Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

trường dung dịch đệm phải ổn định. - Thời gian và số lượng chu kỳ: Tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau. Ngoài ra thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài đoạn ADN cần nhân dòng. Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ. - Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác. Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng. Tuy nhiên, với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng cụ khuếch đại riêng. Ứng dụng của phương pháp PCR Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Theo Lê Đình Lương (2004) kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội. - Trong nghiên cứu khoa học kỹ thuật PCR giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm. - Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, kỹ thuật PCR cho phép lựa chọn cặp cha mẹ làm giống chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ. - Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn, HIV-AIDS… Các hạn chế của phương pháp PCR PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 11 - Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007), phương pháp PCR có các hạn chế sau: - Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb - Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. - Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic) Một số nghiên cứu về PCR Yang và ctv (2006) đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai loại virus IHHNV và WSSV trên tôm he. Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703 và 824bp (trích dẫn bởi Nguyễn Trúc Phương, 2008). Trần Thị Mỹ Duyên (2006) đã ứng dụng và tối ưu hóa qui trình PCR- genotyping với các thay đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng, chu kỳ nhiệt của phản ứng thu được qui trình tối ưu phát hiện tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. Lê Hữu Thôi (2008) thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời YHV, GAV và b-actin. YHV và GAV là hai bệnh do virus trên tôm sú gây thiệt hại nặng đến nghề nuôi tôm của nước ta. Phương pháp giúp phát hiện đồng thời hai loại bệnh này trên tôm đồng thời kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong qui trình thông qua gen nội sinh b-actin. Kết quả sản phẩm PCR cho hai vạch 750 bp (YHV) và 216 bp (b-actin) ở bước 1 và 317 bp (GAV) ở bước 2. Trần Nguyễn Diễm Tú (2008) thực hiện qui trình phát hiện WSSV, HPV và b- actin trên tôm sú. Cũng như YHV và GAV, WSSV và HPV là hai bệnh gây thiệt hại nặng nề đến nghề nuôi tôm sú của nước ta. Kết quả sản phẩm PCR cho hiện vạch ở vị trí 1441 bp (WSSV) và 216 bp (b-actin) ở bước 1 và 941 bp (WSSV), 441 bp (HPV), 216 bp (b-actin) ở bước 2. Victor và ctv (2007) phát triển phương pháp m-PCR phát hiện cùng lúc ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá : Flavobacterium Columnare (504bp), E. Ictaluri (407bp), Aeromonas Hydrophyla (209bp). Gần đây nhất, Nguyễn Trúc Phương (2008) đã định danh E. ictaluri bằng phương pháp truyền thống và bằng bộ kit API20E, sau đó tiến hành kiểm tra lại bằng phương pháp PCR. Kết quả cho thấy 5 trong 7 chủng đã được định danh là E. ictaluri với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR là 407bp. Nguyễn Văn Hòa (2008), dùng qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-Chloroform (Taggart et al, 1992) ly trích ADN từ cơ thịt cá lóc, PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 12 - sản phẩm thu được sau khi điện di trên agarose 1% cho sản phẩm có kích thước phân tử lớn hơn 1kb. Dùng ADN ly trích được thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm thu được có kích thước khoảng 300-400 bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 13 - PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian: từ tháng 01/2009 đến tháng 06/2009. Địa điểm thu mẫu: Thu mẫu từ cá gây cảm nhiễm ở thí nghiệm LD50 của bộ môn sinh học và bệnh thủy sản - khoa Thủy Sản. Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Dụng cụ và hóa chất 3.2.1 Dụng cụ 3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn - Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt - Ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh - Chai 100ml, 250ml, 500ml - Lame, lamelle - Viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn - Tủ ấm, nồi thanh trùng 3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR - Ống tub 1.5ml, 0.5ml, 0.2ml, khay đựng ống tub, que nghiền - Cân điện tử - Micropipet các loại - Đầu col các loại - Máy ly tâm lạnh - Máy ủ mẫu - Máy vortex - Máy đo ADN - Máy PCR - Bộ điện di (nguồn và bồn điện di) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 14 - - Bàn đọc UV và máy chụp hình gel - Lò viba - Tủ hút, tủ lạnh 3.2.2 Hóa chất 3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn - Cồn tuyệt đối, NaCl, H2O2 - Vaselin, nước cất - Hóa chất nhuộm gram - Amyl alcohol, ethanol, axit sulphanilic, axit acetic - Dầu paraffin - Glucose - Oxidase thương mại Môi trường - Môi trường thạch: Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA) - Môi trường lỏng: Nutrient broth (NB) - Môi trường OF 3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR - Ethanol - Lysis buffer: 0.5M NaCl; 0.001M EDTA; 1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS); 0.8% Triton; 0.1M Tris-HCl - SDS 10% - Proteinase K - RNase-A - Chloroform-Isoamyl (24:1) - Phenol-Chloroform-Isoamyl (25:24:1) - Isopropanol - Cồn 70% - TE buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, pH=7) - Buffer 10X, MgCl2, dNTPs (10mM), Taq polymerase (5u), mồi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 15 - - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye - Ethidium bromide - Nước tiệt trùng 2 lần 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể - Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200ppm, phơi khô. - Cấp nước vào bể, có sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine. - Đối với bể lớn 2m3 để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, có sục khí trước 1-2 ngày khi thí nghiệm. Bể được đặt ngoài trời nơi có mái che (tránh mưa). - Đối với bể thí nghiệm 100L thì cấp khoảng 60L nước, sục khí. Bể được đặt trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-280C. - Nước sử dụng là nguồn nước máy. - Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, vợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được vệ sinh kỹ. 3.3.1.2 Cá thí nghiệm - Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-20g/con, da sáng, phản ứng linh hoạt. - Cá mua về được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá. - Cá được nuôi dưỡng khoảng 1 tuần trước khi thí nghiệm được tiến hành 3.3.1.3 Vi khuẩn để gây cảm nhiễm Sử dụng nguồn vi khuẩn trữ trong tủ -800C của bộ môn sinh học và bệnh học thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 16 - Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 280C. Sau 24-48 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần). Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 590nm và điều chỉnh OD tương ướng để xác định mật độ vi khuẩn. OD=0.1±0.02 tương ướng mật độ vi khuẩn là 108 cfu/ml. 3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con/bể. Ø Nghiệm thức không tiêm. Ø Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý. Ø Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102 CFU/ml). Ø Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 103 CFU/ml). Ø Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 104 CFU/ml). Ø Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 105 CFU/ml). Ø Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 106 CFU/ml). Ø Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 107 CFU/ml). Thí nghiệm xác định LD50 được tiêm với 6 mật độ khác nhau là 103 đến 108 CFU/ml đối với chủng A1 . 3 chủng còn lại tiêm từ 102 đến 107 CFU/ml. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 17 - Cá mua về được thuần hóa 1 tuần thì tiến hành tiêm vi khuẩn cho cá ở các mật độ vi khuẩn và tiêm ở gốc vi ngực của cá. Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm. Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm. Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày. 3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn Trước khi giải phẫu đặt cá lên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng. Khi giải phẩu để tránh các tạp khuẩn từ bên ngoài, cần áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình phân lập vi khuẩn. Dụng cụ lấy mẫu được đốt trên đèn cồn và để nguội trước khi lấy mẫu ở các cơ quan. Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch các chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc Quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặc điểm: hình dạng khuẩn lạc, kích cỡ, màu sắc. Nhuộm Gram Nhuộm Gram để quan sát hình dạng, kích thước, xác định vi khuẩn thuần và là Gram âm hay Gram dương. Các bước thực hiện - Sử dụng lame sạch, cho một ít nước muối sinh lý lên lame. - Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít vi khuẩn cho lên giọt nước muối sinh lý trên lame và trải đều. - Để lame khô tự nhiên. - Hơ lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn, để nguội và tiến hành nhuộm. - Nhuộm crystal violet (dd1) khoảng 1 phút sau đó rửa lame bằng nước. - Nhuộm iodine (dd2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước. Sau đó rửa bằng dung dịch alcohol/acetone (dd3) từ 2-3 giây. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 18 - - Rửa lại bằng nước sạch. - Nhuộm safranin (dd4) khoảng 2 phút, rửa bằng nước sạch và để khô. - Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40 X, nhỏ lên lamelle 1 giọt dầu nếu ở vật kính 100X. Kết quả Gram dương: màu xanh/ tím Gram âm: màu đỏ/ hồng Tính di động Phương pháp này dùng để kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn bằng cách cho giọt nước treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện - Cho vaselin lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn - Dùng pipet tiệt trùng nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lamelle - Tiệt trùng que cấy và lấy một ít vi khuẩn hòa vào nước muối sinh lý trên lamelle - Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. - Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước có thể treo ngược trên lame. - Quan sát lame dưới kính hiển vi (vật kính 40X) Phản ứng oxydase Các bước thực hiện - Chạm nhẹ que thử oxidase vào một khuẩn lạc trên đĩa agar hoặc dùng que cấy nhặt một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxydase. - Quan sát sự thay đổi màu sắc trên que thử trong 30 giây. Kết quả: que thử chuyển sang màu xanh đậm cho phản ứng dương tính (+) que thử không chuyển màu phản ứng âm tính (-) Phản ứng catalase Các bước thực hiện - Nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 19 - Kết quả: vi khuẩn cho phản ứng catalase dương tính (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại không sủi bọt, phản ứng catalase âm tính (-). Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test) Các bước thực hiện Dùng đầu que cấy đã tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường O-F, sau đó phủ 0,5-1ml parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (khả năng lên men glucose: F), ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (khả năng oxy hóa: O) và ủ trong tủ ấm 28-300C. Đọc kết quả sau 1-7 ngày - Lên men (F): khi ống có phủ dầu parafin chuyển sang màu vàng. - Oxi hóa (O): khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng. - Không phản ứng khi cả 2 ống đều có màu xanh 3.3.3 Phương pháp PCR 3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR Thực hiện phân tích 14 mẫu trên 4 chủng vi khuẩn A1, T8, CAF255, CAF258 từ thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD50 của bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản. Mẫu sau khi phân lập vi khuẩn, trữ thận trước lại trong ống eppendorf 1,5ml trọng lượng từ 0.06 - 0.15g bằng ethanol hoặc chiết tách mẫu tươi không qua bảo quản. 3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992). Các bước tiến hành - Thận cá trữ trong ống 1.5ml, loại bỏ ethanol sau đó nghiền nát trong 600ml dung dịch Lysis buffer (0.5M NaCl, 0.001 EDTA, 1% SDS, 0.8% Triton, 0.1M Tris-HCl), 40ml SDS 10% và 1ml Proteinase K (40mg/ml). Chuyển động đảo lộn ống 25 lần. Ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 370C. - Cho vào 10ml RNase (2mg/ml). Chuyển động đảo ngược ống 25lần. Ủ dung dịch ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 20 - - Cho vào 600ml Chloroform – Isoamyl (24:1) đảo và ly tâm 13.000 vòng trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Protein sẽ lắng xuống thành 1 lớp nhỏ giữa 2 pha. Cẩn thận hút dung dịch phía trên cho vào ống tub 1.5ml khác. - Cho vào 600ml Phenol – Chloroform – Isoamyl (25:24:1) và đảo ngược ống để rửa DNA. Ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 40C. Cẩn thận hút dung dịch phía trên cho vào ống tub 1.5ml khác. - Lặp lại bước trên 1 lần nữa. - Cho vào 600ml Isopropanol lạnh. Ly tâm 13.000 vòng trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 40C. DNA lắng đáy ống tub, nhẹ nhàng loại bỏ dung dịch phía trên. - Cho vào 600ml cồn 70% lạnh. Ly tâm 13.000 vòng trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ phòng. Nhẹ nhàng loại bỏ cồn phía trên. - Lặp lại bước trên 1 lần nữa. Dùng micropipet loại bỏ cồn thật kỹ. - Lật ngược và phơi ống trong vài giờ ở nhiệt độ phòng. - Cho 50ml TE buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, có pH=7) vào tub chứa DNA, bảo quản thời gian ngắn ở 40C và bảo quản lâu ở -200C. 3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy Thí nghiệm này được thực hiện với DNA chiết tách từ vi khuẩn đã được cấy trên môi trường tổng hợp sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường NB (Nutrient broth) và DNA chiết tách trực tiếp từ thận cá. Thí nghiệm 1: DNA của các chủng vi khuẩn đã được chiết tách từ thận cá được pha loãng 10 lần, nồng độ từ 100 đến 10-9 với 100 là 500ng/ml. Thực hiện phản ứng PCR để tìm ra nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được E. ictaluri. Thí nghiệm 2: Các chủng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường nuôi cấy chung được nuôi tăng sinh trong môi trường NB đến pha log. Sau đó ly trích ADN bằng qui trình của Bartie và ctv (2006), ADN cũng được pha loãng 10 lần, nồng độ từ 100 đến 10-9 với 100 là 200ng/ml. Thực hiện phản ứng PCR giống thí nghiệm 1. 3.3.3.3.1 Chiết tách acid nucleic (Bartie và ctv, 2006) - Cho 1.5ml dung dịch vi khuẩn nuôi cấy trong NB vào ống eppendorf. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 21 - - Tiếp tục cho vào 100ml dung dịch TE (10mM Tris HCl và 1mM EDTA). - Ủ ở 950C trong 15 phút. - Làm lạnh nhanh ống eppendorf trong nước đá. - Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. - Chuyển phần dung dịch bên trên sang ống eppendorf mới. Đo DNA bằng máy so màu quang phổ Hòa tan 50ml dung dịch ADN vào 450ml nước cất (độ pha loãng 10 lần) vào cuvet thạch anh sau đó đặt vào máy quang phổ xác định chỉ số hấp thụ ADN ở bước sóng 260nm (A260) . Công thức tính hàm lượng ADN (mg/ml) = A260 * 50 * độ pha loãng 3.3.3.3.2 Khuyếch đại ADN: (theo Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) - Thành phần cho phản ứng: Đoạn mồi xuôi (EiFd-1): GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC Đoạn mồi ngược (EiRs): GAACGCTATTAACGCTCACACC Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR Thành phần tham gia phản ứng Hàm lượng PCR Buffer 10X MgCl2 25Mm dNTPs 10mM Taq DNA polymerase 5U Đoạn mồi (EiFd-1) 10mM Đoạn mồi (EiRs-1) 10mM DNA mẫu 20ng H2O - - Chu kỳ nhiệt Giai đoạn tiền biến tính: 95°C trong 4 phút. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm: Giai đoạn biến tính: 95°C trong 30 giây Giai đoạn gắn mồi: 53°C trong 45 giây PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 22 - Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72°C trong 30 giây. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72°C trong 10 phút. 3.3.3.3.3 Điện di Phương pháp: Chạy điện di trên agarose 1.5% (0.45g agarose = 30ml dung dịch TAE 0.5X). Các bước tiến hành - Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1.5% agarose. - Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn. - Để dung dịch nguội khoảng 50-60°C cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào khay. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Độ dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá 0,8cm. - Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel. Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X dung dịch nạp mẫu vào từng giếng một. - Sử dụng thang ADN để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Sử dụng dòng điện từ 90V. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Đọc kết quả Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat. Căn cứ vào thang ADN 1 kb plus ladder (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử. Trọng lượng phân tử đọan ADN của vi khuẩn E. ictaluri cần phát hiện là 407bp. 3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của phương pháp được xác định bằng cách dùng qui trình phát hiện Edwardsiella ictaluri để phát hiện các vi khuẩn phổ biến dùng trong thủy sản 1. Vibrio alginolyticus 2. Aeromonas hydrophila PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 23 - 3. Pseudomonas putida 4. Eschericchia coli Thao tác chiết tách vi khuẩn, khuếch đại và điện di giống 3.3.3.2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 24 - PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân tích vi sinh 4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý Cá sau khi tiêm được bố trí ngẫu nhiên, theo dõi trong 14 ngày. Khi cá chết hoặc lờ đờ, có những biểu hiện bất thường được thu mẫu phân tích. Cá bị bệnh thường bơi lờ đờ, bỏ ăn, nổi trên mặt nước, bơi lội chậm chạp, không phản ứng hoặc phản ứng chậm với tiếng động. Dấu hiệu bên ngoài : màu sắc cá nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da, miệng, bụng, dưới các gốc vây bụng, vây ngực, vây đuôi, vây hậu môn. Dấu hiệu bên trong: xoang bụng xuất huyết, có nhiều dịch nhờn. Bóng hơi căng phồng, gan tái nhợt và sưng, thận sưng và bị nhũn. Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng (Hình 4.1). Phan Thị Mỹ Hạnh (2004), Ngô Minh Dung (2007) khi gây cảm nhiễm E. ictaluri cũng có những dấu hiệu tương tự. Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa Vi khuẩn gây cảm nhiễm được sử dụng từ nguồn vi khuẩn trữ trong tủ -800C. Cá gây cảm nhiễm khi có dấu hiệu lờ đờ, nổi lên mặt nước sẽ lấy mẫu vi khuẩn từ hai cơ quan gan và thận. Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA (hoặc NA), ủ ở 28 – 300C sau 24 – 48 giờ xuất hiện các khuẩn lạc nhỏ, tròn, trắng đục, không nhân. Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hoá của chúng được trình bày ở bảng 4.1. Kết quả phân tích ở trên phù hợp với kết quả phân tích các đặc tính sinh lý và sinh hóa của E. ictaluri trên cá PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 25 - nheo Mỹ (Hawke 1979) và gần đây nhất là kết quả phân tích của Nguyễn Trúc Phương (2008). Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa Chỉ tiêu A1 T8 CAF255 CAF258 Chủng chuẩn Hawke (1979) Nhuộm Gram - - - - - Hình dạng que que Que que Que Di động + + + + + Catalase + + + + + Oxidase - - - - - O-F + + + + + Sinh H2S - - - - - Sử dụng Urea - - - - - Sinh indole - - - - - Ghi chú: (+) cho phản ứng dương tính, (-) cho phản ứng âm tính 4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh). 4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) Để xác định khả năng ứng dụng của qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), sử dụng qui trình chiết tách 6 mẫu thận gồm 1 mẫu từ cá khỏe và 5 mẫu cá cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri, chủng CAF255, nồng độ vi khuẩn từ 102 đến 106 CFU/ml. ADN sau khi chiết tách được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 260nm và dùng công thức tính hàm lượng ADN. Hàm lượng ADN thu được dao động từ 1.27mg/ml đến 10.81mg/ml (bảng 4.2). Kết quả cho thấy qui trình có thể được dùng để chiết tách ADN trực tiếp từ thận. Bảng 4.2 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Taggart et al., 1992) Chủng vi khuẩn Trọng lượng thận (g) Hàm lượng Proteinase K (ml) Thời gian ủ bước 1 Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ bước 2 Hàm lượng ADN (mg/ml) Cá khỏe 0.06 1 24h 10 1h 1.27 CAF255 102_III_F4 0.09 1 24h 10 1h 10.81 CAF255 103_III_F1 0.03 1 24h 10 1h 3.595 CAF255 104_III_F3 0.07 1 24h 10 1h 6.125 CAF255 0.07 1 24h 10 1h 6.205 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 26 - 105_II_F5 CAF255 106_III_F7 0.07 1 24h 10 1h 7.335 Mẫu cá khỏe có hàm lượng ADN thấp nhất (1.27mg/ml), mẫu này đồng thời được phân lập vi khuẩn trên môi trường tổng hợp kết quả không thấy vi khuẩn phát triển trên môi trường. Điều này cho thấy ADN chiết tách được từ thận là ADN của cá, không có ADN của vi khuẩn. Mẫu có hàm lượng ADN cao nhất (10.81 mg/ml) là mẫu có trọng lượng thận lớn nhất, cho thấy khi trọng lượng thận lớn thì hàm lượng ADN chiết tách được cao hơn. Với cùng qui trình này, Nguyễn Văn Hòa (2008) thực hiện ly trích DNA từ cơ thịt cá lóc cũng đã thu được ADN với hàm lượng dao động từ 19 đến 96 mg/ml. 4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 Ở bước 1 của qui trình cần ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 370C. Để rút ngắn thời gian ủ này nhằm rút ngắn thời gian thực hiện qui trình cần tăng hàm lượng Proteinase K đảm bảo chiết tách được ADN. Thực hiện chiết tách 5 mẫu thận, trong đó 4 mẫu cá cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri, chủng A1 và 1 mẫu cá tự nhiên có dấu hiệu bệnh. Hàm lượng Proteinase K là 20ml (40mg/ml), ủ mẫu với các mốc thời gian lần lượt là 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 24 giờ (ủ qua đêm). Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 Chủng vi khuẩn Trọng lựong thận (g) Hàm lượng Proteinase K (ml) Thời gian ủ bước 1 Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ bước 2 Hàm lượng ADN (mg/ml) A1 108_I_F4 0.06 20 1h 10 1h 10.7 A1 105_II_F4 0.08 20 2h 10 1h 3.455 A1 103_II_F1 0.13 20 4h 10 1h 11.6 A1 108_I_F3 0.15 20 6h 10 1h 9.95 F1 0.14 1 24h 10 1h 12.06 Hàm lượng ADN thu được khi tăng hàm lượng Proteinase K và giảm thời gian ủ dao động từ 3.455mg/ml đến 12.06mg/ml (bảng 4.3). Từ bảng kết quả cho thấy hàm lượng ADN ở thời gian ủ 24 giờ là cao nhất, tuy nhiên ở các mốc 1 giờ và 4 giờ cũng thu được hàm lượng ADN khá lớn, không chênh lệch nhiều so với mốc 24 giờ. Với hàm lượng Proteinase K giống nhau, thời gian ủ khác PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 27 - nhau với mốc thời gian ủ ngắn nhất (1 giờ) vẫn thu được hàm lượng ADN khá lớn. 4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase Với hàm lượng Proteinase K là 20ml và thời gian ủ rút ngắn qui trình vẫn cho kết quả tốt. Tuy nhiên, dùng 20ml cho 1 mẫu phân tích so với qui trình gốc cao hơn đến 20 lần. Proteinase K và RNase là hai thành