Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của β - 1,3/1,6 - glucan và vitamin c lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng của tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRẦN QUÂN ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  APPLICATION OF STANDARDIZIED CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong những năm học vừa qua. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận sự giúp rất nhiều từ các thầy cô và các anh chị công tác ở Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Trong đó tôi xin chân thành cảm ơn: - TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vƣớng mắc trong quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - ThS. Ngô Xuân Tuyến là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn về phƣơng pháp nghiên cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn tôi về mặt thao tác trong phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập. - Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi đồng hành trên suốt chặng đƣờng đại học. Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên Đặng Trần Quân v TÓM TẮT Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β- 1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID50 của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở liều thấp (101,5SID50) và liều cao (10 4 SID50) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3 nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6- glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các vi dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp. vii MỤC LỤC Trang tựa .................................................................................................................... i Lời cảm ơn ............................................................................................................... iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................. ix Danh sách các hình ................................................................................................... x PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2 Nội dung ........................................................................................................ 1 1.3 Mục tiêu ........................................................................................................ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú ............................................................................... 3 2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú .......................................................................... 5 2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng ..................................................... 5 2.2.2 Tác nhân gây bệnh ................................................................................ 5 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................... 6 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền ........................................................................ 6 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với bệnh đốm trắng ......................................................................................................... 7 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch ..................................................................... 7 2.3.2 Vaccin ................................................................................................. 10 2.3.3 Vitamin ............................................................................................... 11 2.3.4 Fucoidan ............................................................................................. 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm ........................... 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ........................... 13 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ...................... 14 2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch ..................................................................... 15 2.5.1 Nguyên lý ........................................................................................... 15 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm .................................................................... 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU ................................ 16 3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................. 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 16 3.2.1 Vật liệu sinh học ................................................................................. 16 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................... 16 3.2.2.1 Dụng cụ ................................................................................... 16 3.2.2.2 Hoa chất .................................................................................. 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 19 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus ................................... 19 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú ...................................... 19 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC .......................................................... 19 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC ............... 