Xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan edwardsiella ictaluritrên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long

yên liệu gốc 20.000 lần. Điện di Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel. Dùng pipet hút 10 µl mẫu cần phân tích trộn với một giọt dung dịch nạp mẫu 6X cho vào từng giếng một. Sử dụng thang DNA để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Nối bồn điện di với nguồn điện và sử dụng dòng điện 100 V. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Đọc kết quả Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus ladder (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử. Trọng lượng phân tử đoạn DNA của vi khuẩn E. ictaluri cần phát hiện là 407 bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 3.3.7 Phương pháp lập kháng sinh đồ Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Huys et al., 2005 Vi khuẩn sau khi được phục hồi trên môi trường TSA, kiểm tra tính thuần. Sau 48 giờ nuôi cấy, dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng để tạo dung dịch có độ đục tương đương với độ đục dung dịch chuẩn 3,0 McFarland. Sau đó lấy 100µl dung dịch vi khuẩn tán đều trên môi trường TSA bằng que thủy tinh đã tiệt trùng. Sau 1 phút dùng 8 loại kháng sinh đặt lên mặt thạch và ủ trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ. Đường kính vòng vô trùng được tính bằng milimet (mm). Đường kính vòng vô trùng đó được phân thành 3 loại là kháng, trung bình nhạy và nhạy. Dựa theo Bảng 3.2 để xác định tính nhạy hay kháng của các chủng vi khuẩn. Bảng 3.2: Giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy và nhạy của các loại kháng sinh theo đường kính chuẩn trung bình của công ty Bio-rad Kháng sinh Kháng (mm) Trung bình nhạy (mm) Nhạy (mm) AMX-25µg ≤13 14-17 ≥18 FFC-30µg ≤16 17-19 ≥20 NOR-10µg ≤12 13-16 ≥17 CS-50µg ≤8 9-10 ≥11 CIP-5µg ≤15 16-20 ≥21 S-10µg ≤11 12-14 ≥15 DO-30µg ≤12 13-15 ≥16 OA-2µg ≤14 - ≥15 3.3.8 Phương pháp xác định MIC Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp pha loãng môi trường loãng (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006). Các bước tiến hành như sau Chuẩn bị môi trường và hoá chất Vi khuẩn được lấy từ tủ -80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ. Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần. Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5ml NB (Nutrient broth), ủ ở 28oC trong 48 giờ. Chuẩn bị dung dịch thuốc Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị hai chai dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp cho mỗi loại thuốc kháng sinh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 Pha loãng hai lần để có các nồng độ: 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml. Pha loãng bằng nước muối sinh lý. Chú ý: Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml. Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;…; 0,5 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml. Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo. Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Mỗi nồng độ thuốc được lặp lại 3 lần. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng NB (không dùng nước cất) ở điểm OD = 0,1 ± 0,02 mật số vi khuẩn khoảng 1x108 CFU/ml) rồi pha loãng xuống 1000 lần để mật độ vi khuẩn còn khoảng 1x105 CFU/ml. Sau đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng vi khuẩn và được ủ trong điều kiện với các ống MIC. Cho 2ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 2ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 2;...; 512 µg/ml (lắc đều) Thí nghiệm có 2 đối chứng: Đối chứng âm: (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý) Đối chứng dương: (2ml dung dịch vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý) Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 48 giờ (đến khi thấy vi khuẩn trong đối chứng dương phát triển). Đọc kết quả Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì làm lại thí nghiệm. Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng âm và dương. Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó không có vi khuẩn phát triển. 3.4 Phương pháp xử lý số liệu Microsoft Word được sử dụng để đánh văn bản và Microsoft exell được dùng để vẽ biểu đồ và xử lý số liệu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Kết quả sau 7 đợt thu mẫu tại 3 tỉnh: Vĩnh Long, Đồng Tháp và thành phố Cần Thơ, thu ở 18 ao với tổng số 101 con cá, trong đó gồm có 32 cá khỏe và 69 cá bệnh. Cá được thu từ những ao có dấu hiệu bệnh. Các cơ quan gan, thận và tỳ tạng của cá có dấu hiệu bệnh mủ gan và cả cá khỏe được cấy trên môi trường dinh dưỡng chung TSA (Tryptone soya agar) và môi trường EIA (E. ictaluri agar) ủ trong tủ ấm ở 28oC (48 giờ), những khuẩn lạc có dấu hiệu đặc trưng của nhóm vi khuẩn E. ictaluri về màu sắc (trắng đục), kích thước nhỏ li ti, hình dạng (que ngắn)... theo mô tả của Hawke et al., (1981), Plumb, (1999), Từ Thanh Dung (2005) được tách ròng. Kết quả được 84 chủng, trong đó có 31 chủng phân lập trên gan, 23 chủng phân lập trên thận và 30 chủng phân lập trên tỳ tạng. Bên cạnh việc phân lập vi khuẩn các dấu hiệu bên trong và bên ngoài của cá cũng được ghi nhận. Kết quả ghi nhận được có 54/101 cá thể có dấu hiệu xuất huyết, 38/101 cá thể có dịch trong xoang bụng trong đó có 16/38 trường hợp có dịch màu vàng và 22/38 trường hợp có dịch màu trắng trong (hoặc đục, có thể có mùi hôi). Một số cá thể có các đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng với kích thước từ 1-3mm, cụ thể có 40/101 cá thể có đốm trắng trên thận, 34/101 cá thể có đốm trắng trên tỳ tạng, 29/101 cá thể có đốm trắng trên gan và 22/101 cá thể có gan trắng nhạt. Dựa vào dấu hiệu khi phân tích mẫu vi sinh cùng với kết quả các chỉ tiêu cơ bản: nhuộm Gram, oxidase, catalase, tính di động chọn ra 10 chủng (7 chủng ở Vĩnh Long và 3 chủng ở Đồng Tháp) đặc trưng nhất để tiến hành định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống và bằng bộ kit API 20E. 4.1.2 Kết quả định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống Kết quả kiểm tra các chủng vi khuẩn với 22 chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa đã xác định hầu hết các chủng vi khuẩn này có đặc điểm giống nhau (Bảng 4.1). Hình 4.1: (A) Đĩa cấy thuần; (B)Vi khuẩn E. ictaluri gram âm, hình que ngắn. A B PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 Bảng 4.1 Các chỉ tiêu hình thái sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp truyền thống S T T Chỉ tiêu Chủng vi khuẩn CA 3.1G CA 3.2T CA 3.4 TT CA 4.1G CA 4.3G CA 4.3 TT CA 4.4G MX 3.3G MX 5.3 T MX 13.2 T 1 Gram - - - - - - - - - - 2 Hình dạng Que Que Que Que Que Que Que Que Que Que 3 Oxidase - - - - - - - - - - 4 Catalase + + + + + + + + + + 5 Di động + + + + + + + + + + 6 O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 7 Arginine - - - - - - - - - - 8 Lysin + + + + + + + + + + 9 Ornithine - - - - - - - - - - 10 Citrate - - - - - - - - - - 11 Nitrate + + + + + + + + + + 12 H2S - - - - - - - - - - 13 Ure - - - - - - - - - - 14 Indole - - - - - - - - - - 15 VP - - - - - - - - - - 16 Arabinose - - - - - - - - - - 17 Glucose + + + + + + + + + + 18 Innositol - - - - - - - - - - 19 Mannitol - - - - - - - - - - 20 Rhamnose - - - - - - - - - - 21 Sorbitol - - - - - - - - - - 22 Sucrose - - - - - - - - - - Ghi chú: CA: Chánh An; MX: Mỹ Xương G: gan; T: thận; TT: tỳ tạng Số trước dấu chấm ".": chỉ số ao Số sau dấu chấm ".": số thứ tự của mẫu cá Qua Bảng 4.1 cho thấy kết quả kiểm tra 22 chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri đều có hình que, gram âm. Tất cả các chủng vi khuẩn đều cho phản ứng dương tính với 6 chỉ tiêu: catalase, tính di động, phản ứng O/F, lysine, khả năng tạo nitrit từ nitrate, glucose. Các chỉ tiêu còn lại đều cho phản ứng âm tính. Hình 4.2: (A) Khả năng sử dụng các loại đường (Sucrose, Mannitol, Sorbitol, Glucose, Arabinose, A B PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 Innositol, Rhamnose); (B) Các phản ứng Nitrate, ure, lên men và oxi hoá đường glucose (O/F), VP, citrate, indole, H2S (Theo thứ tự từ trái sang phải). Kết quả cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn có đặc điểm giống với mô tả của Từ Thanh Dung (2005) là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động yếu, catalase dương tính, oxidase âm tính, có khả năng lên men glucose, không sinh H2S và Indole âm tính được chọn ra để kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa truyền thống. Ngoài các chỉ tiêu trên thì Crumlish et al., (2002) khi phân lập vi khuẩn trên cá tra bệnh mủ gan ở ĐBSCL trong các trường hợp bệnh cho kết quả với vi khuẩn E. ictaluri ở các chỉ tiêu còn lại đều âm tính ngoại trừ khả năng thủy phân lysine và khả năng sử dụng đường glucose. Trong đề tài này, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa truyền thống cho thấy ngoài các chỉ tiêu cơ bản trên thì các chỉ tiêu còn lại đa số đều âm tính trên tất cả các chủng vi khuẩn ngoại trừ khả năng thủy phân lysin và khả năng sử dụng đường glucose là dương tính. Như vậy, kết quả nghiên cứu của đề tài phù hợp với kết quả nghiên cứu của Crumlish et al., (2002) và Từ Thanh Dung (2005). 4.1.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E Bên cạnh việc xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống, đề tài cũng tiến hành xác định các chỉ tiêu sinh hoá của vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.2. Qua Bảng 4.2 cho thấy đa số các chỉ tiêu đều âm tính, kết quả dương tính ở các chỉ tiêu lysine, glucose và citrate. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê Minh Đương (2007). Nhưng đối với khả năng sử dụng đường glucose của chủng CA4.4G cho kết quả âm tính, sự sai khác này có thể do trong quá trình thực hiện thí nghiệm vi khuẩn có khả năng bị nhiễm tạp khuẩn hoặc do hóa chất thí nghiệm không đảm bảo chất lượng. Hình 4.3: Kết quả kiểm tra vi khuẩn E. ictaluri trên Kit API 20E Ghi chú: ONPG; ADH; LDC; ODC; CIT; H2S; URE; TDA; IND; VP; GEL; GLU; MAN; INO; SOR; RHA; SAC; MEL; AMY; ARA (theo thứ tự từ trái sang phải) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 Bảng 4.2. Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hoá các chủng vi khuẩn bằng bộ kit API 20E. Chỉ tiêu Chủng vi khuẩn CA 3.1G CA 3.2 T CA 3.4T T CA 4.1G CA 4.3G CA 4.3TT CA 4.4G MX 3.3G MX 5.3T MX 13.2T Gram - - - - - - - - - - Hình dạng que que que que que que que que que Que Oxidase - - - - - - - - - - Catalase + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ ONPG - - - - - - - - - - ADH - - - - - - - - - - LDC + + + + + + + + + + ODC - - - - - - - - - - CIT - + + - + - + + - + H2S - - - - - - - - - - URE - - - - - - - - - - TDA - - - - - - - - - - IND - - - - - - + - - - VP - - - - - - - - - - GEL - - - - - - - - - - GLU + + + + + + - + + + MAN - - - - - - - - - - INO - - - - - - - - - - SOR - - - - - - - - - - RHA - - - - - - - - - - SAC - - - - - - - - - - MEL - + + - - - - - - - AMY - - - - - - - - - - ARA - d d - - - - - - - Ghi chú: ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: arginine decarboxylase; LDC: lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: H2S production; URE: urea; TDA: tryptophane deaminase; IND: indole; VP: phản ứng voges-proskauer; GLE: gelatin; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; SAC: sucrose; MEL: melibiose; AMY: amigdaline; ARA: arabinose. Bên cạnh đó, chỉ tiêu kiểm tra khả năng sử dụng citrate cũng cho kết quả âm tính ở các chủng vi khuẩn CA3.1G, CA4.1G, CA4.3TT và MX5.3T, kết quả này giống với nghiên cứu của Nguyễn Trúc Phương (2008) trên chủng vi khuẩn tham khảo E223. Tuy nhiên các chủng còn lại cho kết quả dương tính với chỉ tiêu này. Năm 2006, Lương Trần Thục Đoan đã kiểm tra đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn E. ictaluri 224 phân lập trên cá tra ở Việt Nam thì chỉ tiêu citrate cho kết quả dương tính. Đến năm 2007, Lê Minh Đương đã tiến hành gây cảm nhiễm cá tra bằng dòng vi khuẩn EHO2, khi kiểm tra bằng bộ Kit API 20E cho kết quả là 8 chủng vi khuẩn tái phân lập từ các cơ quan máu, lớp nhớt trên da, não, tim, gan, tỳ tạng, thận và ruột trước thì chỉ có chỉ tiêu glucose và lysine là dương tính, tất cả các chỉ tiêu còn lại đều âm tính. Nhưng cũng với kết quả tái định danh thì 9 chủng vi khuẩn phân lập từ lô E223 và 1 chủng phân lập từ lô đối chứng ngoài kết quả dương tính với glucose và lysine PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 còn cho kết quả dương tính với chỉ tiêu citrate. Như vậy chỉ tiêu citrate có thể thay đổi giữa các chủng vi khuẩn E. ictaluri khác nhau. Chủng CA4.4G ngoài việc cho kết quả âm tính với đường glucose còn cho kết quả dương tính với chỉ tiêu Indole, sự sai khác biệt này có thể có liên quan với nhau do đặc tính của chủng vi khuẩn. Ngoài ra, kết quả giống nhau giữa 2 chủng vi khuẩn CA3.2T và CA3.4TT là dương tính với chỉ tiêu đường melibiose và có phản ứng không rõ ràng với đường arabinose. Định danh vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp truyền thống hay phương pháp API 20E đều cho kết quả phù hợp với kết quả định danh của các tác gải trước đây. Tuy nhiên ở mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng. Đối với phương pháp sinh hóa truyền thống thì cần nhiều thời gian, quá trình thao tác dễ bị tạp nhiễm và khá phức tạp. Bộ Kit API 20E hạn chế được những nhược điểm này, tuy nhiên chi phí cho việc sử dụng kit lại khá cao và vì đây là bộ kit được chế tạo để sử dụng trên người với nhiệt độ tối ưu là 37oC trong khi áp dụng vào thí nghiệm trong thủy sản cho nhóm vi khuẩn E. ictaluri với mức nhiệt độ tối ưu thấp hơn khá nhiều (28oC) thì mức độ chính xác của kết quả phân tích cần được lưu ý. Góp phần khắc phục những nhược điểm của hai phương pháp này đó là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) vừa tiết kiệm được nhiều thời gian vừa mang tính chính xác cao. 4.2 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR PCR là công cụ giúp phát hiện nhanh mầm bệnh vi sinh vật trên tôm, cá. Qua qui trình chiết tách DNA cho kết quả ở Bảng 4.3 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Bartie và ctv, 2006) Chủng vi kkhuẩn Giá trị đo được ở 260 nm Hàm lượng DNA (ng/µl) MX13.2T 0,38 1900 CA4.1G 0,353 1765 CA3.1G 0,355 1775 MX3.3G 0,367 1835 CA4.3G 0,342 1710 CA4.4G 0,474 2370 CA3.4TT 0,426 2130 CA3.2T 0,428 2140 MX5.3T 0,338 1690 CA4.3TT 0,339 1695 Từ kết quả chiết tách DNA ở trên cho thấy hàm lượng DNA khá cao (dao động từ 1690-2370 ng/µl) trong khi hàm lượng DNA cần cho phản ứng chỉ có 20 ng/µl. Vì vậy kết quả hàm lượng DNA chiết tách được pha loãng để đảm bảo giá trị hàm lượng DNA cần sử dụng trong phản ứng. Kết quả điện di được trình bày ở Hình 4.4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Hình 4.4. Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri Giếng M: thang đo DNA (1 kb plus Invitrogen) Giếng 1: đối chứng âm (nước) Giếng 2: đối chứng dương Giếng 3: MX13.2T Giếng 4: CA4.1G Giếng 5: CA3.1G Giếng 6: MX3.3G Giếng 7: CA4.3G Giếng 8: CA4.4G Giếng 9: CA3.4TT Giếng 10: CA3.2T Giếng 11: MX5.3T Giếng 12: CA4.3TT. Qua kết quả Hình 4.4 cho thấy cả 10 chủng vi khuẩn đều hiện vạch tại vị trí 407 bp chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri, trên tất cả các mẫu đều không có sản phẩm phụ. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Trúc Phương (2008). Trong đó vạch hiện rõ nhất ở giếng thứ 5 là chủng CA3.1G. Các giếng thứ 3; 4; 6; 8; 9; 11; 12 vạch sáng hiện lên cũng khá rõ. Riêng ở giếng thứ 7 và 10 các vạch không rõ như các giếng còn lại có thể do thao tác trong quá trình tách chiết. 4.3 Kết quả kháng sinh đồ Tất cả các chủng vi khuẩn được tiến hành lập kháng sinh đồ với 8 loại thuốc kháng sinh: AMX, FFC, NOR, CS, CIP, S, DO và OA. Kết quả được trình trong Bảng 4.4 Qua Bảng 4.4 cho thấy 100% các chủng vi khuẩn kháng hoàn toàn với streptomycin (S) và oxolinic acid (OA). Bên cạnh đó đối với kháng sinh FFC tất cả các chủng vi khuẩn trên đều cho kết quả đường kính vòng vô trùng rất bé so với giới hạn mức độ kháng của vi khuẩn. Vậy 100% vi khuẩn phân lập được đều kháng với FFC. 407bp M 1 2 4 3 5 6 7 8 9 10 11 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Bảng 4.4: Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn E. ictaluri Vi khuẩn Đường kính vòng vô trùng của thuốc kháng sinh (mm) AMX FFC NOR CIP CS S DO OA CA3.1G 46 13 26,5 32 15,5 - 27 - CA3.2T 46 12 24,5 34 15,5 - 43 - CA3.4TT 44,5 12 24,5 32 15 - 35 - CA4.1G 46,5 11 26 34,5 14 - 21 - CA4.3G 48,5 12 26,5 36 15,5 - 41,5 - CA4.3TT 45 11 26 33 16 - 22 - CA4.4G 50 11 20 26 15 - 12 - MX3.3G 47,5 11,5 27 35 15,5 - 26,5 - MX5.3T 43 12 26 29 15,5 - 32 - MX13.2T 46 12 19,5 25 16 - 14 - Hình 4.5: Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn E. ictaluri Theo Reger et al., (1993) cho rằng các chủng E. ictaluri ở Hoa Kỳ đều nhạy với DO. Trong nghiên cứu này kết quả cho thấy DO có vòng vô trùng thể hiện cả 3 mức là kháng, trung bình nhạy và nhạy. Trong đó có chủng CA4.4G kháng, chiếm 10%; chủng MX13.2T ở mức trung bình nhạy chiếm 10%; 8 chủng còn lại nhạy với loại kháng sinh này, chiếm 80%. Như vậy, tính nhạy của DO đối với nhóm vi khuẩn này đang giảm dần, vì vậy người nuôi nên thận trọng khi sử dụng. Trái ngược với 3 loại kháng sinh S, OA và FFC, kết quả đường kính vòng vô trùng trên kháng sinh AMX rất lớn. Kết quả này cho thấy vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra ở Chánh An (Vĩnh Long) và Mỹ Xương (Đồng Tháp) còn rất nhạy với loại kháng sinh này. Trong nghiên cứu của Châu Hồng Thuý (2008) ở tỉnh Trà Vinh cho thấy có 53,5% chủng kháng với NOR và 30% chủng trung bình nhạy nhưng trong nghiên cứu này kết quả 100% vi khuẩn nhạy với loại kháng sinh này. Kết quả tương tự trên tất cả các chủng vi khuẩn đối với 2 loại kháng sinh CIP và CS. Đường kính vòng vô trùng trên CIP và CS thể hiện tính nhạy của vi khuẩn đối với 2 loại kháng sinh này. Như vậy, cả 4 loại kháng sinh này đều nhạy với các chủng vi khuẩn phân lập được ở Vĩnh Long và Đồng Tháp, trong đó nhạy nhất là AMX. Vì vậy ta có thể dùng để điều trị cho cá khi cần thiết, tuy nhiên ở mỗi vùng nuôi khác nhau vi khuẩn sẽ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 phản ứng khác nhau với từng loại kháng sinh. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh phải hết sức cẩn thận và hợp lý để tránh hiện tượng kháng thuốc kháng sinh gây thiệt hại đến môi trường sinh thái, sức khỏe động vật thủy sản nuôi đồng thời cũng gây khó khăn cho vấn đề điều trị bệnh sau này. Ngoài ra, còn ảnh hưởng đến kinh tế và quan trọng hơn là ảnh hưởng đến sức khỏe con người. 4.4 Kết quả MIC Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn đều kháng hoàn toàn với streptomycin và oxolinic acid. Qua kết quả này, đề tài chọn ngẫu nhiên hai chủng CA3.4TT và MX3.3G để làm thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chúng trên kháng sinh streptomycin (S). Kết quả được thể hiện ở Bảng 4.5 Bảng 4.5: Giá trị MIC của thuốc kháng sinh streptomycin trên 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri Chủng vi khuẩn Khoảng giá trị MIC (µg/ ml) 0,25 0,5 1 2 4 CA3.4TT x MX3.3G x Hình 4.6: Kết quả MIC của vi khuẩn E. ictaluri Qua kết quả ở Bảng 4.5 cho thấy giá trị MIC của kháng sinh streptomycin lên 2 chủng vi khuẩn nằm trong khoảng 2-4 µg/ml. Nguyên nhân có thể do mật độ vi khuẩn thấp nên chưa đủ sức kháng lại thuốc kháng sinh ở nồng độ cao và đã bị thuốc ức chế ở nồng độ thấp. Theo nghiên cứu sự kháng thuốc của Stock and Wiedemann (2001) trong số 102 chủng thuộc 3 loài E. ictaluri, E. tarda và E. hoshinae thì chỉ có 2 chủng (1,96%) kháng với streptomycin. Tuy nhiên, năm 2008 kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung cho thấy có 83% vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin, có thể nói đây là lần đầu tiên phát hiện vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin ở tỉ lệ cao nhất. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 Trong nghiên cứu này, kết quả lập kháng sinh đồ lại cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều kháng hoàn toàn với streptomycin. Năm 2008, Huỳnh Thị Phượng Quyên với đề tài tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn E. ictaluri và Aeromonas hydrophyla tại khoa Thủy Sản đã cho kết quả nồng độ MIC của thuốc kháng sinh DO và cefalexine lên chủng vi khuẩn CAF2 và CAF133 trải dài ở các nồng độ từ 16 ppm đến 128 ppm. Đồng thời, kết quả cũng cho thấy trên cùng một loài vi khuẩn A. hydrophyla nhưng với 2 cách xác định mật độ vi khuẩn khác nhau (so màu quang phổ và so màu Mcfarland) sẽ cho kết quả nồng độ MIC cũng khác nhau. Cũng trong nghiên cứu của Huỳnh Thị Phượng Quyên (2008), phương pháp pha loãng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh doxycycline và cefalexine lên 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri (E223 và E258) kết quả nằm trong khoảng từ 8-64 µg/ml. Như vậy, trong nghiên cứu này nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn E. ictaluri trên kháng sinh streptomycin là rất thấp so với các nghiên cứu trước như Từ Thanh Dung (2008) đã nghiên cứu trên kháng sinh streptomycin với 64 chủng vi khuẩn E. ictaluri kết quả cho thấy có 2/64 chủng ở mức 4µg/ml; 9/64 chủng ở mức 8µg/ml; 1/64 chủng ở mức 32µg/ml; 1/64 chủng ở mức 64µg/ml và 51/64 chủng ở mức ≥ 128µg/ml. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết quả định danh được cả 10 chủng đều là vi khuẩn E. ictaluri. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng hoàn toàn với streptomycin và oxolinic acid, các chủng vi khuẩn cũng kháng với florfenicol và vi khuẩn nhạy nhất với kháng sinh amoxycillin. Như vậy, tùy vào vùng nuôi khác nhau mà ta lựa chọn kháng sinh phù hợp khi cần thiết để sử dụng. Kết quả MIC của kháng sinh streptomycin trên 2 chủng vi khuẩn CA3.4TT và MX3.3G thấp, dao động từ 2-4 µg/ml. 5.2 Đề xuất Cần khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên nhiều loại kháng sinh để có cách sử dụng hợp lý thuốc kháng sinh tránh được nhiều thiệt hại. Nên thu nhiều mẫu hơn ở nhiều địa phương khác nhau để có kết quả đánh giá tổng quát hơn. Cần theo dõi trong thời gian dài hơn để biết rõ tình hình xuất hiện bệnh từ đó có biện pháp quản lý và sử dụng kháng sinh hợp lý. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Barrow, G.I. and R.K.A. Feltham., 1993. Cowan and Steel ‘s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity Press, Cambridge. 262. 2. Baxa, D. V., J. M. Groff, A. Wishkovsky and R. P. Hedrick, 1990. Susceptibility of nonictalurid fishes to experimental infection with Edwardsiella ictaluri Diseases of Aquatic Organisms Vol.8: 113-117. 3. Brown, E. E. and J. B. Gratzek., 1980. Fish farming handbook. 4. Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng và Bùi Kim Tân, 2001. Thuốc kháng sinh. Sở khoa học công nghệ và môi trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu, 255 trang. 5. Bùi Quang Tề, 1993. Bệnh cá nuôi lồng bè và biện pháp phòng trị bệnh. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học 1988-1992, trang 120-124. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Cedric Komarl Zilong Tan, and William J. Enright., 2003. Health management practices for cage aquaculture in Asia - a key component for sustainability. Aquaculture Society. Bangkok, Thailand. 7. Clinical and Laboratory Standards Institure (CLSI), 2006. Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolate from aquatic animals; informational supplement, M49-A. Clinical and Laboratory Standards Institure, Wayne, NJ. 8. Crumlish, M., T.T. Dung, J.F. Turnbull, N.T.N. Ngoc and H.W. Ferguson, 2002. Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), culture in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 2002, 25, page 733- 736. 9. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản-Đại học Thủy Sản Nha Trang, 422 trang. 10. Dung, T.T., F. Haesebrouck, N.A.Tuan, P. Sorgeloos, M.Baele and A. Decostere, 2008. Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 11. Dương Nhựt Long, 2003. Giáo trình Kỹ Thuật Nuôi Thủy Sản Nước Ngọt-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 12. FAO, 2005. Hướng dẫn chẩn đoán bệnh của động vật thủy sản Châu Á. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, 247 trang. 13. Ferguson, H.W., J.F Turnbull, A. Shinn, K. Thomson, T.T. Dung and M. Crumlish, 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, Vietnam. Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513. 14. Francis-Floyd, R., Beleau, M. H., Waterstrat, P. R and Bowser, P.R., 1987. Effect of water temperature on the clinical outcome of infection with Edwardsiella ictaluri in channel catfish. J.Am. Vet. Med. Ass. 191: 1413-1416. 15. Frerichs. R.M and R.F. Millar, 1993. Mannual for the isolate and indentification of fish bacterial pathogent. Institure of aquaculture, University of Sterling, Scotland. 107pp. 16. GESAMP 2001. Planning and Management for Sustainable Coastal Aquaculture Development. 17. Hawe, J.P. (1979). A bacterial associated with disease of pond culture channel catfish. Journal of the Fisheries research Board of Canada, 36, 1508-1512. 18. Hawke J.P., A.C. McWhorter, A.G. Steigerwalt and D.J. Brenner, 1981. Edwardsiella ictaluri sp. Nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish. International Journal of Systematic Bacteriology, 31: 396-400 19. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục, 304 trang. 20. Ho, S.P., T.Y.Hsu, M.H.Chen and W.S.Wang, 2000. Antibacterial effect of chloramphenicol, thiamfenicol and flofenicol against aquatic animal bacteria. J. Vet. Med. Sci.62:479 – 485. 21. Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008. Tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa Thủy Sản. Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 38 trang. 22. Inglis, V., R.J. Roberts and Niall R. Bromage, 1994. Enteric septicaemia of catfish. Bacterial Diseases of Fish, page 67-79. 312pp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 23. Kasornchandra, J., Rogers. W.A and Plumb, J.A. (1987). Edwardsiella ictaluri from walking catfish Clarias batrachus L., in Thailand. Journal of Fish Disease. 10, 137-138. 24. Kent, M. L., Lyons, J. M. (1982). Edwardsiella ictaluri in the green knife fish, Egemannia virescens. Fish Health News 2:2. 25. Khuất Hữu Thanh, 2006. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, 270 trang. 26. Lê Minh Đương, 2007. So sánh khả năng xâm nhập của hai dòng vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 63 trang. 27. Lê Thị Bé Năm, 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus, Sauvage 1878). Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ, 38 trang. 28. Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2006. Giáo trình thuốc và hóa chất trong nuôi trồng Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 29. Lê Xuân Sinh và ctv, 2006. Đánh giá sự tiếp nhận và ảnh hưởng của các thông tin liên quan đến việc quản lý sức khoẻ cá tra (pangasius hypophthalmus) nuôi ở An Giang. Dự án DFID. Trang 15-17. 30. Lê Xuân Sinh và Nguyễn Thị Phương Nga, 2005. Những nhận xét cơ bản liên quan tới việc cung cấp và sử dụng hoá chất và thuốc cho nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Báo cáo hội nghị khoa học về nuôi trồng thủy sản toàn quốc. Vũng Tàu 22-24/12/2005. 31. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản- Trường Đại học Cần Thơ, 47 trang. 32. Mygolomba, T.N. and J.A. Plumb, 1992. Longevity of E. ictaluri in the organs of experimentally infected channel catfish, Ictalurus puntatus. Aquaculture. 100: 1-6. 33. Nguyễn Phú Son và ctv, 2003. Nghiên cứu thị trường cá tra, cá basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Dự án nghiên cứu hợp tác giữa Đại học Stirling – Scotland và Đại học Cần Thơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 34. Nguyễn Quốc Thịnh, 2002. Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại học-Khoa Nông Nghiệp-Đại học Cần Thơ. 35. Nguyễn Quốc Thịnh, 2006. Điều tra đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng thuốc và hóa chất trong quá trình nuôi cá tra bè. Khoa Thuỷ Sản- Đại học Cần Thơ. 36. Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008. Điều tra hiện trạng nuôi, bệnh và tình hình sử dụng thuốc-hóa chất trong nuôi thâm canh cá tra ao (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản- Đại học Cần Thơ, 84 trang. 37. Nguyễn Thanh Phương, Phạm Minh Đức, Vũ Nam Sơn và Trần Văn Bùi, 2004. Báo cáo tổng quan ứng dụng công nghệ nhằm nâng cao chất lượng và hạ giá thành sản phẩm thủy sản (Tôm càng xanh, Cá tra, Cá basa và Cá rô phi) ở tỉnh An Giang. Sở khoa học & Công nghệ và Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 38. Nguyễn Thị Tiên, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc của mầm bệnh vi khuẩn phân lập trên tôm sú (Penaeus monodon) bệnh phân trắng. Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 48 trang. 39. Nguyễn Trúc Phương, 2008. Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và API 20E. Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 42 trang. 40. Nguyễn Văn Kiểm, 2004. Giáo trình kỹ thuật sản xuất cá giống-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ. 41. Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004. Nghiên cứu một số ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở ĐBSCL. Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ, 47 trang. 42. Plumb, J.A. and Sanchez, D.J, 1983. Susceptibility of five species of fish to Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Disease. 6, 261-266. 43. Plumb, J.A., 1999. Edwardsiella Septicaemias. Fish diseases and disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal infections. 44. Reger. P.J., D.F. Mockler, and M.A. Miller. 1993. Comparison of antimicrobial susceptibility beta-lactamase production, plasmid analysis PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 and serum bactericidal activity in Edwardsiella tarda, E. ictaluri and E. hoshinae. J. Med. Microbitol. 39: 273-281. 45. Shotts, E.B. and Waltman. W. D.,, 1986. Antimicrobial susceptibility of Edwardsiella ictaluri, Journal of U’ildife Disrasrs. 21 (21.1986), pp173-177. 46. Stock, I., and Bernd Wiedemann, 2001. Natural Antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E. ictaluri and E. hoshinac. Antibiomicrobial Agenrs and chemotherapy, Aug, 2001, P.2245-2255. 47. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản, 2008. Bộ môn sinh học và bệnh thủy sản-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ, 52 trang. 48. Trần Linh Phước, 2003. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. Nhà Xuất Bản Giáo Dục. 49. Trần Thị Hồng Tơ, 2004. Khảo sát một số giống vi khuẩn trong 4 mô hình nuôi thủy sản ở thành phố Cần Thơ và tính nhạy cảm của chúng với kháng sinh. Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 20 trang. 50. Trương Quốc Phú, 2004. Bài giảng quản lý chất lượng nước ao nuôi thủy sản. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 51. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 52. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142. 53. Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006. Bài giảng thực hành bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 PHỤ LỤC Phụ lục 1: thành phần hóa chất các chỉ tiêu thực phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống v Nhuộm Gram Cho một giọt nước muối sinh lý lên lame. Dùng que cấy triệt trùng lấy một ít khuẩn lạc trãi đều lên lame. Để lame khô tự nhiên. Hơ lướt lame lên ngọn đèn cồn để cố định vi khuẩn, để nguội. Nhuộm Crystal violet (dung dịch 1) khoảng 1 phút, rửa lame bằng nước. Nhuộm iodine (dung dịch 2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước. Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone (dung dịch 3) từ 2-3 giây. Rửa lame lại bằng nước sạch. Nhuộm safranin (dung dịch 4) khoảng 2 phút, rửa lại bằng nước sạch và để khô. Quan sát lame trên kính hiển vi quang học (40X và 100X) Vi khuẩn Gram (+): màu xanh / tím. Vi khuẩn Gram (-): màu hồng v Tính di động Cho Vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngữa lamelle lên bàn. Dùng pipet tiệt trùng nhỏ một giọt nước cất (hoặc nước muối sinh lý) lên lamelle. Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc hòa tan vào giọt nước muối trên lamelle. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn. Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X v Phản ứng Oxidase Chạm nhẹ que thử oxidase vào một khuẩn lạc trên đĩa agar hoặc dùng que cấy nhặt một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxidase. Quan sát que thử trong 30 giây và quan sát sự thay đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính (+) và không chuyển màu là âm tính (-). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 v Phản ứng Catalase Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên lame. Dùng que cấy triệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3% Phản ứng Catalase dương tính khi có hiện tượng sủi bọt và ngược lại catalase âm tính không sủi bọt. v Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F test) Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F đã tiệt trùng. Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F, sau đó phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào một ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (F), ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (O). Để 2 ống nghiệm vào trong tủ ấm 28oC. Đọc kết quả sau 1-7 ngày Lên men (F) khi ống có phủ dầu paraffin chuyển màu vàng. Oxy hóa (O) khi ống không có phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng Không phản ứng khi 2 ống nghiệm đều màu xanh. Bảng 3.3: Bảng kiểm tra kết quả test O/F Ống tiếp xúc không khí Ống phủ dầu paraffin Kết quả Xanh lá cây Xanh lá cây Không phản ứng với glucose Xanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính Vàng Xanh lá cây Phản ứng oxy hóa Vàng Vàng Phản ứng lên men v Khả năng sinh H2S Các bước thực hiện: 1. Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất). 2. Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. 3. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội ở 45oC. 4. Cho khoảng 5ml môi trường vào ống nghiệm. 5. Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở 28oC. Đọc kết quả sau 14-28 giờ Vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose và Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)). Vi khuẩn chỉ lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)). Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)). Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm. v Khả năng sinh indole Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội. 3. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 28oC. 4. Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. v Phản ứng Decarboxylase 1. Môi trường Decarboxylase. Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có amino acid. 2. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. 3. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. 4. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm. Sau đó phủ lên mỗi ống 0,5 ml paraffin tiệt trùng. Để trong tủ ấm ở 28oC. 5. Đọc kết quả từ 1-4 ngày. Phản ứng dương tính khi các ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu của ống đối chứng và ngược lại. v Phản ứng Voges-Proskauer (VP) 1. Môi trường MR-VP broth 2. Cho 3ml môi trường vào trong ống nghiệm. 3. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội. 4. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 28oC. 5. Sau 48 giờ nhỏ 0,6 ml dung dịch thuốc thử A và 0,2 ml dung dịch thuốc thử B vào ống nghiệm. 6. Lắc đều và để ống nghiệm 30 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 7. Đọc kết quả: phản ứng dương tính khi có màu hồng của môi trường xuất hiện, và ngược lại. Thuốc thử: A: Hòa tan 5g alpha naphthol trong 100 ml ethyl alcohol. B: Hòa tan 40g KOH trong 100 ml nước cất. v Khả năng sử dụng Citrate 1. Môi trường Simmon’s Citrate agar. 2. Đun sôi và khuấy cho tan. 3. Cho 5ml môi trường vào ống nghiệm và thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. 4. Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. 5. Cấy vi khuẩn trên mặt nghiêng của ống nghiệm, ủ trong tủ ấm 28oC. 6. Đọc kết quả sau 2-7 ngày. Vi khuẩn sử dụng citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường Simmon’s citrate agar và ngược lại. v Khả năng sử dụng Ure 1. Môi trường 0,1% Pepton + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% Phenol red + 0,1% Glucose, thêm 2% Urea cho phản ứng. Môi trường đối chứng không có urea. 2. Cho 3 ml môi trường vào trong ống nghiệm. 3. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. 4. Cấy một ít vi khuẩn vào trong hai ống nghiệm. Để trong tủ ấm 28oC. 5. Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Phản ứng dương tính khi các ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng. v Khả năng sử dụng các loại đường 1. Môi trường: Các dung dịch đường Glucose, Sucrose, Sorbitol, Inositol, Arabinose, Rhamnose, Trehalose. 2. Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm. Ủ trong tủ ấm ở 28oC. 3. Sau 48 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi ống nghiệm chuyển sang màu vàng và ngược lại. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 Bảng 3.4: Các chỉ tiêu định danh E. ictaluri bằng phương pháp sinh hóa truyền thống. STT Chỉ tiêu test 1 Nhuộm Gram 2 Hình dạng 3 Oxidase 4 Catalase 5 Khả năng lên men 6 Tính di động 7 Arginine 8 Lysin 9 Ornithine 10 Khả năng sử dụng nitrate 11 Khả năng sử dụng citrate 12 Khả năng sinh H2S 13 Khả năng sinh urea 14 Khả năng sinh indole 15 Phản ứng VP Khả năng sử dụng các loại đuờng 16 Arabinose 17 Glucose 18 Innositol 19 Mannitol 20 Rhamnose 21 Sorbitol 22 Sucrose PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 Phụ lục 2 Các bước chuẩn bị và thực hiện kiểm tra API 20E Xác định các chỉ tiêu cơ bản như ở trên. Các bước chuẩn bị - Cho một ít nước cất hoặc nước máy vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm trong quá trình ủ trong tủ ấm. - Đặt kít API vào khay nhựa - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều. Các bước thực hiện - Dùng pipet tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào các ô CIT, VP và GEL. - Tương tự cho vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE. Tiếp theo cho dầu paraffin tiệt trùng vào phần lõm của các ô này. - Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 28oC và đọc kết quả sau 48 giờ. Đọc kết quả + Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử - TDA: nhỏ một giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết quả sau vài giây. Nếu có một màu nâu đỏ nhạt xuất hiện cho phản ứng dương tính (+), màu vàng cho phản ứng âm (-). - IND: cho một giọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết quả sau vài giây. Nếu có màu hồng xuất hiện cho phản ứng dương tính (+), màu vàng hoặc màu xanh nhạt xuất hiện cho phản ứng âm tính (-). - VP: nhỏ một giọt thuốc thử VP1 sau đó cho một giọt VP2 vào ô VP, đọc kết quả sau 10-15 phút. Màu hồng hoặc màu đỏ xuất hiện cho phản ứng dương tính (+), không có màu xuất hiện cho phản ứng âm tính (-). + Các chỉ tiêu còn lại không cần sử dụng thuốc thử, kết quả được đọc dựa vào bảng chỉ tiêu. · Sau khi cho thuốc thử vào các ô TDA, IND và VP đậy nắp khay nhựa lại. · Khi cho thuốc thử vào các chỉ tiêu trên không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 Bảng 3.5: Cách đọc kết quả bộ kít API STT Chỉ tiêu Thành phần Âm tính Dương tính 1 ONPG Ortho-notrophenyl galactoxydase Không màu Vàng 2 ADH Arginine Vàng Đỏ/ cam 3 LDC Lysine Vàng Đỏ/ cam 4 ODC Ornithine Vàng Đỏ/ cam 5 CIT Sodium citrate Xanh nhạt/ vàng Xanh lá cây/ xanh biển 6 H2S Sodium thiosulphate Không màu/ xám nhạt Đen 7 URE Urea Vàng Đỏ/ cam 8 TDA L-Tryptophane Vàng Nâu đỏ nhạt 9 IND L-Tryptophane Xanh nhạt/ vàng Hồng 10 VP Sodium Pyruvate Không màu Hồng/ đỏ 11 GEL Gelatin Không xuất hiện màu đen Khuếch tán màu đen 12 GLU D-glucose Xanh/ xanh lá cây Vàng 13 MAN D-mannitol Xanh/ xanh lá cây Vàng 14 INO Innositol Xanh/ xanh lá cây Vàng 15 SOR D-sorbitol Xanh/ xanh lá cây Vàng 16 RHA L-rhamnose Xanh/ xanh lá cây Vàng 17 SAC D-sucrose Xanh/ xanh lá cây Vàng 18 MEL D-melibiose Xanh/ xanh lá cây Vàng 19 AMY Amygdalin Xanh/ xanh lá cây Vàng 20 ARA L-arabinose Xanh/ xanh lá cây Vàng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 Phụ lục 3 Bảng 4.6 Dấu hiệu bên trong và bên ngoài của các mẫu cá ST T KH mẫu Dấu hiệu bên ngoài Dấu hiệu bên trong Chất dịch trong cơ thể Cơ quan phân lập G T TT 1 MX2.1 Xuất huyết các vi, da thân, nắp mang Thận và tỳ tạng có đốm trắng x x 2 MX2.2 Xuất huyết các vi, da thân, nắp mang Gan, thận và tỳ tạng có đốm trắng. Gan nhạt màu 3 MX2.3 Xuất huyết cơ bụng, vùng mắt Gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng x x x 4 MX2.4 Xuất huyết các vi, hậu môn, da bụng Thận, tỳ tạng có đốm. Gan tái nhạt Dịch trong x x 5 MX2.5 Xuất huyết vi bụng, hậu môn Bình thường 6 MX2.6 Bình thường Bình thường 7 MX3.1 Xuất huyết các vi, da bụng Thận, tỳ tạng có đốm trắng. Thận bị nhủn. Dịch trong 8 MX3.2 Xuất huyết các vi G-T-TT có đốm trắng Dịch trong 9 MX3.3 Xuất huyết vi bụng G-TT có đốm. Thận nhủn. Gan nhạt màu Dịch trong x x x 10 MX3.4 Xuất huyết các vi, da bụng G-TT có đốm trắng. Thận nhủn Dịch trong x 11 MX3.5 Xuất huyết các vi, miệng Bình thường 12 MX3.6 Xuất huyết các vi Bình thường 13 MX4.1 Bình thường Gan trắng nhạt. Bóng hơi sưng. TT có đốm trắng Dịch trong 14 MX4.2 Bình thường Gan trắng nhạt. Bóng hơi sưng Dịch trong 15 MX4.3 Xuất huyết vi ngực, vi bụng Gan trắng nhạt 16 MX4.4 Bình thường Gan trắng nhạt Dịch trong 17 MX4.5 Xuất huyết các vi Bình thường 18 MX4.6 Xuất huyết vi bụng, đuôi Bóng hơi sưng 19 MX5.1 Xuất huyết vi ngực, da bụng Thận nhủn. TT có đốm. x 20 MX5.2 Xuất huyết các vi G-T-TT có đốm Dịch vàng x x x 21 MX5.3 Xuất huyết các vi G-TT có đốm. Thận nhủn. Bóng hơi trương to x x 22 MX5.4 Xuất huyết các vi, da bụng Gan trắng nhạt. TT có đốm PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 23 MX5.5 Xuất huyết vi hậu môn Bình thường 24 MX5.6 Xuất hưyết miệng Bình thường 25 MX13.1 Vi bị ăn mòn đến hậu môn Thận nhủn, có đốm trắng. TT sưng Dịch trong x x 26 MX13.2 Cơ đuôi bị ăn mòn Thận có đốm trắng x x 27 MX13.3 Xuất huyết các vi. Đuôi bị ăn mòn T-TT có đốm trắng Dịch trong, có mùi hôi 28 MX13.4 Đuôi bị ăn mòn G-T-TT có đốm trắng Dịch trong có mùi hôi x x 29 MX13.5 Xuất huyết các vi Bình thường 30 MX13.6 Bình thường Bình thường 31 CA1.1 Bình thướng Gan trắng nhạt 32 CA1.2 Xuất huyết các vi Xuất huyết thành bụng x x 33 CA1.3 Xuất huyết da bụng Gan nhạt Dịch trắng đục và hôi x x 34 CA1.4 Bình thường Gan vàng Dịch vàng 35 CA1.5 Bình thường Xoang bụng có mùi hôi 36 CA1.6 Bình thường Thận có đốm trắng 37 CA2.1 Bình thường G-T có nhiều đốm trắng x x 38 CA2.2 Bình thường Thận có đốm trắng. Bóng hơi sưng Dịch trong 39 CA2.3 Bình thường G-T có đốm trắng Dịch vàng x 40 CA2.4 Bình thường Gan trắng nhạt. Thận có đốm trắng 41 CA2.5 Bình thường Gan nhạt màu 42 CA2.6 Bình thường Bình thường 43 CA3.1 Bình thường G-T-TT có đốm trắng x x x 44 CA3.2 Xuất huyết các vi G-T có đốm trắng x x 45 CA3.3 Bình thường G-T có đốm trắng. Thận trước sưng 46 CA3.4 Bình thường G-T-TT có đốm trắng. Bóng hơi sưng Dịch vàng x x 47 CA3.5 Bình thường Gan nhạt màu. Xoang bụng có mùi hôi 48 CA3.6 Bình thường Bình thường 49 CA4.1 Xuất huyết các vi. Mang nhạt màu Gan có đốm trắng. T-TT sưng x x x 50 CA4.2 Xuất huyết da bụng Gan nhạt màu. T-TT có đốm trắng Dịch vàng x x x 51 CA4.3 Xuất huyết thân G-T-TT có đốm trắng x 52 CA4.4 Xuất huyết thân, G-T-TT có đốm x x x PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 bụng trắng. T-TT sưng 53 CA4.5 Bình thường Bình thường 54 CA4.6 Xuất huyết vi đuôi, quanh miệng Bình thường 55 CS1.1 Xuất huyết nhẹ. Vi đuôi bị đứt ngang Xuất huyết nội quan 56 CS1.2 Cơ bị thối rửa Xuất huyết thành bụng Dịch có mùi hôi 57 CS1.3 Lở loét toàn thân Thận nhủn 58 CS1.4 Xuất huyết các vi Gan có đốm trắng Dịch trong 59 CS2.1 Lở loét, xuất huyết các vi Gan nhủn, có đốm trắng Dịch nhày, có mùi hôi 60 CS2.2 Vi đuôi bị đứt, xuất huyết các vi G-T-TT có đốm trắng Dịch trong x x x 61 CS2.3 Lở loét nặng. Xuất huyết các vi Gan tái nhạt. TT sưng 62 TT1.1 Bình thường G-T-TT có đốm trắng Dịch vàng x x 63 TT1.2 Bình thường Gan có màu không đồng nhất. T-TT có đốm trắng Dịch vàng x x 64 TT1.3 Xuất huyết hậu môn G-T-TT có đốm trắng. Thận nhủn. Ruột sưng x x x 65 TT1.4 Xuất huyết vi lưng G-T-TT có đốm trắng Dịch vàng x x 66 TT1.5 Bình thường Bình thường 67 TT1.6 Bình thường Bình thường 68 TT2.1 Xuất huyết nắp mang, phù mắt Gan nhạt màu 69 TT2.2 Xuất huyết các vi Gan nhạt màu 70 TT2.3 Bình thường Gan nhạt màu. Thận có đốm trắng Dịch vàng x x x 71 TT2.4 Bình thường G-T-TT có đốm trắng Dịch vàng x x 72 TT2.5 Bình thường Gan nhạt màu 73 TT2.6 Bình thường Bình thường 74 SD1.1 Bình thường Gan nhạt màu. T-TT có đốm Dịch trong x x x 75 SD1.2 Bình thường Gan nhạt màu. T-TT có đốm trắng Dịch vàng x x x 76 SD1.3 Xuất huyết vi hậu môn Gan nhạt. Thận nhủn. TT có đốm trắng Dịch trong x x 77 SD1.4 Bình thường T-TT có đốm trắng x x x 78 SD1.5 Bình thường Gan nhạt màu. Thận có đốm trắng 79 SD1.6 Bình thường Gan nhạt màu. Thận sưng, có đốm trắng Dịch màu hồng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 43 80 SD2.1 Bình thường Gan nhạt màu. Nội quan xuất huyết 81 SD2.2 Sưng hầu Bình thường 82 SD2.3 Xuất huyết các vi G-T-TT có đốm trắng Dịch vàng x 83 SD2.5 Bình thường Bóng hơi trương to 84 SD2.6 Bình thường Gan nhạt màu 85 SD3.1 Xuất huyết các vi Bóng hơi trương to 86 SD3.2 Xuất huyết các vi Gan nhạt màu 87 SD3.3 Xuất huyết các vi Gan nhạt màu Dịch vàng 88 SD3.5 Xuất huyết các vi Gan, thận nhạt màu 89 SD3.6 Xuất huyết các vi. Đuôi bị ăn mòn Gan nhạt màu 90 TN1.1 Phù mắt, hàm dưới sưng, xuất huyết quanh mắt Xuất huyết nội tạng. Gan có đốm trắng 91 TN1.2 Xuất huyết thân, da bụng Thận có đốm trắng Dịch vàng x x 92 TN1.3 Bình thường T-TT có đốm trắng. Gan nhạt màu Dịch vàng x x x 93 TN1.4 Bình thường Bình thường 94 TN1.5 Xuất huyết các vi, da bụng Bình thường 95 TN1.6 Xuất huyết da bụng, hậu môn Bình thường 96 TN2.1 Xuất huyết các vi, hầu, hốc mắt Xuất huyết nội tạng Dịch có mùi hôi 97 TN2.2 Trắng các vi G-T có đốm trắng x x x 98 TN2.3 Xuất huyết da bụng, hậu môn Xuất huyết cơ bụng Dịch có mùi hôi 99 TN2.4 Xuất huyết hầu, vi ngực. Phù mắt Xuất huyết trên ruột 100 TN2.5 Xuất huyết thân Bình thường 101 TN2.6 Bình thường Bình thường Dịch vàng Ghi chú : G: Gan T: Thận TT: Tỳ tạng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version