phần chiếm chi phí cao nhất trong qui trình chiết tách acid nucleic. Ngoài ra ở bước 2 của qui trình chiết tách cần ủ mẫu trong 1 giờ ở 370C. Thực hiện chiết tách 5 mẫu thận từ cá cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri, chủng T8, hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5ml và 5ml, ủ mẫu ở các mốc thời gian 15 phút, 30 phút và 1 giờ. Sử dụng hàm lượng Rnase là 5ml cho 1 mẫu phân tích Bảng 4.4 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase Chủng vi khuẩn Trọng lượng thận(g) Hàm lượng Proteinase K (ml) Thời gian ủ bước 1 Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ bước 2 Hàm lượng ADN (mg/ml) T8 102_I_F1 0.1 2.5 1 giờ 10 1h 10.575 T8 104_II_F1 0.07 2.5 30phút 10 1h 4.655 T8 102_II_F2 0.08 5 1 giờ 5 1h 1.275 T8 105_II_F2 0.1 5 30phút 5 1h 9.82 T8 106_II_F1 0.07 2.5 15phút 5 1h 2.92 Từ bảng kết quả cho thấy, mẫu có hàm lượng Proteinase K 2.5ml, RNase 5ml và thời gian ủ 15 phút có hàm lượng ADN là 2.92mg/ml vẫn cao hơn mẫu có hàm lượng Proteinase K 5ml, RNase5 ml và thời gian ủ 1 giờ (hàm lượng ADN là 1.275mg/ml). Điều này chứng tỏ qui trình có thể thực hiện với hàm lượng Proteinase K, RNase nhỏ nhất và thời gian ủ ngắn nhất từ kết quả chiết tách các mẫu ở trên. 4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5ml, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 28 - Việc giảm hàm lượng Proteinase K và RNase, đồng thời giảm thời gian ủ ở bước 2, tiếp tục giảm thời gian ủ ở bước 1 để có được phương pháp tối ưu nhất phát hiện E. ictaluri với chi phí thấp nhất và thời gian ngắn nhất. Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), hàm lượng Proteinase K 2.5ml, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút. Chủng vi khuẩn Trọng lượng thận (g) Hàm lượng Proteinase K (ml) Thời gian ủ bước 1 Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ bước 2 Hàm lượng ADN (mg/ml) T8 102_II_F3 0.15 2.5 15 phút 2.5 30 phút 11.52 CAF258 103_II 0.12 2.5 15 phút 2.5 30 phút 11.88 CAF258 104_II_F5 0.08 2.5 15 phút 2.5 30 phút 10.06 CAF258 106_I_F3 0.07 2.5 15 phút 2.5 30 phút 7.015 CAF258 107_III_F10 0.07 2.5 15 phút 2.5 30 phút 7.215 Tất cả mẫu được ly trích với cùng hàm lượng Proteinase K, hàm lượng RNase; cùng thời gian ủ ở bước 1 và bước 2. Hàm lượng ADN thu được dao động từ 7.015 đến 11.88mg/ml. Hàm lượng thấp nhất thu được từ qui trình này cao hơn nhiều so với hàm lượng thấp nhất thu được từ các qui trình trước, và hàm lượng cao nhất là tương đương với các qui trình trước. Tuy hàm lượng Proteinase K sử dụng gấp 2,5 lần so với qui trình gốc nhưng hàm lượng RNase đã giảm đáng kể (4 lần), và tổng thời gian thực hiện qui trình chỉ mất khoảng 2 giờ trong khi nếu thực hiện qui trình gốc mất khoảng 1 ngày. 4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR 4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy Thí nghiệm xác định độ nhạy được thực hiện bằng phản ứng PCR với các hàm lượng ADN khác nhau từ 100 đến 10-9 ng/ml (với 100 là hàm lượng biết trước) nhằm xác định hàm lượng ADN thấp nhất có thể phát hiện E. ictaluri. Thí nghiệm này được thực hiện với ADN chiết tách từ vi khuẩn (Bartie và ctv, 2006) đã được phân lập trên môi trường tổng hợp sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường Nutrient broth (NB) và ADN chiết tách trực tiếp từ thận cá theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 29 - Thí nghiệm 1 (DNA chiết tách trực tiếp từ thận) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1000bp 407bp 500bp 300bp 100bp Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ thận Giếng M: Maker; Giếng 1: ĐC (-); Giếng 2: 100; Giếng 3: 10-1; Giếng 4: 10-2; Giếng 5: 10-3; Giếng 6: 10-4; Giếng 7: 10-5; Giếng 8: 10-6; Giếng 9: 10-7; Giếng 10: 10-8; Giếng 11: 10-9 Ghi chú: Chủng vi khuẩn CAF255; 100 = 500ng Kết quả cho thấy hàm lượng ADN thấp nhất có thể phát hiện được E. ictaluri khi chiết tách trực tiếp từ thận cá là 50ng/ml. Thí nghiệm 2 (ADN chiết tách từ vi khuẩn) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 407bp Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ vi khuẩn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 30 - Giếng M: Maker; Giếng 1: ĐC (-); Giếng 2: 100; Giếng 3: 10-1; Giếng 4: 10-2; Giếng 5: 10-3; Giếng 6: 10-4; Giếng 7: 10-5; Giếng 8: 10-6; Giếng 9: 10-7; Giếng 10: 10-8; Giếng 11: 10-9 Ghi chú: Chủng vi khuẩn CAF255; 100 = 200ng Với ADN chiết tách từ vi khuẩn, hàm lượng thấp nhất để phát hiện E. ictaluri là 0.2ng/ml. Kết quả cho thấy hàm lượng thấp nhất để phát hiện E. ictaluri từ hai thí nghiệm chênh lệch rất lớn (250 lần). Do ADN chiết tách từ vi khuẩn được nuôi tăng sinh đã qua một bước phân lập trên môi trường thạch thu được chủng vi khuẩn thuần nên ADN thuần thúy chỉ là ADN của vi khuẩn E. ictaluri. Trong khi đó, do chiết tách trực tiếp từ thận cá nên ngoài ADN của E. ictaluri còn có ADN của cá và ADN của vi khuẩn khác nếu có. 4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu Qui trình phát hiện E. ictaluri được kiểm tra tính đặc hiệu bằng cách sử dụng qui trình để phát hiện các loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thủy sản. Qui trình là đặc hiệu cho loài E. ictaluri nếu cho kết quả dương tính với E. ictaluri và cho kết quả âm tính với các chủng vi khuẩn khác. 8 7 6 5 4 3 2 1 M 407bp Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu. Giếng M: Maker; Giếng1: ĐC (-); Giếng 2: E.ictaluri – CAF258; Giếng 3: E.ictaluri – CAF255; Giếng 4: E. ictaluri – T8; Giếng 5: Pseudomonas putida; Giếng 6: Eschericchia coli; Giếng 7: Vibrio alginolyticus; Giếng 8 : Aeromonas hydrophila. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 31 - Kết quả điện di 7 chủng vi khuẩn, có 3 chủng E. ictaluri và 5 chủng vi khuẩn thường gặp trong nuôi trồng thủy sản. Tất cả các chủng khác ngoài E. ictaluri đều cho kết quả âm tính, 3 chủng E. ictaluri cho kết quả dương tính. Qua kết quả điện di xác định qui trình đặc hiệu với vi khuẩn E. ictaluri. 