Tre Post 12-15 - - 119 3/5/2007 Bến Tre Post 12-15 - - 120 7/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 + - 121 7/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 122 7/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 123 7/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 124 7/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 125 7/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 126 8/5/2007 Cần Thơ Post 12-15 +++ - 127 8/5/2007 Cần Thơ Post 12-15 +++ - 128 9/5/2007 Kiên Giang Post 12-15 - + 129 9/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 130 9/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 131 9/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 132 9/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 133 9/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 134 9/5/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 135 11/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 136 11/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 65 137 11/5/2007 Bạc liêu Post 12-15 - - 138 11/5/2007 Bạc liêu Post 12-15 - - 139 11/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 140 11/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 141 11/5/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 142 14/05/2007 Kiên Giang Post 12-15 - - 143 14/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 144 14/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 145 14/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 146 14/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 147 16/05/2007 Vũng Tàu Post 12-15 - - 148 16/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 149 16/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 150 16/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 151 18/05/2007 Cà Ná Post 12-15 - - 152 18/05/2007 Cà Ná Post 12-15 - - 153 21/05/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 154 21/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 155 21/05/2007 Cần Thơ Post 12-15 - - 156 23/05/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 157 24/05/2007 Sóc Trăng Post 12-15 - - 158 24/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 159 25/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 160 25/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 161 28/05/2007 Cà Mau Post 12-15 + + 162 28/05/2007 Cà Mau Post 12-15 ++ ++ 163 29/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 164 29/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 165 29/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 - - 166 30/05/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 167 30/05/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 168 30/05/2007 Cà Mau Post 12-15 - - 169 31/05/2007 Trà Vinh Post 12-15 + - (+) Mức độ nhiễm nhẹ (++) Mức độ nhiễm trung bình (+++) Mức độ nhiễm nặng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu