Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm - Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus  PAGE \* MERGEFORMAT 1 VIỆN SINH HỌC-THỰC PHẨM  TIỂU LUẬN Moân: Ñeà taøi: TPHCM, tháng 5 /2011 MỤC LỤC I. LỜI MỞ ĐẦU 2 II. NỘI DUNG Chương 1: Staphylococcus aureus và những tính chất đặc trưng 1.1. Giới thiệu 3 1.2. Hình dạng và đặc tính 4 Chương 2: Bệnh và triệu chứng lâm sàng 2.1. Độc tố ruột (enteroxin) 7 2.2. Các độc tố khác của Staphylococcus aureus 8 2.3. Cơ chế gây độc của SEB 10 2.4. Bệnh và triệu chứng 10 Chương 3: Phương pháp phân lập và xác định 3.1. Môi trường chọn lọc Baird – Parker (B-P agar) 12 3.2. Phương pháp ELISA 13 Chương 4: Liên hệ với thực phẩm 4.1. Staphylococcus aureus trong thực phẩm 16 4.2. Quy trình xác định Staphylococcus aureus trong thực phẩm 17 III. KẾT LUẬN 19 Tài liệu tham khảo 20 I. LỜI MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm đang là chủ đề nóng của xã hội. Ngộ độc thực phẩm có rất nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản chất thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,… Nhưng quan trọng hơn hết vẫn là từ vi sinh vật, trong đó có Staphylococus aureus-một trong những nguyên nhân chính. Điều đáng lưu ý và quan tâm ở đây là chủng này có khả năng tiết ra một số độc tố bền với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Hơn nữa, chúng lại có khả năng kháng kháng sinh, khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây nên nhưng căn bệnh nguy hiểm. Vì thế mà nhóm em thực hiện đề tài: “Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm-Staphylococcus aureus” nhằm mục đích tìm hiểu nguồn gốc phát sinh, những tác hại mà Staphylococus aureus gây ra cũng như các biện pháp phòng ngừa và chữa trị... Đặc biệt là tìm hiểu các phương pháp phân tích để nhận biết và phát hiện chúng, đây đồng thời có thể xem là một biện pháp hữu hiệu để kiểm tra độ an toàn của thực phẩm. Bài tiểu luận còn nhiều thiếu sót, chúng em rất mong được cô góp ý kiến để hoàn thành đề tài một cách tốt nhất. II. NỘI DUNG CHƯƠNG 1: Staphylococcus aureus và những tính chất đặc trưng Giới thiệu: Tụ cầu khuẩn (staphylococci) được mô tả lần đầu tiên bởi nhà phẫu thuật người Scotland, ông Alexander Ogston vì nguyên nhân của một số hiện tượng sinh mủ (hình thành mủ) truyền nhiễm ở người. Năm 1882, ông đặt tên cho chúng là staphylococcus (tiếng Hy Lạp: straphyle, chùm nho; coccus, hạt lúa hay trứng cá) vì hình dạng chúng xuất hiện dưới kính hiển vi. Mô tả đầu tiên của ngộ độc thực phẩm do tụ cầu khuẩn được cho là của Vaughan và Sternberg, những người đã khảo sát một dịch bệnh lớn ở Michigan tin rằng nguyên nhân là bởi pho mát bị nhiễm tụ cầu khuẩn. Sự liên kết rõ ràng của các sinh vật với ngộ độc thực phẩm phải đợi cho đến khi Barber (1914) chứng minh rằng tụ cầu khuẩn có thể gây ra ngộ độc bởi sữa tiêu thụ từ một con bò bị viêm vú do tụ cầu khuẩn. Năm 1930, Dack đã chỉ ra rằng ngộ độc thức ăn nhiễm tụ cầu khuẩn được gây ra bởi một enterotoxin (độc tố ruột) có khả năng lọc. Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi Hiện nay có 27 loài và 7 phân loài của thế hệ Staphylococcus; sự sản xuất enterotoxin chủ yếu được đi liền với loài Staph. aureus, mặc dù nó cũng được sản xuất bởi các loài khác bao gồm Staph. intermedius và Straph. hyicus. Như một loại bệnh tương đối nhẹ, thời gian ngắn, ngộ độc thực phẩm nhiễm tụ cầu có lẽ nhiều khả năng không được báo cáo như các loại bệnh khác. Đa số những trường hợp báo cáo liên quan đến những sự bộc phát và một vài trường hợp rải rác được phát hiện. Ở Mỹ giữa năm 1983 và 1987, tụ cầu khuẩn chiếm 7.8% (47) của 600 vụ bộc phát ngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn mà đã được ghi lại. Con số tương đương cho Anh và xứ Wales trên cùng thời