4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E. ictaluri (Panangala và ctv, 2007). Qui trình khuếch đại thực hiện với hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1. Thành phần tham gia phản ứng khuếch đại ban đầu có hàm lượng Taq DNA polymerase là 5U/ml. Các polymerase chịu nhiệt là thành phần đắt nhất của phản ứng PCR và thường được sử dụng 1 đơn vị cho một phản ứng. (Nguyễn Văn Thanh, 2007) Nếu hàm lượng Taq DNA polymerase giảm mà vẫn cho được kết quả tốt sẽ có ý nghĩa trong việc giảm chi phí cho một phản ứng PCR. Thực hiện phản ứng PCR với các hàm lượng Taq DNA polymerase khác nhau (5U/ml, 4U/ml, 3U/ml) cho cùng mẫu ADN nhằm kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Taq DNA polymerase thấp hơn. Bảng 4.6 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Taq DNA polymerase 5U/ml) Thành phần tham gia phản ứng Thể tích (ml) PCR Buffer 10X 2.5 MgCl2 25mM 1.5 dNTPs 10mM 0.5 Taq DNA polymerase 5U/ml 1 Đoạn mồi (EiFd-1) 10mM 1 Đoạn mồi (EiRs-1) 10mM 1 DNA mẫu 4ng,20ng,100ng,500ng 1 H2O 16.5 Bảng 4.7Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Taq DNA polymerase 4U/ml) Thành phần tham gia phản ứng Thể tích (ml) PCR Buffer 10X 2.5 MgCl2 25mM 1.5 dNTPs 10mM 0.5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 32 - Taq DNA polymerase 4U/ml 0.8 Đoạn mồi (EiFd-1) 10mM 1 Đoạn mồi (EiRs-1) 10mM 1 DNA mẫu 4ng,20ng,100ng,500ng 1 H2O 16.7 Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Taq DNA polymerase 3U/ml) Thành phần tham gia phản ứng Thể tích (ml) PCR Buffer 10X 2.5 MgCl2 25mM 1.5 dNTPs 10mM 0.5 Taq DNA polymerase 3U/ml 0.6 Đoạn mồi (EiFd-1) 10mM 1 Đoạn mồi (EiRs-1) 10mM 1 DNA mẫu 4ng,20ng,100ng,500ng 1 H2O 16.9 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 407bp 407bp Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Taq DNA polymerase khác nhau Giếng M: Maker; Giếng 1: ĐC(-); Giếng 2: ĐC(+); Giếng 3: A1 108_I_F4 (5U); Giếng 4: A1 105_II_F4 (5U); Giếng 5: A1 103_II_F1 (5U); Giếng 6: A1 108_I_F3 (5U); Giếng 7: F1 (5U). Giếng 8 đến 14 thứ tự mẫu lần lượt giống M 15 16 17 18 19 20 21 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 33 - Giếng 1 đến giếng 7, hàm lượng Taq 4U; Giếng 15 đến 21 thứ tự mẫu tương tự với hàm lượng Taq 3U. Với 3 hàm lượng Taq DNA polymerase khác nhau (5U/ml, 4U/ml, 3U/ml), kết quả không thể hiện sự khác biệt nhiều. Ở hàm lượng Taq 5U/ml không hiện vạch cho mẫu A1 108_I_F3 (giếng 6), trong khi đó ở 2 hàm lượng còn lại thể hiện vạch cho cùng 1 mẫu (giếng 13 và 20) tuy rất mờ. Điều đó cho thấy hàm lượng Taq 3U/ml có thể cho kết quả tốt hơn hàm lượng Taq 5U/ml. Do đó hàm lượng Taq 3U sẽ được sử dụng để thực hiện các phản ứng kế tiếp. 4.4 Kết quả phản ứng PCR 4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992). Để xác định sản phẩm sau khi khuếch đại, dùng ADN đã được ly trích theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), chọn hai mẫu có hàm lượng ADN trung bình giữa các mẫu là CAF258 104_II_F5 và CAF255 106_III_F7 pha ra các nồng độ lần lượt là 4ng, 20ng,100ng và 500ng. Khuếch đại với hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 (Panangala và ctv, 2007), hàm lượng Taq DNA polymerase 5U/ml với chu kỳ nhiệt Giai đoạn tiền biến tính: 95°C trong 4 phút. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm: Giai đoạn biến tính: 95°C trong 30 giây; Giai đoạn gắn mồi: 53°C trong 45 giây; Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72°C trong 30 giây. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72°C trong 10 phút. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 407bp Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri, qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) Giếng M: Maker; Giếng 1: ĐC(-); Giếng 2: ĐC(+); Giếng 3: CAF255 104_III_F3 (4ng); Giếng 4: CAF255 104_III_F3 (20ng); Giếng 5: CAF255 104_III_F3 (100ng); Giếng 6: CAF255 104_III_F3 (500ng); Giếng 7: CAF255 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 34 - 106_III_F7 (4ng); Giếng 8: CAF255 106_III_F7 (20ng); Giếng 9: CAF255 106_III_F7 (100ng); Giếng 10: CAF255 106_III_F7 (500ng). Kết quả điện di cho thấy, qui trình chiết tách acid nucleic thực hiện theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ly trích được ADN của E. ictaluri. Qua phản ứng đã phát hiện được E. ictaluri ở vị trí 407bp. Để xác định hàm lượng ADN thích hợp, mẫu được chạy với 4 hàm lượng ADN khác nhau là 4ng, 20ng, 100ng và 500ng. Kết quả cho thấy ở cả 4 hàm lượng đều có thể phát hiện được E. ictaluri, tuy nhiên ở hàm lượng 4ng hiện vạch rất mờ, ở hàm lượng 500ng vạch thể hiện rõ nhất. Qua kết quả sử dụng hàm lượng ADN 500ng cho phản ứng PCR. 4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được tối ưu. Thực hiện phản ứng PCR với DNA mẫu được chiết tách với qui trình chiết tách tối ưu (hàm lượng Proteinase K 2.5ml, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút). Khuếch đại với hàm lượng Taq DNA polymerase 3U/ml. Kết quả điện di ở trên được thực hiện hoàn chỉnh với tất cả phương pháp đều được tối ưu. Hầu hết các mẫu đều cho kết quả dương tính với E. ictaluri, riêng mẫu T8 102_II_F3 (giếng 8) không hiện vạch, nguyên nhân có thể do mật độ vi khuẩn quá thấp. Kết quả trên không chỉ kiểm tra qui trình chiết tách đã tối ưu ở trên mà còn thể hiện kết quả tối ưu phản ứng PCR. 8 7 6 5 4 3 2 1 M 407bp Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 35 - Giếng M: Maker; Giếng 1: ĐC(-); Giếng 2: ĐC(+); Giếng 3: A1 105_III_F2; Giếng 4: CAF258 107_III_F10; Giếng 5: CAF258 106_I_F3; Giếng 6: CAF258 104_II_F5; Giếng 7: CAF258 103_II; Giếng 8: T8 