Vi nhân giống mía đường

đạt được kích thước về chiều cao, số lá đường kính thân thích hợp sẽ được chuyển ra trồng ở đồng ruộng. Duy trì độ ẩm cao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán. 1.1.5.2.9. Chọn lọc cây đầu dòng Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô. Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu. 1.1.6. Các vấn đề liên quan 1.1.5.1. Mẫu nuôi cấy[5] Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được, sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi. Chọn cơ quan: Hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau có thể dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt. Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý. Mẫu in vitro: Mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm. Sức sống của mẫu: Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất ra cây sạch bệnh. Những cây bị nhiễm virus cũng có thể tạo ra cây sạch bệnh nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Duy trì mẫu: Có nhiều nhân tố kiểm tra và cải thiện những điều kiện sinh lý và vật lý mẫu cây mẹ như dinh dưỡng, nhiệt độ, cường độ ánh sáng mà mẫu cây mẹ sinh trưởng và những xử lý vật lý và hóa học trực tiếp trên mẫu cây mẹ. Dinh dưỡng: Sử dụng vật liệu nuôi cấy khỏe và dinh dưỡng cây mẹ cho thấy rất quan trọng để có mẫu nuôi cấy khỏe. Nhiệt độ: Có sự ảnh hưởng trong nuôi cấy mô khi thể bulb mẹ được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau và thời gian bảo quản khác nhau. Ánh sáng: Ánh sáng đỏ kích thích tăng khả năng tổng hợp Cytokinin và làm giảm tổng hợp Auxin. 1.1.5.2. Ảnh hưởng của môi trường [6] Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nhưng các loài khác nhau có thể đòi hỏi môi trường nuôi cấy khác nhau. Samartin (1989) đã sử dụng 6 công thức muối đa lượng khác nhau đối với cây trà Camelia japonica và thấy rằng môi trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non. Môi trường MS đã chứng tỏ không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong khi môi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 15 Tính độc của môi trường MS cũng được quan sát ở một số loài (Sommer, 1982; Vieitez, 1983) do môi trường này chứa hàm lượng muối đa lượng cao, có thể gây độc cho tế bào in vitro, nhất là protoplast. Phương pháp đơn giản nhất là giảm nồng độ muối khoáng xuống 1/3 hoặc 1/2 (Grosser, 1994). Môi trường cơ bản MS có hàm lượng NH 4 NO 3 , KNO 3 giảm một nửa, bổ sung thêm glutamine 1,550 mg/l, KCl 750 mg/l rất tốt cho nuôi cấy mô sẹo phôi hoá và giảm tích luỹ tinh bột ở một số giống Citrus (Grosser và Gmitter, 1990). Trong số các muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa quyết định đến sự tái sinh chồi. Welander (1985) cho biết khi nồng độ NH 4 NO 3 và KNO 3 trong MS giảm đi 1/2, đỉnh sinh trưởng của dâu tây phát triển khá hơn, rễ tái sinh mạnh hơn. Giảm muối khoáng trong một số trường hợp có tác dụng tốt đối với sự ra rễ ở một số loài (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) như trường hợp chồi hoa hồng ra rễ tốt hơn khi nồng độ nitơ tổng số giảm (Hyndman cs., 1982). Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nồng độ đường 1- 3 % được sử dụng phổ biến. Nồng độ đường sucrose cao hơn 3 % tỏ ra độc ở một số trường hợp (Rublue và Kartha, 1985). Chong và Pua (1985) đã sử dụng sucrose, glucose, fructose and sorbitol nồng độ từ 1-7 % trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giống táo Ottawa 3 và thấy rằng nồng độ sucrose 3% là tối ưu cho sinh trưởng, 100% chồi tạo rễ và chất lượng cây con khoẻ mạnh. Trạng thái vật lý của môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đa số các trường hợp người ta sử dụng môi trường agar nhưng khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng một số loài, môi trường lỏng tỏ ra tốt hơn (Mellor và Stace Smith, 1969). Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thể làm giảm các biến dị tế bào soma (Grosser và Gmitter, 1990). Tế bào mô sẹo phôi hoá ở cây có múi có thể nuôi cấy và bảo quản lâu dài trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng. Nhiệt độ Nhiệt độ trong bình nuôi thường cao hơn nhiệt độ ngoài bình một vài độ và phần đáy bình thường sẽ ấm hơn so với phần nắp bình. Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (chiếu sáng) và ban đêm (không chiếu sáng) được duy trì từ 4 – 80C. Sự chênh lệch nhiệt độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và cải thiện sự sinh trưởng của cây nuôi cấy. [4] Nhiệt độ thích hợp nuôi cấy mô 20-270C. Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào và cơ quan. Tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy thường giảm dần khi nhiệt độ buồng nuôi thấp hơn nhiệt độ tối thích và giảm xuống rất nhanh khi nhiệt độ buồng nuôi cao hơn nhiệt độ tối thích.[4] Xử lý cây mẹ trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro là một phương pháp xử lý cơ bản để sản xuất cây sạch bệnh. Xử lý nhiệt trước khi nuôi cấy in vitro cho thấy đỉnh sinh trưởng đã được khử virus. Ánh sáng Cường độ ánh sáng: cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Tuy nhiên ảnh hưởng đầu tiên đến sự quang hợp là ảnh hưởng đến sinh lý. Ảnh hưởng quan trọng đến chồi, nhưng Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 16 lại tối cần thiết cho sự tạo rễ. cường độ ánh sáng cao hay thấp quá cũng đều ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi. Quang kì và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng. Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro. Ngoài ra có ảnh hưởng của bước sóng đến phản ứng cây in vitro và có mối tương tác giữa bước sóng ánh sáng và môi trường dinh dưỡng. Các chất khí Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây in vitro. O2, CO2 và etylen là những chất được khảo sát nhiều. CO2 có thể bị giới hạn trong bình nuôi cấy và sử dụng nắp bình có lỗ thông khí, sử dụng bình có bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng dưỡng cây có thể cho vi nhân giống giá thành hạ. Giàu CO2 và cường độ ánh sáng cao giúp cho quá trình quang hợp xảy ra nhanh hơn và nâng cao tốc độ vi nhân giống. O2 có giới hạn trong nuôi cấy mô. Etylen xem như là chất làm giảm sinh trưởng trong nuôi cấy mô. Auxin hưởng đến sự phóng thích etylen. Nâng cao hàm lượng ethylen làm giảm sinh trưởng mô sẹo. Hormon Người ta nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng auxin và cytokinin trong hệ thống vi nhân giống. Sự phối hợp của 2,4-D và NAA có ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo cũng như tái sinh cây. GA3 được sử dụng trong môi trường nuôi cấy để kích thích vươn thân, đặc biệt trong trường hợp có hàm lượng Cytokinin cao dẫn đến hình thành các cụm chồi có cấu trúc đặc. 1.1.5.3. Sự hoại mẫu [6] Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro: + Bị virus hay thể giống như virus xâm chiếm, không hoại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau. Để làm giảm tác nhân gây nhiễm sử dụng mẫu nuôi cấy là nhu mô phân sinh đỉnh. + Bị vi sinh vật hủy hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường. Sử dụng thuốc kháng sinh nhằm hạn chế sự hoại mẫu của vi sinh vật như amphotoricin B, nystelin, kanamicin, vancomicin và penicillin khử được vi khuẩn Gram (-) Gram (+) nấm mốc… Sử dụng từng đơn chất hay phối hợp. Nồng độ khử trùng 5-100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy và loại kháng sinh sử dụng. Mô thực vật rất nhạy cảm với tác động của kháng sinh và có những phản ứng khác nhau lên kiểu di truyền do đó nên cẩn thận khi sử dụng. 1.1.5.4. Sự tạp nhiễm [12] Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng như ve bét, môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy. 1.1.5.5. Tính bất định về mặt di truyền [12] Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp 1985; Fish và Karp 1986). Nuôi Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 17 cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng , số lượng và năng suất và biến dị này không di truyền. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều thì càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi việc nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền càng ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn sẽ làm giảm sự biến dị. 1.1.5.6. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy [12] Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine. Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: - Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác. - Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau. - Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol. - Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non. - Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng. - Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần. 1.1.5.7. Hiện tượng thủy tinh thể Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy. Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây.[12] Đặc điểm cây thủy tinh thể: Nhận thấy là có sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở cây nuôi cấy mô và cây ngoài tự nhiên. Lượng sáp chứa trong cây ngoài vườn ươm cao hơn hẳn cây in vitro. Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó, gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vô tính và đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy. [6] Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể [6]: - Giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi. - Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy. ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng. - Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy cây bị thủy tinh thể. - Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt. - Tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ MÍA 1.2.1. Nguồn gốc Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 18 Mía là tên gọi chung của một số loài trong chi Mía (Saccharum), bên cạnh các loài lau, lách. Chúng là các loại cỏ sống lâu năm, thuộc tông Andropogoneae của họ Hòa thảo (Poaceae), bản địa khu vực nhiệt đới và ôn đới ấm của Cựu thế giới. Chúng có thân to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2-6 m. Tất cả các dạng mía đường được trồng ngày nay đều là các dạng lai ghép nội chi phức tạp. Chúng được trồng để thu hoạch nhằm sản xuất đường.[8] 1.2.2. Phân loại [8] Một số loài mía được liệt kê dưới đây. • Saccharum barberi • Saccharum bengalense • Saccharum edule • Saccharum officinarum (loài này có được trồng tại Việt Nam) • Saccharum sinense 1.2.3. Đặc điểm hình thái Trên cây mía, thông thường phần ngọn sẽ nhạt hơn phần gốc (trong chiết nước mía). Đó là đặc điểm chung của thực vật: chất dinh dưỡng (ở đây là hàm lượng đường) được tập trung nhiều ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự trữ). Đồng thời, do sự bốc hơi nước của lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng phải được cung cấp nước đầy đủ để cung cấp cho lá, gây ra hàm lượng nước trong tỉ lệ đường/nước phần ngọn sẽ nhiều hơn phần gốc, làm cho ngọn cây mía nhạt hơn. [8] Thân mía Ở cây mía, thân là đối tượng thu hoạch, là nơi dự trữ đường được dùng làm nguyên liệu chính để chế biến đường ăn. Thân cây mía cao trung bình 2-3 m, một số giống có thể cao 4-5m. Thân mía được hình thành bởi nhiều dóng (đốt) hợp lại. Chiều dài mỗi dóng từ 15-20 cm, trên mỗi dóng gồm có mắt mía (mắt mầm), đai sinh trưởng, đai rễ, sẹo lá… Thân mía có màu vàng, đỏ hồng hoặc đỏ tím. Tuỳ theo từng giống mà dóng mía có nhiều hình dạng khác nhau như: Hình trụ, hình trống, hình ống chỉ… Thân đơn độc, không có cành nhánh, trừ một số trường hợp bị sâu bệnh. Rễ mía: Cây mía có 2 loại rễ là rễ sơ sinh và rễ thứ sinh. + Rễ sơ sinh mọc ra từ đai rễ của hom trồng, có nhiệm vụ hút nước trong đất để giúp mầm mía mọc và sinh trưởng trong giai đoạn đầu (rễ tạm thời). Khi mầm mía phát triển thành cây con, thì các rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của gốc cây con, giúp cây hút nước và chất dinh dưỡng. Lúc này các rễ sơ sinh teo dần và chết, cây mía sống nhờ vào rễ thứ sinh và không nhờ vào chất dinh dưỡng dự trữ trong hôm mía nữa. + Rễ thứ sinh là rễ chính của cây mía, bám vào đất để giữ cho cây mía không bị đỗ ngã, đồng thời hút nước và chất dinh dưỡng nuôi cây trong suốt chu kỳ sinh trưởng (rễ vĩnh cữu). Rễ mía thuộc loại rễ chùm, ăn nông, tập trung ở tầng đất mặt 30-40cm, rộng 40-60 cm. Lá mía Cây mía có bộ lá phát triển mạnh, chỉ số diện tích lá lớn và hiệu suất quang hợp cao, giúp cây tổng hợp một lượng đường rất lớnLá mía thuộc loại lá đơn gồm phiến lá và bẹ lá. Phiến lá dài trung bình từ 1,0-1,5m có một gân chính tương đối lớn. Phiến lá có màu xanh thẩm, mặt trên có nhiều lông nhỏ và cứng, hai bên mép có gai nhỏ. Bẹ lá rộng, ôm kín thân mía,có nhiều lông. Nối giữa bẹ và phiến lá là đai dày cổ lá. Ngoài ra còn có lá thìa , tai lá… Các đặc điểm của lá cũng khác nhau tuỳ vào giống mía. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 19 Hoa và hạt mía + Hoa mía (còn gọi là bông cờ): Mọc thành chùm dài từ điểm sinh trưởng trên cùng của thân khi cây mía chuyển sang giai đoạn sinh thực. Mỗi hoa có hình chiếc quạt mở, gồm cả nhị đực và nhụy cái, khả năng tự thụ rất cao.Cây mía có giống ra hoa nhiều, có giống ra hoa ít hoặc không ra hoa. Khi ra hoa cây mía bị rỗng ruột làm giảm năng suất và hàm lượng đường. Trong sản suất người ta thường không thích trồng các giống mía ra hoa và tìm cách hạn chế ra hoa. + Hạt mía: Hình thành từ bầu nhụy cái được thụ tinh trông như một chiéc váy nhỏ, hình thoi và nhẵn, dài khoảng 1-1,2mm. Trong hạt có phôi và có thể nảy mầm thành cây mía con, dùng trong công tác lai tạo tuyển chọn giống, không dùng trong sản xuất.Cây mía từ khi nảy mầm đến thu hoạch kéo dài trong khoảng 8-10 tháng tuỳ điều kiện thời tiết và giống mía. 1.2.4. Yêu cầu sinh thái Khí hậu - Nhiệt độ: Thích hợp trong phạm vi 20-250C. Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá ảnh hưởng đến sinh trưởng bình thường và giảm tốc độ quang hợp.Thời kỳ đầu, từ khi đặt hom đến mọc mầm thành cây con, nhiệt độ thích hợp từ 20-250C.Thời kỳ đẻ nhánh (cây có 6-9 lá), nhiệt độ thích hợp 20-300C.Ở thời kỳ mía làm dóng vươn cao, yêu cầu nhiệt độ cao hơn để tăng cường quang hợp, tốt nhất là 30-320C. - Ánh sáng: Rất cần cho sự quang hợp để tạo đường cho cây mía. Mía là cây nhạy cảm với ánh sáng và đòi hỏi cao về ánh sáng. Thiếu ánh sáng, mía phát triển không tốt, hàm lượng đường thấp. Khi cường độ ánh sáng tăng thì hoạt động quang hợp của bộ lá cũng tăng. Thiếu ánh sáng cây mía phát triển yếu, vóng cây, hàm lượng đường thấp và cây mía dễ bị sâu bệnh. Trong suốt chu kỳ sinh trưởng, cây mía cần khoảng 2.000 – 3.000 giờ chiếu sáng, tối thiểu cũng 1.200 giờ trở lên. Quang hợp của cây mía tỉ lệ thuận với cường độ và độ dài chiếu sáng. Thiếu ánh sáng cây hút phân kém do đó phân đạm, lân, kali chỉ hiệu quả khi ánh sáng đầy đủ. Vì vậy ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới mía vươn cao mạnh nhất khi bắt đầu vào mùa hè có độ dài ngày tăng lên. Chính vì vậy, nó là nhân tố quan trọng quyết định năng suất và sản lượng mía. - Lượng nước và ẩm độ đất: Đây là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây mía. Trong thân cây mía chứa nhiều nước (70% khối lượng). Lượng mưa thích hợp 1.500 – 2.000 mm/năm, phân bố trong khoảng thời gian từ 8-10 tháng, từ khi cây mía mọc mầm đến thu hoạch.Cây mía là loài cây trồng cạn, có bộ rễ ăn nông nên rất cần nước nhưng không chịu ngập úng. Ở vùng đồi gò đất cao cần tưới nước trong mùa khô. Nơi đất thấp cần thoát nước tốt trong mùa mưa. Thời kỳ cây mía làm dóng vương cao rất cần nhiều nước, ẩm độ thích hợp khoảng 70-80%, ở các thời kỳ khác cần ẩm độ 65-70%. Đất Cây mía thích hợp ở loại đất tơi xốp, tầng đất mặt sâu, giữ ẩm tốt và dễ thoát nước. Độ pH thích hợp 5,5-7,5. Các loại đất như sét nặng, chua, mặn, bị ngập úng hoặc thoát nước kém… đều không thích hợp cho cây mía sinh trưởng và phát triển.Thực tế cho thấy, ở nước ta, cây mía được trồng trên nhiều loại đất khác nhau như đất chua phèn ở đồng bằng Sông Cữu Long, đất đồi gò ở trung du Bắc Bộ, Nam Trung Bộ, Đông Nam bộ. Tuy nhiên ở những vùng này ruộng trồng mía cần đạt những yêu cầu cơ bản, nhất là độ sâu tầng đất mặt và thoát nước. Nếu đất nghèo dinh dưỡng hoặc chua phèn thì cần bón phân đầy đủ và có biện pháp cải tạo đất. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 20 Độ cao Độ cao có liên quan đến cường độ chiếu sáng cũng như mức chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm, do đó ảnh hưởng đến khả năng tích tụ đường trong mía, điều đó ảnh hưởng đến hoạt động của các khâu trong qui trình chế biến. Giới hạn về độ cao cho cây mía sinh trưởng và phát triển ở vùng xích đạo là 1600m, ở vùng nhiệt đới là 700-800 m...[8] 1.2.5. Yêu cầu dinh dưỡng Mía là cây trồng có khả năng tạo ra lượng sinh khối rất lớn, chỉ trong vòng chưa đầy 1 năm, 1 hecta mía có thể cho từ 70-100 tấn mía cây, chưa kể lá và rễ. Vì vậy nhu cầu dinh dưỡng của cây mía rất lớn. Ngoài các chất đa lượng NPK, cây mía rất cần canxi (Ca) và các chất vi lượng. - Đạm (N): Là yếu tố rất quan trọng giúp cây mọc khoẻ, đâm nhiều nhánh, tốc độ làm dóng và vươn cao nhanh, năng suất cao. Trung bình 1 tấn mía tơ cần 1 kg N và một tấn mía để gốc cần 1.25 kg N. Ở giai đoạn đầu cây mía rất cần N, lượng N dự trữ trong cây mía ở giai đoạn đầu có ảnh hưởng đến suốt quá trình sinh trưởng và phát triển về sau. Tuy nhiên nếu bón nhiều đạm và không cân đối với lân, kali và bón muộn cây mía sẽ bị vóng, nhiều nước, lượng đường thấp và dễ nhiễm sâu bệnh. - Lân (P): Lân giúp bộ rễ phát triển để hấp thu nước và chất dinh dưỡng, tăng khả năng chịu hạn, giữ sự cân đối giữa đạm và kali nên giúp cây phát triển khoẻ mạnh, tăng năng suất và chất lượng mía. Đối với công nghiệp chế biến đường, bón đủ lân sẽ giúp quá trình lắng trong nước mía và kết tinh đưòng được thuận lợi.Thiếu lân, bộ rễ phát triển kém, đẻ nhánh ít, thân lá nhỏ, cây cằn cỗi. Phần lớn đất trồng mía ở nước ta đều thiếu lân, nhất là vùng Đông Nam Bộ và Trung Du Phía bắc, do đó chú ý bón lân đầy đủ. Để có một tấn mía cây cần bón thêm 1,3 kg P2O5 . - Kali (K): Là nguyên tố dinh dưỡng cây cần nhiều nhất. Để tạo ra một tấn mía cây cần 2,75 K2O. Kali có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp tạo ra đường. Đủ kali, cây mía cứng cáp, không đổ ngã, ít sâu bệnh, chín sớm và tăng tỉ lệ đường. - Canxi (Ca): Canxi làm giảm độ chua trong đất, cải thiện tính chất vật lý đất, giúp sự phân giải chất hữu cơ và hoạt động của các vi sinh vật đất được tốt hơn, tạo điều kiện cho cây mía hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả hơn. Các vùng đất trồng mía của nước ta thường chua nên cần phải bón thêm vôi. - Các chất vi lượng: Bao gồm các nguyên tố như magiê (Mg), sắt (Fe), mangan (Mn), kẽm (Zn), đồng (Cu)… tuy cần ở số lượng ít nhưng rất quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển cũng như chất lượng của cây mía. Đất ở nước ta do trồng lâu đời lại không chú ý bón bổ sung chất vi lượng nên thường bị thiếu. Nhiều thí nghiệm ở một số vùng cho thấy, nếu bón bổ sung các chất vi lượng đều có tác dung tăng năng suất và chất lượng mía rõ rệt. 1.3. GIÁ TRỊ THƯƠNG MẠI VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY MÍA Mía là cây công nghiệp lấy đường quan trọng của ngành công nghiệp đường. Đường là một loại thực phẩm cần có trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều quốc gia trên thế giới, cũng như là loại nguyên liệu quan trọng của nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhẹ và hàng tiêu dùng như bánh kẹo... Về mặt kinh tế chúng ta nhận thấy trong thân mía chứa khoảng 80-90% nước dịch, trong dịch đó chứa khoảng 16-18% đường. Vào thời kì mía chin già người ta thu hoạch mía rồi đem ép lấy nước. Từ nước dịch mía được chế lọc và cô đặc thành đường. Có hai phương pháp chế biến bằng thủ công thì có các dạng đường đen, mật, đường hoa Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 21 mai. Nếu chế biến qua các nhà máy sau khi lọc và bằng phương pháp ly tâm, sẽ được các loại đường kết tinh, tinh khiết. Ngoài sản phẩm chính là đường những phụ phẩm chính của cây mía bao gồm: • Bã mía chiếm 25-30% trọng lượng mía đem ép. Trong bã mía chứa trung bình 49% là nước, 48% là xơ (trong đó chứa 45-55% cellulose) 2,5% là chất hoà tan (đường). Bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp. Trong tương lai khi mà rừng ngày càng giảm nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi từ cây rừng giảm đi thì mía là nguyên liệu quan trọng để thay thế. • Mật gỉ chiếm 3-5% trọng lượng đem ép. Thành phần mật gỉ trung bình chứa 20% nước, đường saccaro 35%, đường khử 20%, tro 15%, protein 5%, sáp 1%, bột 4% trọng lượng riêng. Từ mật gỉ cho lên men chưng cất rượu rum, sản xuất men các loại. Một tấn mật gỉ cho một tấn men khô hoặc các loại axit axetic, hoặc có thể sản xuất được 300 lít tinh dầu và 3800 l rượu. , một°Từ một tấn mía tốt người ta có thể sản xuất ra 35-50 lít cồn 96 ha với kỹ thuật sản xuất hiện đại của thế kỷ 21 có thể sản xuất 7000-8000 lít cồn để làm nhiên liệu. Vì vậy khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày càng cạn kiệt thì người ta đã nghĩ đến việc thay thế năng lượng của thế kỷ 21 là lấy từ mía. • Bùn lọc chiếm 1,5-3% trọng lượng mía đem ép. Đây là sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đường. Trong bùn lọc chứa 0,5% N, 3% Protein thô và một lượng lớn chất hữu cơ. Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa xêrin làm sơn, xi đánh giầy, vv...Sau khi lấy sáp bùn lọc dùng làm phân bón rất tốt. Theo ước tính giá trị các sản phẩm phụ phẩm còn cao hơn 2-3 lần sản phẩm chính là đường. Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt. Mía thường trồng từ tháng 10 đến tháng 2 hàng năm là lúc lượng mưa rất thấp. Đến mùa mưa, mía được 4-5 tháng tuổi, bộ lá đã giao nhau thành thảm lá xanh dày, diện tích lá gấp 4-5 lần diện tích đất làm cho mưa không thể rơi trực tiếp xuống mặt đất có tác dụng tránh xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa mía là cây rễ chùm và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0-60cm. Một ha mía tốt có thể có 13-15 tấn rễ, sau khi thu hoạch bộ rễ để lại trong đất cùng với bộ lá là chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Theo dự tính của các nhà chuyên môn thì triển vọng trồng mía ở nước ta là rất lớn vì chúng ta có những điều kiện thuận lợi để nâng cao năng suất và sản lượng mía, đáp ứng lượng đường tiêu thụ trong nước và xuất khẩu (Trịnh Minh Châu, 2003). 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu - Ngọn mía có mang đỉnh sinh trưởng. - Các mắt mầm. 2.1.2. Môi trường nuôi cấy - Môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng. 2.2. NỘI DUNG Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 22 2.3. PHƯƠNG PHÁP 2.3.1. Chuẩn bị môi trường MS + A gar + Đường + chất điều tiết sinh trưởng. 2.3.2. Giai đoạn chọn mẫu - Chọn những cây to, khoẻ có lóng dài, không sâu bệnh, chọn những cây mới mọc được từ 2 – 3 lóng trên mặt đất (đã tách rụng bẹ lá, lộ 2 đến 3 lóng). - Khi chặt mẫu cách bao lá cuối cùng 1 lóng. Sau đó chặt đến hết ngọn, cắt hết các tai lá xung quanh (chặt cách đỉnh sinh trưởng của ngọn 20cm buộc thành bó cùng chiều, dựng ngược, đứng bó mẫu). - Mẫu mía không được lấy mẫu vào các ngày trời mưa mà phải chọn những ngày nắng ráo mới lấy mẫu. - Lấy mẫu về dựng ngọn xuống dưới, gốc lên trên để nước không đọng trong bẹ lá. 2.3.3. Giai đoạn khử trùng mẫu và đưa mẫu cấy vào ống nghiệm 2.3.3.1.Tạo cụm chồi từ đỉnh sinh trưởng Giống mía Tạo cụm chồi Nhân cụm chồi Nhân mạ mía Mạ mía Nhân trên ruộng Sản xuất Đỉnh sinh trưởng và chồi mầm Phôi (tạo từ lá) Mía cấy mô Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 23 Đỉnh sinh trưởng được sử dụng làm vật liệu khởi đầu trong vi