Virus PRRS và Protein tái tổ hợp N ứng dụng trong chẩn đoán

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** VIRUS PRRS VÀ PROTEIN TÁI TỔ HỢP N ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Giáo viên hướng dẫn: Bộ môn : CÔNG NGHỆ SINH HỌC PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LI NA MSSV: 06126081 Thành Phố Hồ Chí Minh 31/10/2009 2 I. Đặt vấn đề Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo (Porcine Reproductive and Respiratoty Syndrom ) là bệnh do virus Nidovirales, họ Arteviridae gây ra. Được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987 cho đến nay đã xuất hiện rộng rãi ở Châu Âu và các nước Châu Ávà có nguy cơ lây lan thành dịch.Đây là bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe động vật thế giới.PRRS đặc trưng bởi rối loạn hô hấp, xẩy thai ở heo nái và gây tỉ lệ tử vong cao trên heo con, dẫn đến sự thiệt hại lớn về kinh tế toàn cầu .Trong vòng 20 năm kể từ khi xuất hiện, PRRS đã gây ra nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng lên nền chăn nuôi thế giới và an sinh xã hội. Theo báo cáo, PRRS chiếm 1/3 chi phí cho các bệnh xâm nhiễm trong nghành công nghiệp chăn nuôi heo ở Mỹ, PRRS cũng gây thiệt hại kinh tế đáng kể ở Châu Âu. Gần đây biến chủng mới của PRRS virus ở Trung Quốc đã giết 400.000 trong 2.120.000 số heo bị xâm nhiễm trong vòng 4 tháng ở 10 tỉnh phía đông TRung Quốc. Tại Việt Nam, từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2007, 44 ổ dịch đã bùng phát trong hai dịch bệnh chính, lần đầu xảy ra ở các tỉnh phía bắc trong thời gian từ tháng 3 đến tháng năm, lần thứ hai xảy ra ở các tỉnh phía nam trong khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 7. Khoảng 44000 con heo bị nhiễm, trong đó hơn 4000 con bị chết. Chính vì thế virus PPRS và bệnh do virus này gây nên đang được quan tâm nghiên cứu nhằm tìm hiểu và nắm bắt cơ chế phát sinh và gây bệnh của virus này để phát triển phương pháp phòng chống quản lý bệnh, phát triển phương pháp chẩn đoán, phát hiện cũng như chế tạo, sản xuất vaccine. Trong bài báo cáo này em xin trình bày những kiến thức, hiểu biết về virus PRRS và protein tái tổ hợp của Virus này, cùng với quy trình sản xuất một số protein tái tổ hợp để ứng dụng trong chẩn đoán cũng như chế tạo vaccine. 3 II.Tổng quan A. Tổng quan về virus PRRS 1. Lịch sử phát hiện bệnh Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 tại Mỹ nhưng một số nghiên cứu dịch tễ học cho rằng có thể bệnh đã lưu hành trước đó tại Canada. Bệnh xuất hiện ở Châu âu vào năm 1990 và hiện đã lưu hành ở nhiều nước thuộc châu lục này. Các kiểm tra huyết thanh học và virus học cho thấy PRRS cũng đã có mặt tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, các nước vùng Ca-ri-bê... Trong những ngày gần đây, bệnh đã xuất hiện tại Trung Quốc và cũng đã xuất hiện ở nhiều địa phương ở nước ta và gây thiệt hại kinh tế lớn trong nghành chăn nuôi heo trên thế giới 2. Virus PRRS 2.1. Hình thái, cấu tạo phân tử virion của PRRSV: Virus Nidovirales hay còn được gọi là virus PRRS (porcine reproductive and Respiratory Syndrome virus) thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus, đây là virus ARN sợi đơn,dương có vỏ envelope bao bọc. Phân tử virion PRRS có dạng hình cầu hoặc trứng với đường kính trung bình là 58nm, trong đó có một số ít phân tử có đường kính lớn hơn 70nm, phân tử virus có bề mặt ngoài trơn với chỉ một vài điểm lồi ra, cách biệt với vỏ bọc một khoảng 2-3nm bên trong phân tử virion là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39nm. Phân tử virion PRRS bao gồm một vỏ bọc lipid có chứa vài envelope protein, protein