102_II_F3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 36 - PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Dùng phương pháp ly trích Phenol Chloroform (Taggart et al, 1992) ly trích được ADN của vi khuẩn E. ictaluri trực tiếp từ thận. - Tối ưu hóa qui trình ly trích ADN từ thận cá với: hàm lượng Proteinase K là 2.5ml, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút. Giảm thời gian thực hiện qui trình xuống 8 lần so với qui trình ban đầu. - Hàm lượng ADN thấp nhất có thể phát hiện được E. ictaluri khi chiết tách từ thận là 50ng/ml, chiết tách từ vi khuẩn là 0.2ng/ml. - Phương pháp PCR với hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 (Panangala và ctv, 2007) được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E. ictaluri. - Chuẩn hóa thành phần phản ứng PCR: hàm lượng Taq DNA polymerase sử dụng là 3U/ml. - Sử dụng ADN từ qui trình chiết tách đã tối ưu thực hiện phản ứng với phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị trí 407bp. 5.2 Đề xuất - Tiếp tục chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN để có được qui trình tối ưu nhất. - Tối ưu hóa phản ứng phát hiện E. ictaluri với nồng độ thấp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 37 - TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bartie, K., Đ. T. H. Oanh, G. Huy, C. Dickson, M. Cnockaert, J. Swings, N. T. Phương, A. Teale. 2006. Tạp chí Công nghệ sinh học 4 (1): p31-40 2. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Giáo trình nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản, 86 trang. 3. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP.HCM, 422 trang. 4. Ferguson, H.W, JF Turnbull, A Shinn, K.Thomson, TT Dung and M.Crumlish, 2001, Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, VietNam. Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513. 5. Hawke, J.P, 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508-1512. 6. Hawke, J.P, R.M Durborow, R.L Thune and A.C Camus, 1998. ESC – Enteric Septicemia of Catfish. SRAC Publication No.477. 7. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục, 301 trang. 8. Huỳnh Chí Thanh, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng kháng sinh. ). Luận văn Đại học, khoa Thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 45 trang. 9. Kasornchandra J, W.A. Rogers and J.A. Plumb 1987. Edwardsiella ictaluri from walking catfish, Clarias batrachus L., in Thailan. Journal of Fish Diseases 10, 137-138. 10. Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân, 2004. Cơ sở di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, 208 trang. 11. Lê Hữu Thôi, 2008. Phát triển qui trình mRT-RCR phát hiện YHV (Yellow Head virus), GAV (Gill-assiociated virus) và gen b-actin trên tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn Đại học, khoa Thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 51 trang. 12. Lê Thị Bé Năm, 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 38 - trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại học, khoa Thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 43 trang. 13. Lê Xuân Sinh, 2005. Giáo trình kinh tế thủy sản, 95 trang. 14. Lê Xuân Sinh, Lê Lệ Hiền, 2008. Cung cấp và sử dụng giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long của Việt Nam. Báo cáo trình bày tại Hội nghị Châu Á-Thái Bình Dương về Cá Da Trơn; ĐHCT, 5-7/12/2008. 15. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại học, khoa Thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 47 trang. 16. Nguyễn Phú Son, 2007. Nghiên cứu thị trường cá tra và basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí khoa học 2007, trang 28 – 37. 17. Ngô Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại học, khoa Thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 47 trang. 18. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc hóa chất trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tại An Giang- Cần Thơ. Luận văn cao học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 74 trang. 19. Nguyễn Hữu Thịnh, Trương Thanh Loan, 2007. Phân lập và khảo sát đặc điểm kháng kháng sinh của Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, Pangasius hypophthalmus, nuôi thâm canh. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007, trang 175 – 179. 20. Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung và Ferguson H.W, 2004. Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004, trang 120 – 125. 21. Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008. Điều tra hiện trạng nuôi, bệnh và tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi thâm canh cá tra ao (Pangasinodon hypophthalmus). Luận văn Đại học, khoa Thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 84 trang. 22. Nguyễn Thị Hiền, 2008. Vaccine phòng bệnh đốm trắng cá tra kết qủa thực nghiệm và triển vọng ứng dụng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 39 - (09/11/08) 23. Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008.Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa Thủy sản. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 56 trang. 24. Nguyễn Trọng Bình, 2008. Tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận (bệnh gan, thận mủ) và hướng ngăn ngừa bệnh (09/11/08) 25. Nguyễn Trúc Phương, 2008. Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và API20E. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 42 trang. 26. Nguyễn Trúc Phương, Nguyễn Thị Tiên, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008. Phát triển và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). 27. Nguyễn Văn Hòa, 2008. So sánh các loài cá lóc (Channa spp) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long bằng phương pháp hình thái học và PCR mtDNA. Luận văn tốt nghiệp cao học, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ, 60 trang. 