kỳ là 1.9% (54) trong tổng số 2815 vụ. Những cơn ngộ độc thực phẩm nhiễm tụ cầu khuẩn ở Anh lên tới đỉnh điểm trong những năm 50 của thế kỷ hai mươi ở mức 150 vụ mỗi năm nhưng từ đó suy giảm xuống còn 5-10 vụ mỗi năm ở trong thời kỳ 1990-1996 và trong giai đoạn 2000-2005 là 1 vụ trên một năm. Hình dạng và đặc tính: Staphylococcus aureus là một khuẩn cầu Gram dương (+) mà có dạng hình cầu những tế bào dạng trứng có đường kính khoảng 1µm. Sự phân chia tế bào ở một mặt phẳng để tạo thành những khối tế bào không đồng đều giống như chùm nho (hình 7.10) Hình 7.10. Staphylococcus aureus bám trên thép không rỉ (ảnh M.Lo) Staphylococci là những catalase - dương tính, oxidase - âm tính, vi sinh vật kị khí tùy ý. Khả năng lên men glucozo của chúng có thể được sử dụng để phân biệt chúng với Micrococcus giống hô hấp hoàn toàn, mặc dù có những loài ở cả 2 dạng trên mà sự phân biệt này không rõ vì sự sản xuất acid thấp bởi một vài Staphylococci và sản xuất số lượng nhỏ acid dưới điều kiện không có không khí bởi một số micrococci. Việc sản xuất Enterotoxin bị ảnh hưởng một cách bất lợi bởi những điều kiện không có không khí nhiều hơn sự tăng trưởng. Bảng 7.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sản xuất enterotoxin bởi Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là một mesophile điển hình với nhiệt độ tăng trưởng khoảng giữa 7 và 480C và nhiệt độ tối ưu tại 370C với những điều kiện tối ưu khác. Phạm vi nhiệt độ trên đó enterotoxin được sản xuất ra nhỏ hơn một vài độ và có một tối ưu ở 35-400C (Bảng 7.8). Sinh vật có khả năng chịu nhiệt độ không có ngoại lệ với D62 của 20-65s và D72 của 4.1s khi được đo trong sữa sự nuôi vi khuẩn bằng que cấy. Sự chịu đựng nhiệt độ được thể hiện đa dạng đáng kể và những giá trị D được tìm thấy để tăng gấp 3 lần khi sự nuôi cấy đã được thử nghiệm. Sự tăng trưởng xảy ra tối ưu ở giá trị pH từ 6-7 với tối thiểu và giới hạn tối đa lần lượt là 4 và 9.8 – 10. Khoảng pH trên enterotoxin sản xuất ra là hẹp hơn với sự sản xuất độc tố dưới pH = 6.0 nhưng mà cùng với sự phát triển những giá trị chính xác sẽ thay đổi với trạng thái chính xác trung bình. Một đặc trưng của Staph. Aureus mà là một đặc biệt quan trọng xem xét trong một số loại thực phẩm đó là sự chịu đựng muối và aw được biến đổi. Nó tăng trưởng dễ dàng trong các môi trường có 5–7% NaCl và một vài chủng có khả năng tăng trưởng ở môi trường lên đến 20% NaCl. Nó sẽ phát triển xuống để aw của 0.83 nơi mà nó có thời gian vòng đời 300 phút. Một lần nữa phạm vi mà sự sản xuất enterotoxin xảy ra được giới hạn hơn một mức tối thiểu là aw 0.86. Môi trường chủ yếu của Staphylococcus là da, những tuyến da,các màng nhầy của động vật máu nóng. Một vài loài thì được liên kết với vật chủ cụ thể: Staph. Hyicus với heo và Staph. gallinarum với gà. Staph. Aureus là phổ biến hơn nhưng xảy ra thường xuyên hơn ở động vật linh trưởng bậc cao. Ở con người thì nó đặc biệt liên quan đến đường mũi nơi mà nó được tìm thấy với 20-50% của cá thể khỏe manh. Nó có thể được phân lập tử phân và một cách rời rạc từ phạm vi rộng của những nơi khác như đất,nước biển và nước ngọt, bề mặt của cây,bụi và không khí. Mặc dù là một động vật kí sinh vô hại trên bề mặt cơ thể con người nơi mà nó đóng một vai trò hữu ích cho quá trình chuyển hóa những sản phẩm trên da và có thể ngăn chặn những mầm bệnh trên da. Staph. Aureus có thể gây nên những vết rỗ nhỏ trên da như là vết loét do nhiễm trùng và nghiêm trọng hơn là một mầm bệnh cơ hội khi hàng rào da bị chọc thủng hoặc sức chịu đựng của vật chủ thấp. CHƯƠNG 2: Bệnh và triệu chứng lâm sàng Độc tố ruột (enteroxin): - Được sản xuất phần lớn bởi các chủng Staph.aureus. Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt, không bị phá hủy khi đun nấu, có trọng lượng phân tử 28000-30000 Da gồm 6 loại được kí hiệu A, B, C, D, E, F. Năm 2008 tìm ra được hai loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm độc tố ruột do Staph.aureus sinh ra. - Cấu trúc phân tử của Staphylococcal enterotoxin B (SEB): SEB là một trong các ngoại độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn Staph.aureus. Thông thường không bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin. + SEB được hình thành khi Staph.aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như: nhiệt độ môi trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu. + Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn Staph.aureus nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự a.a của SEB được xác định từ năm 1970. - Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của Staph.aureus thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tính hiệu gồm 27 a.a ở đầu N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 a.a rong một chuỗi polypeptide đơn có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu gồm: 7 cấu trúc xoắn anpha và 14 phiến gấp nếp beta và một cầu nối disuifide nối cystein ở vị trí 120 và 140. SEB có khả năng chống lại sự tác động của protease trysin và chymotrysin và papain có trong ruột. - Năm 1986, Christopher và cộng sự đã xác định thành công trình tự SEB của chủng Staph.aureus S6. Trình tự của một gen hoàn thiện được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm 798 nucleotide và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide 1042. Các độc tố khác của Staphylococcus aureus: - Hemolysis: gồm 4 loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản chất protein gây tan máu beta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau. Có khả năng sinh kháng, gây hoại tử da tại chổ và giết chết súc vật thí nghiệm. + Alpha-hemolysis: làm hư hỏng màng tế bào mạnh nhất, có khả năng ức chế thẩm thấu của màng, liên kết với các tế bào nhạy cảm như tiểu cầu, bạch cầu có khả năng phân hủy hồng cầu tổn thương hồng cầu. Alpha-hemolysin tiết ra sẽ gắn vào màng của tế bào nhạy cảm, sự gắn kết đó tạo thành một màng đầy nước tạo điều kiện thấm nước không kiểm soát được các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ. Khi các phân tử quan trọng đi qua như ATP, ion thì không thể đảo ngược thẩm thấu dẫn đến phá vỡ thành tế bào gây ra cái chết cho tế bào chủ. + Beta-hemolysis: là một trong những exotoxins được sản xuất bởi hầu hết các chủng Staph.aureus, là protein có khả năng gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ độc cho nhiều tế bào kể cả hồng cầu người. + Delta-hemolysis: là một peptide rất nhỏ sản xuất bởi hầu hết các chủng Staph.aureus, là một protein hoạt động bề mặt và có thể dễ dàng chèn thêm chính nó vào cấu trúc màng kỵ nước và các kênh ion. + Gamma-hemolysis: nhạy cảm với các loại hồng cầu của thỏ, cừu, người, chuột, bò, ngựa. Gây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gây chết thỏ. - Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc TSST ( toxic shack syndrome toxin): thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông băng dày, bẩn hoặc những người nhiễm trùng vết thương. Khó phân biệt độc tố này với enterotoxin F. TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor neerosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I,II. Cơ chế gây sốc của nó giống như độc tố ruột. - Độc tố exfoliatin hay epidermolitic: Là các men phá hủy thượng bì. Men này gây tổn thương da tạo các bọng nước, Gây hội chứng phồng rộp và chốc lở da ở trẻ em. 85% các polypeptide, loại A bền với nhiệt độ 1000C/20 phút, còn loại B thì không. Kháng thể đặc hiệu có tác dụng trung hòa độc tố này. - Alpha toxin: bản chất là protein gây tan các bạch cầu đa nhân và tiểu cầu, từ đó gây ra ổ áp xe, hoại tử da và tan máu. Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không có tác dụng chống nhiễm khuẩn. - Độc tố bạch cầu (Leucocidin): là nhân tố giết chết bạch cầu của nhiều loại động vật, bản chất là protein, không chịu nhiệt. Tụ cầu gây bệnh có thể bị thực bào như tụ cầu không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên trong bạch cầu. Gồm hai mảnh F và S có thể tách rời nhau, trọng lượng phân tử là 32000, 38000 Dalton. Nếu hai mảnh này tách rời nhau thì chúng sẽ mất khả năng gây độc. Chúng gây ra nhiễm trùng da và hoại tử. - Ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic): độc tố này tương tự như độc tố sinh mủ của liên cầu. Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm với nội độc tố như gây shock, hoại tử gan và cơ tim. Gồm 3 loại ký hiệu A, B, C. Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử và về tính đặc hiệu kháng nguyên, giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào. - Dung huyết tố (hemolycin staphylolycin): phá hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào. - Fribrinolysin (enzyme Staphylokinase): Nhiều chủng của Staph.aureus thể hiện một hoạt hóa plasminogen gọi là staphylokinase. Nó làm phá hủy fibrin. Là một enzyme đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này tạo nên tắc mạch. Cơ chế này giống với Steptokinase, được sử dụng trong y học để điều trị bệnh nhân bị huyết khối động mạch vành. - Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ, chống đông với citrate natri và oxalate natri. Coagulase làm dính tơ huyết vào bề mặt vi khuẩn và do đó cản trở sự thực bào. Men này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm và một enzyme vách vi khuẩn giúp S. aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó. - Hyaluronidase: men này có khả phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức. Thủy phân axit hyaluronic của mô liên kết. - Beta- lactamase: men này phá hủy vòng beta lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. Cơ chế gây độc của SEB: - SEB là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích sao đó kích thích gia tăng số lượng lớn các lympho T. SEB được xem là một siêu kháng nguyên của vi khuẩn vì có thể tạo thành một cầu nối giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và vùng Vbeta của các thụ thể tế bào T như: CD4, CD7. Từ đó kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vbeta mà không cần thiết phải có một quá trình chế biến và trình diện thông thường. - Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine và interleukin (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u beta (TNF-beta) và các interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như: chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy… Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt. - SEB dễ hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định, chịu được các tác động cơ học vừa phải, chịu được nhiệt độ sôi. Bệnh và triệu chứng: Ngộ độc thực phẩm bởi Staph. aureus được đặc trưng bằng thời kỳ ủ bệnh ngắn, điển hình là từ 2-4h. Buồn nôn, ói mửa, co thắt bao tử và kiệt sức là những triệu chứng chủ yếu, và hồi phục hoàn toàn bình thường trong vòng 1-2 ngày. Trong trường hợp mất nước nghiêm trọng, xanh xao rõ rệt có lẽ cần phải điều trị bằng cách truyền dịch vào tĩnh mạch. Thời kỳ ủ bệnh ngắn là đặc trưng của một sự nhiễm độc nơi mà bệnh tật là kết quả của việc ăn vào một độc tố được hình thành trước trong thực phẩm. Staph. aureus sản xuất ít nhất 11 enterotoxin được định rõ từ SEA tới SEJ. Để thêm vào một chút rắc rối và gây nhầm lẫn cho người thiếu thận trọng, không có SEF và có ba biến thể của SEC. Loại độc tố A và D, dù đơn độc hay trong kết hợp, đều thường