GP2, GP5, E và M bao quanh vòng nucleocapsid của PRRSV. Protein 4 N bao bọc RNA genome của virus. Protein vỏ chiếm nhiểu nhất là protein nhân hay là Protein N, protein màng GP5 và M, còn GP2, GP4, E và GP3 là thành phần phụ. 2.2. Cấu trúc genome của PRRSV Toàn bộ trình tự bộ gene của PRRSV đã được giải mã thành công và được ghi nhận vào năm 1993, genome của virus dài khoảng 15kb và gồm tám khung đọc mở ORF. ORF 1a và 1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba bộ gene và mã hóa cho RNA polymerase của virus được xem là protein chịu trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus. Sáu ORF nhỏ hơn là ORF 2-7, nằm ở phía sau của ORF 1b, ở đầu 3’ của genome, mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion. Sản phẩm của các ORF 5,6,7 bao gồm các protein chính của virus. Cho đến nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc chính của PRRS đó là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa quy định bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa quy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng lượng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng ORF 2,3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS virus có lẽ mã hóa cho 3 5 membrane-associated glycoprotein khác là: 29-30 kD GP2, , 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4(Van Nieuwstadt và cộng sự, 1996). 2.3. Sự đa dạng trong các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới PRRS lưu hành trên thế giới với 2 dòng khác nhau: dòng Châu Mỹ (tiêu biểu là chủng VR-2332) và dòng Châu Âu (tiêu biểu là Lelystad-LV). Những chủng virus giữa hai dòng Châu Mỹ và Châu Âu khác nhau về đặc tính gây bệnh và chúng có sự khác nhau về đặc điểm bộ gene và yếu tố kháng nguyên. Các chủng trong cùng một dòng thì có sự tương đồng về cấu trúc kháng nguyên. Tùy theo ORF mà sự tương đồng về gene của hai dòng virus PRRS Châu Âu và Châu Mỹ dao động từ 52 đến 81%. Việc giải mã trình tự nucleotide của từng ORF là cơ sở dữ liệu phân tử quan trọng cho phép xác định và sử dụng trình tự nào trong việc so sánh, chẩn đoán phân biệt các dòng PRRSV cũng như xác định sự tiến hóa của chúng. Ví dụ qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRSV người ta đã xác định được rằng ở PRRSV dòng Châu Mỹ, các ORF 6 và 7 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hóa của dòng virus này. Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS Châu Âu và Châu Mỹ ở hai khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự acid amin của ORF7 giữa hai dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORF6 là 70- 81%. Trong khi đó khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một dòng Châu Mỹ (giống nhau chỉ từ 88-97%) và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng từ 51-59%. Các epitope trung hòa chính nằm trên protein quy định bởi ORF5, tuy có sự biến động lớn trong vùng ORF5 giữa các chủng virus PRRS nhưng các epitope trung hòa thường có sự bảo tồn tốt giữa các dòng PRRS khác nhau. Các epitope trung hòa khác nằm ở trên GP3, GP4 và protein M. Sự tương đồng về trình tự acid amin quy định do các khung đọc mở ORF 2, 3, và 4 giữa các dòng Châu Âu và Châu Mỹ chỉ ở mức độ từ 63, 58, và 68%. Sự khác biệt kiểu gene đương nhiên đưa đến sự khác biệt về kiểu hình và như vậy có thể dựa vào đặc điêm gene để chẩn đoán dòng virus và ngược lại. Đây chính là cơ sở cho việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR, RFLP… để chẩn 6 đoán PRRSV và phân biệt dòng PRRSV Châu Âu và Châu Mỹ.(Nguyễn Ngọc Hải-công nghệ sinh học trong thú y, nhà xuất bản Nông Nghiệp, 2007) Gần đây tại Trung Quốc đã xuất hiện dòng mới là biến chủng của dòng Châu Mỹ, chủng này có độc lực cao hơn, nguyên nhân được đưa ra là do sự mất 30acid amin của protein Nsp2, gây bệnh không chỉ cho heo con mà còn cho cả heo trưởng thành, gây ra tỉ lệ chết cao hơn (khoảng 20%), biến chủng này khó chẩn đoán và hiện chưa có vaccine đặc hiệu, đây là thách thức mới cho các nhà quản lý dịch bệnh cũng như cho các nhà sản xuất vaccine. 3. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo PRRSV gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Trước kia PRRSV chủ yếu gây bệnh trên heo con và gây tỉ lệ tử vong khá thấp (Ở Châu Âu là khoảng 1%) nhưng gần đây biến chủng mới tại Trung Quốc gây bệnh trên cả heo con và heo trưởng thành , ngoài ra nó cũng gây tỉ lệ tử vong cao hơn trong đàn heo bị nhiễm virus (khoảng 20%). Cũng như các virus khác, virus PRRS cũng tạo điều kiện cho các vi khuẩn khác cư trú trong cơ thể như liên cầu khuẩn tăng độc lực và gây bệnh. 7 3.1. Triệu chứng lâm sàng Căn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh, người ta có thể chia thành hai loại triệu chứng: biểu hiện của các triệu chứng rối loạn sinh sản ở heo nái và biểu hiện của các triệu chứng hô hấp. Các triệu chứng sinh sản bao gồm: heo nái bị sốt 39-40°, bỏ ăn,mệt mỏi, giảm tỉ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy thai (tỷ lệ này có thể đến 50% trong các đàn mới bị nhiễm virus), giảm tiết sữa hoặc mất sữa hoàn toàn, thai gỗ, chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không động dục trở lại, rối loạn sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng. Biểu hiện các triệu chứng hô hấp bao gồm: loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở, hắt hơi, tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng. Khi bị nhiễm virus PRRS heo con có tỉ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn phù mắt,các nốt phồng rộp trên da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân. Heo lớn có biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn. Các triệu chứng khác nhẹ hơn. Heo đực giống có các biểu hiện giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và nồng độ tinh trùng). 3.2. Bệnh tích Đối với heo nái, ngoài các triệu chứng sảy thai, tăng tỉ lệ thai chết, heo mắc bệnh thường không có các bệnh tích đặc thù. Đối với heo con thường mang các bệnh tích rõ hơn heo trưởng thành và heo nái, bao gồm: dịch thẩm thấu trong đường tiêu hóa và đường hô hấp đặc biệt trong các phế quản, phù, thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc và tung các mạc, sưng hạch bạch huyết, da nhiều vùng có màu xanh tím. 3.3. Phương thức truyền lây Virus thường xâm nhiễm heo thông qua đường hô hấp và xâm nhập vào tế bào đại thực bào của phế nang phổi rồi nhân lên ở đó, chúng kích thích tạo đáp ứng interferon rất ít trước khi phát tán bên trong vật chủ. Virus PRRS thích hợp với một loại tế bào chuyên biệt với các đại thực bào đã biệt hóa như là đại thực bào túi phổi heo (PAM). Tuy nhiên, cơ chế chính xác của tế bào đích và 8 thông tin của thụ thể chuyên biệt cho virus PRRS cho đến nay vẫn chưa được hiểu tường tận. Một số thụ thể tế bào tiếp nhận PRRS đã được báo cáo, trong đó bao gồm thụ thể CD163 có nhiểu trên các đại thực bào như là PAM.. Trong suốt quá trình xâm nhiễm, PRRS tạo hội chứng bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp. Virus cũng có thể truyền qua tinh dịch và đường từ mẹ sang con và có thể gây tử vong với tỉ lệ khá cao. PRRSV có thể tồn tại trong cơ thể heo, heo bị xâm nhiễm có thể phục hồi khỏi bệnh nhưng vẫn chứa virus trong thời gian dài và lây bệnh cho các heo chưa bị