28. Nguyễn Văn Thanh, 2007. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục, 219 trang. 29. Panangala V. S. , Craig A. Shoemaker, Vicky L. van Santen, Kevin Dybvig, Phillip H. Klesius, 2007, multiplex- PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogen, Flavobacterium columnare, Edwadsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophyla. Dieases of aquatic organisms, 74: 199- 208. 30. Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 47 trang. 31. Plumb, J.A, 1993. Edwardsiella Septicaemia. In: Bacterial disease of fish. (Ed. By inglis,V., Robert, R.J.and Bromage, N.R, 1993), pp 61 – 79. Oxford Blackwell scientific publications. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 40 - 32. Plumb, J.A, 1999. Edwardsiella Septicaemias. Fish disease and Disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal infections. 33. Plumb J.A and D.J. Sanchez, 1983. Susceptibility of five species of fish to Edwardsiella ictaluri. Journal of fish disease 6, 261-266. 34. Taggart, J.B, R.A.Hynes, P.A.Podohl and A.Ferguson, 1992. A simplified protocol for routine total DNA isolation from salmonid fishes. Journal of fish Biology 40:963:965. 35. Thạch Thảo, 2008. Đồng bằng sông Cửu Long: Ô nhiễm môi trường từ việc nuôi cá ba sa, 15/07/2008. 21/11/2008 36. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ, 66 trang. 37. Trần Lê Triệu Tú, 2007. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus). Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 37 trang. 38. Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008. Phát triển qui trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát hiện WSSV (White Spot Syndrome virus), HPV (Hepatopancreatic Parvovirus) và nội chuẩn b-actin trên tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 55 trang. 39. Trần Thị Mỹ Duyên, 2006. Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus- WSSV).Luận văn tốt nghiệp Đại học, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ, 42 trang. 40. Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 2005. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 187 trang. 41. Từ Thanh Dung, 2008. Giáo trình bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sinh. Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ, 127 trang. 42. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004, trang 137 – 142. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 41 - 43. Valerie Inglis, Ronald J. Roberts, Naill R. Bromage. Enteric septicaemia of catfish, Bacterial Diseases of fish, p. 67 – 79. 44. VASEP, 2008. Xuất khẩu thủy sản chạm ngưỡng 4 tỷ USD. 2363 (8/12/08) 45. Victor S. Panangala, Craig A. Shoemaker, Vicky L. van Santen, Kevin Dybvig, Phillip H. Klesius, 2007, multiplex- PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogen, Flavobacterium columnare, Edwadsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophyla. Dieases of aquatic organisms, 74: 199- 208. 46. Wolters. R. W and M. R. Johnson, 1994. Enteric septicaemia resistance in blue catfish and three channel catfish strains. Journal of aquatic animal health 6: 329 – 334. 47. Yang. B, X-L Song, J Huang, C-Y Shi, Q-H Liu and L Liu, 2006. A single-step multiplex PCR for simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp, 29, 301-305. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 42 - PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần tham gia phản ứng PCR với DNA mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992). Giếng Chủng vi khuẩn Trọng lượng thận (g) Tình trạng mẫu Hàm lượng Protein K (ml) Thời gian ủ Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ Hàm lượng ADN (ng) Tag 1 ĐC (-) 2 ĐC (+) 3 CAF255 104_III_F3 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 4 5U 4 CAF255 104_III_F3 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 20 5U 5 CAF255 104_III_F3 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 100 5U 6 CAF255 104_III_F3 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 500 5U 7 CAF255 106_III_F7 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 4 5U 8 CAF255 106_III_F7 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 20 5U 9 CAF255 106_III_F7 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 100 5U 10 CAF255 106_III_F7 0.07 Trữ cồn 20 24h 10 1h 500 5U PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 43 - Phụ luc 2: Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR với DNA mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được chuẩn hóa lần 1. Giếng Chủng vi khuẩn Trọng lượng thận (g) Tình trạng mẫu Hàm lượng Protein K (ml) Thời gian ủ Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ Hàm lượng ADN (ng) Tag 1 ĐC (-) 2 ĐC (+) 3 A1 108_I_F4 0.06 Trữ cồn 20 1h 10 1h 500 3U 4 A1 105_II_F4 0.08 Trữ cồn 20 2h 10 1h 500 3U 5 A1 103_II_F1 0.13 Trữ cồn 20 4h 10 1h 500 3U 6 A1 108_I_F3 0.07 Trữ cồn 20 6h 10 1h 500 3U 7 F1 0.14 Trữ cồn 20 24h 10 1h 500 3U Phụ lục 3: Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR với DNA mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được tối ưu. Giếng Chủng vi khuẩn Trọng lượng thận (g) Tình trạng mẫu Hàm lượng Protein K (ml) Thời gian ủ Hàm lượng RNase (ml) Thời gian ủ Hàm lượng ADN (ng) Tag 1 ĐC (-) 2 ĐC (+) 3 A1 105_III_F2 0.1 Trữ cồn 2.5 1h 2.5 1h 500 3U 4 CAF258 107_III_F10 0.07 Tươi 2.5 15’ 2.5 30’ 500 3U 5 CAF258 106_I_F3 0.07 Tươi 2.5 15’ 2.5 30’ 500 3U 6 CAF258 104_II_F5 0.08 Tươi 2.5 15’ 2.5 30’ 500 3U 7 CAF258 103_II 0.12 Tươi 2.5 15’ 2.5 30’ 500 3U 8 T8 102_II_F3 0.15 Tươi 2.5 15’ 2.5 30’ 500 3U PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 44 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version