xuyên có liên quan nhất trong những vụ ngộ độc thực phẩm. Ở Anh , loại A chịu trách nhiệm cho 52% vụ, loại D chiếm 6%, loại A và D kết hợp chiếm 19%, và loại C và D chiếm 9%. Tính nhạy cảm khác nhau giữa những cá thể đã được đánh giá rằng, trong những vụ ngộ độc đòi hỏi ít hơn 1mg độc tố thuần để gợi ra những triệu chứng. Những độc tố thì nhỏ (Mr 26–30 kDa) mỗi mắc xích polypeptide chia sẻ đáng kể amino acid đồng đẳng. Ngoại trừ SEI, mỗi cái chứa một liên kết đơn disulfide gần phân tử trung tâm. Vì cấu trúc chắc chắn của nó, có có thể kháng cự lại những protease trong ruột và chịu nhiệt, bị bất hoạt chỉ bởi đun sôi kéo dài. Mặc dù được mô tả như là những enterotoxin nhưng những độc tố Staph. aureus chính xác là neurotoxin. Nó gây ra phản ứng buồn nôn bằng cách tác động trên cơ quan thụ cảm trong ruột, kích thích trung tâm nôn ọe trong não thông qua dây thần kinh và dây thần kinh giao cảm. nếu những dây thần kinh này bị cắt đứt vậy sự nôn ọe không xảy ra. Không biết làm thế nào độc tố gây ra tiêu chảy nhưng nó được chứng tỏ rằng không phải là tác động của adenylate cyclase. Những enterotoxin Staph. aureus hiện nay cũng được biết là những siêu kháng nguyên, các phân tử có khả năng kích thích một tỉ lệ cao hơn nhiều của những tế bào T so với những kháng nguyên thông thường. Cái này có lẽ đóng một vai trò gì đó trong bệnh đường tiêu hóa, mà không được biết đến. CHƯƠNG 3: Phương pháp phân lập và xác định Môi trường chọn lọc Baird – Parker (B-P agar): Môi trường chọn lọc bao bọc Staph. aureus hiệu quả và phổ biến nhất được Baird-Parker đề xuất những năm đầu thập niên 60. Phương pháp này là sự kết hợp giữa môi trường có mức độ chọn lọc cao, phản ứng nhận biết đặc trưng và khả năng phục hồi các tế bào bị tổn thương. Liti clorua và khoáng chất là các yếu tố chọn lọc, còn lòng đỏ trứng gà và piruvate hỗ trợ sự phục hồi các tế bào bị tổn thương. Ta có thể nhận biết tụ cầu khuẩn qua đặc điểm khuẩn lạc đen huyền, sáng bóng, môi trường bao quanh sạch sẽ do phản ứng thủy phân protein lipovitellenin trong lòng đỏ trứng gà. Khuẩn lạc cũng thường có đường viền trắng bên trong do sự kết tụ của các acid béo. Khuẩn lạc xuất hiện trong môi trường Baird-Paker (B-P) agar chứng tỏ sự có mặt của tụ khuẩn cầu, vi sinh vật thường được sử dụng trong các thử nghiệm sản xuất coagulase và nuclease chịu nhiệt. Coagulase là một chất ngoại bào làm đông tụ huyết tương của người và động vật trong môi trường không có canxi. Enzim này không đặc trưng cho Staph. aureus vì Staph. intermedius và Staph. hyicus cũng tạo được enxim này. Staph. intermeius không sử dụng khoáng chất nên chỉ hình thành khuẩn lạc trắng trên B-P agar, còn Staph. hyicus, vi khuẩn được tìm thấy trên da lợn và gia cầm, cần nhiều thử nghiệm sinh hóa hơn để phân biệt một cách chắn chắn hơn với Staph. aureus. Sự có mặt của coagulase có thể kiểm tra bằng phương pháp sử dụng huyết tương thỏ được xử lý EDTA trong ống nghiệm coagulase. Hiện nay có rất nhiều các bộ dụng cụ (kit) thử nghiệm nhanh chóng, dựa trên sự phát hiện mối liên hệ giữa coagulase (còn gọi là yếu tố vón cục) với protein A, chất phản ứng với Fc, một phần của phân tử IgG. Phát kiến được tìm thấy bởi sự đông tụ của hồng cầu, hạt nhựa bọc fibrinogen và huyết tương khi tiếp xúc với khuẩn lạc từ môi trường nuôi cấy chọn lọc. Điều này có thể kiểm chứng trực tiếp, không cần thông qua các thế hệ vi khuẩn trung gian. Sự hình thành coagulase có thể được nhận biết thông qua sự thay đổi lòng trắng trứng trong môi trường agar có chứa huyết tương lợn và thỏ. Nuclease chịu nhiệt có thể phát hiện bẳng agar toluidine xanh/DNA, bằng khuẩn lạc bị nấu sôi ở bề mặt nuôi cấy hoặc bằng lớp phủ khuẩn lạc được xử lý nhiệt trên B-P agar. Đã có 4 chủng (biotype) Staph. aureus được phát