nhiễm khác qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp. Tiếp xúc giữa heo ốm và heo khỏe là đường truyền lây chính của bệnh nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác (nếu heo bị bệnh được chuyển đàn, chuyển trại...). Heo mang virus có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện và khống chế bệnh. Tinh dịch lợn mang trùng cũng có khả năng nhiễm virus vì vậy bệnh có thể truyền qua đường sinh dục. Vi rút PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân và nước tiểu của lợn bị bệnh, vi rút có thể phát tán theo gió, không khí (xa trên 3km), nước, hoặc dụng cụ bảo hộ lao động, dụng cụ chăn nuôi và chim hoang truyền dẫn... Virus có mặt trong hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn hơn nhiều trong thịt và có khả năng giữa được độc lực trong điều kiện lạnh (khi giữa thức ăn). Tuy vậy, khả năng truyền bệnh do cho ăn các phụ phẩm trong quá trình giết mổ các gia súc bênh chưa được xác định. Tuy nhiên, tốt hơn hết nên cách ly toàn bộ đàn lợn có nguy cơ với mọi loại nguồn bệnh và không cho ăn các nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh. B. Tổng quan về protein tái tổ hợp dựa trên ORF7 và ứng dụng trong chẩn đoán 1. Giới thiệu Trong 3 protein cấu trúc chính của PRRSV thì người ta nhận thấy rằng N protein quy định bởi ORF 7 hiện diện với số lượng lớn nhất trong phân tử 9 virion của PRRS và huyết của heo bị xâm nhiễm bởi PRRS phản ứng mạnh với N protein, hầu hết kháng thể đơn dòng thu được từ chuột bị cho nhiễm PRRS bán tinh sạch nhận biết đặc hiệu với N-protein. Ngoài ra qua nghiên cứu ORF 7 mã hóa cho Protien N có cấu trúc ổn định và được bảo tồn cao. Chính vì thế nên N protein được xem là ứng viên sáng giá trong việc phát hiện chẩn đoán heo bị nhiễm PRRS. Hiện nay người ta đã phát triển các kit thương mại chẩn đoán PRRS dựa trên ORF7. ELISA là phương pháp thông dụng và tin cậy trong phát hiện chẩn đoán PRRS hiện nay, người ta thường dùng ELISA để phát hiện kháng thể PRRS kháng protein N sản phẩm của ORF7 chính vì thế cần một lượng lớn kháng nguyên là protein N dùng trong các kit chẩn đoán này. Nhưng hiện tại có một hạn chế là PRRSV thường khó nuôi trên môi trường tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trường đại thực bào túi phổi heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi, tuy nhiên, hiện tại người ta chưa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất cả các chủng virus PRRS. Chính vì thế phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho PRRSV là hướng đi đúng và mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein tái tổ hợp N mã hóa bởi ORF7 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm như dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán ELISA. Sản xuất protein N tái tổ hợp mở ra khả năng tạo số lượng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát. Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục được nhược điểm hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trường tế bào như đã nêu ở trên. 2. Cấu trúc phân tử của Protein N Protein N gồm năm vùng cấu trúc chính và có cấu hình xoắn α-helix. Vùng I: nằm ở vị trí của vùng amino-terminal giữa amino acid thứ 18 và 52. Bao gồm vùng quan trọng quyết định yếu tố kháng nguyên nằm giữa amino acid thứ 30 và 52. Vùng này được nhận diện đặc hiệu bởi kháng thể đơn dòng SDOW17 và SDOW17 là kháng thể đơn dòng duy nhất để phát hiện, nhận diện một epitope chung cho hầu hết các chủng virus PRRS Châu Âu và Bắc Mỹ, 10 epitope này nằm ở vị trí bên trong vùng bảo tồn của N protein, cấu hình của vùng này ở dạng cấu hình xoắn helical, kị nước. Vùng II: từ amino acid 37 đến 52, bao gồm các epitope tuyến tính. Vùng III, từ amino acid 52 đến 69, nằm trong vùng bảo tồn cao của N protein. Nhóm amino acid này là thành phần của immunodominant epitope, vì 70% các kháng thể đơn dòng nhận diện cấu hình protein hiện diện trong N-52 nhưng không nhận diện được đột biến loại N-69. Các amino acid từ 40 đến 66 nằm trong vùng ưa nước của N-protein, và nằm ở vùng dễ phát hiện trên bề mặt ngoài của capsid. Vùng IV, trải dài từ amino acid thứ 69 tới 112, được phát hiện bởi sự gắn kết đặc hiệu của kháng thể đơn dòng SR30. Vùng V từ amino acid 112 đến amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu hình chung của protein. 3. Sản xuất protein N tái tổ hợp 3.1. giới thiệu Trong phần trình bày này người ta sản xuất protein N tái tổ hợp bằng cách chèn gene ORF7 mã hóa cho protein nucleocapsid N của Lelystad virus (LV) vào sau promoter P10 của baculor virus Autographa califonia nuclear polyhedrosis. Kết quả tạo ra baculovirus tái tổ hợp là bac-ORF7, biểu hiện protein 15kDa trong tế bào côn trùng. Protein này có kích thước tương tự với kích thước protein N biểu hiện bởi LV trong tế bào CL2621và vẫn giữ được 11 cấu trúc kháng nguyên của Protein N tự nhiên. Protein tái tổ hợp này được đem đi chủng cho heo và kháng thể chống lại protein N tái tổ hợp được sản xuất tăng lên trong cơ thể heo. Tuy nhiên chủng protein N tái tổ hợp không giúp bảo vệ heo khỏi sự xâm nhập của PRRSV. Qua kiểm tra cả hai dòng virus PRRS Châu Âu và Châu Mỹ đều phản ứng với protein N biểu hiện bởi bac-ORF7, như vậy protein N tái tổ hợp có thể được sử dụng trong việc phát hiện kháng thể trong huyết thanh kháng lại các chủng khác nhau của PRRSV. Nhưng protein tái tổ hợp này không có khả năng ứng dụng trong sản xuất vaccine chống virus PRRS. 3.2. Quy trình sản xuất như sau: Chuẩn bị tế bào và virus: virus Autographa California nuclear polyhidrosis (AcNPV) và các virus tái tổ hợp được nuôi cấy trong dòng tế bào Spodoptera frugiperda Sf21. LV và ATCC VR2332 được phát triển trong tế bào đại thực bào túi phổi của heo(PAM) hoặc trong tế bào CL2621. Thiết lập plasmid: tổng hợp hai đoạn oligonucleotide chuyên biệt nằm ở trước và sau của ORF7 là LV40 (59-GATTGGATCCTCGTCAAGTATGGCCGG-39) và LV41 (59-CTAAGGATCCTGTCAAATTAACTTGCA-39), và sử dụng làm primer trong phản ứng PCR để khuyếch đại ORF7 từ cDNA clone. Các nu được gạch chân không thuộc trình tự của LV nhưng được thêm vào để tạo vị trí BamHI trong mồi. Vị trí cắt giới hạn BamHI được thêm vào mồi để tạo dòng ORF7 sau promoter p10 của baculovirus chuyển bởi vector pACAS3. Chuyển và chọn lọc protein tái tổ hợp N biểu hiện bởi tế bào Sf21: Chủng AcNPV DNA hoang dại và pACAS3 được đồng chuyển vào tế bào Sf21. Virus tái tổ hợp biểu hiện ß-galactosidase được chọn lọc ít nhất ba lần và được kiểm tra sự biểu hiện của N protein. DNA của tế bào và của virus được ly trích từ tế bào Sf21 đã được chuyển gene ở trên. DNA của virus được cắt bởi BamHI và XhoI để khẳng định gene ORF7 được chèn đúng vào locus p10 của baculovirus. 12 Đánh dấu phóng xạ và phân tích protein: Sau khi cho xâm nhiễm Chủng AcNPV DNA hoang dại và pACAS3 vào tế bào Sf21 được 40 giờ thì đánh dấu phóng xạ với L-[35S]methionine. CL2621 xâm nhiễm bởi virus LV cũng được đánh dấu. tế bào bị ly giải sau đó được đem đi phân tích miễn dịch kết tủa (immunoprecipitation). Miễn dịch kết tủa và điện di: kiểm tra protein tái tổ hợp bằng phương pháp miễn dịch kết tủa và điện di, protein tái tổ hợp đã được đánh dấu phóng xạ được miễn dịch kết tủa với huyết thanh kháng LV; peptide đặc hiệu N, huyết thanh mẫu, và kháng thể đơn dòng SDOW17 và WBE6. Phức hợp miễn dịch được gắn với các hạt protein A-Sepharose CL-4B. Các hạt protein A-Sepharose được hòa trong dung dịch buffer Laemmli, hỗn hợp này được đun nóng trong hai phút ở nhiệt độ 100°C trước khi được phân tích bằng điện di bằng phương pháp sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE) trên gel polyacrylamide 12,5 %. Gel được ngâm trong Amplify trong 30 phút để nhuộm huỳnh quang và sau đó được làm khô và protein miễn dịch kết tủa được quan sát bằng phóng xạ tự ghi. Quy trình này cũng được dùng để kết tủa miễn dịch protein từ dung dịch ly giải tế bào CL2621 bị xâm nhiễm LV. Đo sản lượng Protein N tái tổ hợp theo thời gian bằng phương pháp ELISA: tế bào Sf21 được xâm nhiễm với baculovirus tái tổ hợp bac-ORF7 với liều hữu hiệu là TCID50s. Tại 24, 48, 72 và 96 giờ sau xâm nhiễm, tế bào được thu hoạch, rồi được rửa với phosphate-buffered saline (PBS), rồi được ly giải trên đá trong dung dịch ly giải (30mM Tris-HCl [pH7,5], 10mM MgCl2 và 1% Nonidet-P40; 40×106 tế bào/ml). Dung dịch ly giải được ly tâm ở 1400 vòng/phút để loại các mảnh vỡ của tế bào. Dung dịch sau ly tâm của bac-ORF7 được bảo quản ở -70°C.Đĩa phản ứng ELISA được phủ với dung dịch ly giải của tế bào bac-ORF7 và được ủ qua đêm với tỉ lệ 1:125 trong dung dịch coating buffer (50mM NaHCO3 [pH 9,65]. Đĩa được rửa trong PBS chứa 0,05 % tween 80 và được ủ ở 37°C trong một giờ với độ pha loãng 1:500 của ascetic fluid của kháng thể đơn dòng WBE6 đặc hiệu cho protein N trong ELISA buffer ( PBS, 0,05% Tween 80, 4% huyết thanh ngựa). Đĩa phản ứng được rửa và ủ trong một giờ ở 37°C với kháng thể horseradish peroxidase (HRPO)- 13 conjugated của thỏ gắn trực tiếp với Immunoglobin của chuột ở độ pha loãng 1:1000 trong ELISA buffer. Sau đó đĩa phản ứng được rửa và được nhuộm. Blocking ELISA để phát hiện kháng thể đặc hiệu cho protein N: dung dịch ly giải của tế bào SF21 được thu nhận sau khi cho xâm nhiễm vớ baculorvirus tái tổ hợp hai ngày rồi được sử dụng cho phản ứng ELISA như đã mô tả ở trên. Các giếng phản ứng được rửa và ủ với 100ml huyết thanh thử độ pha loãng 1:4 trong ELISA buffer. Mỗi mẫu huyết thanh được kiểm tra 3 lần lặp lại. Đối với đối chứng, sử dụng độ pha loãng (1:4 tới 1:2,048) của huyết thanh kháng LV và ba huyết thanh có phản ứng âm tính được kiểm tra trên mối đĩa. Sau một giờ ủ ở 37°C với MAbs HRPO-conjugated của chuột Đĩa phản ứng được rửa và nhuộm như đã mô tả ở trên. Khi kháng thể kết gắn SDOW17 của protein tái tổ hợp N bị khóa bởi immunoglobin của heo, kháng thể đơn dòng RM19ME của chuột không thể kết gắn được chứng tỏ rằng huyết thanh đem kiểm tra dương tính với LV. Blocking được tính toán dựa theo công thức %blocking=100-OD của huyết thanh kiểm tra/ OD của huyết thanh âm tính của heo)×100. Chủng heo với bac-ORF7 và thử nghiệm với LV: heo con hai tuần tuổi không bị mầm bệnh xâm nhiễm được chủng với 2ml bac-ORF7 (tương đương 20mg protein N) ở ngày 0 và ngày 28. Hai heo đối chứng được chủng tương tự với 2ml baculovirus kiểu hoang dại. Ở ngày 42 cả bốn heo được cho nhiễm với 1ml 105 TCID50 của LV. Mẫu huyết thanh được lấy ở ngày 0, 21, 28,42,45, 52, 58, và 63. Tế bào đại thực bào bị xâm nhiễm với LV được khẳng định trong tất cả mẫu huyết thanh bằng IPMA. Blocking ELISA cho protein N được thực hiện với huyết thanh thu thập sau khi chủng heo như trên. Tất cả heo thí nghiệm được quan sát hàng ngày các triệu chứng của bệnh như sốt hoặc rối loạn hô hấp. Heo bị chết ở ngày 63 sau khi chủng và mô phổi được phân tích bệnh tích. Kháng nguyên virus được quan sát bằng phương pháp immunoperoxidase staining với MAbs SDOW17 và kháng thể chuột HRPO- conjugated gắn trực tiếp với immunoglobin như đã miêu tả ở trên. 14 III. Kết luận PRRS virus là virus đang được quan tâm nghiên cứu bởi các nhà khoa học trên thế giới vì đây là virus gây thiệt hại lớn trong nghành chăn nuôi heo thế giới. mặt khác sự đa dạng di truyền của virus này cùng với sự biến đổi lien tục của chúng dẫn đến sự khó khăn trong chẩn đoán cũng như tạo ra loại vaccine đặc hiệu và có hiệu quả trong công tác phòng chống dịch bệnh xảy ra. Do đặc điểm khó nuôi cấy trên môi trường tế bào nên có những khó khăn nhất định trong việc sản xuất các kháng nguyên dùng làm vật liệu cho các kit chẩn đoán virus cũng như nuôi cấy virus để tạo nguyên liệu sản xuất vaccine nhược độc cho virus này. Chính vì thế protein tái tổ hợp là hướng đi tiềm năng trong việc sản xuất kháng nguyên ứng dụng trong sản xuất kit chẩn đoán trên quy mô lớn và khắc phục được nhược điểm nêu trên, ngoài ra protein tái tổ hợp cũng mở ra tiềm năng cho sản xuất vaccine bảo vệ heo khỏi PRRSV. Trong bài báo cáo này em chỉ trình bày những kiến thức hiểu biết chung về virus PRRS và hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo do virus này gây ra. Đồng thời nêu ra nghiên cứu về sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF7 của virus là vùng có tính bảo tồn cao, có ứng dụng rõ ràng trong công tác chẩn đoán và phân biệt các dòng virus PRRS. Hiện nay còn có hướng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 của virus PRRS trong sản xuất vaccine vì protein GP5 được quy định bởi ORF này có chứa những epitope trung hòa chính quan trọng của PRRSV, đó cũng là hạn chế của bài báo cáo khi em chưa đưa ra được nghiên cứu này. 15 IV. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Ngọc Hải, Công nghệ sinh học trong thú y, nhà xuất bản Nông Nghiệp, 2007. 2. Sarah k. Wooton, Eric A.Nelson, and Dongwan Yoo, Department of Pathobiology, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario N1G 2W1, Canada,and Department of Veterinary Science, South Dakota State University, Brookings, South Dakota . Antigenic structure of the Nucleocapsid Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. 3. J.J.M. Meulenberg, R.J.Bende, J.M.A.Pol, G.Wensvoort, and R.J.M. Moormann, Department of Virology, Institute for Animal Science and Health (ID-DLO), Lelystad, The Netherlands. Nucleocapsid Protein N of Lelystad Virus: Expression by Recombinant Baculorvirus, Immunological Properties, and Suitability for Detection of Serum. 4. Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken Inui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam Nguyen, Di Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong Tian, and George F. Gao. Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Viet Nam and China, 2007. 5. Kyoung-Jin Yoon, assistant professor; Chih-Cheng Chang, Graduate assistant; Jeffrey Zimmerman, associated professor; and Karent Harmon, associated scientist, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine. Field and Experimental Assessment of PRRSV Evolution. 6. Dee S, Deen J, Rossow K, Weise C, Eliason R, Otake S, Joo HS, Pijoan C. Can J Vet Res. 2003.Mechanical transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus throughout a coordinated sequence of events during warm weather. 7. T Dokland, A Deshpande, Y Fang, E Nelson, Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham; Department of Veterinary Science, South Dakota State University AM Burrell, W Xu, Q Hoang, RC Willis, R 16 Shah, M Bounpheng, X Fang Applied Biosystems, Austin, Texas, Cryo- electron microscopy of PRRSV virions.