19 3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20 3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc ............................... 20 3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 20 viii 3.4 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 21 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn ........................... 21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) ....................................................................... 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23 4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn ...................... 23 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm đối với WSSV .............................................................................. 24 4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp (10 1,5 SID50/ml) ............................................................................................ 24 4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao (10 1,5 SID50/ml) ............................................................................................ 28 4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm ở từng phƣơng thức quản lý ........................................................................ 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 35 5.1 Kết luận ....................................................................................................... 35 5.2 Đề nghị ........................................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. …37 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSD: White spot disease. WSSV: White spot syndrome Virus. WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry. proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa). VP28: envelope protein (28 kDa). DNA: Deoxiribonucleotide acid. RNA: Ribonucleotide acid. MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius. IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus. PCR: Polymerase chain reaction. PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride. SID50/ml: Shrimp infectious dose 50% enpoint x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau ......................................................................................................... 20 Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm .................................. 21 Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm ............................................................................................................. 23 Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi ................................. 23 Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24 Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp ................................................................................................ 25 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26 Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều cao .................................................................... 28 Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao .... 30 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở các thời điểm thu mẫu ở liều cao……..………………………………………30 Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm………………………………………………....32 Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế bào máu cùa giáp xác ....................................................................................... 4 Hình 2.2 Virus hội chứng đốm trắng .............................................................. 6 Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV ..................................... 6 Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan ............................................ 9 Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C ........................................................ 12 Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm ..................................... 19 Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát chẩn đoán IHC ................................................. 20 Hình 3.2 Hình bố trí thí nghiệm cảm nhiễm WSSV cho tôm .......................... 21 Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn ........................................... 23 Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV ........................................................... 25 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp ................................ 26 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều thấp ................................................................................................................... 26 Hình 4.3 Tôm đối chứng chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV ......... 29 Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao .......................................... 29 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao ................................. 30 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều cao ..................................................................................................................... 31 Hình 4.5 Tôm đƣợc bổ sung β-1,3/1,6-glucan ở 120 giờ sau gây nhiễm ........ 