hiện nhưng ứng dụng của chúng vẫn còn hạn chế vì hầu hết các giống mà con người tìm được đều thuộc chủng A. Staph. aureus được sử dụng cùng với phage; hầu hết các giống gây độc thực phẩm thuộc về nhóm huyết thanh III. Quá trình xử lý nhiệt có thể tiêu diệt nhiều vi sinh vật nhưng độc tố ruột vẫn còn. Do vậy việc nhận biết thực phẩm bị nhiễm độc mang tính cảnh báo về mối nguy hiểm hơn là phục vụ cho công việc đếm các tế bào vi khuẩn sống sót. Đến nay đã có một số kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch đối với độc tố của tụ cầu khuẩn. Các phương pháp ức chế đông tụ trước đây như thử nghiệm khuếch tán microslide gel có độ nhạy kém, tốn nhiều thời gian và cần thao tác cẩn thận để nhận biết được độc tố. Hiện nay, kỹ thuật ELISA ngày càng được dùng phổ biến, phương pháp này có thể phát hiện độc tố ở mức 0,1-1,0 ng/g thực phẩm và có thể đảo ngược sự kết tụ cao su thụ động với độ nhạy 0,5 ng/ml. Phương pháp ELISA: Phương pháp ELISA: (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay ) là 1 kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể (KT) hay kháng nguyên (KN) trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay, ELISA được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt là trong kiểm tra an toàn trong các sản phẩm sinh học. Có 2 loại phương pháp ELISA: + Phương pháp ELISA trực tiếp (direct ELISA): dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. + Phương pháp ELISA gián tiếp (indirect ELISA): dùng dể phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết thanh. Ưu điểm: Phương pháp này được sử dung cho các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ KN-KT, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm. + Nhanh, thao tác đơn giản. + Ít tốn sinh phẩm, hóa chất, số lượng mẫu lớn, rất thích hợp với việc phân tích đối với nguyên liệu thô. Nhược điểm: Độ chính xác không cao. Nguỵên tắc kỹ thuật ELISA: Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng và sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp như: horeseradich perosidase hay alkaline phosphatase). Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu, KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép (sandwich). Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Khi bổ sung các cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện của KN. Cần tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện phản ứng. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml. Vật liệu và phương pháp: Chuẩn bị các KN: S. aureus được nuôi cấy trên môi trường Staph.110 ủ ở 370C trong 24h. Thu chủng vi khuẩn với nước muối đệm phosphate (pH 6.8) có chứa formalin 0.3% và đun nóng ở 1000C trong 1h. Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch huyền phù nói trên ở dưới da với lượng 0.5;1;1.5 và 2ml khoảng 4 ngày. Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml Staph.aureus được nuôi cấy trong môi trường canh thịt vào thỏ. Sau đó 14 ngày tiêm môi trường giống như trên, thu nhận máu và huyết thanh khi giết thỏ. Tinh chế và ước lượng Protein: kháng thể thỏ được phân lập và tinh khiết một phần thông qua phương pháp kết tủa ammonium sulfate và hàm lượng protein đã được ước tinh bằng phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường chuẩn của huyết thanh bò albumin. Sự tiếp hợp: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp hợp với một phần KT tinh khiết của thỏ, sử dụng bước hai trong phương pháp glutaradehyde. Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phủ) được đổ vào từng giếng, polystyrene, tấm microtitration gồm 96 giếng ủ ở 40C trong 24h. Sau đó, tấm được rửa năm lần với đệm rửa. Các tấm được giữ cố định bởi 100µl PSB đổ vào từng giếng và ủ ở 370C trong 24h. Sau khi ủ, tấm đã được rửa sạch bằng đệm rửa. ELISA trực tiếp: ELISA trực tiếp được thực hiện để phát hiện KT tiếp hợp enzyme. Các tiếp hợp enzyme này pha loãng trong PBS là 1:100; 1:200; 1:400 và 1: 800. 