Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) bị bệnh đục thân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN CN. ĐOÀN VĂN CƢỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tập tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn cô - TS. Lý Thị Thanh Loan đã hƣớng dẫn em giải quyết các vấn đề em thắc mắc trong suốt quá trình làm đề tài cũng nhƣ tạo điều kiện cho em hoành thành khoá luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị làm việc tại Trung Tâm quốc gia Quan Trắc, thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II, nhất là các anh chị tại phòng Mô học: anh Đoàn Văn Cƣờng, anh Phạm Văn Điền, chị Tuyết Anh, chị Lan đã tận tình chỉ bảo cho em các phƣơng pháp thao tác và thực hành đề tài trong suốt thời gian em làm đề tài này. Sau cùng, xin cảm ơn toàn thể gia đình mến yêu cùng toàn thể các bạn học chung khoá 29, ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm thân thƣơng vì đã luôn động viên, chỉ bảo, giúp đỡ, thƣơng yêu nhau. Vì là bƣớc đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, cho nên không trách khỏi khiếm khuyết và sai lầm, mong đƣợc sự góp ý chỉ bảo của các thầy cô cùng các bạn sinh viên. TP. HCM, tháng 9 năm 2007 Sinh viên thực hiện, NGUYỄN MINH VÀNG iv TÓM TẮT NGUYỄN MINH VÀNG, lớp Công nghệ sinh học, khóa 29, niên khóa 2003 – 2007, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN CN. ĐOÀN VĂN CƢỜNG Thời gian thực hiện đề tài: 3/2007  9/2007. Bệnh đục thân trên Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là một bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng có thể gây chết 100% ấu trùng và hậu ấu trùng tôm càng xanh. Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát những biến đổi cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị đục thân. Để khảo sát những biến đổi cấu trúc mô học, chúng tôi tiến hành thu mẫu tôm càng xanh tại hai địa điểm: An Giang (thu mẫu bệnh không có dấu hiệu đục thân) và Bến Tre (thu mẫu bệnh có dấu hiệu đục thân). Kết quả phân tích mô học cho thấy có những bất thƣờng trong cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên cơ quan mang, gan tụy, cơ ở tôm càng xanh bị bệnh đục thân. Sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân của các tế bào cơ quan gan tụy, các thể vùi bên trong nhân của các tế bào của cơ quan mang và sự hoại tử cơ là những đặc điểm chung quan sát đƣợc trên các mẫu tôm ấu trùng bị bệnh đục thân. v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B (B-cells): Blasenzellen cells (Tế bào B) DNA: Deoxyribonucleic Acid ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay F (F-cells): Fibrillenzellen cells (Tế bào F) FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức lƣơng nông thế giới) HP: Hepatopancreas (Cơ quan gan tụy) HPV: Hepatopancreatic parvovirus IHHNV: Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ILS: Interlamellar space INIs: Các thể vùi trong nhân tế bào INOs: Các thể ẩn trong nhân tế bào L: Lamellae (Phiến mang) LU: Lumen M: Muscle (Cơ) MBV: Monodon baculovirus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuổi Polymerase) R (R-cells): Restzellen cells (Tế bào R) RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse – transcription polymerase chain reaction (Phản ứng chuổi Polymerase phiên mã ngƣợc) TCX: Tôm càng xanh UNDP: United Nations Development Programe XSV: Extral small virus WSSV: White Spot Syndrome Virus (Virus gây hội chứng đốm trắng) vi DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 4 Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man 1879. ........... 4 Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên của Macrobrachium rosenbergii trên thế giới. ............................................................................................................................... 7 Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX chính trên thế giới. .......................................... 8 Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX trên thế giới qua các năm. ....................... 8 Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX. ............................................... 14 Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử. ....... 15 Hình 2.8: Hình dạng XSV và MrNV dƣới kính hiển vi điện tử. ................................. 16 Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus. ..................................................................................................................... 16 Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX. ...................................................... 18 Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX. ......................................................... 19 Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô cơ TCX. ........................................................... 27 Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thƣờng của cơ quan gan tụy. ................................. 28 Hình 4.3a: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX. ......................... 29 Hình 4.3b: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX .......................... 30 Hình 4.4: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX. ........................................................... 31 Hình 4.5: Thể vùi bên trong nhân của các tế bào trrên cơ quan mang TCX ............... 33 Hình 4.6: Sự hoại tử cơ trên TCX bị đục thân. ............................................................ 34 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang ......................... 25 Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang .................. 26 Bảng 4.3: Kết quả phân tích mô học các mẫu TCX bệnh đục thân ............................. 32 Bảng 4.4: So sánh các mẫu TCX bị đục thân và không bị đục thân ............................ 35 viii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii TÓM TẮT .......................................................................................................................iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................... vii MỤC LỤC ................................................................................................................... viii Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2. 1 Hình thái tôm càng xanh ......................................................................................... 3 2. 2 Đặc điểm sinh học tôm càng xanh .......................................................................... 4 2.2.1 Sinh sản tôm càng xanh ..................................................................................... 4 2.2.2 Môi trƣờng và chu kỳ sống ................................................................................ 6 2.2.3 Phân bố .............................................................................................................. 7 2. 3 Tình hình nuôi tôm càng xanh tại Việt Nam và trên thế giới ................................. 7 2. 4 Các bệnh thƣờng gặp trên tôm càng xanh ............................................................... 9 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh ..................................................................... 9 2.7.2 Những bệnh thƣờng gặp trên tôm trƣởng thành .............................................. 12 2. 5 Bệnh đục thân ........................................................................................................ 13 2. 6 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học ................................................................... 17 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống .................................................................. 17 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp ....................................................................... 17 2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch ...................................................................... 17 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ ................................................................................... 17 2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh................................... 18 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy ...................................................................... 18 2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang ......................................................................... 19 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN .................... 20 3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 20 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ...................................................................... 20 ix 3.1.2 Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 20 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất ............................................................. 20 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị ................................................ 20 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 21 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 24 4.1 Kết quả .................................................................................................................. 24 4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân ....................................................................................................................... 24 4.1.2. Kết quả khảo sát mô học tôm càng xanh có dấu hiệu đục thân .................. 32 4.2 Thảo luận ............................................................................................................... 34 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 37 Kết luận .......................................................................................................................... 37 Đề xuất ........................................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 38 Tiếng Việt ...................................................................................................................... 38 Tiếng Anh ...................................................................................................................... 38 Danh sách các trang website .......................................................................................... 42 1 Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm càng xanh (TCX) (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) là loài tôm nƣớc ngọt có kích thƣớc lớn nhất trong họ Palaemonidae, chỉ phân bố ở vùng Tây Nam châu Á Thái Bình Dƣơng (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Là một đối tƣợng thủy sản quan trọng trong sản xuất và khai thác, TCX đƣợc thuần dƣỡng để sản xuất tại nhiều khu vực trên thế giới. Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long có sản lƣợng tôm lớn nhất nƣớc. Trong chu kỳ phát triển của ấu trùng tôm càng xanh, bệnh đục thân trên ấu trùng TCX là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với ngƣời sản xuất giống bởi khả năng gây chết rất cao, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày. Trƣờng hợp đầu tiên đƣợc ghi nhận là vào năm 1995 ở Martinique, Pháp (Arcier và c.t.v., 1999), sau đó ở Hàn Quốc (Tung và c.t.v., 1999), Trung Quốc (Qian và c.t.v., 2003), gần đây nhất ở Ấn Độ (Hameed, 2003). Bệnh tác động chủ yếu vào giai đoạn TCX giống, tác nhân gây bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Hiện có nhiều phƣơng pháp hiện đại đƣợc ứng dụng vào chẩn đoán bệnh thủy sản nhƣ là PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), hóa mô miễn dịch, lai tại chổ (in situ hybridization), miễn dịch huỳnh quang, ... cho kết quả chính xác. Nhƣng đối với những bệnh mới có tác nhân gây bệnh mới chƣa biết đƣợc về cấu trúc di truyền, không