32 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ thực tế phải đối đầu với bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) gây nhiều thiệt hại nặng nề cho ngành nuôi tôm Việt Nam cũng nhƣ thế giới trong những năm qua, nhiều biện pháp kỹ thuật đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng ở hầu hết các giai đoạn của một vụ nuôi tạo nên giải pháp “phòng ngừa tổng hợp” nhằm hạn chế tối đa dịch bệnh đốm trắng xảy ra. Mặc dù vậy, cho đến nay biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh đốm trắng trên tôm vẫn còn bỏ ngỏ. Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng các vaccine hay chất kích thích miễn dịch (immunostimulants) nhằm nâng cao sức đề kháng của tôm đối với WSSV. Tuy nhiên việc đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của các biện pháp này là rất khó. Thông qua mô hình cảm nhiễm chuẩn, sẽ cho phép chúng ta đánh giá một cách khoa học mức độ ảnh hƣởng của một số giải pháp kỹ thuật ứng dụng trong phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi, cụ thể là việc sử dụng các chất kích thích tăng cƣờng hệ miễn dịch của tôm. Đi từ cơ sở thực tiễn đó, đƣợc sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus–WSSV) của tôm sú (Peneaus monodon)”. 1.2 Nội dung Trong đề tài, chúng tôi bổ sung vào thức ăn cho tôm 2 hợp chất là Vitamin C và -1,3/1,6-glucan, đƣợc xem nhƣ là các chất kích thích tăng cƣờng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (insufficient immune system) của tôm, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó gây gây nhiễm các đàn tôm với 2 liều gây nhiễm 101,5SID50 và 104SID50 của dòng WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ trong cùng điều kiện. Thu mẫu và 2 tiến hành kiểm tra sự nhiễm WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC (Immunohistochemistry). 1.3 Mục tiêu Đánh giá ảnh hƣởng của hai hợp chất vitamin C và -1,3/1,6-glucan lên độ mẫn cảm đối với WSSV của tôm sú. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú Ngành nuôi tôm phát triển, tôm thƣờng đƣợc nuôi với mật độ cao trong môi trƣờng tồn tại nhiều tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên ở điều kiện bình thƣờng thì giữa sinh vật (vật chủ), mầm bệnh và môi trƣờng giữ trạng thái cân bằng. Bản thân vật chủ duy trì cho mình tình trạng khoẻ mạnh bằng cách chống lại sự tấn công của các tác nhân gây bệnh. Cơ chế kháng bệnh chủ yếu của tôm sú là miễn dịch không đặc hiệu , điều này có hạn chế so với động vật có xƣơng sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không có và không tạo ra đƣợc kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập (Văn Thị Hạnh và ctv, 2003). Lớp biểu bì là hàng rào lý hoá hữu hiệu chống lại sự bám dính và xâm nhập của mầm bệnh. Một khi hàng rào này bị hƣ hại, các vi sinh vật đi vào cơ thể, vào máu chúng sẽ gặp những cơ chế phòng vệ bẩm sinh bao gồm các đáp ứng miễn dịch tế bào và thể dịch. Đầu tiên, hệ thống hoạt hoá prophenoloxidase (proPO) đƣợc kích hoạt dẫn đến sự tổng hợp melanin và tạo ra các yếu tố liên quan đến các phản ứng miễn dịch khác nhƣ peroxinectin. Tiếp đến, các tế bào máu tham gia vào việc dọn dẹp các mầm bệnh bằng các cơ chế thực bào vi sinh vật hay bẫy chúng trong các khối tế bào máu, đóng gói (encapsulation) các vi sinh vật lớn hơn. Các phản ứng độc tế bào cũng đƣợc kích hoạt. Cuối cùng các phân tử cảm ứng nhƣ các peptide kháng khuẩn, các yếu tố cần cho quá trình Opsonin cũng đƣợc tạo ra (Cerenius và Söderhäll, 2004). Theo Lê Hồng Phƣớc (2002), trong nghiên cứu về phản ứng loại thải vi sinh vật của tế bào máu trên tôm sú, từ máu tôm sú có thể tìm thấy 5 lọai tế bào máu: hyalinocyte (chiếm 37%), small-granular semi-granulocyte (25%), large-granular semi-granulocyte (15%), small-granular granulocyte (6%) và large-granular granulocyte (17%). Trong thí nghiệm này, tôm với trọng lƣợng trung bình 3,28 ± 1,12 g đƣợc tiêm vi khuẩn Gram âm Vibrio anguillarum với liều 30 µl/g tôm (mật độ vi khuẩn: 107 – 108 CFU/ml). Sau 7 ngày tiêm, hầu hết không thấy sự hiện 4 diện của vi khuẩn trên các cơ quan khảo sát: mô liên kết, tim, gan tụy, mô tạo máu, cơ quan lympho. Khả năng loại thải vi sinh vật của các loại tế bào máu khác nhau cũng khác nhau. Semi-granulocyte có chỉ số thực bào cao nhất so với các lọai tế bào khác. Granulocyte và hyalinocyte có chỉ số thực bào thấp nhất. Ở tôm cũng nhƣ hầu hết các loài giáp xác khác tồn tại những cơ chế để phát hiện sự xâm nhập của các tác nhân lạ từ bên ngoài (vi khuẩn, nấm) thông qua sự nhận diện những thành phần vách tế bào của chúng nhƣ lipopolysaccharides (LPS) và β-glucan bởi các protein nhận biết trong huyết tƣơng nhƣ BGBP (Beta Glucan Biding Protein). Phức hợp β-glucan - BGBP kích thích sự hoạt hóa prophenoloxidase (proPO) thành phenoloxidse (PO), enzyme điều khiển quá trình tổng hợp melanin. Chất này cùng với các tiền chất của nó có vai trò nhƣ các chất diệt khuẩn (Vargas-Albores và ctv, 2000).Trong một nghiên cứu của mình, Chang và ctv (2002) đã chứng minh đƣợc tác dụng của β-1,3-glucan giúp tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của tôm sú đối với virus gây hội chứng đốm trắng. Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế bào máu cùa giáp xác (Vargas-Albores và ctv, 1998) Theo Krimbrell và ctv (2001), ở tôm cũng nhƣ hầu hết các động vật không xƣơng sống thiếu một hệ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và chỉ dựa hoàn toàn vào các đáp ứng miễn dịch tự nhiên. Tuy nhiên theo nhƣ Witteveldt và ctv (2003), những tôm sống sót sau khi bị nhiễm WSSV có tỷ lệ sống cao hơn ở lần gây nhiễm WSSV tiếp theo. Sự phát hiện này cùng với nghiên cứu thử nghiệm cấp vaccine tiểu đơn vị chứa protein vỏ của WSSV (VP19, VP28) cho tôm sú (Penaeus monodon) thông qua đƣờng miệng đã chứng minh đƣợc rằng một khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có thể đƣợc kích thích sau khi cấp vaccin. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tôm đƣợc cấp vaccine chứa 5 VP28 sống sau khi gây nhiễm WSSV bằng cách ngâm là 61%. Nhóm đối chứng không đƣợc cấp vaccine có tỷ lệ chết 67%. Hiện nay, còn hiếm các thông tin về các công trình nghiên cứu sự tồn tại các peptide kháng khuẩn ở giáp xác. Tuy nhiên, gần đây đã xác định đƣợc từ tế bào máu của tôm sú P.monodon các protein có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn rộng, bao gồm cả vi khuẩn Gram- và Gram+ (Somboonwiwat và ctv, 2005) Tóm lại, hệ miễn dịch của tôm sú nói riêng và các loài giáp xác nói chung còn ở mức độ tiến hóa thấp, chủ yếu dựa trên các đáp ứng miễn dịch tự nhiên. Trong đó, vai trò của các bạch cầu và hệ thống proPO hết sức quan trọng. Vì thế, việc tăng cƣờng sức đề kháng cho các đối tƣợng nuôi thủy sản thuộc nhóm giáp xác không thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccine mà chủ yếu là các biện pháp tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trƣờng nuôi và sử dụng các chất kích thích miễn dịch (immunostimulant) (Đỗ Thị Hoà và ctv, 2000) 2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú 2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nƣớc có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh đốm trắng phát hiện lận đầu tiên tại Đài Loan – 1992, Trung Quốc – 1993, Nhật Bản – 1994, sau đó là các nƣớc Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) gây tổn thất nghiêm trọng về sản lƣợng tôm nuôi. 2.2.2 Tác nhân gây bệnh: Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) thuộc một họ virus mới, Nimaviridae (Vlak và ctv, 2002). Virus dạng hình trứng, kích thƣớc 120 x 275 nm, có một đôi phụ bộ ở một đầu kích thƣớc 70 x 300 nm (Wang và ctv, 1995). Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside và vật chất di truyền. Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19 và VP15 có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa. Hiện nay virus WSSV đã đƣợc giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001). Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thƣớc thay đổi từ 293 đến 308 kbp (van Hulten và ctv, 2001) tùy theo các mẫu phân lập từ các vị trí địa lí khác nhau. 6 Hình 2.2. Virus gây hội chứng đốm trắng (Jo-ann Leong, 2005) A. Mô hình cấu trúc WSSV B. Ảnh hiển vi điện tử của WSSV 2.2.3 Dấu hiệu bênh lý Tôm nhiễm bệnh có thể có màu hồng đến nâu đỏ. Bên trong vỏ giáp xuất hiện những đốm trắng đƣờng kính từ 0,5 đến 2 mm, xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp (carapace) và đốt bụng thứ V,VI. Gan tuỵ trƣơng có màu trắng hoặc hơi vàng. Tôm có các biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thƣờng có khuynh hƣớng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy Tôm có dấu hiệu trƣơng nhân trong tế bào bị nhiễm. Vài trƣờng hợp tôm ở trạng thái hấp hối chuyển sang màu đỏ hoặc hồng, tỉ lệ chết tăng dần đến 80 hay 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Bùi Quang Tề, 2003). Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV. (Vlak., 2002) (A) Tôm bị nhiễm WSSV (B) Tế bào bị nhiễm WSSV trong mang của tôm sông 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền bệnh Mầm bệnh WSSV có thể lan truyền theo 2 trục: 7 Trục ngang: là con đƣờng chủ yếu. Từ nguồn nƣớc, từ thức ăn, từ các loài giáp xác hoang dã trong ao hoặc ngoài ao xâm nhập trong quá trình thay nƣớc. Đặc biệt, khi tôm ăn xác những con tôm chết do bệnh đốm trắng trong ao sẽ dẫn đến sự lan truyền bệnh rất nhanh và gây chết hàng loạt (Tookwinas, 1998). Ngoài ra, chó, mèo, các loài chim ăn thịt và con ngƣời cũng là trung gian mang mầm bệnh từ ao này sang ao khác. Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con. Tuy nhiên khả năng truyền theo trục dọc vẫn chƣa đƣợc chứng minh mặc dù WSSV đã đƣợc phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998). 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm nuôi đối với bệnh đốm trắng Dịch bệnh bùng phát không phải chỉ do sự hiện diện của tác nhân gây bệnh mà đó là kết quả của sự tƣơng tác rất phức tạp giữa mầm bệnh, vật chủ và môi trƣờng. Vật chủ phải mẫn cảm với mầm bệnh và điều này chịu ảnh hƣởng của yếu tố di truyền, tình trạng dinh dƣỡng, tuổi và sự hiện diện của virus ở các giai đoạn sớm của chu kỳ sống, trạng thái sinh lý của vật chủ, sự hiện diện và ảnh hƣởng của các yếu tố gây stress lên vật chủ cũng nhƣ chất lƣợng môi trƣờng nuôi (Newman, 1999). Do đặc điểm cơ chế kháng bệnh của tôm chủ yếu dựa vào các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, cho đến nay việc phòng ngừa dịch bệnh virus trên tôm nói chung và bệnh đốm trắng nói riêng còn rất hạn chế. Hiện không có biện pháp đáng tin cậy nào để phòng ngừa dịch bệnh đốm trắng xảy ra mà biện pháp đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới là “Phòng ngừa tổng hợp”. Bƣớc đầu tiên trong việc quản lý sức khoẻ tôm nuôi là tăng cƣờng các biện pháp an toàn nghiêm ngặt để ngăn chặn các mầm bệnh