100µl PBS được thêm vào mỗi giếng. Huyết thanh thỏ được pha loãng trong PBS ở tỷ lệ 1:10. Đó là 2 lần tuần tự pha loãng từ 2 lên đến 11 giếng, như 100µl được thêm vào. Giếng 12 được sử dụng để kiểm soát. Các đĩa được ủ ở 370C trong 2h. Sau đó rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa. Tiếp tục pha loãng 100µl ở mỗi hàng, đầu tiên pha loãng A+B, thứ 2 là pha loãng C+D, thứ 3 là pha loãng E+F, thứ 4 là Pha loãng G+H trên tấm microtitration. Ủ ở 370C trong 2h. Sau khi ủ rửa lại 5 lần bằng dung dịch rữa. Sau đó thêm 100µl guaiaclo (guaicol + H2O2) và ủ ở 370C trong 20 phút. Tiếp tục thêm 50µl H2SO4 1M (thuốc dừng) vào mỗi giếng. O.D đã được ghi lại ngay lập tức trong cùng vi đĩa đọc ELISA, đọc ở bước sóng 450nm (Kemney và Challacombe, 1989). Phân tích thống kê: các dữ liệu được phân tích qua Duncan’s Multiple Range (DMR) kiểm tra hoàn toàn theo thiết kế ngẫu nhiên (CRD) (Steel và Torrie,1984). Kết quả: Các xét nghiệm huyết thanh khác nhau đã được sử dụng cho các KN phát hiện như là thử nghiệm nhanh chóng làm ngưng kết, thử nghiệm agar gel phát hiện, nhưng tốt nhất là phương pháp ELISA để phát hiện KN. Nề tảng của phương pháp ELISA là dựa trên sự thay đổi màu sắc, có lợi thế hơn các xét nghiệm khác như ngưng kết, huỳnh quang hoặc phóng xạ trong phản ứng KN-KT có thể được đo đều đặn khách quan trong sắc độ kế đơn giản. Ngoài ra, sử dụng các tấm microtitre ELISA cho phép một số lượng lớn phản ứng để được đọc trong thời gian ngắn (Dawkins et al,1990). CHƯƠNG 4: Liên hệ với thực phẩm Staphylococcus aureus trong thực phẩm: Việc tồn tại một lượng nhỏ Staph. aureus trong thực phẩm không có gì lạ. Chúng tồn tại tự nhiên trong thịt gia cầm và các loại thịt sống khác như một thành phần vi sinh thực vật bề mặt. Tương tự, tụ khuẩn cầu có thể được tìm thấy trong sữa tươi với mật độ như giai đoạn sinh sôi của bệnh viêm tuyến vú. Là một đối thủ cạnh tranh kém, chúng thường không gây ra vấn đề gì nghiêm trọng vì chúng không thể phát triển mạnh và dễ bị tiêu diệt sau qua trình nấu nướng hay tiệt trùng. Tuy nhiên vẫn có sự phát triển bùng nổ trong các sản phẩm từ sữa như sữa bột, chocolate sữa, nơi mà tụ khuẩn cầu sinh sôi và tiết ra độc tố từ trong sữa tươi không qua tiệt trùng. Ví dụ điển hình là sự kiện ở Nhật Bản năm 2000, ảnh hưởng tới 13000 người. Một giai đoạn trong sản xuất sữa bột phân lập đã tạo điều kiện cho tụ khuẩn cầu nhân lên và tích lũy độc tố. Lượng bột bị nhiễm độc đó được dùng để chế biến các sản phẩm ăn thường ngày. Mặc dù bản thân của chúng không gây nguy hiểm đến sức khỏe con người nhưng sực có mặt của tụ khuẩn cầu trong thịt sống làm cho thực phẩm chế biến bị nhiễm độc chéo. Sự mất vệ sinh trong quy trình chế biến cũng là một yếu tố nhiễm độc thường gặp trong tác nhân gây độc do con người. Bệnh viêm mũi họng do vi khuẩn thường kéo theo sự xuất hiện của chúng trên da và thức ăn cũng sẽ bị nhiễm khuẩn theo từ phần da bị tổn thương, do ho và hắt hơi. Phải cần một số lượng >106 cá thể trên 1g mới đủ sản sinh lượng độc tố gây bệnh. Nhiễm bẩn là điều kiện cần thiết nhưng chưa phải tất cả cho một sự bùng nổ vi sinh vật. Đặc biệt, điều kiện nhiệt độ và thời gian phải phù hợp cho sự phát triển của chúng. Những nghiên cứu ở Mỹ và Anh đã chứng minh sản phẩm thịt gà cầm và thịt gia súc đông lạnh hoắc nấu chín là môi trường phát triển tốt của tụ khuẩn cầu. Thịt được ướp muối như đùi lợn và thịt bò càng bị nguy hiểm bởi tụ khuẩn cầu không bị muối ức chế như phần lớn thực vật vi sinh khác. Những miếng thịt phục vụ trong các bữa buffet là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của