thể tạo đƣợc mẫu dò (probe), đoạn mồi (primer), kháng thể, ....vì thế, không thể chẩn đoán đƣợc tác nhân gây bệnh. Phƣơng pháp mô học (histopathology) truyền thống đƣợc phát triển từ những năm đầu có kính hiển vi đã đƣợc ứng dụng một cách rộng rãi trên thế giới, từ các bệnh viện, các phòng nghiên cứu, các trung tâm xét nghiệm, các viện nghiên cứu, .... Đây là phƣơng pháp nghiên cứu căn bản, chủ yếu quan sát về cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định đƣợc chức năng cũng nhƣ các trạng thái bệnh lý của tế bào, đặc biệt là đối với một số bệnh mới ta chƣa có primer, probe, ... thì phƣơng pháp mô học truyền thống rất hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh. 2 Hiện nay tại Việt Nam, tỉ lệ ấu trùng TCX bệnh đục thân khá cao, vẫn chƣa xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Đáp ứng nhu cầu bức thiết của thực tế sản xuất và tình hình dịch bệnh, dƣới sự hƣớng dẫn và giúp đỡ của TS. Lý Thị Thanh Loan cùng các anh chị tại phòng thí nghiệm Mô học, Trung tâm Quốc gia Quan Trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản (thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II), chúng tôi xin đƣợc thực hiện đề tài: “Ứng dụng phƣơng pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) bị bệnh đục thân”. Mục đích của đề tài: Khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân để tìm ra tác nhân gây bệnh. Nội dung thực hiện:  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân.  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân.  So sánh những biến đổi cấu trúc tế bào của các cơ quan, từ đó xác định nguyên nhân gây bệnh. 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. 1 Hình thái tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 đƣợc Holthius (1950) phân loại nhƣ sau: Ngành chân khớp : Arthropoda Ngành phụ : Anterata Lớp giáp xác : Crustacea Lớp phụ giáp xác bậc cao : Malacostraca Bộ mƣời chân : Decapoda Bộ phụ chân bơi : Natantia Phân bộ : Caridea Họ : Palaemonidae Họ phụ : Palaemoninae Giống : Macrobrachium Loài : M. rosenbergii DE MAN 1879 Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là loài TCX lớn nhất trong giống Macrobrachium: con đực có thể dài tới 320 mm, con cái 250 mm (đo từ mút chủy (rostrum) đến mút đuôi (telson)). Toàn thân thƣờng có màu xám hơi lục hoặc hơi nâu, đôi khi có màu hơi xanh, màu sắc đậm dần lên ở những con lớn hơn. Có những sọc nâu, xám, trắng đục dọc theo chiều dài thân. Tác giả Forster và Wickins (1972) mô tả đặc điểm cấu tạo ngoài TCX (Hình 2.2), toàn thân đƣợc phân thành 20 phần phụ (segment) (somite) và đƣợc chia thành hai phần riêng biệt: phần đầu (cephalothorax) có 14 phần phụ và phần đuôi (abdomen) có 6 phần phụ. Phần đầu lại đƣợc chia thành 2 phần riêng biệt nhau là cephalon và thorax. Tên gọi và chức năng của 20 phần phụ của Macrobrachium rosenbergii đƣợc liệt kê trong phần Phụ lục A. 4 Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 (Forster và Wickins, 1972) 2. 2 Đặc điểm sinh học tôm càng xanh 2.2.1 Sinh sản tôm càng xanh Phần lớn tôm đực trƣởng thành lớn hơn tôm cái cùng tuổi, có đôi chân ngực (chân bò) thứ hai lớn và dài, đầu lớn, bụng nhỏ, thuôn, lỗ sinh dục đực nằm ở gốc của đôi chân ngực thứ 5. Giải phẩu cơ quan sinh dục đực gồm có các phần: màng treo, dịch thể, ống xoắn dẫn tinh (gồm có ống dẫn tinh giữa, ống phóng tinh ra ngoài, đƣờng ống dẫn tinh trong suốt) (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Con cái có đầu và đôi chân ngực thứ 2 nhỏ hơn ở con đực cùng tuổi nhiều lần, vị trí của lổ sinh dục cái ở giữa hai gốc của đôi chân bò thứ 3. Ở con cái thành thục, có 5 thể nhìn thấy trứng màu đỏ da cam qua lớp vỏ giáp đầu ngực. Màng bụng uốn vào phía trong tạo thành một buồng chứa trứng. Phần gốc của những chân bụng, đặc biệt là ba đôi chân bụng đầu tiên phát triển dài ra và có những tấm lông cứng, dài để mang trứng khi sinh sản. Tôm đực trƣởng thành, thành thục có thể trạng khoẻ mạnh (vỏ cứng) có thể tiến hành giao vĩ trong khi con cái chỉ có thể tiến hành giao vĩ khi đã hoàn tất lột vỏ tiền giao vĩ (Nguyễn Việt Thắng, 1993), quá trình giao vĩ có thể chia thành 4 giai đoạn: Tiếp xúc, Ôm giữ tôm cái, Trèo lên lƣng, Lật ngửa và gắn túi tinh. Sau khi giao vĩ từ 6 – 20 giờ, tôm cái bắt đầu đẻ trứng. Những con cái chƣa giao vĩ nhƣng đã thành thục, chín mùi sinh dục cũng có thể đẻ trong vòng 24 giờ sau khi lột vỏ tiền giao vĩ, nhƣng không đƣợc thụ tinh và trứng chỉ lƣu lại trong buồng ấp trứng của con cái vài giờ mà thôi. Khi đẻ trứng con cái cong mình về phía trƣớc đến khi ngực bụng tiếp xúc nhau, đẩy trứng từ buồng trứng ra ngoài qua lổ sinh dục, trứng sẽ đi qua túi tinh (khi con cái đã đƣợc giao vĩ) và đƣợc thụ tinh,. sau đó trứng rơi vào buồng ấp. Vị trí của buồng ấp trứng ở chân bụng thứ tƣ nhận đƣợc trứng đầu tiên, sau đó lần lƣợt tới chân bụng thứ ba, thứ hai và cuối cùng là chân bụng thứ nhất, trong đó, trứng đƣợc bao bọc bởi một màng nhày trong suốt, và đƣợc sắp rất đều và ngăn nắp vào các sợi lông ở 4 cặp chân ngực này. Theo Nguyễn Việt Thắng (1993), thời gian ấp trứng từ 19 – 23 ngày nếu nhiệt độ từ 25 – 31oC, thời gian này dao động từ 17 – 23 ngày với nhiệt độ từ 26 – 30oC. Suốt thời gian ấp trứng, tôm cái dùng chân bụng quạt nƣớc, tạo dòng nƣớc luôn chuyển động qua vùng bụng làm thoáng khí cho trứng. Tôm cái khéo léo dùng chân ngực thứ nhất loại bỏ những trứng hƣ và những vật lạ bám vào buồng trứng. Trứng của loài tôm nƣớc ngọt này có dạng hình bầu dục rất nhỏ, chiều dài trục lớn của trứng chỉ khoảng 0,6 – 0,7 mm, có màu sáng da cam trong suốt 2 – 3 ngày sau nở, sau đó chuyển dần sang màu da cam, đến ngày thứ 12 có màu xám xanh nhạt, sau đó màu đậm dần đến khi nở. 6 2.2.2 Môi trƣờng và chu kỳ sống Ấu trùng TCX sau khi nở ra cần có môi trƣờng nƣớc lợ (6 – 18 o/oo) để sống và phát triển, chính vì vậy cho nên dù là loài tôm nƣớc ngọt, khu vực sống tự nhiên của chúng phải tiếp giáp với vùng nƣớc lợ. Những con tôm cái