Xác định hóa chất bảo vệ thực vật carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

p khuếch tán trên nền pha rắn diatomaceous (tảo cát) và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan = 1:1 tốc độ 5ml/phút. Phương pháp có độ thu hồi 70 – 110% và hệ số biến thiên từ 1,62 – 18,3% với khoảng nồng độ 0,01 – 0,2mg/kg. [33] Phương pháp sắc ký khí đã được ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật như các chất clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat. Tuy nhiên phương pháp chỉ phân tích được những chất dễ bay hơi, còn các chất khó bay hơi thì phải tạo dẫn xuất nên tốn thời gian và hóa chất. Hơn nữa, để phân tích được đồng thời các chất thì cần thời gian phân tích dài. Do vậy, phương pháp ít được ứng dụng để phân tích carbamat. 1.3.7. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Gianni Sagratini và cộng sự [19] đã xác định dư lượng thuốc trừ sâu carbamat và phenylure trong một số loại quả bằng phương pháp vi chiết pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ. Điều kiện chiết mẫu tối ưu ở nhiệt độ 20°C, thời gian hấp phụ mẫu là 90 phút và thể tích mẫu 1ml. Các sợi silica được phủ 3 loại chất hấp phụ: cacbowax 50µm, polydimetylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) 60µm và polyacrylat 85µm. Giới hạn định lượng của phương pháp từ 0,005 – 0,05µg/ml, tùy thuộc từng chất. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu quả. Xác định đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat và lân hữu cơ trong rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Mẫu được chiết bằng acetonitril, sau đó được tách bằng cách chiết pha rắn khuếch tán (dispersive – SPE) với chất hấp phụ là primary secondary amine (amin bậc một hai). Hiệu suất thu hồi cao, từ 70 – 110% với RSD < 8%. Giới hạn phát hiện thấp 0,5 – 10ng/ml, túy thuộc từng chất. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong rau quả. Trong 25 mẫu rau quả được lấy từ các chợ, gần 70% mẫu chứa một hoặc vài loại thuốc trừ sâu, trên 30% mẫu còn lại chứa nhiều loại thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, tất cả các nồng độ thuốc trừ sâu tìm thấy đếu thấp hơn giới hạn cho phép.[29] Xác định dư lượng carbamat trong rau quả bằng phương pháp khuếch tán trên nền pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ. Mẫu được chiết trên nền các pha rắn khác nhau: C8, C18, NH2, CN và phenyl. Hiệu suất chiết tốt nhất trên nền pha rắn C8 đạt từ 64 – 106% với RSD 5 – 15%. Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,001 – 0,01mg/kg, thấp hơn giới hạn cho phép của châu Âu từ 10 – 100 lần. Phương pháp được ứng dụng để xác định carbamat trong các mẫu rau quả tại các chợ ở Valencian.[30] Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây. Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ. Phương pháp này tuy mới ra đời nhưng nó được ứng dụng rộng rãi để phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamat. Phương pháp có thể phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau. Phương pháp có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được. Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để nghiên cứu xác định đồng thời các chất carbamat. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Hiện nay, nhiều người nông dân đã lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều mẫu rau vượt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá như cải ngọt, mồng tơi, cải bẹ xanh, cải bắp, cải thảo, rau muống, dưa leo…Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong các loại rau quả quá cao đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường và sức khỏe con người, là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Do đó, đối tượng nghiên cứu là một số loại rau như rau cải, rau thơm, rau rền, bắp cải, và một số loại quả như cam, lê, táo, quýt… Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời các chất carbamat trong rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối-phổ khối phổ LC/MS/MS. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau: 2.1.2.1 Xây dựng phương pháp Khảo sát phương pháp bao gồm: Điều kiện tách chiết mẫu Điều kiện chạy máy Thẩm định phương pháp: Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ Khoảng tuyến tính Độ chụm (độ lặp lại) Độ đúng (độ chệch, độ thu hồi) 2.1.2.2. Ứng dụng phương pháp Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định tồn dư thuốc bảo vệ thực vật họ carbamat trong một số loại rau và quả trên địa bàn Hà Nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn này là các loại rau củ, có nền mẫu phức tạp. Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện. Trong bản luận văn này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng để tách chiết và làm giàu mẫu. Thông thường, phương pháp này sử dụng hai pha lỏng không trộn lẫn. Tuy nhiên, chúng tôi sử dụng một loại hạt nhồi là kieselguhr như chất mang trong sắc ký phân bố lỏng – lỏng. Kieselguhr hay còn gọi là diatomaecous earth (đất diatomit) hay Celite, có màu trắng ngà, có khoảng pH làm việc rộng từ 1 – 13. Nó được sử dụng để chiết lỏng – lỏng các mẫu thực phẩm mà không cần dùng đến phễu chiết. Mẫu sau khi chiết bằng dung môi phân cực ở dạng lỏng được đưa qua cột đã nhồi hạt kieselguhr và được giữ lại ở trên cột. Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng dung môi không phân cực. Sử dụng cột nhồi hạt kieselguhr có ưu điểm hơn so với chiết lỏng – lỏng thông thường như thời gian chiết nhanh hơn, không cần phải mất thời gian để tách lớp, lượng dung môi sử dụng rửa giải ít hơn nhiều, có độ thu hồi và độ lặp lại cao. 2.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 2.2.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Sơ đồ cấu tạo thiết bị HPLC được chỉ ra ở hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có tính đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng – lỏng và sắc ký trao đổi lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn… 2.2.2.2. Pha tĩnh trong HPLC Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC) Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN...), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluene....Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực. Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril....Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực . 2.2.2.3. Pha động trong HPLC Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được các điều kiện sau: Pha động phải trơ với pha tĩnh. Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững và không bị phân hủy trong quá trình chạy sắc ký. Pha động phải có độ tinh khiết cao. Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký. Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. Pha động phải không quá đắt. Có thể chia pha động làm hai loại: Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như MeOH, ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược. Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene....Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ. 2.2.2.4. Detector trong HPLC Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp. Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS). Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang. Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp.... Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như diot-aray, mass spectrometry, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kĩ thuật tin học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích. 2.2.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất. Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ. 2.2.2.5.1. Nguồn ion Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dưới đây là hai phương pháp ion hóa được sử dụng trên thiết bị Finnigan LCQDUO: a) Ion hóa phun điện tử – ESI Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm. Hình 2.2. Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ. b) Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – APCI Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm. APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình. Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương. Hình 2.3. Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500°C. Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa chất phân tích. Đối với kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương, sự ion hóa mẫu được thực hiện qua 3 giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: Giai đoạn thứ hai: Giai đoạn thứ ba: APCI là một kĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm chạy và nồng độ đệm. Nó được sử dụng để ion hóa các chất có khối lượng phân tử nhỏ (có khối lượng phân tử < 2000u). 2.2.2.5.2. Bộ phận phân tích khối lượng a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser) Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này. b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới. Trái với lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ. Các ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu được các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần. c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser) Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng ion có thể phân tích không bị hạn chế. 2.2.2.5.3. Bộ phận phát hiện Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang. Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn. 2.3. Phương tiện nghiên cứu 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ 2.3.1.1. Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS của Thermo bao gồm: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS. Cột sắc ký C18 của Water (150mm × 4,6mm × 5μm). Máy lắc vortex. Máy đồng nhất mẫu. Máy li tâm MIKRO 22R. Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg). Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g). Máy cất quay chân không Eyela. 