tụ khuẩn cầu bởi vì thức ăn phải được chế biến trước một thời gian và thường được lưu trữ ở nhiệt độ thường hoặc không được ướp lạnh đầy đủ. Đồ hộp cung cấp môi trường thích hợp, không có đối thủ cạnh tranh cho tụ cầu khuẩn và sự nhiễm bẩn sau khi đồ hộp bị rò rỉ là cơ hội cho sự nhân lên của tụ cầu khuẩn. Nguyên nhân của sự nhân lên của tụ cầu khuẩn còn có thể do phô mai cứng hay kẹo lạnh, custards và bánh phủ kem lạnh. Ví dụ như ở Nhật Bản đó là cơm nắm làm bằng tay và ở Hungary là kem. Quy trình xác định Staphylococcus aureus trong thực phẩm: - Đặc điểm quan trọng nhất của Staph.aureus được các nhà khoa học sử dụng để phân biệt với các Staphylococci khác là khả năng sinh tổng hợp coagulase va khả năng sử dụng Mannitol. - Một số chủng thuộc loài Staph.aureus có khả năng sinh tổng hợp độc tố ruột enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm. Tuy nhiên số lượng tế bào vi khuẩn phải đủ lớn (không thấp hơn 106 CFU/g) thì mới đủ sinh ra một lượng toxin gây ngộ độc cho người sử dụng. Do đó việc định lượng Staph.aureus trong thực phẩm là rất cần thiết để dự đoán khả năng gây ngộ độc của sản phẩm và đánh giá tổng quát mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm.  Chuẩn bị mẫu Cấy mẫu lên môi trường thạch Baird-Parker hoặc môi trường Mannitol muối và ủ Quan sát và chọn khuẩn lạc Tính toán kết quả Kiểm tra Coagulase Tính chất hóa sinh Khả năng lên men glucose và mantol Tính mẫn cảm với lysostaphin Khả năng sinh tổng hợp thermonuclease Quy trình định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm III. KẾT LUẬN Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) là vi khuẩn gram dương, không di động, không sinh nha bào, một số chủng Staph.aureus có thể tạo vỏ polysaccharide. Staph.aureus sinh trưởng tốt trong môi trường tổng hợp như thạch máu và huyết thanh, có phản ứng indol, thủy phân gelatin và làm đông huyết tương, chịu nhiệt và muối tốt. Trong môi trường thạch, khuẩn lạc có hình tròn bóng, đục mờ, có thể có màu vàng đậm, vàng cam hay trắng. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 37oC, hiếu khí hay kị khí tùy ý. Staph.aureus có khả năng sinh nhiều độc tố như: hemolysis, TSST, exfoliatin, epidermolitic, alpha toxin, leucocidin, pyrogenic, hemolycin staphylolycin, fribrinolysin, coagulase, hyaluronidase, beta-lactamase, đặc biệt là độc tố ruột (enterotoxin). Có thể xác định Staph.aureus bằng phương pháp truyền thống trên môi trường thạch Braid-Parker Agar (BPA), hay bằng các phương pháp hiện đại như ELISA, lai phân tử, bộ Kit MRSA. Staph.aureus là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và gây nên những căn bệnh nguy hiểm ở người. Điều đáng lưu ý là khi gia nhiệt ta chỉ có thể tiêu diệt được tế bào nhưng độc tố của nó lại bền với nhiêt. Vì thế thực phẩm cần đảm bảo vệ sinh từ khâu chế biến đến khâu bảo quản. Người lao động tiếp xúc với thực phẩm phải thận trọng giữ gìn vệ sinh tốt như đeo găng tay, khẩu trang… Ngoài ra một số Staph.aureus có độc lực mạnh còn có khả năng kháng kháng sinh như penicillins, methicillin, dicloxacillin, nafcillin, oxacillin, cephalosporins… người mắc bệnh có nguy cơ tử vong cao. Nguyên nhân chủ yếu là do sự lạm dụng quá nhiều kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Cho nên, thực phẩm trước khi đưa ra thị trường cần được kiểm định kỹ lưỡng và chặt chẽ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Martin R. Adams and Maurice O. Moss, University of Surrey, Guildford, UK, “Food microbiology 3rd Edison”.  HYPERLINK "" %20YTCC/@YTCC%2008%20Dan%20trang/T%E1%BA%A0O%20KH%C3%81NG HYPERLINK "" %20TH%E1%BB%82%20%C4%90A%20D%C3%92NG%20V%C3%80%20X HYPERLINK "" %C3%82Y%20D%E1%BB%B0NG%20QUI%20TR%C3%8CNH%20ELISA.htm  HYPERLINK "" www.yduocngaynay.com