đang mang trứng sẽ di chuyển xuống cửa sông nơi có độ mặn 12 – 18o/oo, tại đây, trứng sẽ nở và phóng thích ấu trùng vào sống tự do môi trƣờng nƣớc. Trong suốt giai đoạn biến thái của ấu trùng sang dạng hậu ấu trùng (postlarvae) (PL), ấu trùng phải trải qua 11 giai đoạn biến thái khác nhau (Nguyễn Việt Thắng, 1993) (Phụ lục B). Tuy nhiên từ giai đoạn thứ VI trở đi có khác biệt về kích thƣớc của các con ấu trùng, điều này giải thích tại sau một số nhà khoa học cho rằng chỉ có 8 giai đoạn biến thái của ấu trùng TCX (Macrobrachium rosenbergii). Đến giai đoạn hậu ấu trùng, tôm chuyển sang sống ở tầng đáy và bắt đầu di chuyển ngƣợc lên môi trƣờng nƣớc ngọt. Tác giả New (2000) cho biết nhiệt độ thấp có thể làm chậm quá trình di chuyển tìm nƣớc ngọt của những hậu ấu trùng, nhiệt độ thích hợp nhất cho cả hai giai đoạn hình thái ấu trùng và hậu ấu trùng là 29 – 31oC. Ấu trùng sống trôi nổi và bơi theo kiểu giật lùi, lộn ngƣợc bằng các phần phụ ở ngực với phần bụng quay lên phía trên thay vì là phần lƣng nhƣ ở tôm hậu ấu trùng và tôm trƣởng thành. Ngƣợc lại, khi ấu trùng chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng, đƣợc nhận diện bởi khả năng bơi lội giống tôm trƣởng thành, toàn thân có màu hơi mờ đục và có một vùng màu vàng sáng trên đầu. Hậu ấu trùng có khả năng đi bằng các chân bò, không chỉ bò trên các bề mặt mềm mà còn có thể đi trên mặt đá ở các bãi sông cạn và trong những con suối. Chúng cũng có thể trèo qua các thác nƣớc, đập nƣớc nhỏ, và cũng có thể bò trên mặt đất nếu có đủ độ ẩm. TCX trƣởng thành hoạt động về đêm, hoạt động bơi lội lên mặt nƣớc để kiếm thức ăn trong khi về ban ngày chúng lẫn vào trong các vùng nƣớc tối và hoạt động ở tầng đáy. Khẩu phần ăn của ấu trùng Macrobrachium rosenbergii là những phiêu sinh vật nhỏ, những côn trùng rất nhỏ, và có thể ăn cả đồng loại là các ấu trùng nhỏ hơn. TCX ở giai đoạn hậu ấu trùng và giai đoạn trƣởng thành có khẩu phần ăn đa dạng, bao gồm tảo, thực vật sống trong nƣớc, các loài thân mềm, côn trùng và sâu bọ, kể cả các động vật giáp xác khác, chúng là loài động vật ăn tạp. Chúng cũng có thể ăn thịt lẫn nhau nếu thiếu thức ăn hay do mật độ quá đông trong một diện tích chật hẹp (ví dụ khi nuôi 7 số lƣợng lớn trong các ao hồ). Hình thái các giai đoạn biến thái (12 giai đoạn) đƣợc ghi nhận trong phần Phụ lục A. 2.2.3 Phân bố Tôm càng nƣớc ngọt phân bố khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới trên thế giới. Hiện nay đƣợc biết có trên 100 loài, trong đó hơn một phần tƣ số này có ở châu Mỹ. Chúng có mặt ở hầu hết các vùng nƣớc ngọt nội địa nhƣ sông, hồ, đầm lầy, mƣơng, ao cũng nhƣ các vùng cửa sông. Hầu hết các loài đều cần có nƣớc lợ cho các giai đoạn biến thái của ấu trùng. Một số loài thích nghi môi trƣờng nƣớc trong, một số loài khác gặp trong điều kiện nƣớc rất đục nhƣ TCX. Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên của Macrobrachium rosenbergii trên thế giới (FAO). Vùng màu đỏ là vùng có thể tìm thấy TCX trong tự nhiên. TCX phân bố ở tất cả các thủy vực nƣớc ngọt (đầm, ao, sông, rạch, ruộng lúa...) kể cả ở vùng nƣóc lợ cửa sông. Trong tự nhiên có thể tìm thấy TCX ở khu hệ Ấn Độ Dƣơng và Tây Nam Thái Bình Dƣơng (Hình 2.3). Ở Việt Nam, TCX phân bố chủ yếu các tỉnh Nam Bộ, đặc biệt là các vùng nƣớc ngọt và các vùng cửa sông ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Một số quốc gia không có TCX phân bố trong tự nhiên nhƣ Pháp, Mỹ, khu vực Đài Loan hiện đã di giống về nuôi trong tự nhiên. 2. 3 Tình hình nuôi tôm càng xanh tại Việt Nam và trên thế giới Theo New (2000), lịch sử phát triển của nghề nuôi TCX đƣợc bắt đầu từ năm 1961 bởi Ling, ngƣời đầu tiên phát hiện TCX có một giai đoạn sống cần nƣớc lợ - giai 8 đoạn ấu trùng, và chính ông là ngƣời đầu tiên thành công trong việc ƣơng nuôi ấu trùng TCX; tiếp theo nghiên cứu của Ling, Fujimura T. (1972) đã thành công trong nghiên cứu sản xuất giống TCX đại trà đƣợc thực hiện từ năm 1965 đến 1968 áp dụng qui trình nƣớc xanh để cung cấp giống cho các trại nuôi tôm giống tại Hawaii và các vùng khác; từ năm 1973, Aquacop đã bắt đầu nghiên cứu và áp dụng qui trình nƣớc trong hở, qui trình cơ bản đƣợc thực hiện vào năm 1976 và hoàn thiện từ năm 1980, một chu trình sản xuất giống khá phổ biến hiện nay. Năm 1978, FAO tiến hành đề án “Mở rộng nuôi TCX” do UNDP tài trợ và đƣợc thực hiện tại Thái Lan đến 1981, nhờ đó sản lƣợng tôm thịt ở Thái Lan tăng nhanh đáng kể từ dƣới 5 tấn/ha năm 1976 lên khoảng 400 tấn/ha năm 1981 (FAO, 2002). Jee (1986) nghiên cứu và ứng dụng qui trình nƣớc xanh cải tiến trên cơ sở cải tiến qui trình nƣớc xanh trƣớc đó, sau đó qui trình này đƣợc áp dụng phổ biến ở Malaysia và Việt Nam (FAO, 2002). Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX chính trên thế giới (FAO Fishery Statistics, 2002) Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX trên thế giới qua các năm (FAO Fishery Statistics, 2002) Có nhiều hình thức nuôi TCX hiện nay nhƣ nuôi tôm trên ruộng lúa, nuôi trong ao, nuôi trong mƣơng vƣờn, nuôi trong đăng và lồng, nuôi đơn hay nuôi hỗn hợp với cá, …. Năm 1984, sản lƣợng TCX thế giới đạt 5.246 tấn, năm 1989 đạt 17.608 tấn và năm 2000 đạt trên 119.000 tấn (FAO, 2002). Hầu hết sản lƣợng TCX trên thế giới đƣợc nuôi ở Châu Á, trong đó Trung Quốc có sản lƣợng lớn nhất, khoảng 128.000 tấn vào năm 2001. Năm 2002, Trung Quốc chiếm 58% tổng sản lƣợng TCX của thế giới. 9 Nghề nuôi TCX ở nƣớc ta là một nghề truyền thống, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long. Việc nghiên cứu sản xuất giống TCX đã đƣợc bắt đầu từ đầu thập niên 80 với qui trình nƣớc trong hở và tuần hoàn. Tuy nhiên, việc sản xuất giống nhân tạo chỉ phát triển từ 1999 khi nhu cầu con giống ngày càng cao, khi nghiên cứu và áp dụng thành công quy trình nƣớc xanh cải tiến. Trong nuôi tôm thịt, năm 2002 cả nƣớc đạt 10.000 tấn, chủ yếu tập trung sản lƣợng tại các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long nhƣ An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bến Tre với diện tích nuôi mỗi tỉnh khoảng 200 – 800 ha. Có nhiều mô hình nuôi trồng thuỷ sản khác nhau đƣợc nông dân ứng dụng, phổ biến nhất là mô hình nuôi TCX luân canh với lúa, đạt 686 kg/ha/vụ, nuôi tôm kết hợp với lúa đạt năng suất bình quân 4,12 tấn/ha/vụ, nuôi ao đạt 1,2 tấn/ha/vụ, nuôi tôm đăng quầng trên sông (phát triển mạnh tại Đồng Tháp) với khoảng 300 quầng năm 2001 và 1.500 quầng vào năm 2002. Nhìn chung, nghề nuôi TCX trên thế giới hiện nay đang trên đà phát triển mạnh và sản lƣợng sẽ tăng 12 - 30 % mỗi năm và có thể đạt 750.000 – 1.000.000 tấn/năm vào năm 2010, trong đó Trung Quốc chiếm ƣu thế nhất về sản lƣợng, tiếp theo là Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Thái Lan. Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng nhất của nghề nuôi TCX là trong những năm 1999 – 2001 với tốt độ tăng trƣởng đạt 30%/năm, đặt ra nhiều vấn đề cần xem xét để phát triển bền vững nghề nuôi tôm với bài học sâu sắc từ sự phát triển của nghề nuôi tôm biển (New, 2005). Rất nhiều vấn đề liên quan đến TCX đã và đang tiếp tục nghiên cứu và góp phần quan trọng vào ứng dụng thực tế (New, 2005). 2. 4 Các bệnh thƣờng gặp trên tôm càng xanh 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 2.4.1.1 Bệnh hoại tử cơ (idiopathic muscle necrosis) (IMN) Bệnh đƣợc biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh trắng cơ (white muscle disease), bệnh hoại tử cơ (muscle necrosis), bệnh đục cơ (muscle opacity hoặc milk prawn disease) (Tonguthai, 1997). Bệnh gây nên tỉ lệ chết cao ở ấu trùng TCX bởi các sợi cơ hoại tử. Nash và c.t.v. (1987) cho rằng IMN gây chết đến 60% ở hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong các trại sản xuất giống ở Thái Lan. Trên Macrobrachium rosenbergii, IMN 10 xảy ra khi tôm bị sốc môi trƣờng, do không đảm bảo vệ sinh, do thay đổi nhiệt độ, do giảm oxi hoà tan, do hoạt động quá mức hay do môi trƣờng sống chật hẹp. Bệnh cũng có thể xảy ra sau khi đem hậu ấu trùng đƣa vào ao nuôi thịt 1 hoặc 2 ngày, có thể do tôm bị sốc khi vào sống trong môi trƣờng mới. Để khống chế sự việc này, nên giữ hậu ấu trùng tôm trong ao ƣơng vài ngày trƣớc khi chính thức thả vào ao nuôi. 2.4.1.2 Bệnh giữa chu kỳ (mid-cycle disease) (MCD) Nhìn chung bệnh xảy ra từ giai đoạn ấu trùng thứ VI đến XI. Anderson và c.t.v. (1990) cho biết một tỉ lệ chết cao xảy ra trên ấu trùng ở các trại ƣơng TCX ở Malaysia trong khoảng thời gian 16 ngày sau khi nở. Triệu chứng bệnh tƣơng tự trong trƣờng hợp thối rữa do vi khuẩn xảy ra trong tự nhiên. Ấu trùng bỏ ăn hay giảm ăn và xảy ra hiện tƣợng ăn thịt lẫn nhau (các con yếu bị con khoẻ hơn ăn thịt). Ấu trùng bị bệnh thƣờng có màu nâu xanh và bơi một cách yếu ớt và không thể định phƣơng hƣớng. Hiện không xác định đƣợc tác nhân gây bệnh, có thể là do Enterobacter aerogenes (Johnson, 1978; Brock, 1988). Brock (1983) cho rằng chế độ vệ sinh tốt không thể chống lại mầm bệnh, cần nên có chế độ dinh dƣỡng đặc biệt với đầy đủ artermia cần thiết. 2.4.1.3 Bệnh hoại tử cơ do vi khuẩn (bacterial necrosis) Những con ấu trùng bị bệnh, thân tôm thƣờng có màu xanh xám, không ăn, yếu ớt và rơi xuống đáy bể, trên râu và trên các phần phụ xuất hiện những đốm nâu. Tác nhân gây bệnh này đã đƣợc xác định, bao gồm các vi khuẩn hình sợi Leucothrix spp., các cầu khuẩn và các vi khuẩn hình que hiện diện trên các sợi mang và trên các phần phụ. Bệnh thƣờng xâm hại trên các ấu trùng IV-V, gây nên sự chết hàng loạt (100%) trong 48 giờ (Aquacop, 1977). 2.4.1.4 Bệnh phát sáng (luminous disease) Vibrio harveyi đƣợc xác định là tác nhân gây nên bệnh này trên các ấu trùng giai đoạn sớm, một bệnh rất thƣờng gặp cả trên đối tƣợng tôm nƣớc ngọt và tôm nƣớc mặn. Ngoài đặc điểm phát sáng vào ban đêm, một đặc điểm rất dễ nhận thấy, còn có thể quan sát thấy trên các con tôm bệnh các vùng cơ mờ đục, bơi lội yếu dần và chết. Đây là một căn bệnh nghiêm trọng, có khả năng gây chết đến 100%, và có thể kháng lại một số thuốc sử lý. Sae-oui và c.t.v. (1978) đã làm một thí nghiệm kiểm tra tính nhạy cảm của Vibrio harveyi tìm thấy trên P. merguiensis, kết quả chứng minh rằng 11 Ca(HOCl)2 với nồng độ 20 – 30 ppm hoặc formalin nồng độ 50 ppm có khả năng giết chết hoàn toàn loài vi khuẩn này trong môi trƣờng. 2.4.1.5 Bệnh lột vỏ không hoàn toàn (exuvia entrapment disease) (EED) Bệnh ảnh hƣởng nặng nhất trên TCX ở giai đoạn ấu trùng cuối và giai đoạn PL sớm, đƣợc xem nhƣ một hội chứng. Ấu trùng bị hội chứng này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi các phần phụ khi chúng thay vỏ, nhƣ không thể trút vỏ khỏi mắt, chủy hay các phần phụ khác của cơ thể, hoặc sau khi lột vỏ chúng trở nên dị tật, kết quả tạo sự cản trở khi chúng di chuyển và có thể khiến chúng bị chết. Nguyên nhân của hội chứng này không đƣợc rõ, có thể do chất lƣợng nƣớc trong bể nuôi quá bẩn hay do khẩu phần dinh dƣỡng không hợp lý. 2.4.1.6 Bệnh do động vật nguyên sinh Zoothamnium sp., Epistylis sp., Vorticella sp., Acineta sp. là những động vật nguyên sinh đƣợc biết là có khả năng gây bệnh trên ấu trùng loài tôm Macrobrachium rosenbergii. Chúng gây nên những vệt mờ đục trên tôm ấu trùng, có thể đƣợc loại bỏ khi ấu trùng lột xác, nhƣng cũng có khả năng gây cản trở quá trình lột xác và gây chết. Ấu trùng có nhiều khả năng bị tấn công hơn tôm trƣởng thành, nguyên nhân do các ao nuôi kém vệ sinh, chất lƣợng nƣớc xấu, khi cải thiện chất lƣợng nƣớc ao nuôi bệnh sẽ hết. 2.4.1.7 Bệnh do virus Cho đến ngày nay, những loài virus đƣợc phát hiện là tác nhân gây bệnh dịch trên TCX bao gồm Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (EXV) (Qian và c.t.v., 2003); Parvolike virus (Anderson và c.t.v., 1990; Lightner và c.t.v., 1994); Infectious hypodermal and haematopancreatic necrosis virus (IHHNV) (Hsieh và c.t.v., 2006). Đối với WSSV (White Spot Syndrome Virus), TCX hoàn toàn có khả năng kháng lại mầm bệnh xâm nhiễm bằng một cơ chế đặc biệt vẫn chƣa hiểu rõ (Hameed, 2000). 2.4.1.8 Bệnh do cấu trúc lớp vỏ không bình thƣờng Lớp vỏ đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng canxi hay có thể nói canxi chính là bộ xƣơng của loài giáp xác này. Chính vì thế nếu thành phần canxi trong lớp vỏ thay đổi, trở nên quá ít hay quá nhiều, lớp vỏ sẽ trở nên mềm hoặc bị dị dạng, cản trở sự di chuyển và 12 sự phát triển của tôm (ảnh hƣởng đến khả năng săn mồi, trốn tránh kẻ thù, khó lột vỏ, ...), có thể gây chết tôm nhƣng thƣờng ở tỉ lệ thấp. 2.7.2 Những bệnh thƣờng gặp trên tôm trƣởng thành 2.4.2.1 Bệnh tổn thƣơng lớp vỏ Bệnh này đƣợc biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh đốm nâu, bệnh đốm đen. Chƣa rõ nguyên nhân gây nên bệnh này, có thể do nhiều tác nhân khác nhau gây nên, bao gồm những tổn thƣơng của lớp kitin hay những bất thƣờng do cơ học, do dinh dƣỡng, do tác nhân hoá học hoặc những nhân tố khác, tạo điều kiện cho vi khuẩn hay nấm xâm nhập gây bệnh. Những con tôm bị bệnh có triệu chứng hoại tử, sƣng viêm và sau đó để lại các vết đen trên thân và trên các phần phụ khác. Môi trƣờng nƣớc quá bẩn, nhiều chất hữu cơ với mật độ vi khuẩn cao đƣợc coi là nguyên nhân gây nên sự thƣơng tổn lớp vỏ của TCX (Macrobrachium rosenbergii), bao gồm các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào (lipase và protease) nhƣ Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp. 2.4.2.2 Bệnh đen mang (black gill disease) Mang tôm xuất hiện những vết đen là do sự tập trung của các sản phẩm hóa học hay do quá trình nitơ hoá dẫn đến sự đen hóa cơ quan mang của tôm (Tonguthai, 1997), tôm có thể bị chết do stress vì nồng độ amonia hay nitrite trong ao nuôi, quá cao so với ngƣỡng nồng độ nitrite thấp nhất có thể gây chết tôm khoảng 2 mg/l (Tonguthai, 1997). Những nghiên cứu mô bệnh học cho thấy có sự tập trung sắt trong tế bào mang TCX, đây có thể là kết quả của sự ô nhiễm sắt trong ao nuôi. 2.4.2.3 Bệnh trắng thân (white prawn disease) Đôi khi đƣợc gọi là hội chứng trắng, chỉ tấn công TCX (Macrobrachium rosenbergii) trƣởng thành, thƣờng trên tôm cái. Bệnh tấn công làm lớp mô bên dƣới lớp kitin chuyển trắng đục và mềm nhƣng các mô cơ vẫn bình thƣờng. 2.4.2.4 Bệnh đỏ thân (red discoloration) Bệnh chỉ gây hại trên tôm trƣởng thành, làm biến đổi màu sắc phần đuôi sang màu đỏ nhạt, có thể do sự phân tán sắc tố hay mất một số sắc tố. Hiện nay chƣa xác định đƣợc tác nhân gây nên bệnh này. 2.4.2.5 Bệnh do kí sinh trùng 13 2.4.2.6.1 Protozoa Hall (1979) cho rằng Corthunia sp., Epistylis sp., Vorticella sp. là những động vật nguyên sinh gây bệnh phổ biến nhất. Thông thƣờng chúng ký sinh trên lớp vỏ bên ngoài, trong hốc mắt, râu, chân đuôi (uropod) và trứng (trên tôm cái đang mang trứng). Một khi chúng kí sinh trên thân tôm, chúng sẽ làm cản trở quá trình lột xác của tôm và có thể gây chết do thiếu oxi huyết. 2.4.2.6.2 Metazoan Macrobrachium spp. đóng vai trò nhƣ một vật chủ trung gian mang ấu trùng của loài sán lá Carnaeophallus choanophallus (Johnson, 1978). Trên tôm Macrobrachium rosenbergii trƣởng thành nuôi ở Thái Lan cũng đã phát hiện một loài sán lá ký sinh nhƣng chƣa định danh đƣợc (Nash, 1989). 2.4.2.6.3 Isopod Nhóm động vật chân chèo gây hại trên tôm nƣớc ngọt thuộc về họ Bopyridae (Johnson, 1978). Một loài Isopod tìm thấy trong mang của những con tôm bệnh đã đƣợc nghiên cứu và phân loại, có thể là loài Probopyrus buitendijki, đƣợc cho là tác nhân ký sinh trên Macrobrachium rosenbergii ở vùng Đông Nam Á. 2. 5 Bệnh đục thân Bệnh xuất hiện ở một số quốc gia và vùng lảnh thổ: Khu vực châu Á (Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Malaisia) và vùng Caribbean (Cộng hoà Dominican, những hòn đảo phía Tây nƣớc Pháp). Gần đây bệnh đã xuất hiện tại các trại sản xuất giống của Việt Nam. Bệnh đục thân gây một số triệu chứng lâm sàng sau: Các bó cơ mờ đục (Akiyama và c.t.v., 1982; Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988). Xảy ra với xác xuất cao nhất ở giai đoạn ấu trùng thứ IV - VI. Tôm bỏ ăn, rớt xuống đáy bể nuôi và bị ăn thịt bởi những ấu trùng khỏe hơn. Hình dáng ngoài của tôm có màu xám xanh, bơi yếu ớt, thƣờng bơi theo đƣờng xoắn ốc. Tỉ lệ chết cao, đột ngột, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày kể từ khi phát hiện có dấu hiệu bị đục cơ. 14 Lờ đờ, giảm ăn, phần cơ bụng có màu trắng đục. Vùng đuôi (telson) bị đục trƣớc và dần dần chuyển sang phần thân tôm, và sau một thời gian thì tất cả cơ phần bụng và phần đầu ngực đều chuyển sang màu trắng đục. Triệu chứng mô học o Hao mòn khối gan tụy (Bower, 1998). o Hoại tử các sợi cơ (Vijayan, 2005; Bonami, 2005; Qian, 2003). Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX (Hameed (A, C); Vijayan, 2005 (B), Cheng và Chen, 1998 (D)). (A) và (B) Sự trắng cơ xảy ra trên PL TCX, cho thấy sự biến đổi hoàn toàn màu sắc PL. (C) và (D) Sự trắng cơ xảy ra trên tôm trƣởng thành; (D) So sánh hai mẫu tôm bệnh và không bệnh đục cơ, ở trạng thái bình thƣờng có màu hơi đục, khối gan tụy có màu gạch tƣơi (hình phía trên), khi bệnh, cơ chuyển sang đục và khối gan tụy chuyển màu vàng nhạt (hình phía dƣới). Theo Tonguthai (1977), trên TCX có nhiều bệnh gây triệu chứng đục cơ: Idiopathic muscle necrosis (IMN) (Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988), Larval mid- cycle disease (MCD) (Anderson và c.t.v., 1990; Johson, 1979; Brock, 1988), Bacterial A B C D 15 necrosis (Aquacop, 1977), Viral disease (Anderson và c.t.v., 1990), white muscle disease (white tail disease) (Hameed, 2005). Tác nhân gây nên căn bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Brower (1998) cho rằng Enterobacter aerogenes có khả năng gây hiện tƣợng đục cơ trên ấu trùng TCX ở giai đoạn IV-XI, Cheng và Chen (1998) đề nghị một loài vi khuẩn giống Enterococcus (Enterococcus-like bacterium) (Hình 2.7). Gần đây dịch bệnh trắng đuôi bùng phát tại nhiều quốc gia trên thế giới, gây triệu chứng đục các bó cơ ở phần đuôi TCX. Nhiều tác giả đã nghiên cứu và công bố tác nhân chính là MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) và XSV (extral small virus) (Yoganandhan, 2006; Vijayan, 2005); Bonami, 2005; Qian, 2003). Hiện không có bất kỳ một bài báo khoa học nào ghi nhận những biến đổi mô học trên cơ thể TCX bị đục thân, ngoại trừ dấu hiệu hoại tử các bó cơ ở phần đuôi. Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử (Cheng & Chen, 1998) Enterococcus-like bacterium là một song cầu khuẩn Gram (+), có quan hệ gần gũi với Enterococcus seriolicida, vi khuẩn giống Enterococcus này đƣợc phát hiện trên tôm bị đục thân tại Hàn Quốc (Cheng và Chen, 1998). Thực nghiệm của tác giả này cho thấy rằng khi xâm nhiễm vi khuẩn này vào Macrobrachium rosenbergii sẽ gây tỉ lệ chết cao, gây chết 100% trong vòng một tuần. MrNV là một RNA virus hình đa diện, tròn có đƣờng kính 26-27 nm, một chủng trong họ Nodaviridae (Hình 2.8). Bộ gen gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 và 1,3 kb. Vỏ capsid là một loại prôtein có trọng lƣợng phân tử 43 kDa (Bonami và c.t.v., 2005). Là một RNA virus, MrNV thực hiện quá trình sao chép trong nguyên sinh chất của hầu hết các tổ chức mô cơ thể TCX. XSV, một tiểu 16 thể giống virus có liên quan đến MrNV, có hình đa diện đƣờng kính 14-16 nm. Bộ gen của XSV là một phân tử RNA kích thƣớc 0,9 kb, mã hoá tạo nên vỏ capsid là hai chuỗi polipeptide trọng lƣợng phân tử 16 và 17 kDa (Bonami và Widada, 2004). Là một tiểu thể giống virus có kích thƣớc nhỏ, lại không mang các đoạn gen mã hoá enzyme cho quá trình sao chép, Widada và Bonami (2004) cho rằng cần có sự hiện diện của MrNV nhƣ là một yếu tố xúc tác không thể thiếu cho quá trình sao chép XSV trong các tổ chức mô TCX. Tuy vậy quan hệ này vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ ràng. Hình 2.8: Hình dạng XSV (A) và MrNV (B) dƣới kính hiển vi điện tử (Bonami và c.t.v., 2005). Bar = 100 nm. Vị trí của MrNV trong họ Nodaviridae đƣợc ghi nhận trong Hình 2.9. Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus (Bonami, 2005) A B A 17 2. 6 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống Phƣơng pháp mô học truyền thống là phƣơng pháp dùng kính hiển vi quang học (độ phóng đại tối đa 1.200 lần) quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định các trạng thái bệnh lý của mô - tế bào. Mẫu đƣợc cố định trong dung dịch Davision (mẫu giáp xác) hoặc dung dịch Bouin (mẫu cá), sau đó đem xử lý, đúc parafin, cắt và nhuộm. Quan sát lát cắt bằng kính hiển vi quang học. 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp Phƣơng pháp này dùng để khảo sát các hiện tƣợng bên trong mẫu mô bằng cách dùng phóng xạ. Ngƣời ta đƣa các tiền chất là các phân tử phóng xạ nhƣ: acid amin phóng xạ, nucleotide phóng xạ vào tế bào. Các phân tử này đƣợc tế bào tổng hợp thành các phân tử có cấu trúc lớn hơn. Tiêu bản đƣợc phủ một lớp tráng (lớp phim) và đƣợc bảo quản trong hộp tối. Các hạt Bromide bạc khi gặp phóng xạ sẽ hình thành các hạt bạc đen. Cấu trúc có chứa phân tử phóng xạ sẽ thấy có những hạt bạc đen. Mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Phƣơng pháp này cho biết nhiều hoạt động của nhiều cấu trúc ở cấp độ vi thể. 2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch Dựa trên lý thuyết kết gắn kháng nguyên với kháng thể. Kháng thể đƣợc dùng có chất đánh dấu để phát hiện và định vị các prôtein đặc hiệu. Tùy theo chất đánh dấu (huỳnh quang, men, hạt vàng) mà tiêu bản đƣợc quan sát ở các loại kính hiển vi khác nhau. 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện các DNA bất thƣờng. Chuỗi DNA đƣợc biến tính bằng nhiệt độ hay hóa chất tạo dạng sợi đơn. Sau đó đƣợc gắn với đoạn dò (probe) chuyên biệt có đánh dấu. 18 2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX (Cheng và Chen, 1998). Hp - tế bào F; Hpb - tế bào B; Hbr - tế bào R; Mfn – nhân tế bào biểu mô; Mef - lớp tế bào biểu mô; Sin – xoang tạo máu; Lm – lumen. Haematoxylin và Eosin. Hình 2.10 mô tả cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy (Cheng và Chen, 1998) trên Macrobrachium rosenbergii không mang bệnh, cho thấy khá rõ cấu trúc của các tổ chức tế bào khác nhau. Ở tôm bình thƣờng không mang bệnh, tiếp diện ngang của khối gan tụy cho thấy một cấu trúc gồm nhiều tuyến hình ống (tubule) liên kết chặt chẻ với nhau bằng một lớp biểu mô liên kết đơn. Tiếp diện ngang của thành trong của các tubule này có dạng hình hoa thị thông đến bộ máy tiêu hóa. Các tế bào trong khối gan tụy đƣợc phân thành nhiều nhóm khác nhau: nhóm tế bào E (E-cells) (embryonic cells) ở giai đoạn đầu của sự phát triển (tế bào mầm), tìm thấy ở biên của tuyến hình ống; nhóm tế bào F (F-cells) (Fibrillezellen cells) bắt màu đen và không có không bào trên tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi quang học; nhóm tế bào B (B-cells) (Blasenzellen cells) hình cầu trong chứa dịch chất tiêu hóa; nhóm tế bào R (R-cells) (Restzellen cells) dự trữ năng lƣợng chứa những giọt lipid và mạng lƣới nội chất nhám. Một vài tế bào trên tiêu bản đang trong giai đoạn phân chia tế bào. Những kẻ hở giữa các tuyến hình ống đƣợc xem là bình thƣờng. 19 2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang (Li, Zhao và Yang, 2006), cho thấy sự sắp xếp tuần tự của các phiến mang (L - lamellae) và các khoảng trống (ILS - interlamellar space). HC - hemocyte; PC - pillar cell. Haematoxylin và Eosin, x 20. TCX có 16 sợi mang, mỗi bên 8 sợi, dài 4 – 8 mm ở tôm chƣa trƣởng thành. Bề mặt của mỗi sợi mang đƣợc bao phủ bởi một lớp kitin mỏng, phía dƣới lớp kitin là một lớp biểu mô đơn. Trên mỗi sợi mang có nhiều phiến mang (lamellae), bên trong chứa hồng cầu và biểu mô (Hình 2.11). 20 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1 Bố trí thí nghiệm 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ 4/2007 đến 8/2007. Địa điểm phân tích: Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực Nam Bộ (trực thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II). Địa điểm thu mẫu: o Trại giống 1: Thị xã Long Xuyên, tỉnh An Giang. o Trại giống 2: Huyện Châu Thành, An Giang. o Trại giống 3: Xã Quới Sơn, Huyện Châu Thành, Bến Tre. o Trại giống 4: Xã An Hiệp, Huyện Châu Thành, Bến Tre. 3.1.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc chia thành hai nhóm: Thu mẫu định kỳ: tại trại giống chú Hùng và trại giống Hải Duyên. o Tại trại giống 1: Thu mỗi lần 4 mẫu x 3 lần. o Tại trại giống 2: thu 3 lần, lần 1 thu 9 mẫu (B1  B9), lần 2 thu 5 mẫu (B2, B3, B5, B6,B7), lần 3 thu 1 mẫu (B6). Thu mẫu bệnh: tại trại giống 3 và trại giống 4. 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị 3.2.1.1 Trang thiết bị Máy xử lý mẫu tự động Bình rót parafin Bộ phận làm lạnh mẫu Máy cắt mẫu microtome 21 Nồi nƣớc có chỉnh nhiệt độ Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính Tủ ấm Máy nhuộm mẫu tự động Kính hiển vi quang học 3.2.1.2 Dụng cụ Khung chứa mẫu có nấp đậy Đèn cồn Kéo Panh Khung inox dùng để đúc mẫu Lam Lamel 3.2.1.3 Hoá chất Cồn 70% Cồn 80% Cồn 90% Cồn tuyệt đối 99,5% Chloroform Parafin Xylen Thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin Keo dán: Baum Canada Formalin Acid acetic glacial Nƣớc cất 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành 3.2.2.1 Lấy mẫu 22 Khối gan tụy của tôm bị tiêu hủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự tiêu hủy mô do các enzyme tiết ra từ các tế bào gan tụy đã chết), điều này có nghĩa là cấu trúc của khối gan tụy khi tôm chết sẽ bị phân huỷ rất nhanh. Do đó mẫu phải đƣợc cố định nhanh khi tôm vẫn còn sống, để đảm bảo cấu trúc mô học của khối gan tụy không bị thay đổi. Dung dịch Davision có thành phần nhƣ sau: Acid acetic glacial : 115ml Cồn 95% : 330ml Formalin : 200ml Nƣớc cất : 335ml Hoà tan các thành phần lại với nhau và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Theo FAO (2000), nên ngâm trực tiếp ấu trùng và hậu ấu trùng (Postlarvae) (PL) giai đoạn sớm trong dung dịch cố định với tỉ lệ tối thiểu là 10 thể tích dung dịch cố định với 1 thể tích mô tôm. Thể tích này rất quan trọng trong việc bảo quản mẫu có hiệu quả, việc cố gắng làm giảm tỉ lệ này để giảm chi phí có thể làm cho mẫu mô không đạt yêu cầu cho quá trình đọc mẫu. 3.2.2.2 Xử lý mẫu Mẫu tôm post sau khi cố định xong tiến hành xử lý mẫu. Mẫu đƣợc lấy ra khỏi dung dịch cố định và tiến hành xử lý mẫu, với sơ đồ nhƣ sau: Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Sau khi xử lý xong tiến hành đúc mẫu. 3.2.2.3 Cách đúc mẫu Mục đích của việc đúc mẫu là làm cho mẫu tôm đƣợc cố định để có thể cắt với lát mỏng (khoảng 5µm) cho việc quan sát trên kính hiển vi dễ dàng, chính xác không làm thay đổi cấu trúc của các tổ chức tế bào. Cần phải thực hiện tuần tự theo các bƣớc sau: 23 Đặt mẫu vào đáy khuôn inox sao cho mặt tiếp xúc của mẫu với đáy khuôn là lớn nhất. Thực hiện bƣớc này tốt thì hình ảnh khối gan tụy và cơ quan mang có diện tích lớn, dễ quan sát cấu trúc mô bên trong. Rót parafin vào khuôn, cố gắng giữ mẫu sao cho mẫu ở trung tâm khuôn (để khi tiến hành cắt mẫu và quan sát trên kính hiển vi đƣợc tốt hơn), đậy nắp cassette lại. Đặt khuôn inox lên trên bề măt của dụng cụ làm lạnh, đợi khoảng 15 phút sau tách khối parafin ra đặt trực tiếp lên bàn lạnh. 3.2.2.4 Cách cắt mẫu Dùng máy cắt microtome, lát cắt có độ dày 5 – 6 micromet. Lát cắt đƣợc đặt lên lam, cho vài giọt cồn 70% lên, làm căng bề mặt mẫu bằng cách cho qua bể nƣớc ấm khoảng 40oC, sau đó đính mẫu lên lam và đặt vào bàn ấm ở nhiệt độ 40oC trong vòng 4 đến 6 giờ thì tiến hành nhuộm mẫu. 3.2.2.5 Nhuộm mẫu Theo phƣơng pháp của Sheenhan và Hrapchak (1980), dùng thuốc nhuộm là Haematoxylin và Eosin. Sơ đồ nhuộm mẫu: Nhỏ một giọt keo Boume Canada ngay lên trên tiêu bản mẫu và đặt lamel lên, ép sát lame lên lam kính, cố gắng tránh sự hình thành bọt khí bên trong. 3.2.2.6 Quan sát trên kính hiển vi Đặt tiêu bản lên kính hiển vi, tiến hành quan sát hình thái cấu tạo tế bào khối gan tụy, cơ quan mang, cơ của mẫu. 24 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát cấu trúc tế bào TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) bị bệnh đục thân và không bị bệnh đục thân nhƣng có những dấu hiệu bất thƣờng. Tổng số mẫu tôm chúng tôi thu đƣợc là 34 mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng tại An Giang và Bến Tre, các mẫu ấu trùng tôm đƣợc thu đều có dấu hiệu giảm ăn, ít vận động, bơi lội thất thƣờng (bơi lờ đờ, bơi theo đƣờng xoắn ốc, …) trong đó có 11 mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng thu tại Bến Tre bị đục thân. 4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân Các đặc điểm chung của mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng TCX thu tại An Giang đƣợc trình bày trong Bảng 4.1. 25 Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang Trại giống Đợt Kí hiệu Ngày thu Tuổi thu (ngày) Tình hình chung Dấu hiệu lâm sàng mẫu thu 1 I B1 16/06/2007 18 (L) - Sản xuất giống theo qui trình nƣớc xanh cải tiến. - Chất lƣợng nƣớc bể nuôi không đƣợc đảm bảo, ban đầu tốt, tảo phát triển nhiều, sau chất lƣợng suy giảm, tảo không phát triển đƣợc, màu nƣớc chuyển sang trong và nâu. - Tỉ lệ chết tăng dần theo sự phát triển của ấu trùng tôm TCX. - Không bị đục thân. - Lờ đờ, biếng ăn, biếng động. - Mất phƣơng hƣớng, bơi xoay vòng. B2 -nt- 19 (L) B3 -nt- 20 (L) B4 -nt- 21 (L) II B1 29/06/2007 31 (L) B2 -nt- 32 (L) B3 -nt- 33 (L) B4 -nt- 34 (L) 2 I B1 16/06/2007 PL 4 B2 -nt- 16 (L) B3 -nt- 16 (L) B4 -nt- PL 5 B5 -nt- 16 (L) B6 -nt- 14 (L) B7 -nt- 17 (L) B8 -nt- 17 (L) B9 -nt- 14 (L) II B2 29/06/2007 39 (PL) B3 -nt- 27 (L) B5 -nt- 40 (PL) B6 -nt- 40 (PL) B7 -nt- 37 (PL) III B6 06/07/2007 49 (PL) Bảng 4.1 cho thấy tất cả các mẫu TCX thu đƣợc ở An Giang đều không có dấu hiệu của bệnh đục thân, kết quả phân tích mô học của các mẫu TCX này sẽ làm căn cứ để xác định những khác biệt về sự thay đổi cấu trúc mô học của TCX bệnh đục thân so với bình thƣờng và so với các