lây lan đến hệ thống nuôi nhƣ: - Loại bỏ mầm bệnh trong ao và nƣớc trƣớc khi thả giống. - Sử dụng nguồn giống khoẻ mạnh, không mang mầm bệnh - Loại trừ các con đƣờng truyền bệnh. Tiếp đến, trong quá trình nuôi, một yếu tố quan trọng là giảm tối thiểu tình trạng stress bởi sự thay đổi đột ngột của chất lƣợng nƣớc ao nuôi sẽ làm tôm bị sốc. Đây là điều kiện để dịch bệnh bùng phát trong đó có bệnh đốm trắng. Các yếu tố đặc biệt quan trọng là oxy hòa tan, nhiệt độ, độ mặn và pH. Vidal (2001) đã xác định đƣợc 8 mối liên hệ giữa bệnh đốm trắng và nhiệt độ của nƣớc. Nghiên cứu này chỉ ra rằng với nhiệt độ 25oC, khả năng 100% tôm chết do bệnh đốm trắng; nếu nhiệt độ tăng lên 32oC thì tỷ lệ chết của tôm chỉ khoảng 20%. Kết quả này đƣợc giải thích là do nhiệt độ của nƣớc tăng lên làm giảm khả năng tái tạo của WSSV. Song song đó, việc bổ sung vào khẩu phần ăn của tôm các chất chất kích thích miễn dịch, vitamin, vaccine… là cần thiết nhằm tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của tôm chống lại mầm bệnh. 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch Chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học có khả năng làm tăng họat tính của các tế bào bạch cầu và vì thế chúng có thể giúp tăng cƣờng tính kháng của vật nuôi đối với sự xâm nhiễm của virus, vi khuẩn, nấm và các vật ký sinh khác. Bên cạnh đó các chất này cũng giúp chống lại các tế bào ung thƣ ở ngƣời nhờ vào khả năng hoạt hóa các tế bào bạch cầu nhận ra và tiêu diệt các tế bào khối u (Jan Raa, 2000). Hầu hết các chất kích thích miễn dịch đƣợc tạo ra từ các phân tử cấu trúc của tế bào vi khuẩn, nấm sợi và nấm men. Theo Raa (1996), các chất này có 7 nhóm: Các phân tử cấu trúc của vi khuẩn (lipopolysaccharide , lipopeptide, glycoprotein vỏ và muramylpeptide). Các sản phẩm β-1,3-glucan từ vi khuẩn (Curdlan) và nấm sợi (Krestin, Lentinen, Schizophyllan…). Các β-1,3/1,6-glucan từ thành tế bào nấm men bánh mì (MacroGard, Betafectin). Các cấu trúc Carbohydrate (glycan) từ các nguồn sinh học khác nhƣ tảo biển. Các peptide từ các dịch chiết của động vật hay từ quá trình thủy phân enzyme các protein từ cá. Các nucleotide. Các sản phẩm tổng hợp (Bestatin, FK-156, Levamisole…). Chất kích thích miễn dịch có thể đƣợc cung cấp cho tôm bằng các cách nhƣ tiêm (ít dùng), cho trực tiếp vào nƣớc, trộn với thức ăn (dễ nhất). Liều lƣợng và thời gian bổ sung bao nhiêu là tùy thuộc vào nguồn gốc sản phẩm. Ví dụ β-1,3-glucan từ Schizophyllum commune đƣợc sử dụng với lƣợng 2 – 10 g/kg thức ăn trong thời gian 20 ngày, thời gian giản cách 10 ngày là phù hợp cho tôm sú (Chang và ctv, 2002). 9 Việc sử dụng chất kích thích miễn dịch nhằm tăng cƣờng tính kháng của tôm sú đối với virus WSSV đã đƣợc nghiên cứu trong những năm gần đây. Trong đó -glucan đã đƣợc nghiên cứu khá kĩ. Đây là một loại hợp chất đƣờng thu đƣợc từ nhiều nguồn khác nhau: nấm men, vi khuẩn, các loại nấm khác... Mỗi loại có cấu trúc đặc trƣng riêng tùy theo liên kết giữa các phân tử glucose nhƣ ở nấm men -glucan có phân nhánh -1,3 và -1,6. Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan ( Song và ctv (1997) đã chứng minh đƣợc rằng β-1,3/1,6-glucan từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng tăng cƣờng tính kháng của P.monodon đối với WSSV. Tỉ lệ sống của PL66 và PL113 lần lƣợt là 59% và 24% sau khi cảm nhiễm tôm bằng cách ngâm với WSSV trong 6 giờ. Trong một nghiên cứu gần đây, Chang và ctv (2002) đã bổ sung β-1,3-glucan từ vào thức ăn viên của tôm với các liều 0, 1, 2, 10, và 20 g/kg thức ăn. Nghiên cứu này đƣợc tiến hành trên tôm ở giai đoạn Juvenile (6,5 ± 0,4 g). Thời gian cho ăn là 20 ngày và sau đó sẽ tiến hành gây nhiễm với WSSV. Kết quả cho thấy tôm ở các nghiệm thức có bổ sung β-1,3- glucan với liều nhỏ hơn 1 g/kg thức ăn chết hết đến ngày 12 sau khi gây nhiễm. Trái lại ở nghiệm thức 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống đến ngày thứ 12 sau gây nhiễm là 42,2%, cao hơn một cách có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác (P<0,05). Những tôm sống ở các nghiệm thức tiếp tục đƣợc quan sát đến ngày 60 sau cảm nhiễm. Kết quả nhƣ sau: Ở nghiệm thức 2 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 66,7% (20% quần thể ban đầu). Ở nghiệm thức 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 75% (31% quần thể ban đầu). 10 Ở nghiệm thức 20 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 75% (18,3% quần thể ban đầu). Trọng lƣợng cơ thể của tôm tại thời điểm này là 10 – 15 g. So với nghiệm thức đối chứng (không gây nhiễm virus), tỷ lệ tôm sống và trọng lƣợng cơ thể tôm là 77% và 11 – 15 g. Song song với những kết quả trên, các tác giả cũng nghiên cứu sự biến động các thành phần của hệ đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu nhƣ số lƣợng và khả năng thực bào của tế bào máu, hoạt tính enzyme phenoloxidase, superoxide dismutase, nồng độ ion superoxide. Nhận thấy rằng ở các nghiệm thức bổ sung 2, 10 và 20 g/kg thức ăn, sau khi cảm nhiễm, các thành phần trên biến đổi theo chiều hƣớng suy giảm nhƣng phục hồi và đạt cực đại một vài ngày sau đó. Sự biến đổi này có tác dụng làm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với WSSV. 2.3.2 Vaccine Vaccine là một sản phẩm đƣợc tạo nên từ chính các tác nhân gây bệnh, hay các độc tố do các tác nhân gây bệnh tiết ra, nhằm tác động vào hệ thống miễn dịch đặc hiệu của động vật có