nhân giống để đạt được sự an toàn cao về mặt di truyền trong quá trình nhân giống. - Khử trùng mẫu trước khi cấy vào ống nghiệm: mẫu lấy về ta dùng cồn lau toàn bộ mẫu. Bóc bẹ quá già đi và lau sạch phấn, cắt điểm hai bên và phần dài của bẹ mía. Rửa bằng nước cất sau đó dùng cồn lau lại mẫu một lần nữa rồi đưa vào trong phòng để cấy. - Cấy vào ống nghiệm: Thao tác này thực hiện trong phòng cấy vô trùng trên tủ cấy vô trùng. - Dùng tay bóc từng lớp bẹ một, khi bóc không được cho tay qua mẫu bóc hết lớp vỏ bẹ bao bọc ngoài mắt mía. - Dùng dao cắt lấy mắt mía có dính phần thịt mía, chồi đỉnh, kích thước 1cm x 1cm cấy vào bình đựng môi trường (môi trường MS có bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng, BA hoặc kinetin) đã được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C. Nuôi bình trong phòng nuôi với nhiệt độ 26– 280C, và ánh sáng đèn neon, cường độ ánh sáng 2000 – 3500 lux. Sau 2 – 3 tuần chồi đỉnh và mắt mía mọc thì chuyển sang giai đoạn nhân chồi. 2.3.3.2. Tạo phôi và tái sinh phôi từ lá non Ngọn mía 3 đến 4 tháng tuổi được bóc bỏ lá già, phần lá non được khử trùng và cắt thành từng mảnh có kích thước 0.5x2 cm. Mẫu lá được cấy vào môi trường MS cải tiến có 2,4-D. Sau 2 tuần thì phôi soma sẽ hình thành trên mẫu cấy. Cấy cụm phôi có kích thước 15 đến 16 mm trên môi trường MS có 2,4-D với nồng độ giảm thấp so với môi trường tạo phôi ban đầu để tăng số lượng phôi. Phôi được tái sinh trên môi trường MS có bổ sung BA và IBA trong điều kiện chiếu sáng 2000 đến 3000 lux. Sau 1 tuần các điểm xanh xuất hiện, 3 đến 4 tuần sau khi cấy chồi mía phát triển cao 2 đến 3 cm và hình thành cụm chồi. 2.3.4. Giai đoạn nhân chồi Các chồi mía được tạo từ khi cấy vào ống nghiệm sau 2 – 3 lần cấy chuyển liên tiếp tạo ra được các cụm chồi. Từ các cụm chồi này tiếp tục nhân trong môi trường MS có bổ sung chất đièu tiết sinh trưởng (BA và IBA hay NAA) và nuôi trong phòng nuôi với nhiệt độ 26 – 280C, và ánh sáng đèn neon, cường độ ánh sáng 2000 – 3500 lux. Cụm chồi phát triển nhanh và mạnh, trong đó có chồi vươn lên rất cao. Cụm chồi được nhân liên tục để tăng số lượng. 2.3.5. Giai đoạn nuôi cây Các cây chồi tạo được ở giai đoạn nhân được cấy chuyển vào môi trường nuôi cho cây cứng cáp không đẻ chồi. Kết quả giai đoạn nhân chồi đã tạo ra hàng vạn chồi mía để chuyển sang giai đoạn ra rễ. 2.3.6. Giai đoạn ra rễ Những chồi mía vươn cao được tách khỏi cụm chồi và cấy sang môi trường tạo rễ, đó là môi trường MS có bổ sung BA và NAA. Sau 20 – 30 ngày cây con có bộ rễ phát triển và rễ có màu vàng nhạt thì kết thúc nuôi cây trong ống nghiệm. 2.3.7. Giai đoạn vườn ươm Vườn ươm cần phải được chuẩn bị như sau: [1] - Đất đã được xử lí sạch mầm bệnh. - Che nắng và mưa không cho ảnh hưởng trực tiếp. - Phun sương giữ cho độ ẩm luôn là 80 – 90% nhưng không để ngập úng. - Đất phải tơi xốp, giàu mùn, mật độ cấy cây con là 5 x 10cm. - Phun NPK loãng mỗi tuần. - Phòng bệnh thối nhũn do nấm Pellicularia filamentosa gây ra. Dùng đất bãi phù sa sông trộn với cát theo tỉ lệ 3 đất + 1 cát. Lên thành luống rộng 1,2m, độ dày lớp đất mặt luống 15 – 20 cm, thoát nước tốt. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 24 Các cây mía được tạo trong ống nghiệm dùng panh lấy ra rửa sạch bộ rễ, không được làm thương tổn đến bộ rễ. Cấy cây mía vào luống đã chuẩn bị, sau khi cấy phun nước đủ ẩm cho luống cây. Chế độ chăm sóc sau khi cấy: Trong 10 ngày đầu thường xuyên phun ẩm cho cây 8lần/ngày và che sáng cho luống cây bằng lưới che râm với độ che sáng 80%. Nếu về mùa mưa rào phải làm mái che mưa. Sau 15 ngày bỏ dần lưới che râm để tỉ lệ che sáng 50%, giảm dần số lần tưới nước trong một ngày và tăng lượng nước tưới trong một lần. Sau một tháng bỏ lưới che râm và mái che mưa đi. Sau khi ra ngôi 15 ngày tưới phân hỗn hợp NPK hoà tan 100g phân với 10 lít nước tưới cho 10m2. Cứ 1 tuần tưới phân một lần và tăng dần lượng phân bón. Khi cây được 1,5 tháng ngừng tưới phân, giảm tưới nước. Sau khi ra ngôi được 2 – 2,5 tháng cây Mía có chiều cao 20cm – 25cm đạt tiêu chuẩn trồng sẽ được các công ty mía đường trong tỉnh tiếp tục triển khai gia đoạn ruộng giống cấp 1, ruộng giống cấp 2 để phục vụ cho sản xuất đại trà. [9] 3. THẢO LUẬN [10], [11] 3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA AUXIN ĐẾN SỰ CẢM ỨNG MÔ SẸO Kambaska Kumar Behera và Santilata Sahoo đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giống mía Saccharum officinarum trên môi trường MS bán rắn cơ bản (Murashige và Skoog của năm 1962) có bổ sung nồng độ khác nhau và sự kết hợp của nhiều loại auxin như 2,4- D (0.5,1.0,2.0,2.5,3.0 và 4,0 mg/l), IBA (0.5,1.0,2.0,2.5,3.0 và 4,0 mg/l) và NAA (0.5,1.0,2.0,2.5,3.0 và 4,0 mg/l). Mô sẹo được quan sát trong vòng 2 tuần, sau khi thêm vào môi trường MS có chứa nồng độ khác nhau của IBA, NAA và 2,4-D (0.5,1.0,2.0,2.5,3.0 và 4,0 mg/l). Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 25 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ auxin khác nhau lên sự cảm ứng mô sẹo mía TN Loại auxin Nồng độ auxin (mg/l) Số mô được tạo sẹo Tỉ lệ tạo sẹo (%) 1 IBA 0.5 0 0 2 1 0 0 3 2 0 0 4 2.5 0 0 5 3 0 0 6 4 0 0 7 NAA 0.5 0 0 8 1 2 0 9 2 10 20 10 2.5 20 30 11 3 30 25 12 4 0 0 13 2,4-D 0.5 20 25 14 1 30 30 15 2 50 40 16 2.5 90 100 17 3 70 60 18 4 30 20 Mặc dù tất cả các nồng độ của 2,4-D đều cảm ứng mô sẹo được nhưng cảm ứng mô sẹo tốt nhất là 2,5 mg /l 2,4-D với tiềm năng tái tạo mô sẹo từ tất cả các giống. Trong môi trường nuôi cấy này tạo ra mô sẹo màu trắng kem. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của 2,4-D ở nồng độ 2.5mg/l là 100% . Ở các nồng độ thí nghiệm, NAA cũng cho khả năng cảm ứng tạo sẹo nhưng với tỉ lệ thấp (cao nhất là 30% với nồng độ 2.5mg/l) còn IBA thì không cảm ứng được. Hình 3.1. Sự tái sinh mô sẹo trong môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2.5mg/l Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 26 Hình 3.2. Sự tái sinh mô sẹo trong môi trường MS có bổ sung NAA 2.5mg/l Theo báo cáo của Khan và cs (1998) và Khatri và cs, (2002). Begum và cs, (1995), 3,5 mg/l 2,4-D cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo từ lá cao nhất ở giống mía Bangladesh Nagabari. Islam và cs (1982) cũng báo cáo rằng 0.5-5.0 mg /l 2,4-D có khả năng cảm ứng mô sẹo lá trên môi trường MS. Nồng độ NAA ở 2.0 và 3.0 mg/l sản xuất số lượng nhỏ (20-30%) mô sẹo xám và cứng. Ngày cấy chuyền thứ hai, mô sẹo đã được chuyển thành mô sẹo không có khả năng tái sinh trong môi trường có sự kết hợp NAA, giảm trọng lượng mô sẹo trong khi môi trường MS cơ bản kết hợp với IBA không cho thấy bất kỳ sự tạo sẹo nào đáng kể. Ở nồng độ thấp của 2, 4-D, các giống mía tạo ít mô sẹo và ở nồng độ 0.5 - 1.0 mg/ l 2,4-D kết hợp với môi trường MS cơ bản, mô sẹo không được cảm ứng. Như vậy, giống mía Saccharum officinarum yêu cầu nồng độ cao 2,4-D cho sự cảm ứng tạo sẹo. 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ KINETIN ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI TỪ MẪU CẤY BAN ĐẦU Theo công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhẫn: ThÝ nghiÖm gåm 5 c«ng thøc được tiến hành trên 2 giống mía F134 và QĐ15: trên môi trường MS, ta cố định nồng độ NAA và thay đổi nồng độ BA và Kinetin. - CT1(đối chứng): MS + 0,5ppm α-NAA - CT2: MS + 0,5 ppm α-NAA + 0,5 ppm BA - CT3: MS + 0,5 ppm α-NAA + 1 ppm BA - CT4: MS + 0,5 ppm α-NAA + 0,5 ppm K - CT5: MS + 0,5 ppm α-NAA + 1 ppm K Kết quả thu được như sau: Bảng 3.1. Tỉ lệ tái sinh chồi từ mẫu cấy (%) CT Chất ĐHTT (ppm) Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày Sau 15 ngày BA K F13 4 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ 15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 1 0 0 0 0 8.1 20.1 21.9 45.4 60 61.3 62.3 63.5 2 0.5 0 0 0 10. 23.5 25.5 48.3 67.8 79.3 83.7 86.7 3 1 0 0 0 15.7 30.7 30.7 65.7 80.3 86.4 90.4 92.5 4 0 0.5 0 0 9.4 22.4 26.3 45.9 64.7 73.7 84.3 85.9 5 0 1 0 0 13.5 27.3 28.4 63.5 79 88.5 89.7 90.3 Từ bảng số liệu trên ta nhận thấy: Víi auxin ë nång ®é thÊp (0,5ppm α-NAA) và thay ®æi xytokinin (BA và kinetin) tõ 0,5 ®Õn 1,0ppm th× sau 6 ngày nu«i cÊy, c¸c mÇm mÝa cña c¶ 2 gièng ®Òu b¾t ®Çu h×nh Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 27 thành trªn c¶ 5 c«ng thøc. Sau 15 ngày, tû lÖ t¸i sinh chåi ®¹t trªn 60% ë c«ng thøc ®èi chøng (kh«ng cã BA và K) và trªn 80% ë c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm (cã BA hoÆc K). Như vËy, nång ®é thÝch hîp cho kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi víi c¶ 2 gièng là 1ppm BA hoÆc 1ppm K. ë ngưìng nång ®é này, ta thấy tû lÖ mÉu t¹o chåi ®¹t 89,7 - 90,4% víi gièng F134 và 90,3 - 92,5 % víi gièng Q§15 sau 15 ngày nu«i cÊy là tương đối cao. Bảng 3.2. Kh¶ n¨ng sinh trưëng, ph¸t triÓn cña chåi ®ưîc thÓ hiÖn qua chØ tiªu chiÒu cao và sè l¸ CT Chất ĐHTT (ppm) Sau 15 ngày Sau 20 ngày Sau 25 ngày Sau 30 ngày F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 BA K h sl h sl h sl h sl h sl h sl h sl h sl 1 0 0 0.7 - 0.4 - 0.9 - 0.7 - 1.2 - 0.8 - 1.9 - 0.9 - 2 0.5 0 0.8 - 0.6 - 2 - 2.4 0.5 2.4 0.5 7 2.3 3.8 1.3 12.1 2.6 3 1 0 0.8 - 0.6 - 1.9 - 1 - 5.2 1 2.6 0.5 8 2.3 10.9 2.5 4 0 0.5 0.7 - 0.6 - 1 - 1.3 - 2.1 0.4 2.7 0.5 6 2 5.1 1 5 0 1 0.6 - 0.5 - 1.2 - 1.7 0.3 3.7 1.3 6.1 1.8 8 2.5 10.6 2.5 (Ghi chó: h là chiÒu cao trung b×nh cña chåi (cm) ; sl là sè l¸ trung b×nh/chåi) C¸c chåi mÝa sinh trưëng, ph¸t triÓn tèt h¬n trªn c¸c m«i trưêng cã xytokinin (CT2 - CT5). Trªn c¸c m«i trưêng này, sau 30 ngày nu«i cÊy, gièng F134 cã chiÒu cao c©y ®¹t tõ 3,8- 8,2cm tư¬ng øng víi sè l¸ tõ 1,3- 2,5 l¸. Gièng Q§15 còng cã chiÒu cao dao ®éng tõ 5,1-12,1cm và sè l¸ tõ 1,0- 2,6 l¸/c©y. Cïng thêi gian này, trªn m«i trưêng kh«ng cã xytokinin (đối chứng), chiÒu cao c©y chØ ®¹t 1,9cm (F134), 0,9cm (Q§15) và c¶ 2 gièng ®Òu chưa cã l¸. Như vËy, trªn m«i trưêng dinh dưìng MS cã 0,5 ppm α-NAA cã thÓ bæ sung BA hoÆc kinetin ë nång ®é 1ppm ®Ó kÝch thÝch kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi mÝa tõ mÉu cÊy ban ®Çu. Theo Kambaska Kumar Behera và Santilata Sahoo Mô sẹo bở được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất với nồng độ khác nhau như BAP, Kinetin (0.5-4.0 mg/l) và IBA, NAA (0.1-1.0 mg/l) để tái sinh nhiều chồi đơn hay cụm chồi. Cytokinin (BAP và Kinetin) và auxin (IBA, NAA) được sử dụng ở các nồng độ và sự kết hợp khác nhau cho việc tái sinh chồi. Trong suốt quá trình nghiên cứu, sự hình thành chồi đã chịu ảnh hưởng của nồng độ cao và loại của chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong thử nghiệm. Trong đó, hiệu suất tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung BAP (2,0 mg / l) + IBA (0,5 mg / l) (Bảng 3.3). Với sự kết hợp này, 92% mô tạo chồi. Số chồi có thể sử dụng được là 12,4 ± 1,90 với chiều dài trung bình của các chồi là 6,2 ± 0,37. Hiệu suất tốt thứ hai đã được tìm thấy trên môi trường MS có bổ sung BAP (2.0 mg/ ) + IBA (1.0 mg/l), trong đó trung bình số chồi có thể sử dụng là 10.5 ± 1,31 với chiều dài trung bình của chồi 4,0 ± 0.61cm (Bảng 3.3). Islam và cộng sự (1982) cũng thông báo những tác động tích cực của sự kết hợp BAP + IBA trên sự tạo chồi ở mía. Quan sát thấy rằng sự kết hợp BAP + NAA có hiệu quả cao nhưng không cao hơn so với khi kết hợp BAP + IBA. Tuy nhiên, sự kết hợp cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ thấp rất cần thiết cho sự biệt hóa của chồi bất định từ mô sẹo của đỉnh sinh trưởng mía hơn là dùng cytokinin riêng rẽ. Tất cả các nghiên cứu này kết luận rằng tiềm năng tái sinh của mô sẹo là hiện tượng đặc trưng phụ thuộc kiểu gene và đồng thời nó song song với nồng độ và sự kết hợp các chất điiều hòa tăng trưởng (Maretzki và Nickell, 1973; Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 28 Maretzki, 1987). Quan sát thấy rằng mô sẹo bắt nguồn từ các loại auxin khác nhau cho tiềm năng tái sinh khác nhau. Sự cảm ứng mô sẹo, sự tăng sinh và tiềm năng tái sinh trong cây mía diễn ra đồng bộ với nhau (Geetha và Padmanadhan, 2001). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cytokinin (BAP, kinetin) và auxin (IBA, NAA) ở các nồng độ và sự kết hợp khác nhau trong môi trường MS lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo. TN Nồng độ, mg/l % mô tạo chồi Số chồi/mô Chiều dài trung bình của chồi BAP T1 0.5 15 2.8 ± 0.90 3.5 ± 0.84 T2 1.0 30 3.1 ± 0.51 3.6 ± 0.77 T3 1.5 40 3.5 ± 0.47 3.7 ± 1.16 T4 2.0 45 4.2 ± 0.65 4.0 ± 0.47 T5 2.5 50 4.5 ± 0.94 5.2 ± 0.24 T6 3.0 30 4.1± 0.51 3.4 ± 0.75 T7 4.0 20 3.2 ± 0.47 2.5 ± 0.47 Kinetin T8 0.5 12 2.0 ± 0.47 3.1 ± 0.89 T9 1.0 42 3.0 ± 0.81 2.9 ± 0.04 T10 1.5 45 3.2 ± 0.82 3.0 ± 0.47 T11 2.0 48 2 .1 ± 0.44 3.5 ± 0.40 T12 2.5 60 4.5 ± 0.70 4.4 ± 0.28 T13 3.0 40 3.8 ± 0.56 4.0 ± 0.47 T14 4.0 17 1.2 ± 0.32 2.0 ± 0.47 BAP+IBA T15 0.5+0.1 40 3.0 ± 0.81 2.2 ± 0.47 T16 0.5+0.2 65 4.0 ± 0.94 3.1 ± 0.47 T17 0.5+0.5 25 3.2 ± 0.47 3.0 ± 0.94 T18 0.5+1.0 15 3.5 ± 0.62 2.8 ± 0.89 T19 1.0+0.1 50 4.2 ± 0.47 3.2 ± 0.47 T20 1.0+0.2 69 5.2 ± 0.37 3.5 ± 0.16 T21 1.0+0.5 40 3.2 ± 0.43 2.1 ± 0.04 T22 1.0+1.0 30 3.0 ± 0.47 2.0 ± 0.23 T23 2.0+0.1 45 3.3 ± 0.61 3.4 ± 0.29 T24 2.0+0.2 61 3.4 ± 0.65 2.9 ± 0.28 T25 2.0+0.5 92 12.4 ± 1.90 6.2 ± 0.37 T26 2.0+1.0 75 10.5 ± 1.31 4.0 ± 0.61 BAP+NAA T27 0.5+0.1 45 2.0 ± 0.47 2.0 ± 0.47 T28 0.5+0.2 50 3.2 ± 0.29 4.5 ± 0.94 T29 0.5+0.5 57 3.8 ± 0.82 4.2 ± 0.8 T30 0.5+1.0 60 4.1 ± 0.73 3.0 ± 0.84 T31 1.0+0.1 67 5.3 ± 0.53 4.3 ± 0.32 T32 1.0+0.2 36 5.0 ± 0.94 4.0 ± 0.94 T33 1.0+0.5 25 2.2 ± 0.74 2.0 ± 0.23 Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 29 T34 1.0+1.0 40 3.2 ± 0.74 2.5 ± 4.0 T35 2.0+0.1 35 3.4 ± 0.61 2.3 ± 0.16 T36 2.0+0.2 33 3.2 ± 0.47 3.0 ± 0.23 T37 2.0+0.5 90 8.2 ± 0.95 7.5 ± 1.02 T38 2.0+1.0 75 4.6 ± 0.24 5.5 ± 0.47 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ KINETIN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI MÍA TRONG ỐNG NGHIỆM Theo công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhẫn: M«i trưêng nÒn là MS có 0,5ppm α-NAA (®/c) ®ưîc bæ sung BA hoÆc K ë c¸c ngưìng nång ®é: 0,5ppm, 1ppm, 1,5ppm, và 2ppm. Khi t¨ng nång ®é BA và K ®· cho thÊy t¸c ®éng cña chóng ®Õn hÖ sè nh©n chåi sau 4 tuÇn cÊy chuyền. Khi bæ sung BA và kinetin víi nång ®é 1ppm vào m«i trưêng nu«i cÊy, hÖ sè nh©n chåi khi cÊy chuyÓn ë thêi ®iÓm 4 tuÇn là 4,4 - 4,5 lÇn víi BA và 5,3 - 5,5 lÇn víi kinetin. Khi t¨ng BA và Kinetin lªn 1,5 và 2ppm th× hÖ sè nh©n cña c¶ 2 gièng ®Òu gi¶m. Tuy nhiªn, tèc ®é gi¶m hÖ sè nh©n nhanh h¬n khi t¨ng BA. ë nång ®é 2 ppm, hÖ sè nh©n cña gièng F134 chØ cßn 3,4 (vưît ®/c 0,1) và gièng Q§15 là 3,2 (kÐm ®/c 0,1). Trong khi còng ë nång ®é 2ppm cña kinetin, hÖ sè nh©n vÉn vưît ®èi chøng 0,8 (F134) và 0,9 (Q§15). Như vËy, m«i trưêng nh©n nhanh ®ưîc chän vÉn là MS cã 0,5ppm α-NAA và 1 ppm BA (hoÆc 1 ppm kinetin). 3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG TRƯỞNG VÀ SACCHAROSE ĐẾN QUÁ TRÌNH RA RỄ CỦA CHỒI MÍA TRONG ỐNG NGHIỆM Theo Nguyễn Thị Nhẫn Theo dâi qu¸ tr×nh ra rÔ cña c©y mÝa in vitro trªn m«i trừêng cã bæ sung α-NAA víi c¸c nång ®é 0ppm (kh«ng bæ sung); 0,25ppm; 0,5ppm; 0,75ppm; 1ppm và trªn m«i trưêng cã bæ sung hàm lưîng Saccaroza víi c¸c nång ®é 3%(®/c); 4,5%; 6%; 7,5%; 9% trong m«i trưêng kh«ng cã chÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng. KÕt qu¶ cho thÊy: Gièng Q§15 cã 3 trong sè 5 c«ng thøc cã tû lÖ chåi ra rÔ 100% sau 3 tuÇn nu«i cÊy. Tuy nhiªn, chÊt lưîng bé rÔ ®ưîc ®¸nh gi¸ cao nhÊt ë c«ng thøc cã nång ®é α-NAA là 0,5ppm, víi sè rÔ trung b×nh/c©y là 8,3 rÔ, sau ®ã là nång ®é 0,75ppm (3,9 rÔ/c©y). Trªn m«i trưêng dinh dưìng kh«ng cã α-NAA tû lÖ chåi ra rÔ chØ ®¹t 83,3% và trung b×nh chØ cã 2,8 rÔ/c©y. Saccaroza là thành phÇn quan träng cña m«i trưêng nu«i cÊy. Nhưng khi sö dông ë nång ®é cao ®· cã t¸c dông xóc tiÕn nhanh qu¸ tr×nh ra rÔ cña chåi mÝa. Sau 3 tuÇn nu«i cÊy ®· cã 100% sè chåi ra rÔ ë hàm lưîng saccaroza tõ 6% ®Õn 7,5%. Tuy nhiªn, sè rÔ trung b×nh/c©y ®¹t cao h¬n ë hàm lưîng saccaroza 7,5%. Khi t¨ng nång ®é saccaroza lªn 9% kh«ng chØ làm gi¶m sè rÔ/c©y mà tû lÖ c©y ra rÔ còng ®· gi¶m chót Ýt. Gièng F134 Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 30 B¶ng 3.4. Kh¶ n¨ng ra rÔ cña gièng mÝa F134 sau 3 tuÇn nu«i cÊy Công thức Nồng độ (ppm) Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 3 tuần SR % SR % SR % Bổ sung a-NAA 1(đ/c) 0,00 1,2 29,2 1,9 38,5 2,7 42,7 2 0,25 1,8 30,5 2,6 47,3 3,2 68,4 3 0,5 2,5 33,5 4,6 62,7 5,6 90,0 4 0,75 1,3 28,7 3,5 54,6 3,8 86,5 5 1,00 1,1 26,8 2,6 45,1 3,8 63,7 Bổ sung hàm lượng saccaroza 1(đ/c) 3,0 1,2 29,2 1,9 38,5 2,7 42,7 2 4,5 0,5 30,0 1,4 35,7 3,0 55,3 3 6,0 1,5 41,1 3,2 69,3 5,3 88,7 4 7,5 1,4 39,0 4,6 76,6 6,5 89,0 5 9,0 2,0 27,6 3,7 53,6 4,2 85,3 Trªn gièng F134 còng cã kÕt qu¶ tư¬ng tù như gièng Q§15. Nång ®é α-NAA thÝch hîp nhÊt cho qu¸ tr×nh ra rÔ cña gièng mÝa này còng là 0,5ppm. Tuy nhiªn, tû lÖ c©y ra rÔ cña gièng này lu«n thÊp h¬n gièng Q§15 ë tÊt c¶ c¸c cÆp c«ng thøc tư¬ng øng. Sau 3 tuÇn, c«ng thøc cã tû lÖ c©y ra rÔ cao nhÊt còng chØ ®¹t 90%. Nång ®é saccaroza cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch nhanh sù ra rÔ vÉn là 6 -7,5%. Tuy nhiªn, sau 3 tuÇn nu«i cÊy chưa cã c«ng thøc nào ®¹t tû lÖ c©y ra rÔ 100% và nång ®é saccaroza cao (9%) chưa biÓu hiÖn râ øc chÕ sinh trưëng, ph¸t triÓn cña bé rÔ như gièng Q§15. Theo Kambaska Kumar Behera và Santilata Sahoo Môi trường tạo rễ: các thân non dài khoảng 5-6 cm cắt ra từ ống nghiệm được cho vào môi trường MS bán rắn có bổ sung nồng độ khác nhau của IBA, NAA và IAA (0,5- 3.0 mg/l) riêng lẻ hoặc kết hợp. Ra rễ in vitro và làm quen với khí hậu: Các loại auxin được sử dụng ở nồng độ khác nhau và kết hợp để tạo rễ bất định. Trong số đó NAA và IBA đáp ứng tương đối tốt hơn so với IAA cho việc tạo rễ. Sự kết hợp NAA + IBA cho thấy kết quả tích cực. Việc tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS bán rắn có bổ sung 2,5 mg/l NAA (Bảng 3.5) và số rễ/chồi cao nhất là 13,4 ± 1,5, mà chỉ mất 8 -10 ngày cho sự tái sinh mầm rễ với chiều dài rễ trung bình là 4,0 ± 0,94 cm cho giống Nayana hàng tại Orissa (Bảng 3.5). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại auxin lên sự hình thành rễ in vitro trên môi trường MS TN Nồng độ (mg/l) % chồi tạo rễ Số rễ/chồi Chiều dài trung bình của rễ Ngày xuất hiện rễ IBA T1 0.5 20 3.2 ± 0.47 1.9 ± 0.45 15-20 T2 1.0 25 3.5 ± 0.61 2.1 ± 0.41 15-20 T3 1.5 60 5.3 ± 0.32 2.3± 0.32 11-14 T4 2.0 72 8.2 ± 0.84 2.5 ± 0.23 10-12 T5 2.5 82 10.5 ± 0.70 3.4 ± 0.65 10-12 T6 3.0 46 4.6 ± 0.65 1.8 ± 0.09 10-15 Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 31 NAA T7 0.5 20 3.2 ± 0.65 0.9 ± 0.45 12-15 T8 1.0 40 3.8 ± 0.47 1.0 ± 0.29 12-15 T9 1.5 65 5.2 ± 0.74 1.5 ± 0.23 10-12 T10 2.0 79 8.3 ± 0.28 3.4 ±0.47 10-12 T11 2.5 85 11.2 ± 1.5 4.0 ± 0.94 8-10 T12 3.0 55 5.1 ± 0.47 2.0 ± 0.47 10-15 IAA T13 0.5 0 0 0 0 T14 1.0 15 2.2 ± 0.33 0.75 ± 0.04 10-18 T15 1.5 20 3.2 ± 0.65 0.8 ± 0.12 10-17 T16 2.0 25 1.5 ± 0.23 1.0 ± 0.43 10-15 T17 2.5 30 2.2 ± 0.16 2.5 ± 0.47 10-15 T18 3.0 50 5.6 ± 0.57 1.5 ± 0.23 12-15 NAA+IBA T19 0.5+0.5 0 0 0 0 T20 0.5+1.0 40 5.2 ± 0.61 2.3 ± 0.37 10-17 T21 1.0+1.0 52 5.8 ± 0.61 3.2 ± 0.89 10-15 T22 1.5+0.5 60 6.4 ± 0.71 1.4 ± 0.28 15-17 T23 0.5+1.5 48 5.3 ± 0.74 1.2 ± 0.33 10-17 T24 2.0+0.5 50 6.4 ± 0.92 1.9 ± 0.14 10-12 T25 0.5+2.0 75 10.4 ± 0.67 3.5 ± 0.47 12-14 T26 2.5+0.5 60 6.7 ± 0.96 2.5 ± 0.89 10-12 T27 0.5+2.5 82 11.3 ± 1.08 3.9 ± 0.47 10-15 T28 3.0+0.5 40 5.2 ± 1.01 3.2 ± 0.61 15-17 T29 3.0+1.0 35 4.2 ± 0.37 3.0 ± 0.80 15-17 T30 1.0+3.0 30 3.3 ± 0.47 2.8 ± 0.49 15-17 Hình 3.3. Chồi ra rễ trong môi trường MS bán rắn có bổ sung NAA (2.5 mg/l). Theo Lal và Singh (1994) rễ có thể dễ dàng tạo ra trên các chồi nuôi cấy bằng cách chuyển chúng sang môi trường có hoặc không có NAA. Baksha và cs (2002) đã sử dụng 5,0 mg/l NAA cho phản ứng tạo rễ tốt nhất trong môi trường MS bán rắn. Sabaz và cs (2008) đã sử dụng 1,0 mg / l IBA như là hormone tăng trưởng tốt nhất cho việc tạo rễ với số lượng rễ cao nhất là 41rễ/cây. Gosal và cs (1998) thu được rễ trên môi trường MS lỏng có chứa NAA (5 mg/l) và 70 g/l sucrose. Ali và Afghanistan (2001) quan sát thấy Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 32 chỉ có 6-7 rễ sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có chứa 2,0 mg/l IBA và 6% sucrose. Baksha và cs (2002) cũng thu được sự tạo rễ ở 0,1-0,5 mg/l IBA cùng với 0,5- 2,0 mg/l BAP nhưng đó chỉ là chất lượng kém. Những phát hiện này cũng khớp với những phát hiện trước đó của Nadar và Heinz (1977). Alam và cs (2003) báo cáo rằng phản ứng tạo rễ tốt nhất là ở 2,5 mg/l IBA với 16 rễ/chồi với chiều dài rễ 1,1 cm. Mamun và cs (2004) thu được kết quả tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung auxin (NAA + IBA) 0,5 mg/l đối với từng chất. Chúng ta cũng thấy rằng 0,5 mg/l NAA và 2,5 mg/l IBA cho phản ứng tạo rễ tốt thứ hai với số rễ 11,3 ± 1,08/chồi và chiều dài rễ 3,7 ± 0,47 cm. Các cây con với chồi và rễ phát triển tốt sau khi cho thích ứng với điều kiện khí hậu sẽ được chuyển ra đất (Bảng 3.3, hình 3.4). Hình 3.4. Tăng tính chịu đựng của cây trên khay nhựa 3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA GIÁ THỂ LÊN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA CÂY MÍA IN VITRO KHI ĐƯA RA VƯỜN ƯƠM C¸c lo¹i gi¸ thÓ ®ưîc sö dông gåm: 1. C¸t 2. C¸t + than trÊu (1:1) 3. §Êt (®Êt t¬i xèp, nghiÒn nhá và tưíi Èm) 4. §Êt + than trÊu (1:1) 5. §Êt ưít (®Êt t¬i xèp, tưíi nhiÒu nưíc, ®¶o nhuyÔn gÇn gièng như ®Êt gieo m¹). Bảng 3.4. Tỉ lệ sống của cây mía ngoài vườn ươm (%) Công thức Giá thể Số cây trồng Sau 5 ngày Sau 10 ngày Sau 15 ngày F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 1 Cát (đ/c) 80 97,5 97,5 95,7 95,0 91,2 90,0 2 Cát + than trấu (1:1) 80 96,2 95,0 92,5 95,0 92,5 90,0 3 Đất 80 91,2 90,0 87,0 85,0 86,2 77,5 4 Đất + than trấu (1:1) 80 93,7 97,5 90,0 95,0 85,5 92,5 5 Đất ướt 80 100 100 100 97,5 97,5 95,0 Tû lÖ sèng cña c¶ 2 gièng thÝ nghiÖm ®Òu ®¹t cao nhÊt trªn nÒn ®Êt ưít (95 – 97,5% sau 15 ngày). Tuy nhiªn, ngoài gi¸ thÓ b»ng ®Êt, c¸c gi¸ thÓ cßn l¹i ®Òu cã thÓ sö dông ®Ó trång c©y mÝa in vitro khi chuyÓn tõ èng nghiÖm ra vưên ư¬m víi tû lÖ sèng ®¹t Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 33 trªn 90%. Riªng gièng F134 cã biÓu hiÖn sai kh¸c kh«ng râ trªn nÒn ®Êt (CT3) và ®Êt + than trÊu (CT4). Ngoài tû lÖ sèng cao, ®éng th¸i t¨ng trưëng chiÒu cao c©y cña c¶ 2 gièng ®Òu vưît tréi trªn nÒn ®Êt ưít. Như vËy, ®Êt ưít là lo¹i gi¸ thÓ rÊt thuËn lîi cho kh¶ n¨ng håi phôc nhanh cña c©y mÝa khi chuyÓn tõ ®iÒu kiÖn b¸n tù dưìng sang tù dưìng hoàn toàn cña c©y mÝa khi chuyÓn tõ èng nghiÖm ra vưên ư¬m. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB ĐHQGTPHCM, tr 9 – 19, 130 – 208. [2]. Ths. Nguyễn Xuân Dũng , Đôi điều về công nghệ sinh học, Chi cục Bảo vệ thực vật Bình Dương. [3]. Nguyễn Thị Luyện, Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna Radiata(L.) Wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen. [4]. PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh, Bài giảng Nuôi cấy mô tế bào thực vật (power point), Chương 1-2. [5]. GS. Trần Văn Minh, Công nghệ nuôi cấy mô, NXB Khoa học và Kỹ thuật [6]. Thực hành nuôi cấy mô. [7]. [8]. [9]. Hồ Thị Quyên - Trung tâm nuôi cấy mô thực vật Thanh Hoá 64 [10]. Nguyễn Thị Nhẫn, Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống cây mía Saccharum officinarum L. [11]. Kambaska Kumar Behera và Santilata Sahoo, Rapid In vitro Micro propagation of Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv-Nayana) Through Callus Culture, Nature and Science, 2009;7(4), ISSN 1545-0740, naturesciencej@gmail.com [12]. Nuôi cấy mô _vn [13]. Trần Thị Thùy Dung, Khảo sát ảnh hưởng của môi trường SH, B5 và ½ MS đấn sự tạo chồi của cây hoa chuông (Sinningia speciosa ) in vitro, Khóa luận tốt nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.