2.3.1.2. Dụng cụ Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml. Bình định mức: 5, 10, 50, 100ml. Ống li tâm 50ml Cột nhồi kieselguhr. Bình cô quay 100ml Vial loại 1,8ml. Pipet pasteur. Ống đong, phễu, giấy lọc. Pietman loại 200µl và đầu côn. 2.3.3. Dung môi, hóa chất Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết. Chuẩn carbamat gồm: carbofuran, propoxur, carbaryl, fenobucarb. Methanol. n-hexan. Diclometan. Amoniacetat CH3COONH4. NaCl. Nước cất 2 lần. * Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l: Cân chính xác 0,1g chất chuẩn lần lượt của từng carbamat, hoà tan cho vào từng bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. Chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C. - Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l: lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc của mỗi carbamat 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. - Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 200µg/l: lấy chính xác 0,2ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol. * Chuẩn bị dung môi pha động - Kênh A: dung dịch acid focmic 0,1% trong nước: lấy chính xác 1ml acid focmic vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất. - Kênh B: methanol. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tối ưu các điều kiện xác định carbamat bằng LC/MS/MS 3.1.1. Chọn các điều kiện chạy của detector khối phổ 3.1.1.1. Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ Các chất carbamat có khối lượng phân tử nhỏ và kém phân cực. Qua tham khảo một số bài báo, chúng tôi khảo sát tiến hành xác định carbamat bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn ion dương. Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng xyranh 500µl bơm từng chuẩn carbamat 1000ppb vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất carbamat, tối ưu hóa từng ion mẹ, ta được điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Tốc độ khí phun = 80 (arb) Tốc độ khí bổ trợ = 10 (arb) Thế phun điện tử = 4kV Nhiệt độ mao quản = 270 °C Trong kĩ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn ion dương, các ion mẹ thường ở dạng (M+1). Tiến hành khảo sát bắn phá các ion mẹ, kết quả như sau: Bảng 3.2. Kết quả bắn phá các ion mẹ Carbamat Khối lượng phân tử M Ion mẹ Carbofuran 221,3 221,98 Propoxur 209,3 210 Carbaryl 201,2 201,84 Fenobucarb 207,3 208,00 Hình 3.1. Phổ khối ion mẹ của carbaryl Hình 3.2. Phổ khối ion mẹ của carbofuran Hình 3.3. Phổ khối ion mẹ của fenobucarb Hình 3.4. Phổ khối ion mẹ của propoxur 3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion con Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao thì cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp. Dùng xyranh 500µl bơm từng chuẩn vào detector và để máy tự động tối ưu hóa mức năng lượng bắn phá ion mẹ để tạo các ion con. Kết quả thu được ở bảng 3.2. Bảng 3.3. Năng lượng bắn phá và các ion con của carbamat Carbamat Ion mẹ Năng lượng bắn phá Collision Energy (%) Ion con Carbofuran 222 48 165 Propoxur 210 45 168, 153 Carbaryl 202 45 145 Fenobucarb 208 37 152 Hình 3.5. Phổ khối ion con của Carbofuran sau khi bắn phá Hình 3.6. Phổ khối ion con của Fenobucarb sau khi bắn phá Hình 3.7. Phổ khối ion con của Propoxur sau khi bắn phá Hình 3.8. Phổ khối ion con của Carbaryl sau khi bắn phá 3.1.2. Chọn pha tĩnh Cột tách là trái tim của hệ sắc ký, nó đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Các chất nhóm carbamat là các chất kém phân cực, do đó cột tách được sử dụng là cột pha đảo. Hơn nữa, chất nhồi pha đảo sử dụng hệ dung môi phân cực có tính kinh tế cao, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để tách các chất carbamat. Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột: Cột Symestry Shield C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm). Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm). 3.1.3. Chọn pha động Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid focmic. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp carbamat 1000ppb để khảo sát thành phần pha động khi có thêm chất trên, các điều kiện chạy máy được cố định như sau: Cột Symestry Shield Water C18 và tiền cột. Detector: khối phổ. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Pha động: kênh B là methanol, kênh A lần lượt là acid focmic 0,1%, acid acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nước. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thành phần pha động Carbamat Diện tích pic St Acid focmic 0,1% Acid acetic 0,1% CH3COONH4 0,1% Carbofuran 88164531 62596017 52548096 Propoxur 8023138 7095289 5289116 Carbaryl 8972544 4205380 3950325 Fenobucarb 5076448 2191283 2239988 Nhận xét: Sử dụng pha động là acid focmic 0,1% cho diện tích pic cao nhất, tăng độ nhạy của phương pháp. Do đó, chúng tôi chọn pha động là methanol và dung dịch acid focmic 0,1% trong nước cho các khảo sát tiếp theo. Trong phương pháp nghiên cứu, pha tĩnh sử dụng là cột C18, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực. Chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn chất tan phân cực. Do tính chất kém phân cực của các chất nhóm carbamat nên chúng tôi chọn pha động trên 2 kênh: Kênh A: dung dịch acid focmic 0,1% trong nước. Kênh B: dung môi methanol. Chọn dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất nhóm carbamat 1000ppb để khảo sát tỉ lệ dung môi, cố định các điều kiện: Cột Symestry Shield Water C18 (150mm x 4,6mm x 5mm). Cột bảo vệ: Symestry Water C18 (20 mm x 3,9 mm x 5mm). Detector: MS/MS. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Thời gian chạy: 30 phút. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi pha động được chỉ ra ở bảng dưới đây. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi pha động tới thời gian lưu. Tỉ lệ pha động Thời gian lưu (phút) % A % B Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb 10 90 3,83 3,78 4,12 4,34 20 80 4,36 4,30 4,91 5,52 30 70 5,29 5,23 6,43 8,29 40 60 7,19 7,27 9,78 15,53 50 50 11,48 11,49 17,82 Không thấy Nhận xét: Từ bảng kết quả trên ta thấy, khi để thành phần pha động chạy với chế độ đẳng dòng isocractic, tỉ lệ methanol càng cao, thời gian lưu càng giảm, các chất không tách ra khỏi nhau. Hơn nữa, khi chất phân tích ra quá sớm, rất dễ bị ảnh hưởng bởi các tạp chất. Ngược lại, khi lượng methanol càng giảm thì thời gian lưu tăng, các chất tách ra khỏi nhau nhưng thời gian chết giữa các chất cũng tăng theo, làm tăng thời gian phân tích và tốn dung môi. Do đó, để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient. Bảng 3.6. Chương trình chạy gradient rửa giải các chất carbamat Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) HCOOH 0,1 % MeOH 0 0,5 90 10 1,0 0,5 50 50 6,0 0,5 20 80 12,0 0,5 0 100 13,0 0,5 0 100 15,0 0,5 90 10 18,0 0,5 90 10 Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau: Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm). Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm). Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid focmic 0,1% trong nước, kênh B là dung môi MeOH. Chương trình chạy gradient ở bảng 3.6. Tốc độ dòng 0,5ml/phút. Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3. 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát lập đường chuẩn Lập đường chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phương pháp phân tích. Từ đường chuẩn ta có thể biết được khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đưa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 20ppb đến 1500ppb từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm và chuẩn trung gian 10ppm. Các dung dịch chuẩn được pha trong methanol. Sau đó đem đo ở các điều kiện như đã tối ưu ở trên, kết quả thu được ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ carbamat Nồng độ C (ppb) Diện tích píc Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb 20 1818855 50 4323952 390301 385265 212190 100 8848970 742948 643172 393640 200 17287122 1577384 1181737 814165 500 38708909 3668940 3127832 1923068 1000 75531554 7089406 6399387 4013364 1500 95077738 8595550 8192473 5140543 Hình 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Fenobucarb và đường chuẩn của Fenobucarb Hình 3.10. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Carbaryl và đường chuẩn của Carbaryl Hình 3.11. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Propoxur và đường chuẩn của Propoxur Hình 3.12. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Carbofuran và đường chuẩn của Carbofuran Hình 3.13. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 500ng/g Từ các đồ thị trên ta thấy, từ nồng độ trên 1000ppb thì mối quan hệ giữa diện tích pic và nông độ các chất carbamat không còn tuyến tính nữa. Như vậy, giới hạn tuyến tính của cacbofuran, propoxur, carbaryl và fenobucarb là 1000ppb. 3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD [10] Giới hạn phát hiện LOD được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Để xác định giới hạn phát hiện, chúng tôi dùng chuẩn hỗn hợp 50ppb rồi tiến hành pha loãng cho tới khi thu được chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Kết quả thu được như sau: giới hạn phát hiện của carbofuran là 5ng/ml; giới hạn phát hiện của carbaryl, propoxur và fenobucarb là 15ng/ml. Hình 3.14. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 15ng/ml Hình 3.15. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 5ng/ml 3.2.3. Giới hạn định lượng LOQ [10] Giới hạn định lượng LOQ được xem là nồng độ thấp nhất mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Theo lí thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ = 3,33 LOD. Do đó, giới hạn định lượng của carbofuran là 20ng/ml còn giới hạn định lượng của carbaryl, fenobucarb và propoxur là 50ng/ml. 3.2.4. Độ chính xác của phép đo Theo ISO, độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Sai số được tính theo công thức: Trong đó: %X : Sai số phần trăm tương đối. Si : giá trị diện tích pic đo được. St : giá trị diện tích pic tìm được theo đường chuẩn. n : số lần đo. Độ lặp lại của phép đo được xác định theo các đại lượng S2 và CV. Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình. n : số lần đo. S : độ lệch chuẩn. CV : hệ số biến động của phép đo. Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo ta dựng đường chuẩn, pha 3 mẫu có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính. Thực hiện đo mỗi mẫu 4 lần. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau Nồng độ (ppb) Diện tích pic Si Diện tích pic St %Xtb CV (%) Lần đo 1 2 3 4 50 Carbofuran 4462544 4479553 4710802 5088066 4864153 6,0 6,2 Propoxur 407756 401130 413389 465694 441555 7,2 7,0 Carbaryl 312599 317887 306848 273725 292517 6,7 6,6 Fenobucarb 213922 185829 207264 212625 194482 7,6 6,4 500 Carbofuran 38651499 39116327 39580072 39847129 38708909 1,6 1,3 Propoxur 3617105 3727622 3748831 3681568 3668940 1,4 1,6 Carbaryl 3098305 3230757 3206597 3173917 3127832 2,1 1,8 Fenobucarb 1957011 1908327 1961337 1943537 1923068 1,4 1,2 1000 Carbofuran 76364091 76360700 74430251 74136751 75531554 1,4 1,6 Propoxur 7054760 6944509 6924225 7523589 7089406 2,7 3,9 Carbaryl 6683924 6255124 6552468 6959715 6399389 4,5 4,4 Fenobucarb 4266145 4099357 3972133 4202736 4013364 3,5 3,1 Nhận xét: Phần trăm sai số và hệ số biến thiên CV của phép đo tại 3 mức nồng độ 50ppb, 500ppb và 1000ppb có giá trị từ 1,2 – 7,6% đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. 3.3. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu Các chất carbamat đều có độ phân cực kém, tan nhiều trong dung môi ít phân cực. Do đó, chúng tôi tiến hành tách chiết carbamat theo nguyên tắc sau: các chất carbamat được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung môi methanol, sau đó được làm sạch qua cột kieselguhr và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ. Qui trình dự kiến chiết carbamat: Mẫu /ống li tâm 50ml + thêm chuẩn hỗn hợp 4 carbamat + MeOH Lắc vortex Đồng nhất Lọc / bình định mức 50ml Li tâm 6000 v/ph, 5 phút Cho 20ml qua cột Kieselguhr Rửa giải Cô quay /40°C đến cạn LC/MS/MS + định mức bằng NaCl bão hòa Hòa cặn bằng 1ml MeOH 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết Để tách chiết các chất carbamat khỏi nền mẫu, chúng tôi sử dụng dung môi Methanol : H2O với các tỉ lệ khác nhau. Hút chính xác 0,5ml dung dịch chuẩn hỗn hợp carbamat 1000ppb cho vào các bình định mức 50ml. Thêm vào các bình 40ml dung môi methanol : H2O với các tỉ lệ khác nhau và định mức bằng dung dịch NaCl bão hòa rồi lắc đều. Hút chính xác 20ml dung dịch trên cho qua cột kieselguhr. Mẫu được rửa giải, đem cô quay đến cạn và hòa cặn bằng 1ml methanol rồi đem đo LC/MS/MS. Kết quả thu được như sau: Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết đối với các chất carbamat MeOH:H2O mlt (ng) Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb 1:1 200 4483543 665262 240667 310632 Spic 52,5 72,5 41,2 68,9 mtt(ng) 26,3 37,7 20,6 34,5 R (%) 2:1 200 15655765 1690891 1039212 817610 Spic 183,4 191,9 177,8 181,4 mtt(ng) 91,7 95,9 88,9 90,7 R (%) 3:1 200 16414779 1628490 1010188 839404 Spic 192,3 184,8 172,8 186,3 mtt(ng) 96,1 92,4 86,4 93,1 R (%) 4:1 200 13946052 1174001 969756 496001 Spic 163,4 133,2 165,9 110,1 mtt(ng) 81,7 66,6 83,0 55,0 R (%) Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết carbamat vào tỉ lệ dung môi chiết Nhận xét: Tại tỉ lệ dung môi MeOH:H2O = 2:1 và 3:1 thì hiệu suất chiết là tốt nhất. Do đó, chúng tôi chọn tỉ lệ MeOH:H2O = 2:1 để tiết kiệm dung môi MeOH cho các lần khảo sát sau. 3.3.2. Khảo sát dung môi rửa giải Đối tượng nghiên cứu là các mẫu rau quả có nền mẫu phức tạp. Do đó, cần phải có quá trình làm sạch mẫu trước khi bơm vào máy. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng cột kieselguhr để làm sạch mẫu. Carbamat được chiết theo quy trình như ở trên và được rửa giải bằng các dung môi khác nhau: hexan, diclometan và etylacetat. Kết quả thu được ở bảng dưới. Bảng 3.10. Kết quả khảo sát loại dung môi rửa giải đối với các chất carbamat Dung môi mlt (ng) Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb Hexan 400 7014554 869221 933158 1371602 Spic 90,8 112,9 178,8 385,1 mtt(ng) 22,7 28,2 44,7 96,3 R (%) Diclometan 400 27420193 2582414 1853667 1054473 Spic 354,8 335,3 355,1 296,0 mtt(ng) 88,7 83,8 88,8 74,0 R (%) Etylacetat 400 Không hòa tan được Nhận xét: Từ kết quả trên ta thấy, khi rửa giải carbamat bằng 3 loại dung môi khác nhau, hiệu suất thu hồi đối với diclometan là tốt nhất, với hexan thì thấp hơn còn etylacetat sau khi cô quay xuất hiện nhiều kết tủa bám lên thành bình. Có thể do dung môi etylacetat rửa giải được nhiều chất hơn diclometan và hexan. Độ thu hồi của carbofuran, carbaryl và propoxur tương đối cao khi dùng diclometan còn fenobucarb thì độ thu hồi tốt hơn khi dùng hexan. Do đó, chúng tôi đã sử dụng cả 2 dung môi trên để rửa giải carbamat. Để có được độ thu hồi tốt nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải hexan : diclometan như sau: carbamat được chiết như quy trình ở trên và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan ở các tỉ lệ khác nhau. Kết quả thu được ở bảng dưới. Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với các chất carbamat Diclometan:hexan mlt (ng) Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb 1:2 200 15265216 1715528 1034817 603147 Spic 187,4 191,8 151,0 158,1 mtt(ng) 93,7 95,9 75,5 79,1 R (%) 1:1 200 15528417 1621848 1257159 718201 Spic 190,7 181,3 183,5 188,3 mtt(ng) 95,3 90,7 91,7 94,1 R (%) 2:1 200 15023256 1592201 992548 493364 Spic 184,5 178,0 144,9 129,3 mtt(ng) 92,2 89,0 72,4 64,7 R (%) 3:1 200 14922541 1430625 1072136 551947 Spic 183,2 160,0 156,5 14,7 mtt(ng) 91,6 80,0 78,2 72,3 R (%) Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết carbamat vào tỉ lệ dung môi rửa giải Nhận xét: từ đồ thị trên ta thấy, độ thu hồi các chất carbamat là tốt nhất tại tỉ lệ diclometan:hexan =1:1. Do đó, chúng tôi chọn tỉ lệ dung môi rửa giải diclometan:hexan =1:1 cho các lần khảo sát sau. 3.3.3. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải Các chất carbamat được chiết theo quy trình như ở trên và được rửa giải bằng hỗn hợp dung môi diclometan:hexan =1:1 tại các thể tích khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 3.10. Bảng 3.12. Kết quả khảo sát thể tích dung môi dung môi rửa giải đối với các chất carbamat V (ml) mlt (ng) Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb 20 200 9642540 814612 484553 248305 Spic 118,4 91,1 70,7 65,1 mtt(ng) 59,2 45,5 35,4 32,5 R (%) 40 200 14462593 1433329 946380 720286 Spic 177,6 160,3 138,1 188,8 mtt(ng) 88,8 80,1 69,1 94,4 R (%) 50 200 15174514 1582214 1214988 722391 Spic 186,3 176,9 177,3 189,4 mtt(ng) 93,2 88,4 88,7 94,7 R (%) 60 200 15294587 1691354 1164021 636247 Spic 187,8 189,1 169,9 166,8 mtt(ng) 93,9 94,6 84,9 83,4 R (%) Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi carbamat vào thể tích dung môi rửa giải Nhận xét: Từ đồ thị trên ta thấy, độ thu hồi carbamat tương đối cao bắt đầu từ thể tích rửa giải bằng 50ml. Do đó, để vừa được hiệu suất thu hồi cao vừa đỡ tốn dung môi, chúng tôi chọn thể tích rửa giải là 50ml cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp Một phương pháp phân tích tốt phải có độ lặp lại và hệ số thu hồi cao. Để đánh giá hai yếu tố trên, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nền mẫu thực. Sử dụng mẫu trắng, thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ 100ppb, 500ppb và 1000ppb. Mỗi mức tiến hành làm lặp lại 4 lần. Độ lặp lại và độ thu hồi được xác định như sau: Độ lặp lại của phương pháp được xác định theo các đại lượng S2 và CV. Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình. n : số lần đo. S : độ lệch chuẩn. CV : hệ số biến động của phép đo. Độ thu hồi của phương pháp theo các công thức sau : Trong đó: C: nồng độ carbamat xác định được (ng/g) C': nồng độ carbamat tính từ đường chuẩn (ng/ml) V: thể tích hòa cặn (V=1ml) m: khối lượng mẫu (g) Cm+c : nồng độ carbamat xác định được trong mẫu thêm chuẩn (ng/g) Cm: nồng độ carbamat có trong mẫu (ng/g) mc: lượng carbamat thêm vào (ng) R: độ thu hồi (%) Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp mc (ng) Diện tích pic Si Diện tích pic St %Rtb CV (%) 100 Carbofuran 4979720 4767493 4689607 5336250 5533186 89,3 5,9 Propoxur 551149 483616 523328 506348 574177 90,0 5,5 Carbaryl 446472 424858 489584 485875 506095 91,2 6,8 Fenobucarb 262141 257556 276491 286139 307509 88,0 4,9 500 Carbofuran 24427430 23747530 23535850 24981490 26219186 92,2 2,7 Propoxur 2494321 2503822 2324398 2494461 2720697 90,2 3,5 Carbaryl 2185965 2190473 2108417 2285938 2373695 92,4 3,3 Fenobucarb 1212958 1290565 1219670 1237636 1397789 88,7 2,8 1000 Carbofuran 46861702 45913577 48446472 47829695 52076686 90,8 2,4 Propoxur 5024113 4669544 4872670 5022337 5403847 90,6 3,4 Carbaryl 4419905 4084287 4226059 4592391 4708195 92,0 5,1 Fenobucarb 2395286 2416886 2328485 2340531 2760639 85,9 1,8 Nhận xét: Độ thu hồi của phương pháp tại 3 mức nồng độ 100ppb, 500ppb và 1000ppb đều trên 80% và nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp CV (%) tại nồng độ 100 – 1000ppb cho phép từ 11 – 15%. Độ lặp lại của các carbamat tại nồng độ 100ppb cao nhất trong 3 mức nồng độ, tuy nhiên vẫn nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Như vậy, phương pháp có độ thu hồi trên 80% và độ lặp lại cao, có thể áp dụng phương pháp để phân tích dư lượng thuốc trừ sâu carbamat trong rau quả. 3.4. Phân tích mẫu thực tế Sau khi nghiên cứu các điều kiện tách chiết carbamat, chúng tôi tiến hành phân tích một số mẫu thực. Đối tượng mẫu là một số loại rau quả sau: quả lê, quả cam, quả quýt, rau dền, rau thơm, rau cải xanh… Các mẫu rau và quả trước khi đem phân tích cần phải xử lí sơ bộ. Các mẫu được nghiền nhỏ và đồng nhất, sau đó được đem cân và tiến hành phân tích như qui trình ở trên. Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình của 3 lần. QUI TRÌNH CHIẾT CARBAMAT TRONG RAU QUẢ Mẫu (~10g)/ống li tâm 50ml + thêm chuẩn hỗn hợp 4 carbamat + 20ml MeOH Lắc vortex 5 phút Đồng nhất Lọc / bình định mức 50ml Li tâm 6000 v/ph, 5 phút Hút 20ml dung dịch cho qua cột Kieselguhr Rửa giải bằng 50 ml hexan:diclometan = 1:1 Cô quay /40°C đến cạn Hòa cặn bằng 1ml MeOH + định mức bằng NaCl bão hòa Để yên 15 phút LC/MS/MS Bảng 3.14. Kết quả phân tích các mẫu quả STT Mẫu Carbamat Lượng thêm vào (ng) Lượng tìm thấy (ng) Độ thu hồi R% 1 Cam Carbofuran 0 KPH - 250 202,7±5,9 81,1 Propoxur 0 KPH - 250 203,0±6,9 81,2 Carbaryl 0 KPH - 250 213,5±4,5 85,4 Fenobucarb 0 KPH - 250 206,6±8,7 82,7 2 Táo Carbofuran 0 KPH - 250 211,0±6,7 84,4 Propoxur 0 KPH - 250 207,7±7,3 83,1 Carbaryl 0 KPH - 250 205,5±8,4 82,2 Fenobucarb 0 KPH - 250 215,4±5,0 86,2 3 Quýt Carbofuran 0 KPH - 100 83,3±3,8 83,3 Propoxur 0 KPH - 100 80,6±3,1 83,1 Carbaryl 0 KPH - 100 80,3±2,8 80,3 Fenobucarb 0 KPH - 100 80,3±2,6 80,3 4 Nho xanh Carbofuran 0 KPH - 200 162,9±5,4 81,5 Propoxur 0 KPH - 200 160,1±5,4 80,0 Carbaryl 0 KPH - 200 168,9±4,7 84,5 Fenobucarb 0 KPH - 200 164,4±4,9 82,2 5 Lê Carbofuran 0 KPH - 200 167,3±5,9 83,6 Propoxur 0 KPH - 200 161,3±6,4 80,6 Carbaryl 0 KPH - 200 162,7±4,4 81,4 Fenobucarb 0 KPH - 200 166,2±5,2 83,1 Bảng 3.15. Kết quả phân tích các mẫu rau STT Mẫu Carbamat Lượng thêm vào (ng) Lượng tìm thấy (ng) Độ thu hồi R% 1 Bắp cải Carbofuran 0 KPH - 250 207,2±8,7 82,9 Propoxur 0 KPH - 250 220,4±8,2 88,2 Carbaryl 0 KPH - 250 205,9±6,0 83,4 Fenobucarb 0 KPH - 250 212,9±7,7 85,2 2 Cải xanh Carbofuran 0 KPH - 500 427,5±10,3 85,5 Propoxur 0 KPH - 500 418,5±8,8 83,7 Carbaryl 0 KPH - 500 434,7±13,9 86,9 Fenobucarb 0 KPH - 500 408,2±7,8 81,6 3 Rau rền Carbofuran 0 KPH - 500 416,4±10,4 83,3 Propoxur 0 KPH - 500 406,4±10,6 81,3 Carbaryl 0 KPH - 500 414,8±7,5 83,0 Fenobucarb 0 KPH - 500 414,9±8,7 83,0 4 Rau cần tây Carbofuran 0 26,6±1,4 Carbaryl 0 KPH - Propoxur 0 KPH - Fenobucarb 0 KPH - 5 Rau mồng tơi Carbofuran 0 8,5±0,5 Carbaryl 0 KPH - Propoxur 0 KPH - Fenobucarb 0 KPH - Nhận xét: Kiểm tra phân tích trên 30 mẫu rau quả các loại, phát hiện 2 mẫu rau có chứa dư lượng carbofuran nhưng đều ở mức thấp, chưa phát hiện được mẫu nào có chứa carbaryl, propoxur và fenobucarb. Hiệu suất thu hồi các mẫu thêm chuẩn đều đạt trên 80%. Chương 4. KẾT LUẬN Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, chúng tôi đã thu được các kết quả sau: Nghiên cứu và tối ưu hóa được các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ như: pha động, cột sắc ký, detector. Nghiên cứu và đánh giá được khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các carbamat, độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. Nghiên cứu và đưa ra điều kiện để tách chiết các chất carbamat trong một số loại rau quả. Đưa ra quy trình phân tích xác định đồng thời dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Tiến hành phân tích trên 30 mẫu rau quả trên địa bàn Hà Nội và phát hiện 2 mẫu rau có chứa dư lượng carbofuran. Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy có thể áp dụng phân tích dư lượng thuốc trừ sâu carbamat trong các loại rau quả với độ tin cậy cao. Đây là một phương pháp có nhiều ưu điểm trong phân tích các chất nhóm carbamat mặc dù chi phí cho phân tích còn khá cao. Nếu có thể, tôi mong tiếp tục nghiên cứu xác định đồng thời các chất khác thuộc carbamat. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT Cổng thông tin điện tử Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn [2009], Dư lượng thuốc trừ sâu ở rau quả Ấn Độ tăng cao. Con người và thiên nhiên (2007), Hóa chất bảo vệ thực vật và sức khoẻ con người (Kỳ I). Việt báo (2006), Rau an toàn thừa thuốc trừ sâu. Phạm Luận (1988), Cơ sở lý thuyết Kĩ thuật phân tích FIA, ĐHTH Hà Nội Phạm Luận, Trần Chương Huyến, Từ Vọng Nghi (1990), Một số phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, ĐHTH Hà Nội. QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm. Rau Hoa Quả Việt Nam (2006), Vệ sinh an toàn thực phẩm: Những con số đáng ngại. Sở khoa học và công nghệ tỉnh An Giang (2007), Dư lượng thuốc trừ sâu trong một số loại rau xanh ngắn ngày tại TP. Long Xuyên. Sở Tài nguyên và Môi trường tỉnh Vĩnh Phúc ( 2008 ), Thuốc bảo vệ thực vật và những tác động của chúng. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hoá phân tích. Công An Ninh Thuận ( 2009), Hơn hai triệu người ăn rau bẩn. B. TIẾNG ANH A. Guiberteau , T. Galeano Diáz, F. Salinas, J.M. Ortiz (1995), “Indirect voltammetric determination of carbaryl and carbofuran using partial least squares calibration”, Analytyca Chimica Acta, 305, pp. 219 – 226. Carbofuran, Conacher HB, Page BD, Lau BP, Lawrence JF, Bailey R, Calway P, Hanchay JP, Mori B (1987), “Capillary column gas chromatographic determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages with confirmation by gas chromatography/mass spectrometry”, Journal-Assocoation of Official Analytical Chemist. David Arráez-Román, Antonio Segura-Carretero, Carmen Cruces-Blanco, Alberto Fernández-Gutiérrez (2004), “Determination of aldicarb, carbofuran and some their main metabolites n groundwater by application of micellar electrokinetic capillary chromatography with diode-array detection and solid-phase extraction”, Pest Management Science, 60, pp. 675-679. Elvira Grou, Valeria Rădulescu (1983), “Direct determination of some carbamat pesticides in water and soil by high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography, 260, pp. 502-506. Feng Tang, Shimei Ge, Yongde Yue, Rimao Hua, Rong Zhang (2005), “High-performance thin-layer chromatographic determination of carbamate residues in vegetables”, Journal of Planar Chromatography, Volume 18, Number 101, pp. 28-33. Feride Koc, Yusuf Yigit, Yavuz Kursad Das, Yasemin Gurel, Cevdet Yarali (2008), “Determanation of aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl and methiocarb residues in honey by HPLC with post-column derivatization and fluorescence detection after elution from a florisil column”, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 16, No. 3, pp. 39-45. Gianni Sagratini, Jordi Manes, Dario Giardiná, Pietro Damiani, Yolanda Picó (2007), “Analysis of carbamate and phenylure pesticide residues in fruit juices by solid-phase microextraction and liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1147, pp. 135-143. Jinno Laboratory (2001), Carbaryl, School of Materials Science, Toyohashi University of Technology, Japan. Jinno Laboratory (2001), Fenobucarb, School of Materials Science, Toyohashi University of Technology, Japan. Jinno Laboratory (2001), Propoxur, School of Materials Science, Toyohashi University of Technology, Japan. José Fernando Huertas-Pérez, Ana M. García Campana, Laura Gámiz-Gracia, Antonio González-Casado, Monsalud del Olmo Iruela (2004), “Sensitive determination of carbaryl in vegetal food and natural waters by flow-injection analysis based on the luminol chemiluminescence reaction”, Analytica Chimica Acta, 524, pp. 161-166. José Fernando Huertas-Pérez, Laura Gámiz-Gracia, Ana M. García Campana, Antonio González-Casado, José L. Martínez Vidal (2005), “Chemiluminescence determination of carbofuran at trace levels on lettuce and waters by flow-injection analysis”, Talanta, 65, pp. 980-985. Karim D. Khalaf, A. Morales-Rubio, M. de la Duardia, “Simple and rapid flow-injection spectrophotometric determination of carbaryl after liquid-liquid extraction”, Analytica Chimica Acta, 208, pp. 231-238. L. Alvarez-Rodrıguez, Ll. Monferrer-Pons, J. S. Esteve-Romero, M. C.Garcıa-Alvarez-Coque, G. Ramis-Ramos (1997), “Spectrophotometric Determination of Carbamate Pesticides With Diazotized Trimethylaniline in a Micellar Medium of Sodium Dodecyl Sulfate”, Analyst, Vol 122, pp.459-463. Masuru Kawasaki, Tsuyoshi Inoue, Katsuharu Fukuhara, Sadao Uchiyama (1999), “Study on GC/MS (SIM) for determination of carbamate and organonitrogen pesticides in foods with simple clean-up by SPE method”, J. Japan, Vol 4, No. 5. Mian Liu, Hui Yang, Hongxia Liu, Po Han, Xie Wang, Shusheng Zhang, Yangjie Wu (2007), “Development of high-performance liquid chromatography and non-aqueous capillary electrophoresis methods for the determination of fenoxycarb residues in wheat samples”, Journal of the Science of Food and Agriculture, Volume 88, Issue 1, pp. 62-67. Min Liu, Yuki Hashi, Yuanyuan Song, Jin-Ming Lin (2005), “Simultaneous determination of carbamate and organophosphorus pesticides in fruits and vegetables by liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1097, pp. 183-187. M. Fernández, Y. Picó, J. Manes (2000), “Determination of carbamate residues in fruits and vegetables by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 871, pp. 43-56. O. Bhargavi, K. Kiran, K. Suvardhan, D. Rekha, K. Janardhanam, P. Chiranjeevi (2006), “A sensitive determination of carbofuran by spectrophotometer using 4, 4-azo-bis-3,3’5,5’-tetrabromoaniline in various environmental samples”, E-Journal of Chemistry, vol. 3, pp. 68 – 77. Urmila Tamrakar, Vinay K. Gupta, Ajai K. Pillai (2009), “Spectrophotometric analysis of carbamate pesticides after thermal gradient separation”, Journal of Planar Chromatography, Volume 22, Number 2, pp. 77-82. Xiaozhong Hu, Yu Jianxin, Yan Zhigang, Ni Lansun, Lin Yanfei, Wang Peng, Li Jing, Huang Xin, Chu Xiaogang, Zhang Yibin (2004), “Determination of Multiclass Pesticide Residues in Apple Juice by Gas Chromatography-Mass Selective Detection after Extraction by Matrix Solid-Phase Dispersion”,  Journal of AOAC INTERNATIONAL, Volume 87, Issue 4, pp. 972-985. Xiaoping Wu, Ling Wang, Zenghong Xie, Professor, Jieshan Lu, Chao Yan, Pengyuan Yang, Guonan Chen (2006), “Rapid separation and determination of carbamate insecticides using isocratic elution pressurized capillary electrochromatography”, Electrophoresis, Vol. 27, pp 768-777. Y. Koteswara, K. Lokanath Swaroop, P. Chiranjeevi, B. Rangamannar, “Spectrophotometric determination of carbosulfan in various environments using novel oxidative coupling”, Proceedings of the Third International Conference on Environment and Health, Chennai, India (2003), pp. 400 – 403. PHỤ LỤC 1. Khảo sát thành phần pha động chế độ isocractic (HCOOH 0,1% : MeOH) Thành phần pha động 10 : 90 Thành phần pha động 20 : 80 Thành phần pha động 30 : 70 Thành phần pha động 40 : 60 Thành phần pha động 50 : 50 2. Khảo sát thành phần pha động sử dụng chất cải biến nền Dung dịch acid acetic 0,1% trong nước Dung dịch amoni acetat 0,1% trong nước Dung dịch acid focmic 0,1% trong nước 3. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết MeOH:H2O = 1:1 MeOH:H2O = 2:1 MeOH:H2O = 3:1 MeOH:H2O = 4:1 4. Khảo sát dung môi rửa giải Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan Rửa giải carbamat bằng dung môi n-hexan 5. Khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải Sắc đồ chuẩn carbamat 200ng/ml Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (1:2) Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (1:1) Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (2:1) Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (3:1) 6. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải Thể tích dung môi rửa giải 20ml Thể tích dung môi rửa giải 40ml Thể tích dung môi rửa giải 50ml Thể tích dung môi rửa giải 60ml 7. Sắc đồ phân tích một số mẫu thực Mẫu cam không thêm chuẩn Mẫu rau cải xanh không thêm chuẩn Mẫu rau thơm không thêm chuẩn Mẫu rau rền không thêm chuẩn Mẫu rau rền thêm chuẩn 500ng/ml Mẫu rau thơm thêm chuẩn 500ng/ml Mẫu rau cải xanh thêm chuẩn 500ng/ml Mẫu cam thêm chuẩn 250ng/ml Mẫu bắp cải thêm chuẩn 250ng/ml Mẫu rau ngót không thêm chuẩn Mẫu rau cần tây không thêm chuẩn Mẫu rau mồng tơi không thêm chuẩn