xƣơng sống trong đó có cá để tạo ra các phản ứng miễn dịch (Lê Thanh Hùng, 2000). Hiện có 5 loại vaccine đang đƣợc dùng trong nuôi trồng thủy sản: Vaccine bất hoạt hoá (Inactivate), Vaccine hoạt lực yếu (Live Attenuated), Vaccine tái tổ hợp (Recombinant), Vaccine là DNA và Vaccine đƣợc sản xuất từ nội tạng của cá bị bệnh. Các vaccine này đƣợc dùng để phòng các bệnh do virus (Viral vaccines), do vi khuẩn (Bacterial vaccines) và do ký sinh trùng (parasite vaccines) cho động vật thủy sản (Lê Thanh Hùng, 2000). Việc sử dụng vaccine cho tôm hay các loài động vật giáp xác nói chung còn đang trong giai đoạn nghiên cứu. Do đặc điểm cơ thể thiếu hệ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và chỉ dựa hoàn toàn vào các đáp ứng miễn dịch tự nhiên nên có ý kiến cho rằng việc sử dụng vaccine cho tôm là không thực tế. Tuy nhiên trong các nghiên cứu gần đây trên tôm sú P.monodon, Witteveldt và ctv (2003) đã chứng minh đƣợc rằng một cơ chế bảo hộ và đáp ứng miễn dịch chuyên biệt có thể đƣợc kích thích sau khi cấp vaccine tiểu đơn vị. Bản chất của các vaccine này là các vi khuẩn đƣợc chuyển nạp gen biểu hiện các protein cấu trúc vỏ VP19 và VP28 của WSSV. Đây là các protein hiện diện nhiều trên vỏ của WSSV và tƣơng tác một cách mạnh mẽ với các kháng thể đa dòng đƣợc tạo ra từ thỏ (Van Hulten và ctv, 2000b). Vaccine đƣợc trộn với thức ăn 11 và cung cấp cho tôm trong 7 ngày. Sau đó, tiến hành cảm nhiễm bằng cách ngâm tôm trong nƣớc biển chứa WSSV trong 7 giờ. Kết quả cho thấy ở các nhóm tôm đƣợc cấp vaccine chứa VP28 và hỗn hợp VP28 + VP19 cho tỷ lệ chết tích lũy (30% và 50%) thấp hơn so với nhóm tôm đƣợc cấp vaccine là các vector rỗng (empty vector) và các nhóm đối chứng dƣơng. Chọn ngẫu nhiên các cá thể còn sống để kiểm tra sự hiện diện của WSSV, tất cả đều cho kết quả âm tính. Song song đó, các tác giả cũng nghiên cứu thời điểm khởi đầu và thời gian bảo hộ của vaccine. Nhóm tôm đƣợc cấp vaccine chứa VP28 (vaccine cho tỷ lệ tôm sống cao) đƣợc chia làm 3 nhóm nhỏ hơn để tiến hành cảm nhiễm ở các thời điểm khác nhau 3, 7 và 21 ngày sau khi ngừng cấp vaccine. Tỷ lệ tôm sống cao đáng kể ở các nghiệm thức 3 và 7 ngày sau khi cấp vaccine (64% và 77%). Trong khi đó, ở nghiệm thức 21 ngày, tôm sống với tỷ lệ thấp (21%). Điều này chứng tỏ hiệu quả bảo hộ của vaccine đã giảm. Qua nghiên cứu trên mặc dù chƣa hiểu rõ cơ chế tác động của các vaccine tiểu đơn vị lên hệ miễn dịch của tôm nhƣng cũng cho thấy ở tôm có tồn tại một bộ nhớ miễn dịch đặc hiệu. Chính vì vậy việc cấp vaccine qua đƣờng miệng cho tôm chống lại WSSV là có thể. Nó mở ra một hƣớng đi mới trong việc thiết lập những phƣơng thức quản lý thực tế nhằm ngăn ngừa WSSV cũng nhƣ các tác nhân gây bệnh khác cho tôm nuôi. 2.3.3 Vitamin Vitamin đƣợc định nghĩa nhƣ nhóm chất hữu cơ hiện diện trong thúc ăn với một lƣợng rất nhỏ mà cơ thể sinh vật không tổng hợp đƣợc hay tổng hợp không đủ cho nhu cầu cơ thể. Chất hữu cơ này không phải là các amino acid hay acid béo thiết yếu, chúng giữ vai trò rất quan trọng trong dinh dƣỡng và sự thiếu hụt lâu dài các dƣỡng thƣờng bị mất đi trong quá trình chế biến thức ăn cho động vật thủy sản. Do đó chất này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các triệu chứng bệnh cho động vật (Lê Thanh Hùng, 2000). Hầu hết các vitamin có vai trò nhƣ một co-enzyme hay các tác nhân bổ trợ các enzyme thực hiện các phản ứng sinh hoá trong cơ thể sinh vật. Vitamin C (acid ascorbic) cũng không ngoại lệ. Chất này dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao (60oC) nên thƣờng đƣợc bổ sung vào thức ăn cho tôm với hàm lƣợng khá cao. Shiau và ctv (1994) đã xác định đƣợc nhu cầu vitamin C cho tôm sú đạt mức tăng trƣởng tối đa vào khoảng 2000 mg/kg thức ăn. Do tan nhiều trong nƣớc, vitamin C đƣợc sử dụng trong thức ăn 12 tôm sú dƣới dạng các dẫn xuất: L-ascorbyl 2-monophosphate Mg (C2MP-Mg), L- ascorbyl 2-monophosphate Na (C2MP-Na), L-ascorbyl 2-sulphate (C2PP)... Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C (www.chemistry.wustl.edu/.../ascorbic.htm) Chƣa có nhiều nghiên cứu về cơ chế tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của tôm của vitamin C. Tuy nhiên, Merchie (1998) thấy rằng lƣợng vitamin C tăng từ 100 lên 3400 mg/kg trong khẩu phần ăn sẽ làm giảm tức thời tỷ lệ chết của tôm sú postlarval do bị sốc thấm lọc. López và ctv (2003) đã chứng đƣợc vitamin C có tác dụng cải thiện tốc độ tăng trƣởng ở tôm. Hàm lƣợng protein máu, tổng lƣợng tế bào máu, lƣợng tế bào hạt (granular cell) và hoạt tính Prophenoloxidase ở nhóm tôm đƣợc bổ sung vitamin C trong 40 ngày cao hơn các nhóm khác. Cơ chế tác động của vitamin C có giống nhƣ một chất kích thích miễn dịch hay không vẫn chƣa đƣợc xác định rõ. Tuy nhiên nó có tác dụng nhƣ một chất chống oxy hóa, có vai trò trong việc bảo vệ các tế bào máu, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch của tôm (López và ctv, 2002). 2.3.4 Fucoidan Wilaiwan Chotigeat và ctv (2003) đã chứng minh đƣợc rằng việc bổ sung fucoidan thô ly trích đƣợc từ một loài tảo biển Sargassum polycystum có thể làm giảm tác động của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra trên tôm sú. Trong thí nghiệm này, fucoidan đƣợc trộn vào thức ăn cho 2 nhóm tôm có khối lƣợng 5 – 8 và 12 – 15 g. Tôm đƣợc cho ăn khoảng 4 ngày trƣớc khi gây nhiễm bằng cách ngâm tôm với dịch WSSV trong 2,5 giờ. Sau đó tiếp tục cho ăn 15 ngày. Kết quả thu đƣợc ở thời điểm10 ngày sau khi gây nhiễm, nhóm tôm đƣợc cho ăn fucoidan, tỷ lê sống cao nhất là 46% và 93% tƣơng ứng với từng khối lƣợng. Trong khi đó ở nhóm đối chứng, tôm chết 50% từ 3 – 5 ngày sau khi gây nhiễm. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy fucoidan 13 đóng vai trò nhƣ một chất kích thích miễn dịch giúp tăng cƣờng hoạt động thực bào so với nhóm đối chứng. Bên cạnh những phƣơng thức nêu trên việc sử dụng các chất diệt virus (antiviral) để ngăn chặn sự tổng hợp DNA hay sự dịch mã RNA của WSSV, cung cấp cho tôm những peptid diệt khuẩn giúp nâng cao sức sống của tôm nhiễm WSSV cũng đƣợc xem là các hƣớng đi có khả năng (Bonilla và ctv, 2005). Tuy nhiên, để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tôm thƣơng phẩm thì cần có những công trình nghiên cứu nhằm đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của tất cả các phƣơng đánh thức này. 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm: 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn: WSSV nhiễm trên một vài loài tôm nuôi và gây ra thiệt hại nghiêm trọng do tỷ lệ tôm chết có thể đến 100% trong 10 ngày sau khi bệnh phát (Karanusagar và ctv, 1997). Để giảm tác động của WSSV, một vài phƣơng thức quản lý sức khoẻ tôm đã đƣợc đề xuất và thử nghiệm. Tuy nhiên việc giá hiệu quả các phƣơng thức này là rất khó. Nguyên nhân là do trong các thí nghiệm này, việc gây nhiễm virus cho tôm đƣợc mô phỏng theo các con đƣờng truyền nhiễm của WSSV trong tự nhiên. Cụ thể, tôm thí nghiệm đƣợc ngâm trong nƣớc có chứa dịch dịch huyền phù WSSV vô bào, nuôi chung với các vật chủ đã bị nhiễm WSSV, cho tôm ăn những mô đã bị nhiễm WSSV. Trong đó, nhiễm virus qua đƣờng miệng đƣợc xem là quan trọng nhất trong điều kiện tự nhiên và nuôi thƣơng phẩm. Tuy nhiên, những phƣơng pháp này tồn tại một hạn chế rất lớn là lƣợng virus gây nhiễm cho mỗi tôm thì không đƣợc biết. Hơn nữa phƣơng thức này thì không đảm bảo đƣợc mỗi tôm đều nhận đƣợc một lƣợng virus nhƣ nhau. Theo Bonilla và ctv (2005) mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn sử dụng một dịch huyền phù virus đã đƣợc chuẩn độ để đánh giá hiệu quả các chiến lƣợc nhằm làm giảm tác động của WSSV. Theo đó, một mô hình gây nhiễm chuẩn cần 2 yếu tố chính: Động vật thí nghiệm có tính biến dị di truyền thấp, có tính mẫn cảm cao với virus và không mang các mầm bệnh đặc biệt. Trong các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn thực hiện trong đề tài này, tôm sẽ đƣợc kiểm tra không mang các mầm bệnh nhƣ WSSV, MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Vius), IHHNV (Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus)… bằng các phƣơng pháp mô học truyền thống (Histopathology), PCR (Polymerase chain reaction)… 14 Một dịch stock virus WSSV đã đƣợc chuẩn độ để xác định số đơn vị gây nhiễm 50% tôm thí nghiệm SID50(Shrimp infectious dose 50% endpoint)/ml dung dịch. Một đơn vị SID50 là lƣợng virus sẽ gây nhiễm cho 50% tôm thí nghiệm. Cho đến nay, trên thế giới vẫn chƣa tìm ra môi trƣờng nuôi cấy tế bào tôm do đó việc chuẩn độ chỉ đƣợc thực hiện trên môi trƣờng in vivo. Một dãy các độ pha loãng theo cơ số 10 của dịch WSSV gốc đƣợc gây nhiễm cho tôm thí nghiệm bằng cách tiêm vào cơ hay qua đƣờng miệng. Dựa vào tỷ lệ tôm nhiễm ở mỗi độ pha loãng sẽ tính đƣợc hiệu giá gây nhiễm SID50 /ml của dịch virus theo công thức của Reed – Muench (1938). 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn: Với những đặc điểm nêu trên, mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn có nhiều ứng dụng quan trọng: Đánh giá sự khác nhau về độ mẫn cảm của vật chủ ở các giai đoạn sống khác nhau hay giữa các loài có quan hệ gần gũi với cùng một tác nhân gây bệnh (Plumb và Zilberg, 1999). Cụ thể ở tôm, có sự khác biệt về tính mẫn cảm với WSSV ở các giai đoạn sống khác nhau (Yoganandhan và ctv, 2003) hay giữa các loài tôm (Lightner và ctv, 1998). Độc tính hay khả năng gây bệnh của mầm bệnh là một đặc tính có thể đo lƣờng đƣợc (Shapiro-Ilan và ctv, 2005). Do đó ứng dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn, ta có thể so sánh độc lực của các chủng WSSV khác nhau. Mô hình cảm nhiễm chuẩn còn giúp ta đánh giá hiệu quả của các phƣơng thức quản lý sức khỏe tôm nhƣ dùng các chất kích thích miễn dịch, các chất diệt virus (antivirals), vaccine… nhằm mục đích giảm tác động của bệnh đốm trắng. Nhằm hỗ trợ trong việc thiết lập các phƣơng thức quản lý mới trong phòng ngừa bệnh đốm trắng có thể áp dụng trong thực tiễn, các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV có vai trò rất quan trọng. Bonilla và ctv (2005) đã sử dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn để nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của WSSV trên Litopenaeus vannamei. Tôm đƣợc chủng WSSV qua đƣờng miệng với liều thấp (10 1,5 SID50) và liều cao (10 4 SID50). Ở mỗi liều cảm nhiễm, mẫu tôm đƣợc thu ở 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48 và 60 giờ sau gây nhiễm. Vị trí của các tế bào bị nhiễm WSSV trên mô đƣợc xác định bằng kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry – IHC) và trong huyết tƣơng bằng kỹ thuật Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect 15 immunofluorescence – IIF). Các tác giả đã rút ra kết luận rằng ruột giữa và mang là những vị trí đầu tiên cho sự tái bản của WSSV. Sự lan truyền mang tính hệ thống của WSSV diễn ra chủ yếu trên các tế bào tự do và mang, ruột trƣớc, mô trung gian (integument), tuyến anten là các cơ quan đích chính của virus này. 2.5 Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch 2.5.1 Nguyên lý Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phƣơng pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã đƣợc đánh dấu nhƣ là thuốc thử đặc hiệu. Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất. Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã đƣợc phát triển bởi Poulos và ctv (2001). Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh. 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm Có nhiều phƣơng pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. Việc lựa chọn phƣơng pháp thích hợp dựa trên các thông số nhƣ loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005). Theo Boenisch và ctv (2002), có 5 phƣơng pháp nhuộm có thể đƣợc sử dung: A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện nhƣ sau: Một kháng thể sơ cấp đƣợc đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc thời gian nhƣng tín hiệu thu đƣợc rất ít, không dủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay. B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể sơ cấp (thƣờng là đơn dòng) kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp (thƣờng là đa dòng) đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phƣơng pháp này linh hoạt và nhạy hơn phƣơng pháp nhuộm trực tiếp.. 16 C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Từ phƣơng pháp B, bổ sung thêm một kháng thể thứ cấp 2 kháng lại kháng thể thứ cấp 1. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải đƣợc đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phƣơng pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope. D.Phương pháp phức hợp miễn dịch enzyme tan: Tuỳ theo phúc hợp miễn dịch enzyme, ta có các phƣơng pháp khác nhau.Ví dụ: Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase. Trƣớc tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp với một lƣợng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó. E.Phương pháp (strept)avidin-biotin: Phƣơng pháp nhuộm này dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin với độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin-biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thƣờng đƣợc sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. 17 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm A. Thời gian tiến hành nghiên cứu: 2/2006 – 8/2006 B. Địa điểm: Trại thực nghiệm nuôi thuỷ sản Thủ Đức, 658 Kha vạn cân, phƣờng Linh Đông, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Phòng Mô Học – Trung tâm Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu sinh học Tôm sú 45 ngày tuổi. Nƣớc biển đƣợc xử lý các bƣớc: cơ học – hoá học - trung hoà. Dòng virus WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ:105,2 SID50/ml. Vitamine C dạng muối polyphosphate - sản phẩm C Vits của công ty Svaks, Ấn Độ. β-1,3/1,6-glucan - sản phẩm PIOMOS của công ty PIOTECH, Mỹ. Thức ăn viên C.P 9003-P sản xuất tại Công ty TNHH Chăn nuôi C.P. Việt Nam. 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 3.2.2.1 Dụng cụ a) Dụng cụ cho quản lý bể nuôi tôm Bể composite 1 m3. Máy bơm, vợt, máy đo thủy hoá… b) Dụng cụ gây nhiễm WSSV cho tôm Kim Isulin 0,5 ml, cỡ đầu kim 26. Micropipet 100 µl, 1000 µl, eppendoff 2 ml, găng tay, bông gòn tiệt trùng. Máy bơm nƣớc, sục khí, đá bọt, bộ lọc cơ. 18 Bể kính 126 lit. Vợt và thức ăn tôm lớn. c) Dụng cụ cho IHC Panh, dao, kéo vô trùng. Máy xử lý mẫu tự động, máy cắt microtome, tủ ấm 37oC, bàn làm lạnh mẫu, nồi nƣớc ấm, bình rót paraffin electrothermal, kính hiển vi quang học. 3.2.2.2 Hoá chất a) Hóa chất cho quản lý bể nuôi tôm Chlorine, Na2S2O3 để xử lý nƣớc biển. Hóa chất dùng phân tích mẫu nƣớc: NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,... b) Hóa chất cho gây nhiễm WSSV cho tôm Dung dịch đệm BPS 10X (1000 ml): + Na2HPO4: 96,72 g + KH2PO4: 20,005 g + KCl: 19,98 g Cồn 70% c) Hóa chất cho IHC: Cồn 50, 70, 95 và 99,6%. Parafin, nƣớc cất khử ion, Tris–NaCl, Tris–HCl, xylene. Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada, chloroform. Dung dịch Davidson có thành phần nhƣ sau: + Cồn 95%: 330 ml + Formalin: 220 ml + Acid acetic glacial: 115 ml + Nƣớc cất: 335 ml Hoá chất là lam dƣơng: + Aceton: 250 ml + (3 – amino propyl) triethoxysaline: 5 ml 19 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus Từ dịch huyền phù virus ban đầu (10oC) hút 100 µl cho vào eppendorf có chứa 900 µl dung dịch BPS 1X. Ta đƣợc độ pha loãng 10-1. Hút 100 µl từ độ pha loãng 10-1 cho vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch BPS 1X. Ta đƣợc độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm nhƣ trên, ta sẽ đƣợc độ pha loãng mong muốn. 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm virus WSSV trên tôm sú Mỗi tôm đƣợc tiêm 100 µl dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ vào giữa mặt bên của đốt thứ 2 hoặc 3. 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC Cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và ngâm trong dung dịch Davidson trong thời gian từ 24 – 48 giờ. Tỷ lệ mẫu : Davidson = 1 : 10 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm sú bằng kỹ thuật IHC Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus